DE2332760A1

DE2332760A1 - Mehrschichtiges analytisches element fuer die quantitative spektrophotometrische analyse

Info

Publication number: DE2332760A1
Application number: DE2332760A
Authority: DE
Inventors: Allan Grosvenor Millikan; Edwin Paul Przybylowicz
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1972-06-30
Filing date: 1973-06-27
Publication date: 1974-01-17
Also published as: GB1440464A; FR2191734A5; BE801742A; JPS5321677B2; CA1015253A; JPS4953888A; DE2332760B2; CH578425A5; DE2332760C3

Description

lehrschichtiges analytisches Element für die quantitative

spektrophotometrische Analyse 9 ^ ^? 7 R Π

Die Erfindung betrifft ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative spektrophotometrische Analyse einer Flüssigkeit, insbesondere in Form eines analytischen Bandes für die automatisierte spektrophotometrische Analyse von Flüssigkeiten, insbesondere Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut.

In den vergangenen Jahren ist eine Anzahl automatisierter Systeme für die Durchführung quantitativer chemischer Analysen von Flüssigkeiten bekannt geworden, die sich insbesondere für klinische Laboratorien als vorteilhaft erwiesen haben, insbesondere für die Blutanalyse.

So sind beispielsweise aus den US-PS 2 797 149 und 3 565 582 kontinuierliche Durchlaufanalysensysteme bekannt geworden, die aus einer Vielzahl von Behältern bestehen, in denen zu untersuchende Proben, Verdünnungsmittel und Test-Reagenzien aufbewahrt, miteinander vermischt und/oder spektrophotometrisch analysiert werden. Die zu testenden Flüssigkeiten, Verdünnungsmittel und Test-Reagenzien v/erden durch die Analysiervorrichtung dabei durch ein komplexes System von Röhren oder Röhrchen geführt. Nachteilig an diesen kontinuierlich arbeitenden Analysevorrichtungen ist, daß ihr Aufbau außerordentlich komplexest und daß sie teuer sind und zu ihrer Bedienung ein fachkundiges Personal erforderlich ist. Nachteilig ist ferner, daß die durchzuführenden Analysen sehr zeitaufwendig sind, daß ferner die Reinigung der Vorrichtungen sehr umständlich ist und daß die bekannten Vorrichtungen nicht die Analyse sehr kleiner Mengen an zu testendem Material ermöglichen, wie sie beispielsweise zur Durchführung mikroanalytischer Testverfahren ausreichen.

Um die Nachteile der bekannten, kontinuierlich arbeitenden Durchflußanalysiervorrichtungen zu überwinden, sind automatisierte chemische Analysiervorrichtungen bekannt geworden, bei

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denen ein endloses analytisches Band verwendet wird, auf welches das zu analysierende Material aufgebracht wird, und welche eine Analyse des aufgebrachten Materials auf spektrophotometrischem Wege ermöglichen, und zwar durch farbbildende Reaktionen zwischen Bestandteilen des zu untersuchenden Prüflings und Test-Reagenzien, die auf das Band aufgebracht oder in diesem enthalten sind. Es sind bereits eine Reihe von endlosen Analysebändern der verschiedensten Struktur bekannt geworden. Zwei Analysebänder verschiedener Struktur sind beispielsweise aus der GB-PS 1 049 364 bekannt. Das eine, in Fig. 4 der Patentschrift dargestellte Band weist Ausschnitte oder Aussparungen auf, in welche abgemessene Mengen der zu prüfenden Flüssigkeit und des Test-Reagens eingebracht werden. Das andere, in Fig. 9 der Patentschrift dargestellte Band besteht aus einer Mehrzahl von Bändern, in denen eine Filtration oder Reaktion erfolgt. Aus der US-PS 3 036 893 ist es des weiteren bekannt, zur Durchführung derartiger automatisierter Analyseverfahren eine Mehrzahl voneinander getrennter Bänder zu verwenden, welche die Aufgabe haben, die zu untersuchende Flüssigkeit aufzunehmen und auszubreiten, sie zu filtrieren und die als Reaktionsmedium dienen. Bei der aus der US-PS 3 036 893 bekannten Analysemethode wird das zu analysierende Material auf ein Band gebracht und dann von diesem auf ein anderes Band übertragen. Aus der US-PS 3 526 480 ist des weiteren ein analytisches Band bekannt, welches Ausschnitte aufweist, die abgemessene Mengen von Test-Reagens enthalten und in welche das zu analysierende Material aufgebracht wird.

Die bekannten Analysesysteme mit endlosen Analysebändern sind naturgemäß viel einfacher als die bekannten Durchflußanalysiervorrichtungen. Jedoch haben auch die bekannten,Analysebänder verwendenden Analysemethoden Nachteile, welche ihre Verwendung und Verbreitung stark behindert haben. So ist es beispielsweise bei solchen Analysebändern, die das Test-Reagens nicht selbst

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enthalten und die hauptsächlich dem Transport der zu analysierenden Probe durch die Vorrichtung dienen, wie es bei bestimmten Ausgestaltungen der GB-PS 1 049 364 der Fall ist, nachteilig, daß die zu analysierende Probe und das Test-Pveagens in getrennten Arbeitsgängen auf das Analyseband zum richtigen Zeitpunkt und in den richtigen Mengen aufgebracht werden müssen. i)es weiteren führt die' Verwendung mehrerer Bänder mit verschiedenen Funktionen, z. B, mit der Funktion der Ausbreitung der zu testenden Probe, mit der Funktion, die Probe zu filtrieren, und mit der Funktion, die Umsetzung der zu analysierenden Verbindung mit dem Test-Reagens durchzuführen, wie es beispielsweise aus der US-PS 5 036 893 und aus der GB-PS 1 049 364 bekannt ist, dazu, daß das Verfahren kompliziert wird. Auch die Verwendung analytischer Bänder komplexer Natur, die schwer herzustellen und teuer sind, z. B, die Verwendung der aus der US-PS 3 526 480 bekannten Bänder, hat die Verbreitung dieser Bänder stark behindert.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative spektrophotometrische Analyse einer Flüssigkeit anzugeben, das sich zur Durchführung automatisierter spektrophotometrischer Analysen eignet und welches einen einfachen Aufbau besitzt, leicht herzustellen und billig ist und mit welchem eine Vielzahl der verschiedensten Analysen in einer kontinuierlichen Analysiervorrichtung· in einfacher und effektiver Weise durchgeführt werden kann.

Ls wurde gefunden, daß sich die gestellte Aufgabe durch ein mehrschichtiges analytisches Element realisieren läßt, das aufgebaut ist aus einem Schichtträger, einer Reagens-Schicht, die ein oder mehrere Test-Reagenzien für die Umsetzung mit bestandteilen des zu testenden Prüflings enthält, und einem porösen Medium, bestehend aus einer oder mehreren Schichten, welches die Aufgabe hat, die zu prüfende Flüssigkeit aus zu-

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breiten und zu filtrieren und des weiteren dazu dient, die spektrophotometrische Analyse durch den Schichtträger zu erleichtern.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative spektrophotometrische Analys einer Flüssigkeit, gekennzeichnet durch 1. einen für Flüssigkeiten impermeablen, lichtdurchlässigen Schichtträger, 2. mindestens einer auf einer Seite des Schichtträgers angeordneten Reagens-Schicht mit einem Reagens, das durch Reaktion mit einem Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit eine Farbveränderung innerhalb 'der Reagensschicht bewirkt, und 3. einer auf der dem Schichtträger abgewandten Seite der Reagens-Schicht angeordneten porösen Schicht oder einem porösen Schichtverband, die bzw. der für den die farbbildende Reaktion mit dem Reagens eingehenden Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit durchlässig ist und die bzw. der die aufgebrachte Flüssigkeit derart lateral ausbreitet, daß ein konstantes Volumen Flüssigkeit pro Flächeneinheit erhalten wird und auf die Reagens-Schicht gelangt.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist das mehrschichtige analytische Element nach der Erfindung die Form eines endlosen Streifen oder Bandes auf. Es kann jedoch auch in anderer Form vorliegen, beispielsweise in Form eines Blattes oder eines kurzen Streifens oder in Form von kleinen Abschnitten, die auf Karten befestigt sind, z. B. Öffnungen aufweisenden Karten.

Kennzeichnend für die erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Elemente ist somit eine Reagens-Schicht, welche die zur Ausführung einer Analyse erforderlichen Reagenzien enthält, so daß bei Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung die die Analyse durchführende Person lediglich iir ein geeignetes Aufbringen der zu analysierenden Probe

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auf das Element zu sorgen hat. Zum Aufbringen der zu analysierenden Probe können automatisch arbeitende Verteilungs- oder Auftragsvorrichtungen verwendet werden, die genau abgemessene Mengen einer zu prüfenden Flüssigkeit zum rechten Zeitpunkt und auf die richtige Stelle des analytischen Elementes aufbringen. Derartige automatisch arbeitende Vorrichtungen sind bekannt. Mit Hilfe einer solchen Vorrichtung und eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung lassen sich beispielsweise quantitative Analysen bestimmter Bestandteile der zu testenden Flüssigkeit durchführen,ζ. B. läßt sich der Glucosegehalt des Blutes analysieren, indem das behandelte analytische Element einem üblichen Spektrophotometer zugeführt wird.

Bei dem erfindungsgemäßen mehrschichtigen analytischen Element handelt es sich um ein sogenanntes integrales mehrschichtiges Element, das sämtliche zur Durchführung des analytischen Prozesses erforderlichen Schichten aufweist, im Gegensatz zu den bekannten automatisierten, Analysebänder verwendenden Systemen des Standes der Technik, bei denen zwei oder mehrere Bänder temporär miteinander in Kontakt gebracht" werden und die nach Bildung einer sogenannten zusammengesetzten Struktur wieder voneinander getrennt werden.

Da das erfindungsgemäße mehrschichtige analytische Element eine integrale Struktur aufweist, in welcher der Schiditräger und die verschiedenen Schichten miteinander verbunden sind, und da es bei der Verwendung des Elementes lediglich erforderlich ist, die zu analysierende Probe auf die obere Schicht des Elementes aufzubringen und das Element durch ein Spektrophotometer zu führen, ist die zur Durchführung einer automatisierten Analyse erforderliche Vorrichtung nicht aufwendig, so daß sich die endlosen analytischen Bändern eigene Einfachheit in einem Analysesystem voll ausnutzen läßt.

Die Begriffe "Farbveränderung" und "farbbildende Reaktion" umfassen hier auch die Fälle, in denen die farbbildende Reaktion innerhalb der Reagens-Schicht in einer Reaktion besteht, bei der eine fluoreszierende Verbindung erzeugt wird.

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Zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente nach der Erfindung können die verschiedensten lichtdurchlässigen, für Flüssigkeiten impermeablen Schichtträger verwendet werden. So können zur Herstellung eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung beispielsweise die verschiedensten Polymeren, z. b. Celluloseacetat, Polyäthylenterephthalat, Polycarbonate und Polystyrole, verwendet werden. Die Dicke des Schichtträgers kann sehr verschieden sein. Zweckmäßig liegt die Schichtstärke bei etwa 0,0508 bis 0,254 mm.

Die Reagens-Schicht kann direkt auf den Schichtträger aufgetragen werden oder auf eine lichtdurchlässige Haft- oder Zwischenschicht, welche die Bindung der Reagens-Schicht auf den Schichtträger unterstützt. Die Reagens-Schicht enthält die Test-Reagenzien, die eine farberzeugende Reaktion mit Bestandteilen der zu analysierenden Probe eingehen. Die Reagens-Schicht kann beispielsweise aus einer Dispersion eines oder mehrerer Test-Reagenzien in einem hydrophilen Kolloid, das als Bindemittel dient, z. b. Gelatine oder Polyvinylalkohol, bestehen. .

Die im Einzelfalle verwendeten Test-Reagenzien der Reagens-Schicht hängen natürlich von dem im Einzelfalle zu analysierenden Material und der im Einzelfalle herbeizuführenden farbbildenden Reaktion ab, die zur Identifizierung des zu analysierenden Stoffes ausgewählt wurde.

Auf der Seite der Reagens-Schicht, die dem Schichtträger abgewandt ist, befindet sich eine oder befinden sich mehrere Schich- ' ten, welche die Funktion haben, die aufgebrachte Flüssigkeit gleichförmig in lateraler Richtung auszubreiten.

Diese Schicht oder diese Schichten können gegebenenfalls des weiteren die Aufgabe haben, aus der zu analysierenden Probe Bestandteile abzufiltrieren^Sas Auftreten oder die Messung der farbbildenden Reaktion stören würden.

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Diese Schicht oder Schichten kann bzw. können des weiteren die Punktion haben, zum Zwecke der Durchführung einer reflexionsspektrophotometrischen Analyse das durch den schichtträger gelangte Licht zu reflektieren.

Ein mehrschichtiges analytisches Element nach der Erfindung weist somit außer dem Schichtträger mindestens zwei Schichten auf, wovon die eine dieser Schichten eine Reagens-Schicht ist und die andere eine Schicht, welche eine gleichförmige laterale Verteilung der aufgebrachten Probe bewirkt und gegebenenfalls noch die weiteren anderen erwähnten Funktionen hat. Es ist jedoch auch möglich, für jede einzelne Funktionjeine besondere Schicht anzuordnen, in welchem Falle ein mehrschichtiges Element nach der Erfindung beispielsweise vier Schichten außer dem Schichtträger aufweist. Andererseits kann eine Schicht auch zwei oder drei Funktionen und eine weitere Schicht die dritte Funktion durchführen. Auch ist es möglich, mehr als nur eine Schicht zu einem bestimmten Zweck zu verwenden, d. h. es ist beispielsweise möglich, zwei oder mehrere einander benachbarte Schichten als Reagens-Schichten zu verwenden.

Die Schicht mit der Ausbreitfunktion ist die vom Schichtträger entfernteste Schicht und die Schicht, auf die die zu analysierende Probe, z. B. Blut, aufgebracht wird. In typischer Weise wird die zu analysierende Probe, wie bereits dargelegt, auf die Schicht mit der Ausbreitfunktion mittels einer automatisch arbeitenden Verteilervorrichtung aufgebracht, welche derart konstruiert ist, daß sie einen kleinen Tropfen Flüssigkeit an der gewünschten Stelle auf die oberste Schicht des Analyseelementes aufzubringen vermag.

Die Schicht mit der Ausbreitfunktion soll den Tropfen gleichförmig in lateraler Richtung verteilen. Die Bedeutung dieser Schicht besteht darin, die Tendenz einer "Ring"-Formation in

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der Reagens-Schicht des Elementes zu verhindern. Das Phänomen der "Ring"-Formation wird beispielsweise in den US-PS 5 ü5o und 3 526 480 beschrieben. Werden demzufolge Tropfen einer zu analysierenden Probe direkt auf eine Reagens-Schicht aufgetragen, so bilden sie durch laterale Ausbildung einen "Ring", wobei eine verminderte Konzentration an Test-Reagens im Zentrum des Ringes auftritt und eine erhöhte Konzentration in der Peripherie des Ringes. Dies führt zu einer ungleichförmigen Farbentwicklung, die wiederum eine quantitative Messung auf spektrophotometrischem Wege verhindert.

Im Falle eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung erfolgt somit praktisch die gesamte laterale Bewegung der Probe in der Schicht mit der Ausbreitfunktion, so daß, wenn die Probe die Reagens-Schicht erreicht, die sich nicht mehr lateral ausbreitet, keine ungleichförmige Verteilung des Test-Reagenses mehr erfolgt.

Im Falle eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung beeinflußt eine Veränderung des Probenvolumens, das auf das Element aufgebrachtwird, den Durchmesser des erzeugten farbigen Fleckens in der Reagens-Schicht, doch das Flüssigkeitsvolumen pro Flächeneinheit, welches die Reagens-Schicht erreicht, bleibt praktisch konstant unabhängig von Veränderungen im Volumen der aufgebrachten Probe. Infolgedessen wird die Dichte des Farbtones, der in der Reagens-Schicht durch die farbbildende Reaktion erzeugt wird, nicht merklich durch eine Veränderung der Größe des auf das Element aufgebrachten Tropfens beeinflußt und der Farbton ist lediglich abhängig von der Konzentration des Bestandteiles, der die farbbildende Reaktion eingeht. Infolgedessen ist es bei Verwendung eines mehrschichtigen analytischen Elementes nach der Erfindung nicht erforderlich, Tropfen gleichförmiger Größe auf das Element aufzubringen oder die Größe der aufgebrachten Tropfen zu bestimmen, um eine quantitative Analyse durchführen zu können.

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Hat die poröse Schicht oder eine Schicht des Schichtenverbandes oder der Schichtenverband die Funktion einer Filterschicht, so bedeutet dies, daß aus der Probe Bestandteile abfiltriert werden sollen, welche die farbbildende Reaktion in der Reagens-Schicht stören würden oder welche die später durchzuführenden spektrophotometrischen Messungen behindern würden. So kann beispielsweise im Falle eines mehrschichtigen analytischen Elementes für die Analyse von Bestandteilen des Blutes eine Fj.lterschicht dazu dienen, rote Blutkörperchen zu entfernen, jedoch das Serum in die darunterliegende Schicht durchzulassen. Eine solche Filterschicht kann aus irgendeinem Material aufgebaut sein, welches einen ausreichenden Porositätsgrad für die zu analysierende Probe aufweist, wobei die optimale Porosität von dem speziellen Verwendungszweck des mehrschichtigen analytischen Elementes abhängt. Soll das analytische Element, z. B. in Form eines endlosen Bandes, für die reflexions-spektrophotometrische Analyse von Blut verwendet werden, so hat es sich als zweckmäßig erwiesen, wenn eine Filterschicht vorhanden ist, die eine Porengröße von 1 bis 5 Mikron aufweist. Eine Filterschicht mit einer solchen Porengröße vermag die Blutkörperchen auszufiltrieren, welche in typischerWeise eine Größe von etwa 7 bis 30 Mikron aufweisen, wobei das Serum die Schicht zu passieren vermag. Bei Verwendung einer Filterschicht mit einer Porengrösse, die zu klein ist, kann die Verwendbarkeit des Elementes oder Bandes beschränken, beispielsweise deshalb, weil sie den Durchtritt von Blutproteinen verhindert, und zwar im Falle solcher analytischer Teste, bei denen es wichtig ist, daß diese Blutproteine die Reagens-Schicht erreichen.

Das mehrschichtige analytische Element der Erfindung kann, wie bereits dargelegt, zur Verwendung in einem analytischen System bestimmt sein, bei dem die Reflexionstechniken einer spektrophotometrischen Analyse angewandt werden, weshalb das Element eine Schicht enthält, die die Funktion einer Reflexionsschicht hat und einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Messungen durch die Schichtträgerseite des Elementes bildet.

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Die Reflexionsschicht stellt dabei eine poröse Schicht dar, damit Bestandteile der zu analysierenden Probe diese Schicht passieren und in die Reagens-Schicht gelangen können. Die Reflexionsschicht soll dabei weiß sein, um einen wirksamen Hintergrund für die reflexions-spektrophotometrischen Messungen zu bilden.

Im Falle eines mehrschichtigen analytischen Elementes, z. B. Bandes, für die Analyse von Blut wird der Durchtritt der Blutkörperchen oder Blutzellen durch die Filterschicht blockiert, weshalb sie die spektrophotometrischen Messungen nicht stören, da diese durch den Schichtträger erfolgen, wobei die reflektierende Schicht als weißer Hintergrund dient.

Beim Ablesen eines ungebrauchten analytischen Elementes des für reflexions-spektrophotomerrische Messungen bestimmten Typs erfaßt der Phctometerdetektor lediglich etwa 1 % der auf das Element auftreffenden Energie Dieses 1 % einfallender Strahlung dient dann als Vergleichswert (1Ou %) für nachfolgende Reflexionsmessungen des Elementes, auf welches eine Probe aufgebracht wurde. Diese geringe Annahmewirksamkeit (collection efficiency) ist das Ergebnis des diffusen Reflexionsvermögens der Ausbreitschichten des beschriebenen Typs und des geringen Annahmewinkels, der für eine Unterscheidung gegenüber diffusem Licht benötigt wird.

Beim Ablesen oder bei der Auswertung des gleichen Elementes im Falle von Durchgangsmessungen erfaßt der Detektor etwa 1,5 bis 2 % der auf das mehrschichtige Element auffallenden Energie. Wird die Dicke der im vorstehenden beschriebenen Ausbreitschichten um etwa die Hälfte vermindert, so erhöht sich die Durchlässigkeit auf etwa 4 °~ und im Falle von Elementen mit mikrokristallinen Cellulose-Ausbrextschichten einer Dicke von etwa 100 bis etwa 300 Mikron erhöht sich die Durchlässigkeit auf ungefähr 20 % der einfallenden Strahlung. Infolge-

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dessen werden bessere Signal-Geräuschwerte dann erhalten, wenn als Bestimmungsmethode die Durchlässigkeitsmethode angewandt wird, weshalb es in vielen Fällen gegebenenfalls vorteilhafter sein kann, diese Bestimmungsmethode anzuwenden.

Abgesehen von den beschriebenen spektrophotometrischen Bestimmungsmethoden können in vorteilhafter Weise auch noch andere Formen der Spektrophotometrie zur Durchführung der Analyseverfahren angewandt werden. Zu erwähnen ist beispielsweise die Fluoreszenz-Spektrophotometrie, in welchem Falle das Reaktionsprodukt der Probe mit einem Test-Reagens aus einer fluoreszierenden Verbindung besteht und die Bestimmung der fluoreszierenden Verbindung mit einer Strahlung erfolgt, welche das Reaktionsprodukt zum Fluoreszieren bringt. Weitere Formen der Spektrophotometrie, die angewandt werden können, sind solche, bei Jenen eine Strahlung angewandt wird, die von sichtbarem Licht verschieden ist, z. B. ultraviolette Strahlung oder infrarotes

Licht. Der Begriff "farbbildende Reaktion" umfaßt daher auch die Fälle, in denen bei der Reaktion eine fluoreszierende Verbindung erhalten wird.
'.\ie bereits dargelegt, kann das analytische Element nach der hrfindung eine Schicht aufweisen, welche die Funktion einer Ausbreitschicht sowie einer Filterschicht hat und die des weiteren gleichzeitig als reflektierende Schicht dient.

Hin Beispiel für eine Schicht, welche sämtliche dieser drei Funktionen auszuführen vermag, ist eine sogenannte "Biush-Polymer-Schicht". Derartige Schichten können bekanntlich (vgl. H. F. Payne "Organic Coating Technology", Verlag John Wiley and Sons, New York, 1954, Bd. I, Seite 414) auf einem Substrat dadurch erzeugt werden, daß man ein Polymer in einer Mischung von zwei Flüssigkeiten löst, wobei die eine Flüssigkeit ein gutes Lösungsmitel für das Polymer ist, wohingegen die andere Flüssigkeit, die einen vergleichsweise höheren Siedepunkt besitzt, ein Nichtlösungsmittel für das Polymer ist oder zumindest

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ein schlechtes Lösungsmittel, worauf man die Polymerlösung auf das Substrat aufträgt und auftrocknet. Da das gute Lösungsmittel für das Polymer aufgrund seines niedrigeren Siedepunktes schneller verdampft, reichert sich das Polymer in der Flüssigkeit an, die ein schlechtes Lösungsmittel oder ein Nichtlösungsmittel für das Polymer ist, in dew Maße, in dem die Verdampfung fortschreitet, was dazu führt, daß das Polymer in Form feiner Partikel ausgeschieden wird und auf dem Substrat eine haftende poröse Schicht bildet. Zur Herstellung derartiger "Llush-Pclymer-Schichten", die Bestandteil eines analytischen Elements nach der Erfindung sein können, können die verschiedensten Polymeren verwendet werden, z. B. Polycarbonate, Polyamide und Celluloseester.

Anstelle einer "Llush-Polymer-Schicht" als geeignete Schicht, die die Funktionen der Proben-Ausbreitung und Filtrierung ausübt sowie den notwendigen Reflexionshintergrund für reflexionsspektrophotometrische ilessungen darstellt, kann eine in entsprechender Weise wirksame Schicht dadurch erzeugt werden, daß man auf die Reagens-Schicht eine dünne Schicht einer mikroporösen Filtermembran auf laminiert. Derartige Filtermembraneii sind oder'bestehen aus sogenannten "blushed Polymeren", hergestellt z. B. aus Celluloseestern,und enthalten Poren mikroskopischer Größe. Zur Herstellung derartiger Schichten ist eine Vielzahl von Stoffen verschiedener Porengröße im Handel erhältlich, Beispiele für Stoffe dieses Typs, die zur Herstellung entsprechender Schichten verwendet werden können und die im Handel erhältlich sind, sind die Filter und Filtermaterialien, die unter der Handelsbezeichnung Millipore von der US-Firma Millipore Corporation erhältlich sind und beispielsweise in der Firmenbroschüre "Millipore Catalogue MC/1" vom August 19 72 der Firma Millipore Corporation of Bedford, Hass., USA 01730 beschrieben werden, und ferner solche Filter und Filtermaterialien, die unter der Handelsbezeichnung "Metricel von der US-Firma Gelnian Instrument Company erhältlich sind.

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Weist das analytische Element nach der Erfindung eine einzige Schicht auf, welche die Funktion der Proben-Ausbreitschicht, die Funktion einer Filterschicht und die Funktion einer reflektierenden Schicht aufweist, so kann das analytische Element, z. B. in Form eines Bandes, aus lediglich zwei Schichten und dem Schichtträger bestehen, da außer der Schicht mit der Funktion einer Ausbreitschicht, einer Filterschicht und einer reflektierenden Schicht nur noch die Reagens-Schicht absolut erforderlich ist. Selbstverständlich kann das Element auch noch andere Schichten aufweisen, sofern dies erwünscht ist, d. h. z. B. können zwei oder mehrere benachbarte Reagens-Schichten angeordnet werden, um nacheinander ablaufende Reaktionen in jeder der Schichten zu ermöglichen.

Wie bereits dargelegt, kannes jedoch auch vorteilhaf-t sein, Elemente zu verwenden, die eine Schicht aufweisen, die als Filterschicht und reflektierende Schicht wirkt,und eine besondere Schicht, die die Funktion einer Proben-Ausbreitschicht hat oder Elemente zu verwenden, die drei separate Schichten aufweisen, welche die Funktionen der Proben-Ausbreitung, der Proben-Filtration bzw. der Lichtreflexion ausüben. In diesem Falle werden die Schichten natürlich derart auf den Schichtträger aufgetragen, daß die Proben-Ausbreitschicht die vom Schichtträger entfernteste Schicht ist, worauf die Filterschicht folgt und dann die reflektierende Schicht und schließlich die Reagens-Schicht.

Ein Beispiel für eine Schicht, die sowohl als Filterschicht wie auch als reflektierende Schicht wirksam ist, ist eine Schicht aus Titandioxid oder Bariumsulfat, dispergiert in einem Bindemittel, z. B. Celluloseacetat, Polyvinylalkohol oder Gelatine. Eine solche Schicht hat sich als besonders wirksam in einem mehrschichtigen Element, z. B. Band, erwiesen, das für die Analyse von Blut bestimmt ist, da das

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Element oder Band wirksam die Blutkörperchen auszufiltrieren vermag, während die Schicht das Serum hindurchläßt, wobei sie gleichzeitig einen wirksamen weißen Hintergrund für spektrophotometrische Messungen durch den Schichtträger liefert.

Line besonders vorteilhafte Schicht mit der Funktion einer Probenausbreitschicht in einem mehrschichtigen Element nach der Erfindung für die Analyse von Blut ist eine Schicht, bestehend aus einer Dispersion von Diatomeenerde in einem Bindemittel, z. B. Celluloseacetat. Diatomeenerde hat sich als außerordentlich wirksam in gleichförmiger Verteilung des Blutes in lateraler Richtung erwiesen. Vorteilhafte Proben-Ausbreitschichten können des weiteren beispielsweise aus mikrokristallinen kolloidalen Produkten hergestellt werden, die sich entweder von natürlich vorkommenden oder synthetischen polymeren Stoffen ableiten. Derartige mikrokristalline Stoffe werden beispielsweise von 0. A. Battista in dem Aufsatz "Colloidal Macromolecular Phenomena, Teil II, Novel llicrocrystals of Polymers", veröffentlicht im Journal of Applied Polymer Science, Band II, Seiten 481-498 (1967) ,beschrieben. Mikrokristalline Cellulose, die zur Herstellung derartiger Schichten verwendbar ist, ist im Handel erhältlich, beispielsweise unter der Handelsbezeichnung Avicel, Hersteller FMC Corporation, USA (vgl. Food Chemical Codex, 1. Ausgabe).

Vorteilhafte Ergebnisse können des weiteren dann erhalten werden, wenn eine Proben-Ausbreitschicht verwendet wird, die aus inerten sphärischen Partikeln gleichförmiger Größe in einer Matrix eines Bindemittels, welches die Partikel an die unterliegende Schicht bindet, aufgebaut ist. Beispiele für derartige sphärische Partikel sind Kügelchen aus Glas und polymere Kunstharzkügelclien, d. h. so_öe;uannie ^figlass beads'' und "polymeric resin beads". Als vortti"iliaf*,<ί IAn J,-^iitt el für derartige Kügeichen haben sich bei?]/·i ε I sv, e i ί ο Gelatine '^τ'κΐ ^olyvinyl-

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alkohol erwiesen, uas Bindemittel soll dabei nach Möglichkeit in geringen Mengen verwendet werden, so daß vermieden wird, daß ein wesentlicher Anteil des Porenvolumens, das durch die sphärischen Partikel erzeugt wird, gefüllt wird.

nine Ausbreitschicht, aufgebaut aus sphärischen Partikeln
gleichförmiger Größe kann Vorteile im Vergleich zu einer porösen Polymerschicht, wie beispielsweise einer sogenannten "Blush-Polymer-Schicht", aufweisen. Eine derartige Schicht vermag beispielsweise einen Bluttropfen außerordentlich rasch gleichförmig und reproduzierbar auszubreiten, und zwar derart rasch , daß das Ausbreiten oder Verteilen beendet ist, bevor eine in iptracht zu ziehende Diffusion von Blutkomponenten in benachbarte Schichten des mehrschichtigen Elementes erfolgen kann. Infolgedessen wird eine sehr gleichförmige Konzentration der Probenbestandteile in der Reagens-Schicht erreicht und infolgedessen eine gleichförmige Verfärbung, die die basis für die
Analyse bildet. Während Blutkörperchen gelegentlich zu einer Verstopfung von porösen Polymerschichten führen können, tritt eine solche Verstopfung nicht auf, wenn die Proben-Ausbreitschicht aus sphärischen Partikeln in einer Matrix eines Bindemittels besteht. Durch Verwendung von sphärischen Partikeln
gleichförmiger Größe werden somit besonders vorteilhafte Ergebnisse erhalten, da diese Partikel ein angemessenes oder
aasreichendes volumen von Poren erzeugen, während sie die
Zwischenräume auf einen relativ engen Bereich begrenzen. Dies führt zu einem Stillstand der Ausbreitung des Blutes, wenn die Zwischenräume des Bereiches, auf den die Probe aufgebracht
worden ist, vollständig gefüllt sind, wobei gleichzeitig eine rasche Drainage des Plasmas in die darunterliegende Schicht
ermöglicht wird, wenn der Ausbreitprozeß beendet worden ist. V.s 3iat sich gezeigt, daß sphärische Partikel einer Größe von etwa. 80 bis 120 likvon besonders vorteilhaft dann sind, wenn JLe Ausbreitschicht beieiner folutanalysc zur Ausbreitung von

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Bluttröpfchen dient. Ein auf eine solche Schicht aufgebrachter Bluttropfen breitet sich in wenigen Sekunden zu einer gleichförmigen kreisrunden Fläche aus, wobei die nach dem Ausbreiten bedeckte Fläche direkt proportional dem Probenvolumen ist.

In vorteilhafter Weise kann der Ausbreitschicht eines analytischen Elementes nach der Erfindung, z. B. zusätzlich zu den sphärischen Partikeln, noch eine geringe Menge einer oberflächenaktiven Verbindung zugesetzt werden, um den Ausbreitprozeß weiter zu beschleunigen.

Außer den beschriebenen Schichten kann ein analytisches Element nach der Erfindung noch weitere Schichten aufweisen. So ist es beispielsweise möglich, zusätzlich eine Dialyseschicht direkt über der Reagens-Schicht anzuordnen. Eine solche Schicht kann beispielsweise bei der Analyse des Glucosegehaltes des Blutes von Vorteil sein, da eine solche Schicht den Durchtritt von Glucose in die Reagens-Schicht ermöglicht, jedoch den Durchtritt von hochmolekularen Proteinen inhibiert, welche die Glucoseanalyse stören könnten. Zur Abtrennung von hochmolekularen Stoffen von nxedrxgmolekularen Stoffen eignen sich beispielsweise semipermeable Cellulosemembranen, die deshalb als Dialyseschichten geeignet sind. Derartige Schichten wirken dabei nach einem anderen Mechanismus als die porösen Polymerschichten, wie z. B. die "Blush-Polymer-Schichten", die hauptsächlich wie ein Sieb oder Gitter wirken, in welchem die Poren den Durchtritt von Lösungen und kleinen Partikeln ermöglichen, jedoch den Durchtritt von Partikeln eines größeren Durchmessers blockieren.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können zur Durchführung der verschiedensten chemischen Analysen verwendet v/erden, und zwar nicht nur auf dem Gebiete der klinischen

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Chemie, sondern vielmehr auch auf dem Gebiet der chemischen Forschung allgemein sowie in chemischen Laboratorien, die den Ablauf chemischer Prozesse überwachen. Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente eignen sich jedoch insbesondere für klinische Testversuche, und zwar für die Analyse von Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blut und Urin, da hier oftmals eine große Anzahl von Analysen durchgeführt werden muß, Analysen oftmals wiederholt werden müssen und die Analysenergebnisse oftmals in einer sehr kurzen Zeitspanne nach Entnahme der Probe zur Verfügung stehen müssen. Im Falle einer Blutanalyse läßt sich beispielsweise ein analytisches Element, z. B. in Form eines Bandes, derart ausgestalten, daß es für die quantitative Analyse von vielen Blutkomponenten, die routinemäßig ermittelt werden müssen,.verwendet werden kann. So kann beispielsweise ein analytisches Element nach der Erfindung, z. B. in Form eines Bandes, leicht zur Analyse solcher Blutkomponenten, wie Albumin, Bilirubin, Harnstoff-Stickstoff, Serumglutamin-Oxalessigsäure-Transaminase, Chlorid, Glucose, Harnsäure und alkalische Phosphatase verwendet werden, wie auch für andere Komponenten des Blutes, in^dem entsprechende Test-Reagenzien ausgewählt werden.

So kann beispielsweise bei der Blutanalyse mit einem analytischen Band nach der Erfindung zunächst die Abtrennung der Blutkörperchen vom Serum erfolgen, beispielsweise durch Abzentrifugieren, worauf das Serum auf das Band aufgebracht wird. Andererseits ist es jedoch nicht erforderlich, eine solche Abtrennung der Blutkörperchen durchzuführen, da das gesamte Blut direkt auf das analytische Band aufgebracht werden kann, wobei die Blutkörperchen durch die Filterschicht abfiltriert werden. Die Gegenwart dieser Blutkörperchen auf dem Band stört die spektrophotometrische Analyse nicht, wenn diese beispielsweise nach der spektrophotometTischen Reflexionsmethode durchgeführt wird, da der Schichtträger und die Reagens-Schicht für

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Licht durchlässig sind und das Licht von der porösen reflektierenden SChicht reflektiert wird. Ein besonderer Vorteil eines analytischen Bandes nach der Erfindung besteht somit darin, daß es sowohl zur Analyse von Serum als auch zur Analyse von Blut verwendet werden kann.

Zur Herstellung der analytischen Elemente nach der Erfindung können die verschiedensten Test-Reagenzien verwendet werden, je nachdem, welche Komponente oder welche Komponenten einer zu analysierenden Testprobe ermittelt werden sollen und je nach der durchzuführenden farbbildenden Reaktion.

Bei der Blutanalyse kann die Bestimmung von Glucose beispielsweise dadurch erfolgen, daß die Reagens-Schicht ein Ferricyanid oder eine Ferricyanidverbindung enthält und daß die Abnahme der gelben Farbe des Ferricyanides ermittelt wird, welche durch Umsetzung des Ferricyanides mit Glucose erfolgt. Da hochmolekulare Proteine des Blutes zu einer gewissen Reduktion des Ferricyanides führen können und somit die Bestimmungsmethode für Glucose stören können, kann zur Vermeidung von auftretenden Schwierigkeiten eine Dialyseschicht des bereits beschriebenen Aufbaues in dem Element oder Band angeordnet werden.

Bei der Analyse von Harnsäure im Blut kann die Reagens-Schicht beispielsweise aus einer Mischung von Kupfersulfat und Neocuproin, d. h. 2,9-Dimethyl-l,10-phenanthrolin der Formel:

CH.

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dispergiert in einem Bindemittel, aufgebaut sein. Die Harnsäure verursacht eine Reduktion des Kupfer(II) zu Kupfer(I), welches dann mit dem Neocuproin einen farbigen Komplex bildet, wobei die Farbdichte direkt proportional der Konzentration der Harnsäure ist.

Bei der Analyse des als Serum-Glutamin-Oxalessigsäure-Transaminase bekannten Enzyms kann beispielsweise eine Folge von Reaktionen durchgeführt werden. Das genannte System katalysiert die Umwandlung von Glutaminsäure in Oxalessigsäure bei einem pH-Wert von 7,4 und die Oxalessigsäure läßt sich durch eine Kupplungsreaktion mit dem Diazoniumsalz eines Farbstoffes, bekannt als "Fast Ponceau L" (Color Index No, CI. 37151), bestimmen. Um den Ablauf der ersten Reaktionsgleichung vor Ablauf der farbbildenden Kupplungsreaktion zu erleichtern, kann es vorteilhaft sein, die Reagenzien in zwei voneinander getrennten Schichten unterzubringen, um zu gewährleisten, daß für den Ablauf der ersten Reaktion eine ausreichende Zeitspanne zur Verfügung steht, bevor die zweite Reaktion ablaufen kann. So kann die Glutaminsäure in einer ersten Reagens-Schicht untergebracht werden, die über einer zweiten Reagens-Schicht angeordnet ist, welche das Salz von Fast Ponceau L enthält.

Eine typische automatische Analysevorrichtung, in der ein analytisches Band nach der Erfindung verwende.t werden kann, weist in typischer Weise Vorrichtungsteile zum Abwickeln oder Abspulen des Bandes von einer Vorratsrolle auf sowie Vorrichtungsteile, die das Band an einem Probenverteiler vorbeiführen, durch welchen ein Tropfen der zu analysierenden Probe, z. B. ein Blutoder Serumtropfen, auf die Oberfläche des Bandes aufgebracht wird, sowie Vorrichtungsteile, die das Band durch eine oder mehrere Entwicklungszonen führen, und schließlich Vorrichtungsteile, durch welche das Band mittels einer Aufnahmewalze aufgespult wird. In den erwähnten Entwicklungszonen wird das Band

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solchen Bedingungen unterworfen, die den Ablauf einer farbbildenden Reaktion zwischen einer Komponente der zu analysierenden Probe und einer Komponente der Reagens-Schicht erleichtern. Dies bedeutet, daß das Band einer Konditionierung unterworfen wird, beispielsweise einer Erhitzung oder der Einwirkung von Wasser oder einem anderen Lösungsmittel zur Beschleunigung oder Unterstützung des Ablaufes der erwünschten Reaktion.

Die analytischen Messungen erfolgen dann dadurch, daß das Band durch eine Zone geführt wird, in der spektrophotometrische Messungen durchgeführt werden können, beispielsweise im Falle der Anwendung einer Reflexionsspektrophotometrie eine Vorrichtung, mittels welcher ein Lichtstrahl durch den Schichtträger gerichtet wird, der dann zurück auf die anzeigenden Teile des Spektrophotometers reflektiert wird. Bei Anwendung von reflexionsspektrophotometrischen Meßmethoden wird eine optische Interferenz durch Rückstände, beispielsweise Blutkörperchen, welche auf oder in den Schichten des Bandes verblieben sind, vermieden.

Wie bereits dargelegt, können jedoch auch andere spektrophotometrische Meßmethoden angewandt werden, beispielsweise die riuoreszenz-Spektrophotometrie. Zur Erzeugung von Vergleichsstandards können Tropfen gesättigter Lösungen der zu analysierenden .Komponente benachbart zu dem Bezirk aufgebracht werden, auf den der Tropfen der zu analysierenden Probe aufgebracht wird, wodurch Differenz-Messungen ermöglicht werden.

Die erfindungsgemäßen analytischen Elemente können in verschiedener Größe hergestellt werden. Im Falle von Bändern besitzt ein typisches Band beispielsweise eine Breite von 16 mm, das beispielsweise auf eine Spule aufgespult und in einer Kassette eingeschlossen sein kann.

Die automatisierten analytischen Systeme können so konstruiert sein, daß in ihnen nur ein einziger Typ eines analytischen

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Bandes verwendet werden kann, und zwar im Falle von Systemen, in denen nur eine einzige Analyse durchgeführt werden soll, . und zwar bei einer großen Anzahl von zu analysierenden Proben, oder aber die Vorrichtung kann so konstruiert sein, daß in ihr die verschiedensten Bänder verwendet werden können, und zwar entweder gleichzeitig oder nacheinander, wobei jedes Band die Reagenzien enthält, die für die Analyse einer bestimmten Komponente der zu analysierenden Probe erforderlich sind. Ein einziges analytisches Band kann des weiteren zur Analyse von zwei oder mehreren Komponenten einer Probe verwendet werden, wenn es Test-Reagenzien für die Durchführung der Analyse jeder der beiden Komponenten enthält, wobei die.Test-Reagenzien in Mischung miteinander in einer Reagens-Schicht vorliegen können oder in zwei oder mehreren, voneinander getrennten Reagens-Schichten, solange nur die Reagenzien derart ausgewählt sind, daß sie die Reaktion des jeweils anderen Reagens nicht stören.

üie Reagens-Schicht kann gegebenenfalls auch in Form einer Mehrzahl oder Vielzahl paralleler, benachbarter Streifen verschiedener Zusanunensetzung vorliegen, wobei jeder Streifen ein oder mehrere Test-Reagenzien enthält, die für die Durchführung einer Analyse einer speziellen Komponente der Probe bestimmt sind.

Wie bereits dargelegt, braucht das analytische Element der Erfindung nicht die Form eines endlosen Bandes zu haben, sondern vielmehr können beispielsweise kleinere Abschnitte auf Karten, und zwar insbesondere Karten mit öffnungen, befestigt sein, wel-

en
ehe mittels besonderer Vorrichtung für derartige Karten durch eine Proben-Auftragszone, eine oder mehrere Konditionierzonen, z. B. Zonen, in denen eine Einwirkung von Wärme oder eines Lösungsmittel erfolgt, und eine Zone, in welcher spektrophotometrische Messungen erfolgen, geführt werden. In oder auf einer solchen Karte kann eine Vielzahl verschiedener analytischer Elemente nach der Erfindung befestigt sein, wobei jedes Element das zur Analyse einer bestimmten Komponente einer Probe

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erforderliche Reagens enthält, so daß eine solche Karte (aperture card) zur Durchführung einer Vielzahl von Testen verwendet werden kann.

In der Zeichnung sind verschiedene Ausführungsformen mehrschichtiger analytischer Elemente nach der Erfindung im Schnitt, vergrößert, dargestellt. Im einzelnen sind dargestellt in:

Fig. 1 ein analytisches Element, bestehend aus einem Schichtträger 10 mit einer darauf aufgetragenen Reagens-Schicht 12, einer reflektierenden Schicht 14, welche einen weißen Hintergrund für reflexions-spektrometrische Messungen durch den Schichtträger 10 liefert, eine Filterschicht 16 und eine Proben-Ausbreitschicht 18. Die Reagens-Schicht 12 kann beispielsweise aus einer Dispersion eines oder mehrerer Test-Reagenzien in einem Bindemittel, beispielsweise Gelatine, bestehen, während jede der Schichten 14, 16 und 18 aus einer sogenannten "Blush-Polymer-Schicht" bestehen kann mit einer Porengröße, die jeweils der Funktion der einzelnen Schicht angepaßt ist.

Fig. 2 ein analytisches Element, bestehend aus einem Schichtträger 20 mit einer Reagens-Schicht 22 und einer Schicht 24, welche die Funktion hat, die aufzubringende Probe auszubreiten und sie zu filtern, und welche des weiteren einen geeigneten Hintergrund für reflexions-spektrophotometrische Messungen durch den Schichtträger 20 ermöglicht. Die Schicht 24 kann beispielsweise aus einer "Blush-Polymer-Schicht" bestehen, die auf die Schicht 2 2 aufgetragen wurde, oder einer Schicht einer mikroporösen Filtermembran, welche auf die Schicht 22 auflaminiert worden ist.

!/ig. 3 ein Element aus einem Schichtträger 30, einer Reagens-Schicht 32, einer Dialyseschicht 34, die aus einer semiperineablen Membranschicht gebildet wurde, und einer Schicht 36, z. B.

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eine"Blush-Polymer-Schicht", welche die Funktion des Ausbreitens der zu analysierenden Probe und der Filtration der Probe ausübt und welche des weiteren einen geeigneten Hintergrund für reflexions-spektrophotometrische Messungen durch den Schichtträger liefert.

Fig. 4 ein analytisches Element, bestehend aus dem Schichtträger 40, einer ersten Reagens-Schicht 42, einer zweiten Reagensschicht 44, einer Schicht 46, die als Filterschicht und lichtreflektierende Schicht dient, und einer Proben-Ausbreitschicht 48. Die Schicht 46 kann beispielsweise aus einer Dispersion von Titandioxid in Celluloseacetat bestehen und die Schicht 48 kann beispielsweise aus einer Dispersion von Diatomeenerde in Celluloseacetat oder aus Glaskügelchen in Gelatine aufgebaut sein.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Auf einen 0,10 mm dicken Polyäthylenterephthalat-Filmschichtträger wurde eine Reagens-Schicht, bestehend aus einer Dispersion von Kupfersulfat und Neocuproin in Gelatine derart aufgetragen, daß auf eine Trägerfläche von 1 dm 0,84 mg Kupfersulfat, 1,28 mg Neocuproin und 53,9 mg Gelatine entfielen.

Auf die Reagens-Schicht wurde dann eine Schicht aus mikroporösem Filtermaterial einer Dicke von 180 Mikron und einer durchschnittlichen Porengröße von 1,2 Mikron auflaminiert. Das Filtermaterial bestand aus einer im Handel erhältlichen mikroporösen Celluloseacetatnitratmembran, die im Handel unter der Handelsbezeichnung Millipore MF Filter, Hersteller Millipore Corporation, USA, erhältlich ist. Die Membran wurdeauf die

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Reagens-Schicht dadurch auflaminiert, daß die Reagens-Schicht zunächst zum Zwecke der Erweichung mehrere Sekunden lang der Einwirkung von Dampf ausgesetzt wurde, worauf die Filterschicht auf die Reagens-Schicht aufgepreßt wurde, worauf die beiden Schichten zum Zwecke der Verbindung mittels einer Walze einem geringen Druck ausgesetzt wurden.

Ein in dieser Weise hergestelltes analytisches Band eignet sich beispielsweise für|die Bestimmung von Harnsäure im Blut, wobei das Vorhandensein von Harnsäure durch die Erzeugung eines rosaroten Farbtones in der Reagens-Schicht angezeigt wird.

Beispiel 2

Ls wurde ein analytisches Band für die Bestimmung von Harnsäure im Blut in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß als Bindemittel für die Reagens-Schicht anstelle von Gelatine Polyvinylalkohol verwendet wurde. Der Polyvinylalkohol wurde dabei in einer Konzentration von 4 3,1 mg/dm verwendet.

Beispiel 3

Es wurde ein analytisches Band für die Bestimmung von Chlorid im Blut in der in Beispiel 1 beschriebenen WEise hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß die Reagens-Schicht aus einer Gelatineschicht bestand, in welcher Silberchromat dispergiert war. Dabei entfielen auf eine Trägerfläche von 1 dm 53,9 mg Gelatine und 18,0 mg Silber. Das Vorhandensein von Chlorid in einer zu analysierenden Probe wird in diesem FaTLe angezeigt durch Veränderung des Farbtones der Reagens-Schicht von rötlich-braun nach gelb.

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ORIGINAL INSPECTED

Beispiel 4

Ls wurde nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ein analytisches Band für die Bestimmung von Albumin im Blut hergestellt, wobei diesmal eine Reagens-Schicht erzeugt wurde, die bestand aus 4,66 mg Ilydroxyphenyiazobenzoesäure, dispergiert in 21,0 mg eines Copolymere!! aus Acrylsäure und 2-Acetoacetoxy-

2 äthylmethacrylat, jeweils bezogen auf eine Fläche von 1 dm . Das Vorhandensein von Albumin in einer zu analysierenden Probe ergibt sich durch die Ausbildung eines rosa-orangen Farbtones in der Reagens-Schicht.

Beispiel 5

Auf einen 0,10 mm dicken Polyäthylenterephthalat-Filmschichtträger wurde eine Reagens-Schicht aus 3,15 mg Glucoseoxidase, 3,95 mg Peroxidase, 4,42 mg o-Dianisidinhydrochlorid und 215 mg Gelatine, jeweils pro 1 dm Trägerfläche, aufgetragen. Baraufhin wurde eine Aufschlämmung durch Vermischen von 12,0 g TiO₂ und 50 ml einer 3 gew.-ligen Lösung von Celluloseacetat in Aceton und Verdünnen durch Zusatz von SO ml einer Mischung aus gleichen Volumenteilen von Aceton und Xylol hergestellt. Die Aufschlämmung wurde dann auf die Reagens-Schicht in einer Schichtstärke entsprechend 300 mg TiO₇ und 37,2 mg Celluloseacetat, jeweils pro dm , aufgetragen, wodurch eine Schicht erhalten wurde, die sowohl als Filterschicht wie auch als lichtreflektierende Schicht wirkte. Daraufhin wurde auf diese Schicht eine Ausbreitschicht aufgetragen, und zwar aus einer Aufschlämmung von Diatomeenerde, Salicylsäure und Celluloseacetat in einer Mischung von 1,2 Volumenteilen Dichloräthan und 1 Volumenteil Aceton.

Ls wurden drei verschiedene analytische Bänder hergestellt unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Diatomeenerde in der Ausbreitschicht, v;obei jedes hergestellte Band

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auf seine Fähigkeit, Blut auszubreiten, untersucht wurde, wobei auf jedes Band eine 10 Mikroliter Probe Blut aufgetragen wurde. Ermittelt wurde die Zeit, die das Blut benötigte, um vollständig in das Band zu diffundieren. Des weiteren wurde der Durchmesser des erzeugten Fleckens ermittelt, und zwar durch den Schichtträger hindurch. Ls wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Ver- Diatomeen- Salicyl- Cellulose- Diffusions- Flecken(Spot)-such erde ₇ säure ₇ acetat₇ zeit in Durchmesser Kr. (mg/dm ) (mg/dm ) (mg/dm") Sekunden in cm

1 300 3,00 37,2 26 1,05

2 375 3,75 37,2 41 1,00

3 450 4,50 37,2 31 - 1,00

Die in diesem Beispiel beschriebenen analytischen Bänder eignen sich für die Bestimmung des Glucosegehaltes des Blutes, wobei das Vorhandensein von Glucose durch die Bildung eines braunen Farbtons in der Reagens-Schicht angezeigt wird.

Beispiel 6

Auf einen 0,10 mm dicken Polyethylenterephthalat-!ilmschicntträger wurde eine Reagens-Schicht der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung aufgetragen, worauf auf die Reagens-Schicht eine mikroporöse Filterschicht des in Beispiel 1 beschriebenen Typs auflaminiert i\^rurde. Die mikroporöse Filterschicht diente als Filterschicht und als Schicht, die für die Durchführung reflexions-spektrophotometrischer Messungen einen geeigneten Hintergrund lieferte. Auf die Filterschicht wurde dann eine Ausbreitschicht aufgetragen, wozu Glaskügelchen eines Durchmessers von 0,08 bis 0,012 mm in einem Verhältnis von 1 g Kügelchen zu 0,5 ml einer Lösung enthaltend 2,5 Gew.-'i Gelatine und 0,01 Gew.-Ό einer oberflächenaktiven Verbindung, und

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zwar para-Isononylphenoxypolyglycidol mit 10 Clycidoleinheiten, verwischt Wurden, worauf die erhaltene Aufschlämmung in Form einer dünnen Schicht auf die mikroporöse Filterschicht aufgetragen wurde, und zwar derart, daß 1 g Kügelchen auf eine Fläche von 27 cm" entfielen.

Auf das erhaltene analytische Element wurden dann 1Ü Mikroliter Blut aufgetragen, wobei sich ergab, daß diese 10 Mikroliter blut in weniger als 1 Sekunde ausgebreitet wurden, und zwar zu einer kreisrunden Fläche von ungefähr 1 cm Durchmesser.

Beispiel 7

Auf einen 0,18 mm dicken Polyäthylenterephthalat-Filmschichttrager wurde zunächst eine Reagens-Schicht aus 2,15 mg Glucoseoxidase, 1,07 mg Peroxidase, 3,20 mg o-Dianisidinhydrochlorid und 215 mg Gelatine,jeweils pro dm Schichtträgerfläche, aufgetragen. Auf die Reagens-Schicht wurde dann eine mikroporöse i-'il termembran, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf laminiert.

Bestimmt wurde die Einwirkung der Größe der zu analysierenden Probe auf die Fläche und die Reflexionsdichte des farbigen Fleckends, der in der Reagens-Schicht erzeugt wurde, durch Einwirkung verschieden großer Proben einer Glucoselösung, die pro 100 ml destilliertes Wasser 100 mg Glucose enthielt.

Die Ablesung der Reflexionsdichten erfolgte 5 Minuten nach Auftragen der Proben auf das analytische Band. Es wurden die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Ergebnisse erhalten.

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ORiGfNAL INSPECTED

	2332760
Flecken(Spot)- Bezirk (mm²)	Reflexions dichte
30	0,66
50	0,71
63	0,70
86	0,65
92	0,70

Probenmenge
in Mikroliter

10
12
15

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß die Reflexionsdichtewerte praktisch unabhängig von der Größe des aufgetragenen Tropfens waren. Die erhaltenen Ergebnissen zeigen demzufolge, daß ein analytisches Element nach der Erfindung eine quantitative Analyse einer Komponente einer zu analysierenden Probe ermöglicht, ohne daß dabei die Notwendigkeit besteht, daß eine genau bestimmte Menge einer Probe auf das Element aufgebracht wird.

Beispiel" 8

Es wurden die folgenden Lösungen hergestellt:

(a) eine Lösung aus 3,23 g einer bei niedriger Temperatur festwerdenden Agarose (Polysaccharid) in 70 ml einer 0,3 molaren 2-Anrino-2-hydroxymethyl-l, 3-propandiol-P.ufferlösung;

(b) eine Lösung aus 108 internationalen Einheiten von Glycerindihydrogenase, 108 mg menschlichen Serumalbumins, 108 mg Resazurin und 54 mg Diaphorase;

(c) eine Lösung aus 54 mg Nicotamidadenindinucleotid in 10 ml einer 0,3 molaren 2-Amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol-Pufferlösung.

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Die beschriebenen Lösungen wurden miteinander vermischt und danach auf einen 0,254 mm dicken Cellulosetriacetat-Filmschicht trä
de.

2 träger derart aufgetragen, daß eine Fläche von 1 m bedeckt wur-

Die erhaltene Reagens-Schicht wurde dann mit einer Ausbreitschicht des in Beispiel 1 beschriebenen Typs beschichtet.

Auf die Überfläche des Elementes wurden Tropfen einer wäßrigen Glycerinlösung mit verschiedenen Mengen von 50 bis etwa 500 mg Glycerin pro Deziliter aufgetragen. Nach dem Auftrocknen wurden die erzeugten fluoreszierenden Bezirke mittels eines Fluoreszenz-Spektrophotometers ermittelt, wobei sich erwies, daß die erzeugte Fluoreszenz proportional zur Konzentration des in der aufgebrachten Probelösung vorhandenen Glycerins war. tine Erregung der fluoreszierenden Bezirke erfolgte mit einer Strahlung einer Wellenlänge von 540 nm, wobei eine Fluoreszenz bei 590 mn auftrat.

Beispiel 9

Zunächst wurden die folgenden Lösungen hergestellt:

(a) eine Lösung aus 107,6 internationalen Einheiten von Glycerindihydrogenase und 107,6 mg menschlichen Serumalbumins, gelöst in 20 ml einer 0,3 molaren Glycin-PufferlÖsung eines pH-Wertes von 9,6;

(b) eine Lösung aus 2,150 g einer bei niedriger Temperatur festwerdenden Agarose (Polysaccharid) in 70 ml einer 0,3 molaren Glycin-Pufferlösung eines pH-Wertes von 9,6;

(c) 504 mg Nicotamidadenindinucleotid in 10,7 ml einer 0,3 molaren Glycin-Pufferlösung eines pH-Wertes von 9,6.

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in 2 ⁷6o

Die Lösungen (a), (b) und (c) wurden bei 4O°C miteinander vermischt und derart auf einen Cellulosetriacetat-Schichtträger

aufgetragen, daß eine Schichtfläche von 1 m bedeckt wurde. Diese Reagens-Schicht wurde dann mit einer Ausbreitschicht wie in Beispiel 1 beschrieben beschichtet.

Auf die Oberfläche des erhaltenen Elementes wurden dann verschiedene Mengen einer wäßrigen Lösung von Glycerin mit 50 mg Glycerin pro Deziliter Wasser aufgetragen. Nach dem Auftrocknen der aufgetragenen Proben innerhalb von 40 Minuten bei Raumtemperatur wurde das in der Reagens-Schicht erzeugte Reaktionsprodukt durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 350 nni angeregt, wobei eine Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 44 5 nut
auftrat. Die Stärke der bei 445 nm erzeugten Fluoreszenz, die
mit einem üblichen Fluoreszenz-Spektrophotometer gemessen wurde, erwies sich als proportional zur Konzentration des Glycerins in der Testprobe.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

] 1·) Mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative spektrophotometrisch'e Analyse einer Flüssigkeit, gekennzeichnet durch 1. einen für Flüssigkeiten impermeablen, lichtdurchlässigen Schichtträger, 2. mindestens einer auf einer Seite des Schichtträgers angeordneten Reagens-Schicht mit einem Reagens, das durch Reaktion mit einem Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit eine Farbveränderung innerhalb der Reagens-Schicht bewirkt, und 3. einer auf der dem Schicht* träger abgewandten Seite der Reagens-Schicht angeordneten porösen Schicht oder einem porösen Schichtverband, die bzw. der für den die farbbildende Reaktion mit dem Reagens eingehenden Bestandteil der zu analysierenden Flüssigkeit durchlässig ist und die bzw. der die aufgebrachte Flüssigkeit derart lateral ausbreitet, daß ein konstantes Volumen Flüssigkeit pro Flächeneinheit erhalten wird und auf die Reagens-Schicht gelangt.

2. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht oder mindestens eine Schicht des porösen Schichtenverbandes aus einer Polymerschicht besteht, die erzeugt wurde durch Lösen eines Polymeren in einem Gemisch zweier Flüssigkeiten, von denen die eine ein gutes Lösungsmittel für das Polymer und die andere ein Nichtlösungsmittel oder zumindest ein schlechtes Lösungsmittel für das Polymer ist und den höheren Siedepunkt besitzt, Auftragen der Lösung auf die Reagens-Schicht oder eine darüber befindliche Schicht und Auftrocknen der Schicht unter Verdunstung der Lösungsmittel.

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3. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht oder mindestens eine Schicht des porösen Schichtenverbandes einen reflektierenden Hintergrund für spektrophotometrische Messungen bildet.

4. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen J. bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die Form eines endlosen Bandes besitzt.

5. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagens-Schicht aus einer dispersion mindestens eines Test-Kcagenses in einem hydrophilen Kolloid besteht.

6. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagens-Schicht aus einer Dispersion mindestens eines Test-Reagenses in Gelatine besteht.

7. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen jjbis S, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagens-Schicht aus der Dispersion mindestens eines Test-Reagenses in Polyvinylalkohol besteht.

8. Mehrschichtiges analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Schichttr-äger aus Celluloseacetat oder Polyäthylenterephthalat besteht.

C. Mehrschichtiges analytisches Element nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mehrzahl von porösen Schichten aufweist, die erzeugt wurden durch Lösen eines Polymeren in einem Gemisch zweier Flüssigkeiten, von denen die. eine ein gutes Lösungsmittel für das Polymer und die andere ein iNiciitlüsungsniittel oder zumindest ein schlechteres Lösungsmittel für das Polymer ist und den höheren Siedepunkt besitzt, Auftragen

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der Lösung auf die Reagens-Schicht oder eine darüber befindliche Schicht und Auftrocknen der Schicht unter Verdunstung des Lösungsmittels, wobei gilt, daß die einzelnen porösen. Schichten des erzeugten porösen Schichtenverbandes eine voneinander unterschiedliche Porosität aufweisen.

10. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine Filter- und reflektierende Schicht, bestehend aus der Dispersion von Titandioxid in einem Bindemittel, ist oder daß im Falle eines porösen Schichtenverbandes dieser Verband mindestens eine derartige Schicht aufweist.

11. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine Filter- und reflektierende Schicht, bestehend aus einer Dispersion aus Bariumsulfat in einem Bindemittel, ist oder daß im Falle eines porösen Schichtenverbandes dieser mindestens eine solche Schicht aufweist.

12. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine Ausbreitschicht, bestehend aus in einem Bindemittel dispergierter Diatomeenerde, ist oder daß im Falle eines porösen Schichtenverbandes dieser mindestens eine solche Schicht enthält.

13. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine Ausbreitschicht ist, aufgebaut aus einer Dispersion inerter sphärischer Partikel gleichförmiger Größe in einem Bindemittel, oder im Falle eines porösen Schichtenverbandes mindestens eine solche Schicht enthält.

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14. Mehrschichtiges analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht eine Ausbreitschicht ist, aufgebaut aus einer Dispersion von Claskügelchen gleichförmiger Größe in einem Bindemittel, oder daß im Falle eines porösen Schichtenverbandes dieser mindestens eine solche Schicht enthält.

15. Mehrschichtiges analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es benachbart zur Reagens-Schicht eine Dialyseschicht aufweist.

16. Mehrschichtiges analytisches Element nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht aus einer Celluloseacetatschicht besteht oder daß im Falle eines porösen Schichtenverbandes dieser mindestens eine Celluloseacetatschicht aufweist.

17. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mehrzahl von einander benachbarten Reagens-Schichten aufweist.

18. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 17", dadurch gekennzeichnet, daß die Reagens-Schicht Glucoseoxidase, Peroxidase und o-Dianisidinhydrochlorid enthält.

19. Mehrschichtiges analytisches Element nach Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagens-Schicht Kupfersulfat und Neocuproin enthält.

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