DE2329174C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Blutammoniak - Google Patents

Description

hierbei die im angegebenen Beieich wirksamen Puffer wie Phosphatpuffer, bevorzugt Tris-Puffer [Tris-(hydroxymethyl>aminomethan] und Triäthanolaminpuffer in Frage.

Die Konzentration der Reaktionsteilnehmer kann im gleichen Bereich liegen wie bei den bekannten Verfahren. Die Konzentration des a-Ketoglutarats im Reaktionsansatz liegt zweckmäßig zwischen etwa S und etwa 20 mM, die Glutamatdehydrogenase wird zweckmäßig in einer Menge zwischen 1 und 20 U/ml Reaktionsansatz zugesetzt Auch die Pufferkonzentration kann in relativ weiten Bereichen schwanken und liegt günstig zwischen etwa 0,0S und 0,25 M. In der bevorzugten Ausführungsfonn mit Zusatz von ADP wird letztere Substanz zweckmäßig in solcher Menge zagesetzt, daß sich eine Konzentration zwischen etwa 0,1 und 2 mM ergibt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann, wie bereits erwähnt, im Plasma durchgeführt werden, d.h. in dem von Erythrozyten bereits befreiten Blut Die Durchführung des Verfahrens erfolgt so, daß der «-Ketoglutarat-haltigen Pufferlösung NADPH und gegebenenfalls ADP zugesetzt wird, dann das Plasma zugemischt wird, der VJangswert der Extinktion gemessen, das Enzym zugesetzt und nach 5 bis 10 Minuten die Extinktionsänderung bestimmt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur einfach und rasch durchführbar, es zeichnet sich auch durch große Genauigkeit aus. So wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt, bei denen 29 Plasmaproben mit Ammoniumchlorid auf eine Endkonzentration von 160,OuM versetzt wurden. Die Bestimmung ergab im Durchschnitt 160,8 μΜ, entsprechend einer Wiederfindung von 100,5*/·.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßcn Verfahrens wird zweckmäßig eine geeignete Reagenzienkombination verwendet. Eine derartige Reagenzienkombination enthält

1. Λ-Ketoglutarat in Puffer pH 7 bis 9,5,

2. Glutamatdehydrogenase und

3. NADPH

nebeneinander in vor Gebrauch unvermischtem Zu* stand. Die Bestandteile 1 und 3 können auch gemischt vorliegen, die Haltbarkeit unter Kühlung beträgt dann jedoch nur etwa 3 bis 4 Wochen.
Bevorzugt besteht die Reagenzienkombination aus

1. 0,05 bis 0,25 M Triäthanolaminpuffer,
pH 8 bis 9,

15 bis 5OmM Λ-Ketoglutarat,

0,3 bis 5 mM ADP und gegebenenfalls

2 bis 30 mM Alkaliazid,

2. 5 bis 50 U Glutamatdehydrogenase, und

3. 0,1 bis 1 μΜο! NADPH, vorzugsweise in Gegenwart eines Stabilisators oder Stabilisierungsgemisches.

Ein geeigneter Stabilisator für NADPH besteht aus Serumalbuimiö allein oder in Kombination mit Natfiumbicarbonat und Dextran. Besonders bevorzugt besteht daher Bestandteil 3 der obigen Kombination aus 04 bis 0,5 μΜοί NADPH, 10 bis SO mg Serumalbumin, 1 bis 5μΜο1 NaHCO, und S bis 60 mg Dextran. Das vorstehend angegebene Reagens ist in den angegebenen Mengen für eine Einzelbestimmung eingestellt. Es kann auch aus einem Vielfachen davon zur Vornahme zahlreicher Bestimmungen bestehen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nichi nur zur direkten Bestimmung von Ammoniak im Blut bzw. Plasma, sondern auch zur Bestimmung ammoniakbildender anderer Substanzen, wie z. B. S Harnstoff. Im letzteren Fall wird dem Reaktionsansatz bzw. Reagens lediglich noch Urease zugesetzt bzw. eine Mischung von Glutamatdehydrogenase und Urease verwendet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ίο weiter.

Beispiel 1 Es wird ein Reaktionsgemisch verwendet, enthaltend

0,15 M Triäthanolaminhydrochlorid pH 8,6, 20 mM a-Ketoglutarat,
1,5 mM ADP,
15 mM Natriumazid,
0,3 mM NADPH.
so

In zwei Küvetten mit einer Dicke von 10 mm werden eindosiert:

as	Proben ansatz	Reagenzien- leerweit- ansatz
Reaktionsgemisch, ml 30 Plasma, ml H1O, ml	1,5 0,5	1„5 0,5

Es wird gemischt und die Ausgangsextinktion E₁ bei 334 mn gemessen. Dann werden beiden Ansätzen je 20 μΐ Glutamatdehydrogenase zugesetzt. Der Extinktionsabfall wird bis zum Stillstand (etwa 5 Minuten) verfolgt, dann die Extinktion E₁ gemessen. Aus Probenansatz und Reagenzienleerwertansatz wird die Extinktionsdifferenz ΔΕ = E_x- JE₁ ausgerechnet. Die korrigierte Extinktionsdifferenz

Δ ^korrigiert — Δ JSprobenaneatx — Δ J?Beacenzlenleerwert geht in die Berechnung ein:

/iMol ΝΗ,/1 = Δ E_k0„ ■ = Δ £_korr · 673

6,0

(eau von NADPH = 6,0 αη*/μΜο1, Verdünnung der Probe im Bestimmungsansatz 4,04fach; Umrechnung !(o auf 1.)

Beispiel 2 Reagenzienkombination für eine Bestimmung J)S 1, Ein Behälter mit Puffer-Substrat-Gemisch in

stabilisierter wäßriger Lösung, enthaltend 0,15 M Triäthanolamindehydrochlorid, pH 8,6, 20 mM a-Ketoglutarat,

1,5 mM ADP,
15 mM Natriumazid.

2. Ein Behälter mit 0,3 μΜοί eingetrocknetem oder lyophilisiertem NADPH

5 μΜοί NaHCO,,

30 mg Albumin.
3. 900 U/ml Glutamatdehydrogenase, gelöst in GIycerin/Wasser 1:1, enthaltend 5 mM Phosphatpuffer pH 7 und 1 mM ADP.

Claims (4)

werden, welches sich für die Anwendung im Routine- Patentnnsprüche: laboratorium eignet und auch mit größeren Proben zahlen durchführbar ist

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß davon Blutammoniak mit Glutamatdehydrogenase S durch, daß bei dem Verfahren der eingangs genannten und Λ-Ketoglutarat in Gegenwart eines Wasser- Art NADPH (Nicotinamid-adenin-dinueleotidphosstoff übertragenden Coenzyms in reduziertem phat in reduzierter Form) als Coenzym verwendet Zustand,dadurch gekennzeichnet,daß wird

NADPH als Coenzym verwendet wird. Die praktische Unbrauchbarkeit von NADH ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- io darauf zurückzuführen, daß im Plasma zahlreiche zeichnet, daß in Gegenwart von ADP gearbeitet Enzyme und Substrate enthalten sind, die ebenfalls wird. zur Reaktion mit NADH befähigt sind und daher

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch zu Nebenreaktionen Anlaß geben, die das Ergebnis gekennzeichnet, daß in einem Puffer von pH 7,0 verfälschen. Es war zu erwarten, daß bei NADPH bis 9,5, vorzugsweise von pH 8,5 bis 8,7, gear- 15 die gleichen Schwierigkeiten vorliegen, da diese Subbeitet wird. stanz das natürliche Coenzym zahlreicher im Plasma

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden vorhandener Enzyme darstellt Hinzu kommt, daß Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Tris- nach den Angaben von E.Schmidt (Methoden Puffer oder Triäthanolaminpuffer verwendet wird. der enzymatischen Analyse [H. U. Bergmeyer, Hrsgb]

ao Bd. 1, S. 607, 2. Aufig., Verlag Chemie, Weinheim [1970]) Glutamatdehydrogenase mit NADH weit

schneller reagiert, so daß angesichts der hierbei

schon auftretenden unerwünscht langsamen Reaktion NADPH schon aus diesem Grunde nicht brauchbar

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quanti- »5 erschien. Überraschenderweise hat sich jedoch ge-

lativen Bestimmung von Blutammoniak mit Glut- zeigt, daß die Bestimmung unter geeigneten Reak-

»niatdehydrogenase und A-Ketoglutarat in Gegen- tionsbedingungen in Gegenwart von NADPH mit

Wart eines Wasserstoff übertragenden Coenzyms in sehr großer Schnelligkeit abläuft und andererseits

reduziertem Zustand, dadurch gekennzeichnet, daß die Nebenreaktionen des NADPH so gering sind,

NApPH als Coenzym verwendet wird. 30 daß nur minimale unspezifische Extinktionsände-

Die Blutammoniakbestimmung ist ein wichtiger rungen auftreten, die praktisch nicht berücksichtigt

bestandteil der Laboratoriumsdiagnostik, insbeson- werden müssen.

Äere bei Leberkrankheiten. Am dringendsten wird So ist es bei dem bekannten Verfahren unter Verliese Bestimmung bei der Diiferentialdiagnose un- wendung von NADH erforderlich, eine 15- bis klarer komatöser Zustände und zur Verlaufbeobach- 35 20minütige Vorinkubation durchzuführen. Aber auch tung bei Leberausfallkoma benötigt. Es v,\irde daher nach Ablauf dieser Vorinkubationszeit sind die unbereits eine Reihe von Verfahren entwickelt, um spezifischen Nebenreaktionen noch nicht zum Stilldiesem Bedarf entsprechen zu können. So ist es stand gekommen und überlagern die eigentliche Bebekannt, die Bestimmung mittels der Berthelot-Re- Stimmungsreaktion, wenn nach 20 Minuten die Glut-Aktion mit eiweißfreiem Blutextrakt durchzuführen 40 amatdehydrogenase dem Bestimmungsansatz zuge- oder im Trichloressigsäureextrakt den Ammoniak setzt wird. Beim erfindungsgemäßen Verfahren hincnzymatisch zu bestimmen. Diese Methoden haben gegen ist jede Vorinkubation unnötig, und ein staden Nachteil, daß sie sehr erhebliche Fehiermöglich- biler Endwert ist bereits nach 5 Minuten erreicht, keiten umfassen, die vor allem darin begründet sind, Hierbei ist zu berücksichtigen, dal) im normalen daß eine Enteiweißung mit starker Säure erforderlich 45 Plasma die vorkommenden NH_S-Konzentrationen so ist, bei der eine Ammoniakneubildung auftreten niedrig sind, daß eine relativ sehr große Menge von kann und der neugebildete Ammoniak die Werte etwa 0,5 ml eingesetzt werden muß, um eine für eine verfälscht. M ο η d ζ a c et al. haben in J. Lab. CHn. genaue Bestimmung ausreichende Extinktionsände-Med., 66, 526 1(965), ein Verfahren beschrieben, rung im optischen Test zu erhalten. Da keine Entweiches sich ohne Enteiweißung durchführen lassen 5° eiweißung oder Denaturierung des Eiweißes erfolgt, soll und auf der Umsetzung mit Glutamatdehydro* liegt also eine sehr große Menge an Enzymen und genäse und Ketoglutarat in Gegenwart von NADH Substraten vor, bei denen eine Nebenreaktion mit (Nicotinamidadenin-dinucleotid in reduzierter Form) NADPH erwartet werden mußte,
bei pH 7,4 beruht. Gemessen wird photometrisch Als besonders günstig erwies sich die Durchführung die Extinktionsänderung bei 340 ιημ. Infolge der SS des Verfahrens der Erfindung in Gegenwart von Trägheit des NH₈-Umsatzes und auftretender un- ADP (Adenosindiphosphat). Es wurde gefunden, daß spezifischer Extinktionsändemngen ist hierbei jedoch sich hierdurch, eine Stabilisierung und Aktivierung eine eindeutige Erkennung des Endpunktes im op- der Glutamatdehydrogenase erzielen läßt, welche tischen Test sehr schwierig und beinhaltet erhebliche einen besonders raschen Ablauf der Bestimmung erFehlerquellen. Man hielt deshalb die Enteiweißung bei 60 möglicht.

der enzymatischen Blutammoniakbestimmung bisher Das Verfahren der Erfindung wird bei neutralem

für unvermeidlich (Manoukian und Fawaz, bis schwachalkalischem pH-Wert durchgeführt, da

Z. klin. Chem. u. klin. Biochem., 7, 32 [1969]). hierbei die Aktivität der Glutamatdehydrogenase die

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine rasch und günstigsten Werte aufweist. Ein geeigneter Bereich sicher durchführbare Blutammoniakbestimmung zu 65 liegt zwischen pH 7 und 9,5. Vorzugsweise wird in schaffen, die ohne großen Aufwand im nicht entei- stärker alkalischem Bereich gearbeitet, als dies bei weißten Plasma durchgeführt werden kann. Insbe- den bekannten Verfahren üblich ist, besonders besondere soll ein derartiges Verfahren geschaffen vorzugt zwischen pH 8,5 und 8,7. Als Puffer kommen