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DE2322115B2 - Tripeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Peptid-Peptidohydrolasen - Google Patents

Tripeptide und deren Verwendung zur Bestimmung von Peptid-Peptidohydrolasen

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DE2322115B2
DE2322115B2 DE2322115A DE2322115A DE2322115B2 DE 2322115 B2 DE2322115 B2 DE 2322115B2 DE 2322115 A DE2322115 A DE 2322115A DE 2322115 A DE2322115 A DE 2322115A DE 2322115 B2 DE2322115 B2 DE 2322115B2
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leu
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pna
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Withdrawn
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DE2322115A
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Karl Goeran Claeson
Birgitta Gunilla Karlsson
Lars-Gundro Moelndal Svendsen
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KABI STOCKHOLM AB
Original Assignee
KABI STOCKHOLM AB
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Publication date
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Publication of DE2322115B2 publication Critical patent/DE2322115B2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

in der bedeuten:
I".
R1 Wasserstoff oder Benzoyl,
R2 Wasserstoff oder Cyclohexyl,
R3 und R4 i-Propyl.i-Butylodersekundär-Butyl,
π = 3 in Verbindung mit R5 = Amidino j»
oder
η —4 in Verbindung mit R5 = Wasserstoff
und
R6 eine chromophore bzw. fluoreszierende
Nitrophenyl-, Methylnitrophenyl-, Dini- y, trophenyl-, Naphthyl- oder Nitronaph-
thylgruppe, sowie deren Additionssalze :nit Säuren,
wobei die Aminosäurereste L-Konfigura-
tion aufweisen.
2. N-Benzoyl-N-cyclohexyl-(beta-Ala)-Val-Arg-p-riitröäniiiu.
3. Verwendung der Tripeptide nach Anspruch 1 oder 2 zur Bestimmung von Peptid-Peptidohydrolasen.
Die Erfindung betrifft Tripeptide der im Hauptanspruch angegebenen allgemeinen Formel und den dort angegebenen Bedeutungen. Die Erfindung betrifft weiterhin N-Benzoyl-N-cyclohexylHbeta-AlaJ-Val-Arg-p-nitroanilid sowie die Verwendung der vorgenannten Tripeptide zur Bestimmung von Peptid-Peptidohydrolasen.
Die Peptide der Erfindung weisen eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Trypsin und anderen proteolytischen Enzymen vom Typ der Peptid-Peptidohydrolasen auf. Sie können zur quantitativen Bestimmung von klassifizierten und bisher nicht klassifizierten Enzymen vom Typ E.C.3.4.4, insbesondere von solchen Enzymen, die Peptide oder Proteine in der Peptidkette an der Carboxylseite von Arginin oder Lysin abbauen, z. B. Trypsin, Thrombin, Plasmin und die unter den nachstehenden Handelsnamen bekannten Enzyme Reptilase® (Pentapharm, Basel), Arvine® (Ferring AB, Malmö) und das bisher nicht klassifizierte Enzym Brinase®(AB Astra, Södertälje). Sie können weiterhin /ur Untersuchung von Reaktionen verwendet werden, bei denen derartige Enzyme gebildet, inhibiert oder verbraucht werden, ebenso für die Bestimmung von Faktoren, die derartige Reaktionen beeinflussen oder daran teilnehmen, beispielsweise für die Bestimmung von Proenzymen, Aktivatoren, Antienzymen und F.nzyminhibitoren.
Die von der International Union of Biochemistry Hlsevier, Amsterdam, 1956, empfohlene Enzymnomenklatur wurde bei der Klassifizierung der Enzyme angewendet.
Verbindungen, die bisher zur quantitativen Bestimmung der obengenannten Enzyme verwendet worden sind, sind in »Methoden der enzymatischen Analyse«, Vol. I, Seite 1023 (Herausgeber Bergmeyer, U.U., Verlag Chemie, 1970), beschrieben worden. In Abhängigkeit von der jeweils stattfindenden katalytischen Reaktion des proteolylischen Enzyms — die esterolytische oder die amidolylische Reaktion — können diese Verbindungen prinzipiell in zwei Hauptgruppen unterteilt werden; Estersubstrate und Amidsubstrate. Die größte Gruppe der bisher verwendeten synthetischen Verbindungen ist diejenige der Estersubstrate. Dies liegt in dem Umstand begründet, daß diese wesentlich schneller durch die Peptid-Peptidohydrolasen umgewandelt werden als die bisher hergestellten Amidsubstrate. Die wesen Midiste biologische Wirkungsweise der als Peptid-Pept johydrolasen klassifizierten Enzyme besteht, wie sich aus dem Namen ergibt, aus der Hydrolyse von Peptid- oder Amidverbindungen natürlicher Substrate, nicht jedoch von Esterbildungen. In der Literatur (Blood Clotting Enzymology, Seiten 36 und 42 bis 44, Herausgeber Seegers, W. H., Academic Press, 1967) ist berichtet worden, daß das Verhältnis zwischen den Reaktionsgeschwindigkeiten der esterolytischen und der amidolytischen Katalysen des Thrombins unter verschiedenen Reaktionsbedingungen nicht konstant ist. Aus diesem Grund besteht ein Bedürfnis für synthetische Peptide, die bezüglich der genannten Enzyme eine wesentlich größere Empfindlichkeit aufweisen und die auch schneller zu meßbaren Produkten als die bisher bekannten abgebaut werden können.
Zur Untersuchung und Verfolgung des Reaktionsverlaufes der enzymatischen Hydrolyse sind die Tripeptide der Erfindung besonders geeignet, da sie folgendes ergeben:
a) Chromophore Produkte, die leicht spektrophoiometrisch gemessen werden können und Lichtabsorptionsmaxima aufweisen, die nicht mit denjenigen der ursprünglichen Amidsubstrate zusammenfallen;
b) fluoreszierende Produkte, die mittels Fluoreszenzspeklropholomclrie gemessen werden können.
Einige synthetische Amide mit hydrolysierbaren chromophoren Gruppen sind z. B. aus CA. 75, 578 (1971), bekannt. Diese stellen im wesentlichen N-unsubslituierte und N-substituierte Monoaminosäure-p-ni-
troanilidderivate sowie Monoaminosäure-/?-naphthyI-amidderivate dar. Von diesen Substanzen kann N-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilid-Hydrochlorid (BAPNA) als Reagenz für Trypsin (EC 3.4.4.) sowie für Reaktionen, in denen Trypsin teilnimmt, genannt werden. Die enzymatische Hydrolyse dieser Amide liefert das chromophore Produkt p-Nitroanilin, das in leichter Weise spektroskopisch bestimmt werden kann.
Die bekannten Amide weisen jedoch nicht die gewünschte Spezifität und Empfindlichkeit auf. Dies stellt einen erheblichen Nachteil dar, der ein komplexeres Verfahren bei der Probeentnahme begründen kann, da man dann eine erhebliche Menge an bilogischem Material benötigt Weiterhin ist die enzymatische Reaktionszeit lang und die Genauigkeit der Enzymbestimmung kann unbefriedigend sein.
Die Tripeptide der Erfindung können gemäß zwei prinzipiell unterschiedlichen Methoden hergestellt werden.
Das erste Verfahren beruht auf der Kopplung der chromophoren druppe R" mit der betreffenden Aminosäure und anschließend einem stufen-* eisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur mittels stufenweiser Ankopplung der übirgen Aminosäuren. Die chromophore Gruppe wird hier als Blockierungsgruppe für die C-terminale Carboxylgruppe der ersten Aminosäure verwendet.
Das andere Verfahren beruht auf einem stufenweisen Aufbau der gewünschten Peptidstruktur und auf der anschließenden Entfernung der verwendeten Blockierungsgruppen, wobei man schließlich die chromophore Gruppe R6 an die '^ptidstruktur ankoppelt.
Für die stufenweise Synthese der Tripeptide der Erfindung sind solche Kopplungsmethoden verwendet worden, die bekannt und in dir Pentidchemie üblich sind. Bekannte und in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen sind z. B. Z (Carbobenzoxy), MeOZ (p-Methoxycarbobenzoxy), NZ (p-Nitrocarbobenzoxy), MAZ (p-Methoxyphenylazo-carbobenzoxy), BOC (tert-Butyloxycarbonyl), TFA (Trifluoracetyl) oder Formyl. Diese werden als Aminoschutzgruppen verwendet. Die .x-Carboxylgruppe kann durch die Umwandlung in verschiedene aktivierte, in der Peptidchemie bekannte und häufig verwendete Derivate aktiviert werden, die entweder isoliert oder in situ erzeugt werden, z. B. p-Nitrophenylester, Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, Säureazide sowie .Säureanhydride, die entweder symmetrisch oder unsymmetrisch sein können. Die Aktivierung kann auch mit einem Carbodiimid, z. B. Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid, durchgeführt werden. Die C-terminalen Carboxylgruppen in dem Aminopeptid- oder dem Aminosäurederivat können geschützt werden, indem man sie beispielsweise zu dem Methyl-, Ethyl- oder Isopropylcster oder durch Überführung in das chromophore Anilinderivat überführt, welches somit als Schutzgruppe während des Aufbaus der Peptidkette wirkt. Diejenigen freien funktionellen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, können während der Synthese der Peptide oder der Peptidderivate in der folgenden Weise geschützt werden.
/.um /.weck des .Schutzes der Argtnyl-<5-guanidogruppe und der l.ysyl-E-aminogruppe kann man solche Aminoschutzgruppen verwenden, die in der Peptidchemie üblich sind, beispielsweise NO2.TOS (p-Toluolsulfonyi) oder lediglich die Protonierung als Scnutz für die Giianidogruppe und Z (Carbobenzoxy), BOC (tert.-Bulyloxycarbonyl) oder auch TOS für die ε-Aminogruppe.
.»ο
Bei der Synthese der Tripeptide der Erfindung kann nach jeder Ankopplung einer neuen Aminosäure eine Reinigung durch Gel-Filtration erfolgen. Hierfür werden für die Gelfiltration geeignete Materialien verwendet, z. B. vernetzte Dextrangele mit unterschiedlicher Vernetzungsart (im folgenden mit G-15 und G-25 bezeichnet) oder hydroxypropylierte vernetzte Dextrangele (im folgenden mit LH-20 bezeichnet). Die Gelmateriaiien werden mit einem geeigneten Lösungsmittel äquilibriert Die Eluierung folgt dann mit dem gleichen Lösungsmittel, z. B. Methanol, Ethanol, Aceton, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die die Herstellung von verschiedenen Substraten der Erfindung durch stufenweise Synthese zeigen.
Für die dünnschichtchromatographische Analyse der Eluate und der Produkte wurden Glasplatten mit fluoreszenzindikatorhaltigen Silicagel als Absorptionsmedium verwendet. Für die Entwicklung der Dünnschieiuchroffiäiogräffiffic wurden die folgenden Lösungsmittelsysteme eingesetzt:
A: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (3 :! : 1)
C: n-Propanol: Ethylacetat: Wasser (7:1:2)
D: n-Heptan : n-Butanol: Essigsäure (3:2:1)
Pi: Chloroform : Methanol (9:1)
Nach der Dünnschichtchromatographie wurden die Platten zunächst im UV-Licht (254 nm) und anschließend mit der Chlor/Toluidin-Reaktion (G. Patacki, Dünnschichtchromatographie in der Aminosäure- und Peptidchemie, Walter de Gruyter, Berlin, 1966, Seite 125) entwickelt
In den Beispielen verwendete Abkürzungen sind die folgenden:
Ac2O = Acetanhydrid
AcOH = Essigsäure
Bz2O = Benzoesäureanhydrid
DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid
DCHA = Dicyclohexylamin
DCU = Dicyclohexylharnstoff
DMF = Dimethylformamid
Et,N = Triethylamin
HMPTA = Hexamethylphosphorsäuretriamid
MeOH = Methanol
NA = Naphthylamin
OpNP = p-Nitrophenoxy
pNA = p-Nitro^nilid
TLC = Dünnschichtchromatographie
Beispiel I
H-Leu-Leu-Arg-pNA-2 HCI
.Stufe la
Z-Arg(NO2)-pNA
35,3 g (0,1 Mol) trockenes Z-Arg(NO.)-OH werden in 20OmI frisch destilliertem HMPTA bei Raumtemperatur gelöst. Dazu werden 10,1 g(0,l MoI)El1N und 24.6 g (0,15 Mol) p-Nitrophenylisocyanat unter Rühren und unter völligem Feucht gkeitsausschluö zugegeben. Nach 24 Stunden bei Raum>emperatur wird die Reaktionsmischung in 2 I einer 2%igen Natriumbicarbon.illösiing unter Rühren eingegossen. Der sich abscheidende Niederschlag wird abfiltriert und dreimal mit 0. > I einer 2%igen N'atriumbicarbonatlösung, zweimal mn 0,2 1
destilliertem Wasser, zweimal mit 0,51 einer 0,5 N-SaIzsäure und schließlich fünfmal mit 0,21 destilliertem Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wird das Rohprodukt in warmem Methanol suspendiert. Der unlösliche Teil, der aus N-N'-bis-p-Nitrophenylharnstoff besteht, wird abfiltriert Das Filtrat wird durch Gelchromatographie an einer LH-20-Kolonne, äquilibriert mit Methanol, gereinigt.
Ausbeute 29,8 G (63,0%) Ia1 F. 185- 186° C, homogen nachTCI.inPiundC
[λ]?-UVc= 1,1; AcOH)
Stufe Ib
Z-Leu-ArgiNO2)-pNA
Herstellungsverfahren: 5,0 g (10,6 mMol) Ia werden in 21 ml Essigsäure und 22 ml 4 N HBr in Essigsäure unter vollständig trockenen Bedingungen gelöst Die Reaktionsmischung wird 1 Stunde lang gerührt und danach in 200 ml Ether unter heftigem Rühren eingegossen. H-Arg(NO2)-pNA - 1,5 HBr fällt aus. Die etherische Lösung wird dekantiert und der körnige Rückstand weitere dreimal mit 100 ml Ether behandelt, um Benzylbromid und überschüssiges HBr und AcOH zu entfernen. Nach dem Trocknen im Vakuum über P2O? ist die Ausbeute des Hydrobromids des Aminosäurederivats quantitativ (4,87 g). 4,87 g (10,6 mMol) H-Arg(NO2)-pNAl,5HBr werden in 5OmI destilliertem DMF gelöst. Die Lösung wird auf — 10°C gekühlt. Dann werden 1,6 g (153 mMol) EtjN zugegeben, um H-Arg(NO2)-pNA aus seinem Hydrobromid freizusetzen. Man läßt die Mischung 1 Stunde lang unter Feuchtigkeitsausschluß reagieren. Ausgefallenes Triethylamin-Hydrobromid wird abfiltriert und das Filtrat auf -10°C gekühlt. Man setzt 4,3 g (12,7 mMol) Z-Leu-OpNP zu, und die Lösung kann sich nun langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 3 Stunden wird die Lösung erneut auf — 100C gekühlt und mit 0.55 g (5 mMol) EtiN gekühlt. Die Pufferprozedur wird ein weiteres Mal nach 2 bis 3 Stunden wiederholt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung bei 400C im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird dreimal mit 100 ml destilliertem Wasser behandelt und wird danach im Vakuum getrocknet. Reinigung: Der trockene Rückstand wird in Methanol gelöst und durch Gelchromatographie an einer LH-20-Kolonne, äqi'ilibriert mit Methanol, gereinigt. Ausbeute: 6,1 g(98%) amorphes Ib, homogen gemäß TCL in Pi.
[/χ] -33,3Vc= 1,0; MeOH)
Stufe Ic:Z-I.cu-Leu-Arg(NO;)-pNA
Ausgangsmateria!: 2,8 g (4,77 mMol) Ib und 2,22 g (5,72 mMol) Z-Leu-OpNP.
Herstellungsverfahren:Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Meihanol.
Ausbeute: 2,5 g (80%) amorphes Ic, homogen gemäß TLC in P1.
[«] -9,9Vf= 1,0; DMF)
Stufe Id
H-Leu-Leu-Arg-pNA · 2 HC!
134,2 mg (0,192 mMol) Ic werden in das Reaktionsgefäß einer Sakakibara-Apparatur gegeben. In das Reaktionsgefäß werden 5 ml trockenen Fluorwasserstoffes destilliert. Man läßt I Stunde unter Rühren reagieren. Dadurch wird die die Guanidinfunktion des Arginins schützende Nitrogruppe und die Z-Gruppe abgespalten. Danach destilliert man den Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck ab und löst den trockenen Rückstand in DMF. Um das erhaltene ί Hydrofluoridderivat des Peptids in sein Hydrochlorid zu überführen, werden 0,25 ml konzentrierter Salzsäure zu der DMF-Lösung gegeben. Nach dem Verdampfen wird das Umwandlungsverfahren ein weiteres Mal wiederholt.
ι ο Reinigung: Der Rückstand nach der letzten Verdampfung wird in einer Lösung von 50%iger Essigsäure gelöst und durch Gelchromatographie an einer G-25-Kolonne, äquilibriert mit. 50%iger Essigsäure, gereinigt. Die das reine Tripeptid-Hydrochloridderivat enthalten- > de Eluatfraktion wurde lyephilisiert.
Ausbeute: 80,0 mg (71%) amorphes I, Chlorgehalt 11,83%, homogen gemäß TCL in A.
[«]·,' -29,9° (c = 0,59:50% AcOH)
Aminosäureanalyse: Leu:2,0; Arg:0,95
B c i s ρ i ρ ! II
N-Bz-Leu-Leu-Ärg-pNA · HCi
Stufella
N-Bz-Leu-Leu-Arg(NO>)-pNA
Ausgangsmaterialien: 703 mg (1 mMol) Ic und 272 mg (1,2 mMol) Bz2O.
Syntheseverfahren: Die Decarbobenzoxylierung von in Ic wird gemäß Beispiel Ib durchgeführt. Das trockene Produkt H-Leu-Leu-Arg(NO2) ■ HBr wird abfiltriert. Das Filtrat wird auf - 100C gekühlt und mit 272 mg (1,2 mMol) Bz2O versetzt. Nach einer Reaktionszeil von 3 Stunden hat die Lösung Raumtemperatur erreicht. Sie r> wird erneut gekühlt und mit 0,07 ml (0,5 mMol) EtjN gepuffert. Die Pufferprozedur wird nach 3 Stunden wiederholt. Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird gemäß dem im Beispiel Ib in beschriebenen Verfahren aufgearbeitet und getrocknet. Reinigung: Gelchromatograpliie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 550 mg (82%) amorphes lla. homogen gemäß TCL in P1.
..-, [λ] -3,6Vi-" 1.01; DMF)
Stufe Il
N-Hz-Lcu-Lcu-Arp-pNA IKI (IU
Ausgangsmaterial: 554,8 mg(0,828 mMol) Ma.
Synthesevvrfahren: Gemäß Id.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 im 20% AcOH und LH-2C in Methanol.
-,-, Ausbeute: 476 mg (87%) lyophilisiertcs, amorphes II, Chlorgehalt 5,30%, homogen gemäß TLC in A.
[«]· · - 73,0; (c= 0,66; 50% AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 2,0; Arg:0,95.
h" Beispiel III
II-I)/-N-CyLl()hcxyl=(,;.A]ii)=Viii-ArH-pNA 1 IG I
„-, Stufe Ilhi
N-/-N-Cy:lohexyH,;-Aki)-V;Ll-Ar£!(NO,|-pNA
Ausgangsmaterial: 286 mg (0,5 mMol) lila und 300 mg (0,7 mMol) N-Z-N-Cyclohexyl-f^Ala) OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographic an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 313 mg (86%) amorphes lila, homogen gemäß TLC in Pi.
[λ] ±0r (c= 1,0; DMF-).
Stuft- !lib
VH/-N-< ">ίϊ(ΐΙκ·\\Ι-Ι.,-ΛΙϋΐ-Viil-.<\ru(N<)..i-p\.\
llllhl
Ausgangsmaterial: 300mg (0.413 niMol) III,ι um! mg (0.544 mMol) IW).
S\ π these verfahren: Gemäß Ha.
N rinmtintT- ( -,rlrhrMnuitfiiTr^rthii' απ j[I {-2" ΙΠ M'.-'.h:i-IHlI
Ausbeute: 243.") mg (87%) amorphes IHh. homogen gemäß TCL in P·.
\\] 0.5 Cc = 0.43: I)Mf).
Sink- MIc
\-U/-VC>clolie\>l-i -ΑΙ;ιΙ-\;ιΙ-Λιμ ■ pV\ IKl
Ausg.tngsmalcri.il: I 70 mg (0.242 mMol) I lib.
S\ nthcsc\ erfahren: Gemäß Id.
Reinigung. Gelchromatographic an 1.11-20 in Methanol
Ausbeute: 1 26 mg (761Vm) Uophilisicrtes. .imorphcs III. f hl'irgehalt 5.1 1 %. homogen gemäß Γ I.C in A.
[\j - 38.5 Cc = 0.69:50% AcOH).
AniinosäiireanaKse: VaI. 1.0; NC \clohex \\-fi AIa:
I i c ι s ρ ιc I IV N-H/-\ al-\ ;ιΙ--\ΐ-μ-ρ\·\ IKI llVl
S:ulj l\ .ι
/-V .,i-\ ,.;- -\ι-μι\( )-i-pN \ ||V .Ii
Ausgangsmateriai: '.97 y (3.43 mMol) lila und 1.6g (J 2 mMol) 7. VaI-OpNP.
S\ nthcieverfahren: Genial' Ib.
Reinigung: Gelcnromatographie an LH 20 in Methanol.
Ausbeute: 1.9 g (82%) amorphes IVa. homogen gemäß TCL in P- und C.
Stufe- !Vp
N-B/-Vai-Viil-ArglNO;l-pNA (IVbi
Ausgangsmateriai: 1.9 g (2.83 mMol) IVa und 0.77 g (3.4OmMoI)Bz-O.
Syntheseverfahren: Gemäß Ha.
Reinigung: Gelchrornatoeraphie an LH-20 in Methanol.
A.üsbsut£i 145σ (ΛΠΟΛ^λ Brnorphcs IV, eemäßTLCinP:.
Stufe IVc
N-H/-Val-Val-Arg-pNH HCI (IV)
Ausgangsmaterial: 362 mg(0,564 mMol) IV.
Syntheseverfahren: Gemäß Id.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 33°/( AcOH.
Ausbeute: 248 mg (69,7%) lyophilisiertes amorphe IV, Chlorgehalt 5,54%, homogen gemäß TLC in A.
ft] - 57.0° (c = 0.65; 50% AcOH).
Aminosäiircanalysc: VaI: 2.0; Arg: 0,9.
Beispiel V N-H/-I cii-Viil-Αιμ-ρΝΛ IKI (Vl
Stille- V;i
/ i en- \ .ι ί-Α r v.\ N ί ;. r-p \.<\ \\ ,ti
Ausgangsmateriai: 1.97 g (3.43 mMol) HIa und !.7 g (■UmMolJZI.cu-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Ib.
Reinigung: (ick hromalographic an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 2.05 g (87%) amorphes Va. homogen gemäß Tl.C in P. und C.
Sink- V b
N-B/-I eu-Viil-ArulNOj-pNA |\ hl
Ausgangsmaien.il. 1.75 g (2.55 mMol) Va und 695 mg (3,0fimMol) U/O
Svntheseverfahrcn: (jemäß lla.
Reinigung: Cjelchromalographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 1.49 g (91%) amorphes Vb. homogen L'cmäßTLCin Pi.
[x] - 2.4 (C= 1.01; I)Mf).
Sllife Vc
VH/-I eii-WιΙ-Αιμ-ρΝΑ HCI |V|
Ausgangsmaterial: 319 mg(0.486 mMol) Vb.
Svntheseverfahren: ("iemäß Id.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 33% AcOII.
Ausbeute: 27h mg (88%) lyophilisiertes amorphes V. Chlorgehalt 5.-1%. homogen gemäß TLC in A.
f x] - 52.0 Cc = 0.65: 50% AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1.0: Leu: 1.1; Arg: 0.95.
Beispiel VI N-B7-iie-Vai-Arg-pNA · HCI (VIi
Stufe Via
Z-IIe-X al-Arg(NO2i-pNA (VIa)
Ausgangsmaterial: 1.97 g (3.43 mMol) HIa und 1,7 g (4.2 mMol) Z-IIe-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 2.0 g (85%) amorphes VIa, homogen gemäß TLC in P-.
Stufe VIb
N-H/-lk--Val-Aig(NOJ)-pNA (VIb)
Ausgangsmaterial: 1,75 g(2,55 mMol) VIa und 695 mg , (3,06 mMol) Βζ,Ο.
Syntheseverfahren: Gemäß 1 la.
Reinigung: Gelchromatographie an I.H-20 in Metha-
Ausbeute: 1,46 g (89%) amorphes VIb, homogen im gemäßTCLinP,.
Sink· VIc
N-H/-lk--Val-Arj!-pNA IKI (Vl) , ,
Ausgangsmaterial: il9 mg(0.486 mMol) VIb.
.Syntheseverfahren:Gemäß Id.
Reinigung: Gelehromatographie an G-15 in 33%iger AcGm. .'Ii
Ausbeute: 264 mg (84%) lyophilisiertes amorphes Vl, Chlorgehalt 5.43%, homogen gemäß TLC in A.
[x] - 29,9" (c = 0,59; 50% AcOH).
Aminosäureanalyse: VaI: 1,0; Me: 0,9; Arg: 1.1.
IU- ι s pi e I VII
N-ü.'-Val-lle-Λιμ-ρΝΛ IKI (VII)
SI)
Sink- Vila
/-lle-Arg|N(),)-pNA (Vila)
Ausgangsmaterial: 4.9 g (10,4 mMol) la und 6,2 g (16 r. mMol) Z-IIe-OpNP.
Syntheseverfahren:Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 4,75 g (78,1%) teilweise kristallines Vila, m homogen gemäß TLC in P|.
[x] +2,3' (C= 1,0; DMF).
Stufe MIb
I",
Z-V;il-lk-Ari!|NO,)-pNA (VIIb)
Ausgangsmaterial: 800 mg (1,37 mMol) Vila und 615mg(l,65mMol)Z-Val-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Ib. -,„
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 833 mg (88,5%) amorphes VIIb, homogen gemäß TLC in P1.
[x]■' - 3,23° (c = 1.1; DMF).
Stufe VIIc
N-B/-Val-lle-Ari:(NO,)-pNA (Vl ic)
Wl
Ausgangsmaterial: 500 mg (0,73 mMol) VlIb und mg (0,876 mMo!) Bz2O.
Syntheseverfahren:Gemäß Ha.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol. h-
Ausbeute: 374 mg (78%) amorphes VIIc, homogen gemäß TLC in Pj.
[nc] +\9°(c =0,99; DMF).
Stufe VIIcI
N-l3/-Val-lk--Arg-pNA · IKI (VIl)
Ausgangsmalerial:200 mg (0,305 mMol) VIIc. .Syntheseverfahren: Gemäß Id.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 3 3% AcOH.
Ausbeute: 153 mg (77,5%) lyophilisiertes amorphes
VII, Chlorgehalt 5,40%, homogen gemäß TLC in A. [ix] - 56,4° (c = 0,64; 50% AcOH). Aminosäiireanalyse: VaI: 1.0; He: 1.1; A'g: 1,1.
Beispiel VIII NH/V.il-l L-u-Λιμ-ρΝΛ IKl (VIII)
Sink· Villa
/-YaI-I οιι-Λιμ(Ν(),)-ρΝΛ (Villa)
Ausgangsmatcrial: 880 mg (1,5 mMol) Ib und b70 mg (LBmMoI)Z-VaI-OpNP.
.Syntheseverfahren: Ciemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 882 mg (86%) amorphes Villa, homogen gemäß TI.C in P1.
[a] -6,6'Cf= 1.01: DMF).
Stufe VIlIb
N-H/-Val-L.cu-Arg(NO,)-pNA (VIIIb)
Ausgangsmaterial: 400 mg (0.583 mMol) Villa und mg(0.707 mMol) Bz.O.
Syntheseverfahren: Gemäß lia.
Reinigung: Gelchromatographie an I.H-20 in Methanol.
Ausbeute: 279 mg (73%) amorphes VlIIb1 homogen gemäß TLC in P,
[*i -0,4' (c = 1,04; DMF).
Stute VIIIc
N-H/-Val-lou-.\ru-pNA IKl (VIII)
Ausgangsmaterial: 150 mg (0.23 mMol) VIIIb. .Syntheseverfahren: Gemäß I.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 3 3% AcOH.
Ausbeute: 126 mg (84,5%) lyophilisiertes amorphes
VIII, Chlorgehalt 5.45%, homogen gemäß Tl C in A. [.«] - 54.0° (c = 0,64; 50% AcOH). Aminosäureanalyse: VaI; 1,0; Leu: 1,1; Arg: 1,0.
IU-i spiel IX N Hz-llc-llo-Arg-pNA IKI (IX)
Stufe IXa
Z-I Ie-I le-Aru(N O. )-pN\ (IXa)
Ausgangsmaterial: 800 mg (1,37 mMol) VII und mg(l,66 mMol) Z-IIeOpNP.
Syntheseverfahren:Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Il 12
Ausbeute: 838 mg (87,5%) teilweise kristallines IXa, Ausbeute: 166 mg (86%) lyophilisiertes amorphes X,
homogen gemäß TLC in P,. Chlorgehalt 5,34°/· homogen gemäß TLC in A.
[λ] -5,7"Cf= 1.04; DMF). [<x] '-51.4"(C = o,67; 50% AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 1,0; He: 1,2; Arg:0.9.
Stufe IXh
N-Bz-lle-lle-Arg(NO,)-pNA (IXb) Beispiel Xl
N-Bz-lle-Leu-Arg-pNA ■ HCI (Xl) Ausgangsma'erial: 440 mg (0,63 mMol) IXa und
mg(0,76 mMol) Bz..O. i<> Stud: XIa
Syntheseverfahren: Gemäß Ua
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha- Z-1Ie-LaI-AIg-(NO,)-pNA iXl.i)
Alisbeule: 409 mg (97%) teilweise kristallines IXb, Ausgangsmaterial: 880 mg (1,5 mMol) lh iinil 696 mg
homogen gemäß TLC in Ρ,. ι, (1,8 πιΜυΙ) Z-IIe-OpNP.
Syntheseverfahren:Gemäß Ib.
Stufe IXc Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha
nol.
N-Bz-lle-lle-Aru-pNA IK I (IX) Ausbeute: 750mg (71%) amorphes XIa. homogen
•ii gemäß TLC in P1.
Ausgangsmaterial: 201 mg(0,3 mMol) IXb. [λ] -9,85° (c = 1,05; RMF).
Syntheseveriahren: Gemäß I.
Reinigung: Gelehromatographie an G-15 in 3 3%
AlOH.
Ausbeute: 172 mg(87%) lyophilisiertes amorphes IX, .., N-Hz-IIc-I ai-Arg(NO,|-pNA iXlb)
Chlorgehalt 5,3 i%, homogen gemäß TLC in A.
[ix] -57,0° Cc· = 0,67;50% AcOH). Ausaangsmaterial: 498 mg (0,71 mMol) XIa und
Aminosäureanalyse: He: 2,0; Arg: 0,9. 193 mg (0,85 mMol) Bz_>O.
Syntheseverfahren: Gemäß Ha.
u .: . ■ , ι ν "' Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha
l> L I S ρ I C 1 A ,
1 nol.
M ,. , ι, A ... ..... ,.,, Ausbeute: 345mg (73%) teilweise kristallines XIb,
N-Bz-Leu- o-Aru-pNA · HC X , -π-τ-ιλ-- γ>
el ' homogen gemäß TLC in Ρ,.
[λ] -5,7° (c= 1,04; DMF).
Stufe Xm
/-Lai-llc-Arii(N(),)-pNA (Xa) Stufe XIc
N-Bz-lle-Leu-Arg-pNA ■ HCI (Xl)
Ausgangsmaterial: 800 mg (1,37 mMol) VIIa und
mg(l,66 mMolJZ-Leu-OpNP. ,„ Ausgangsmaterial: 170 mg(0,254mMol) XIb.
Syntheseverfahren: Gemäß Ib. Syntheseverfahren:Gemäß I.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha- Reinigung: Gelehromatographie an Gi" in 33%
nol. AcOH.
Ausbeute: 772 mg (81%) amorphes Xa, homogen Ausbeute: 129 mg (77%) lyophilisiertes amorphes Xl.
gemäß TLC in P1. ,-, Chlorgehalt 5,31%, homogen gemäßTLC in A.
[λ] - 7,3° (c = 1,02; DMF). [α] -49,9° (c = 0,69;50% AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 1,0; He: 1,1; Arg: 1.05.
Sl"rcXh ι, ■ -ι Yii
H L-1 s ρ ι c 1 XII
N-H/ !.ai-llc-AiulNO,)-pNA (Xh) ,,,
' ' N-Bz-Leu-Leu-Arg-2-NA · HC! i.XII)
Ausgangsmalerial: 500 mg (0,72 mMol) Xa und
mg (0.86 mMol) Bz-O. Slnie XIl a
Syntheseverfahren:Gemäß lla. Z-Arg(NO,)-2-NA iXlla) Reinigung: Gelehromatographie an LH-20 in Metha- -,-,
nol. 3,6 g (10 mMol) trockenes Z-Arg(NO2)-OH werden in
Ausbeute: 482 mg (82%) amorphes Xb, homogen 200 ml THF gelöst 1,0 g (10 mMol) Et1N werden
gemäß TLC in Pi. zugegeben, wonach man die Lösung auf -10 C unter
[λ] +0,50Cc= 1,03; DMF). vollständigem Feuchtigkeitsausschluß kühlt.
„„ 1,3 g (10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester,
^, r γ gelöst in 10 ml THF, werden innerhalb von 10 Minuten
zu der gekühlten Losung gegeben. Danach fügt man
N-Hz-L eii-llc-Arg-pNA · IKI (X) nach weiteren lOMini.ten 1,72 g (10 mMol) 2 Naphthyl-
amin hinzu. Man läßt Jie Reaktionsmischung Raumtem-
Ausgangsmaterial: 193 mg(0,288 mMol) Xb. „-, peratur erreichen und läßt sie bei dieser Temperatur 24
Syntheseverfahren: Gemäß I. Stunden lang stehen. Die Reaktionsmischung wird im
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 33% Vakuum zur Trockene eingedampft, wird 3-bis 5mal mit
AcOH. destilliertem Wasser. 3- bis 5mal mit einer 5'Voieen
13 14
Natriumbicarbonatlösung und wieder 3- bis 5mal mit Ausgangsmaterial: 3,6 g (IO mMol) Z-Arg(N» \)-OH
destilliertem Wasser behandelt und anschließend im und ?,26 g (12 mMol) !-Nitro-2-naphthylamin.
Vakuum getrocknet. Syntheseverfahren: Gemäß XIIa.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha- Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol. , nol.
Ausbeute: 4,05 g (84%) teilweise kristallines XIIa. Ausbeute: 3,1 g (58,7%) amorphe XIIIa, homogen
homogen gemäß TLC in P, und C. gemäß TLC in P, und C.
[a] +/,35°(c = 1,0;DMF). [rt]'- 11.8' (c = 1,0; DM F).
Stufe XlIb „.
1 Stufe XIIIb
Z-Leu-Arg(NO2)-2-NA (XIIb)
/-I αι-Λπΐ(Ν(>,Ι-Ι-πιΐΓο-2-ΝΛ (XIMb)
Ausgangsmaterial: 1,5 g (3,1 mMol) XIIa und 1,43 g
(3,7 mMol)Z-Leu-OpNP. Ausgangsmatcrial: 950 mg (1,8 mMol) XHIa und
Synthese verfahren: Gemäß Ib. ι , 850 rnp(2.2 mMol) 7.-1. cu OpNP.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Mctha- Syntheseverfahren:Gemäß Ib.
nol. Reinigung: Gelchromatographic an I.H-20 hi Mctha
Ausbeute: 1,6g (86%) amorphes XII. homogen nol.
gemäßTlX'in Pi. Ausbeute: 900 mg (78%) amorphes XIIIb. homogen
l'\] -3,!'(V= 1.0,ί)Μί). Ί> gemäß TLC in Pi.
[x] - 10.2 (c= 1.02: DMI).
Stufe XlIl
/-Llhi-I ai-AriilN().,)-2-NA (XIk-) Sink-XIIk
/-I.CII-I cu-Arg(N(),)-l-iiilfo-:-NA (XIlUi Ausgangsmaterial: 1.35 g(2.26 mMol) XIIb und 1.05 g
(2,7ImMoI)Z-LeU-OpNI' Ausgangsmatcrial: 900mg (1,4 mMol) XIIIb und
Syntheseverfahren: Gemäß Ib. 650 mg(1.7 mMol)Z-Lcu-OpNP.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Mclha- Syntheseverfahren:Gemäß Ib.
nol. „, Reinigung: Gelchromatographic an I 11-20 in Melha
Ausbeute: 1,00g (62.4%\ teilweise kristallines XlIc. nol.
homogen gemäß TLC in Ρ,. Ausbeute: 810 mg (77%) amorphes XIIk. homogen
[(X] -20.6" (c-= 1.0; DMF). gemäßTLC- in P1.
[λ] -18.2 (C= 1.01; I)MF).
StIiTe XIIcI i!
N-B/-Leu-I.eu-Aru(N(),)-2-NA (XIUlI Sink-XIIUI
N-H/-I L-ii-l eu-An;(Nn,l-l-nilm-2-\A (MIUH Ausgangsmaterial: 990 mg (1.4 mMol) XIIc und
mg(1.8 mMol) Bz.O. 4ll Ausgangsmaieria'· 680 mg (0.H8 mMol) XIIIc und
.Syntheseverfahren:Gemäß Ha. 260 mg(1.15 mMol) B/. O.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Mctha- Syntheseverfahren:Gemäß Ha.
nol. Reinigung: Gelchromatographie an 1.11-20 in Mctha
Ausbeute: 800 mg (84%) amorphes XIId. homogen nol.
gemäßTLC in P1. :- Ausbeute: 480 mg (73%) amorphes Xlild. homogen
[rx] - 13.4C (C= 1,0; DMF). gemäßTI.C in P,.
[(X] -31.4 (c-= 0.9; I)MF).
Stufe XII c
N-Bz-Leu-Lcu-ArgO-NA ■ IUi (XIIi -„, Slule XIIIc
N-B/-I cu-I L-u-Aiü-l-iiilro-2-NA IK'I (XIIIi Ausgangsmaterial: 350 mg(0,52 mMol) XIId.
Syntheseverfahren:Gemäß I. Ausgangsmatcrial· 74 mg(0,1 mMol) XIIId.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 33% Syntheseverfahren:Gemäß 1.
AcOH. --, Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 33%
Ausbeute: 260 mg (75%) lyophilisiertes amorphes AcOH.
XII, Chlorgehalt 5,30%, homogen gemäßTLC in A. Ausbeute: 47 mg (66%) lyophilisiertes amorphes XIII.
[α]; -51,8° (c = 0,57; 50% AcOH). Chlorgehalt 4,94%, homogen gemäß TLC in A.
Aminosäureanalyse: Leu: 2,0; Arg: 0,95. [«] -33,6C (c = 0,72; 50% AcOH).
mi Aminosäureanalyse: Leu: 2,0; Arg:0,9.
Beispiel XIII
N-Bz-Leu-Leu-Arg-l-nitro-2-NA ■ HCI Beispiel XIV
N-Bz-Leu-Leu-Arg-4-nitro-l-NA ■ lld (XIV)
Stufe XIHa Stufe XIVa
Z-Arg(NO2H-nitro-2-NA (XHIa) Z-Arg(NO2)-4-nitro-l-NA (XIVa)
15
Ausgangsmaterial: 3,6 g (10 mMol) : und 2,26 g (12 mMol) 4-Nitro-l -naphthylamin.
Syntheseverfahren: Gemäß XIIa.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 2,9 g (55%) amorphes XIVa, homogen gemäß TLC in P, und C.
[«]■ -11,4° (c= 1,01; DMF).
Stufe XIVb Z-Leu-Arg( N O2 )-4-nitro-! -NA (X IVb)
Ausgangsmaterial: 650 mg (1,23 mMol) XIVa und 560mg{1:45mMol)Z-Leu-OpNP. π
5ynthesev?rfahren: Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 520 mg (66%) amorphes XIVb, homogen gemäß TLC in P;. vi
" [λ] -11.8° (C= 0.2: DMF).
Sture XiVc Z-Leu-Lcu-Arg(NO:)-4-niiro-l-N/\ (XIVc) :;
Ausgangsmaterial: 520 mg (0.81 mMol) XIVb und ng (0.97 mMol) Z-Leu-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß Ib.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha- m nol.
Ausbeute: 378 mg (62%) teilweise kristallines XIVc. homogen gemäß TLC in Pi.
[λ] -18.0"(C= 1.0: DMF).
Γι
Sture XIVd N-B/-I.cii-Leu-Ara(N(),)-4-nitrt>-l-NA (XIVdI
Ausgangsmaterial: 150 mg (0.2 mMol) XIVd und m mg(0.25 mMol) Bz;O.
Syntheseverfahren:Gemäß Ma.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 120 mg (83%) amorphes XIVd. homogen η gemäß TLC in Pi.
[λ] 30.9'(J = 0.95: DMF).
Stufe XIVe
N-H/-l.eu-l.cu-Arii-4-nitro-l-NA IKI (XIV)
Ausgangsmaterial: 120 mg(0,165 mMol) XIVd.
Syntheseverfahren: Gemäß I.
Reinigung: Oelchromatographic an G-15 in 33% , AcOH.
Ausbeute:48 mg (42%) lyophilisiertes amorphes XIV. Chlorgehalt 4.95%, homogen gemäß TLC in A.
[«]■"■ -36,0° (c = 0,71; 50% AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 2.0; Arg: 0.9. wi
Beispiel XV N-B/-I.CII-I.CII-I.ys-pNA IK I (XV)
63 g (IU mMol) N-BOC-Lys(e-Z)-OH · DCH/ werden in 40 ml trockenem, frisch destilliertem HMPT/ bei Raumtemperatur gelöst Danach werden 5 g (30, mMol) p-Nitrophenyiisocyanat nacheinander unte s Rühren sowie unter vollständigem Feuchtigkeitsau: Schluß zugegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtempera tür wird die Reaktionsmischung gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Der unlösliche Teil, der aus Ν,Ν'-bis-p Nitrophenylcarbamid besteht, wird abfiltriert. Da ι» Filtrat wird durch Gelchromatographie an eine LH-20-Kolonne, äquilibriert mit Methanol, gereinigt.
Ausbeute: 4,17 g (74,5%) teilweise kristallines XVi homogen gemäß TLC in P|.
[«]!' +1,7° (C= 1,0; DMF).
Stufe XVb N-BOC-Lcu-Lysfi-Zl-pNA
2,20 g (Ί,Ί rnMol) XVa werde
(XVb)
Stufe XVa N-B(H -I.vs(-/.l-pN/\
IXViD destillierter Trifluoressigsäure unter vollständigen Feuchtigkeitsausschluß gelöst. Die Reaktionsmischunj wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt danach langsam in 150 ml trockenem Ether unte heftigem Rühren eingegossen. Dabei fäll CFjCOOH · H-Lys(f-Z)-pNA nach dem Kühlen aus Die ehterische Lösung wird abdekantier» und de amorphe Rückstand weitere dreimal mit 75 ml Ethe behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum über P2O und NaOH wird dasTrifluoraeetat des Aminosäurederi vats in quantitativer Ausbeute (2.25 g) erhalten.
2,25 g (4,4 mMol) CF1COOH · H-Lys(E)-pNA werde in IO ml DMF gelöst. Die Lösung wird auf —10°( gekühlt und mit 0.78 ml (5.5 mMol) Et>N versetzt, um di Aminosäure freizusetzen. 2,4 g (6,5 mMol) BOC-Leu OpNP werden zugesetzt und man läßt die Lösun, Raumtemperatur erreichen. Nach 3 Stunden wird di Lösung erneut auf - 100C gekühlt und mit 0.31 ml (2. mMol) Et)N gepuffert. Die Puffermaßnahme wird ei weiteres Mal nach 2 bis 3 Stunden wiederholt. Nac einer Reaktionszeit von 24 Stunden wird die Lösung be 4O0C im Vakuum zur Trockene eingedampft. De Verdampfungsrückstand wird dreimal mit 20 ml destil liertem Wasser behandelt und dann im Vakuun getrocknet. Der rohe trockene Rückstand wird i Methanol gelöst und durch Gelchromatographic a einer LH-20-Kolonne. äquilibriert mit Methanol, gerei nigt.
Ausbeute: 1.7Of (70%) amorphes XVb. homoge gemäß TLC in Pi und C.
[λ] -4.9" (c = 1.1: DMF).
Stufe XVc N-BOC •-I.eu-I.eu-Lys(,-Z)-pN/\ (XVc)
Ausgangsmaterial: 950 mg (1,55 mMol) XVb un 1.16 g (3.1 mMol) BOC-Leu-OpNP.
Syntheseverfahren:Gemäß XVb.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Metha nol.
Ausbeute: 985 mg (88%) amorphes XVc, homoge gemäßTLCinPi.
[«]■■ -22,0° (C= 1.0: DMF).
Stufe XVd N-H/-I.CU-I.eii-l VSf,-Z)-pNA (XVd)
Ausgangsmaterial: 1,25 g (1,4 mMol) XVc und 384 mg (1,7 mMol) Bz3O.
Syntheseverfahren: Die Decarbobutyloxylierung von XVc wurde gemäß dem Verfahren des Beispiels XVb durchgeführt.
Das trockene CFiCOOH - H-Leu-Leu-Lys(E-Z)-pNA wird in 2OmI DMF gelöst und auf -100C gekühlt. Danach werden 200 ml (1,45 mMol) EtjN zugegeben, um das Peptidamin aus seinem Salz freizusetzen. 384 mg (1,7 mMol) Bz2O werden bei -10°C zu der Lösung gegeben, wonach die Maßnahmen des Pufferns und Aufarbeitens gemäß Beispiel XVb durchgeführt werden.
Reinigung: Gelchromatographie an LH-20 in Methanol.
Ausbeute: 920 mg (90%) teilweise kristallines XVd, homogen gemäß TLC in Pi und C.
[α] - 5,95° (c = 1,02; DM F).
Stufe XVe
N-Bz-Leu-Leu-Lys-pNA HCl
(XV)
Ausgangsmaterial: 300 mg (0,41 mMol) XVd.
Syntheseverfahren:Gemäß I.
Reinigung: Gelchromatographie an G-15 in 33% >·, AcOH.
Ausbeute: 170 mg (66%) lyophilisiertes amorphes XV, Chlorgehalt 5,51 %, homogen gemäß TLC in A.
[λ] ·;, - 50,5° (c = 0,62; 50% AcOH).
Aminosäureanalyse: Leu: 2,0; Lys: 0,35. M
Beispiel XVI
N-Bz-ile-Leu-Lys ■ pN'A · HCi (XVI)
Stufe XVIii
N-BOC-IIe-Leu-Lys(,-Z)-pNA (XVIa)
Ausgangsmaterial: 3,0 g (4,9 mMol) gemäß Beispiel XVb und 2,2 g (5,9 mMol) BOC-IIe-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß XVb.
Reinigung: Gelfiltrieren an LH-20 in MeOH.
Ausbeute: 3,05 g (85,7%) teilweise kristallines XVIa, homogen gemäß TLC in P|.
[«]?,' - 15,4° (c = 0,99; DMF).
Stufe XVIb
N-B/.-Ile-t.eu-l.ys(,-/)-pNA (XVIb)
Ausgangsmaterial: 2,4 g (3,3 mMol) XVIa und 0,9 g (3,98 mMol) Bz2O.
Syniheseverfahren:Gemäß XVd.
Reinigung: Das Roherzeiignis wurde in MeOH aufgeschlämmt, rückflußgekocht und danach abgekühlt und filtriert.
Ausbeute: 2,15 g (89,2%) kristallines XVIb, homogen gemäßTLCinPiund A.
[«] -7,2° (c = 0,90; DM F).
SlureXVIc
N-Hz-Ilc-Leu-Lys pNA HCI (XVI)
Ausgangsmaterial: 2,0 g (2,7 3 ;-.Mol) X VIb.
Syntheseverfahren: GemäL I.
Reinigung: Gelfiltrieren an G-15 in 331Vn AcOlI.
Ausbeute: 14 g (87%) amorphes lyophilisiertes XVI, Chlorgehalt 5,59%, homogen gemäß TLC in A.
[«];,' -8,62° (C= 1,03; DMF).
Aminosäureanalyse: He: 1,10; Leu: 1,07; Lys: 1,05.
Beispiel XVII
N-Bz-Va!-Leu-Lys-pNA · HCI (XVII)
Stufe XVIIa
N-BOC-VaI-Leu-Lys(»-Z)-pNA (XVIIa)
Ausgangsmaterial: 0,98 g (1,59 mMol) XVb und 0,69 g (1,90 mMol) BOC-VaI-OpNP.
Syntheseverfahren: Gemäß XVb.
Reinigung: Gelfiltrieren an LH-20 in MeOH.
Ausbeute: 030 g (79,6%) amorphes XVIIa, homogen gemäß TLC in Pi.
[λ] j-7,9° (c- 1,0; DMF).
Stufe XVi i b
N-Bz-Val-Leu-Lys(,-Z)-pNA (XVII h)
Ausgangsmaterial: 650 mg (0,88 mMol) XVIIa und 240 mg (1,1 mMol) Bz2O.
Syntheseverfahren: Gemäß XVd.
Reinigung: Das Roherzeugnis wurde in MeOH aufgeschlämmt und 1 Stunde rückflußgekocht, danach abgekühlt und filtriert.
Ausbeute: 0,43 g (67,4%) kristallines XVIIb, homogen gemäß TLC in P1.
[«];' - 3,6° (c = 0,85; DMF).
Stufe XVIIc
N-B/ .il-I.cu-Lys-pNA · HCI (XVII)
Ausgangsmaterial:395 mg(0,55 mMol) XVIIb.
Syntheseverfahren: Gemäß XVd.
Reinigung: Gelfiltrieren an G-15 in 33% AcOH.
Ausbeute: 0,28 g (82%) amorphes lyophilisiertes XVII, Chlorgehalt 5,9%. homogen gemäß TLC in A.
[«] '-7,00Cc= 1,0,DMF).
Aminosäureanalyse: VaI: 0,96; Leu: 1,03; Lys: 0,98.
Die gemäß den Beispielen hergestellten Peptide wurden in der folgenden Weise zur Bestimmung von verschiedenen Enzymen verwendet:
Das Prinzip für diese Bestimmung gründet sich darauf, daß das bei der enzymatischen Hydrolyse geDÜdete Produkt ein UV-Spektrum aufweist, welches von dem des Peptids vollständig getrennt ist. Das Peptid gemäß Beispiel II, N Bz-Leu-Leu-Arg-pNA ■ HCI, weist somit ein Absorptionsmaximum bei 302 nm mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 12 920 auf. Die Absorption des Peplids bei 405 nm ist unbedeutend. p-Nitroanilin (pNA), das aus dem Peptid während der en/ymatischen Hydrolyse gebildet wird, weist ein Absorptionsmaximum bei 380 nm mit einem molaren Exiinktionskocffizicntcn von 13 200 auf, der bei 405 mn lediglich auf 9620 vermindert ist.
Man kann daher durch spektrophotometrische Messung bei 405 nm in leichter Weise den Grad der enzymatischen Hydrolyse verfolgen, der proportional zu der Menge des gebildeten p-Nitroanilins ist. Der vorhandene Peptidüberschiiß beeinfluß' die Messung bei dieser Wellenlänge nicht. Die Bedingungen sind für
die übrigen Peptide der Erfindung nahezu identisch. Aus diesem Grund wurden die spektrophotometrischen Messungen durchweg bei 405 nm durchgeführt
Die enzymatische Reaktion kann schematisch in der folgenden Weise beschrieben werden:
k, kj
E + S ϊ=- ES » ES' I- chrmnophore Pi
A4
E = Enzym
S = Peptid
ES = Enzym-Peptid-Komplex P, und P2 = P; odukte
k\,ky,k;und k? = Geschwindigkeitskonstanten Dissoziationskonst. für
ES ~ f- = K,„ (Michaelis-Konst.)
AI
Wenn (S) » (E) und A4 <e A, ist, gilt folgendes:
f(E) - (ES)J χ (S) (|
(ES)
Die Bildungsgesckwindigkeit des (Luminophors ist r - Α·., χ (ES)
A-., χ (E.) χ (S)
aufgetragen wird, ergeben sich Km und vm Gleichung 4)) aus dem Diagramm.
Kn, und A, (= 5gj
K,„ f (S)
(2) für Trypsin ui.d verschiedene Peptide sind in Tabelle 1 und für Thrombin in Tabelle 2 angegeben. Die Daten bezüglich Kn, und Jtj sind in den Fällen nicht angeführt, in denen sie nicht bestimmt worden sind oder nicht berechnet werden konnten, weil sich keine lineare
Abhängigkeit zwischen und ^r ergab.
Ene überschlagsmäßige Beurteilung der Enzym-Peptid-Beziehung für verschiedene Peptide wird erhalten, indem man die Menge des pro Minute und pro ml bei der gleichen Konzentration der Substrate gebildeten p-Nitroanilins verfolgt. Dies ist in Tabelle 3 für Trypsin, in Tabelle 4 für Thrombin und in Tabelle 5 für Plasmin gezeigt.
Die in den Tabellen verwendete Abkürzung NlH bezieht sich auf Einheiten des National Institute of Health. Die Trypsin-Einheit ist gleich der Hydrolyse eines μΜοΐ5 N-Tosyl-arginin-methylester-hydrochlorid (TAME) pro Minute bei 25°C und einem DH-Wert von 8,1 in Gegenwart von O1Cl M Calciumionen. Das Trypsin ist im Handel erhältlich, ebenso das Plasmin. 1 mg des Plasmins entsprach 3 Kasein-Einheiten (CU).
Aus Tabelle 3 ergibt sich, daß die Tripeptide der Erfindung gegenüber Trypsin 30 000- bis etwa 68 OOOmal empfindlicher als die Vergleichsverbindung DL-BAPNA sind. Das L-Isomere des BAPNA ist maximal 4ma! empfindlicher als die DL-Verbindung. Daraus ergibt sich eine deutliche Überlegenheit der Tripeptide der Erfindung gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verbindungen.
Wenn alles K an S gebunden ist. gilt: IhS) ^ (E) lind
r - '»„.< - A1 χ (E)
L inew ca vcr-Burk-Gleichung:
I Kn, I I
(3)
(4)
Wie aus Gleichung (2) hervorgeht, bestimmen die Konstanten Kn, und k\ die Wirksamkeit des Peptids für ein gegebenes Enzym. Für die Bestimmung dieser Konstanten wird im Prinzip das folgende Verfahren angewendet: Das Enzym und das Peptid werden in einer Pufferlösung gemischt, und die Reaktion wird spektro· photometrisch 5 Minuten lang verfolgt. Die Kon/entra lion des Peptids (S) wird variiert, während die Enzymkonzentration (E) für jedes Peptid konstant gehalten wird. Die Extinktion (C)D) wird in Abhängigkeit von der Zeil aufgetragen. Aus der so erhaltenen Kurve ergibt der Tangens (= Differenz der Extinktion pro Minute, dOD/min, aus der die Menge des gebildeten p-NA/min (v)\n μΜοΙ berechnet werden kann) zur Zeit Null die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit v. Wenn
gegen
I (S)
Tabelle I Peptid- I'epliil- Hn/ym- l(? A1 x
I knn/. kon/ konz. (Mol/I) II)1
(μΜοΙ/Ι) (,■1M0I/I) (NIH/ml) (wM.il/
Trypsinaktivität, Km und A, nun.
Peptid 16 Nlll/ml)
250-666 250-666 75 7,40 H,.'
33,6-112,0 33.6-112.0 6 0,64 U(I
35,0-150,0 i,i
ΒΛΡΝΛ riiromhinaktiviliii, λ',,, ι und A1 A,,, <
I Peptid Ιίη/ym- I01 * ■
Il kon/. (Mol/I) I.»1
liibcllc 2 (Nlll/ml) ( MoI/
nun.
- 6 Mil/mil
I) Λ PN Λ 50 2.92 Il
I IO IO
Tabelle Z Peptid- I'cptid- Enzym- Gebildetes j Peptid Peptid-
konz.		 Peptid- Enzym-
konz.		 Gebildetes
p-Nitroanilin
korsz. konz. konz. P-Nitroanilin nMol pro ml konz. NIH- nMol pro Min.
Trypsinaktivitä't nMol pro ml nMol pro ml Einheiten nMol pro Min. nMol pro ml Einheiien pro ml
Peptid pro ml pro ml pro ml
IO VI 66,7 0,417 0,1
333,0 50,0 1,04 VII 67,0 66.9
/Z Γ		 0,417 0,3
66,9 333,0 0,0833 14,2 VIII 67,1 OO.J
66.8		 0,417 0,4
66,3 66,9 0,0833 22,7 IX 66,3 66.2 0,417 0,2
BAPNA 66,8 66,5 0,0833 12,8 X 66,3 66,7 0,417 0,7
II 66,2 66,8 0,0833 16,6 Ii XI 66,9 67,0 0,417 0,2
III 66,7 66.2 0,0833 17,1 XlI 67,0 67.1 0,417 0,1
IV 67,0 0,0833 12,0 66.3
V 67,1 0,0833 15,5 65.9
VI 66,3 0,0833 12,4 Tabelle f 66,9
VII 65,9 0,0833 16,5 Piasminaktivität 67.(1
VIII 66^9 O]O833 16/7
IX Peptid Einz).< ·.- Gebildetes
χ konz. p-Nitroütiilin
XI Thrombinaktivität CU- nMol pro Min.
Peptid Enzym- Gebildetes liinheitcn
pro ml		 pro ι. I
Tabelle 4 konz. P-Nitroanilin
NlH- nMol pro Min. ill II
III
IV		 0.167
0.167
0.16?		 2.7
7 τ
Einheitcn pro ml V 0.167 /, /
2,8
pro ml Vl 0,167 2 2
VII 0.167 4.0
ΒΑΡΝΛ 2,08 r..i VIII 0,167 1.5
Il 0,417 1,8 Γι IX 0,167 17.2
III 0,417 1,7 X 0.167 2,0
IV 0,417 0,2 Xl 0,167 1.5
V 0,417 0,4 XII 0.167 17,9
21.3

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    I. Tripeptide der allgemeinen Formel (I)
    N CH-CO —NH CH -CO NH CH CO NHR6
    ' I I I
    R1 R4 ICfU)n
    NHR5
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