DE2225275B2 - Verfahren zur quantitativen Calciumbestimmung - Google Patents
Verfahren zur quantitativen CalciumbestimmungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen quantitativen alkalischen Calciumbestimmung im Blutserum.
Die klassische Methode zur Calciumbestimmung im Serum ist die von Clark und Collip, »A Study of the
Tisdall Method for the Determination of Blood Serum Calcium with a Suggested Modification«, J. Bioi. Chem.
63, 461 -464 (1925); auch ibid. 49, 487 (1921), nach der das Calcium als Oxalat gefällt wird und anschließend
kolorimetrisch bestimmt wird. Oxalat wurde zur Calciumbestimmung bereits im Jahre 1871 von Pribram,
»Berichte über die Verhandlungen der Königlich. Sächsischen Gesellschaft der Wissenschaften zu Leipzig«, Math.-phys. Classe, 1971 XXIII, 279, wie in Kramer
und Tisdall, J. Biol. Chem. 47, 475 (1921) angeführt, benutzt, jedoch war die Methode von Clark und Collip
bis vor wenigen Jahren die verbreiteste. In neuester Zeit ist man aber von dieser Methode abgerückt, da sie ein
Zentrifugieren erfordert und eine besonders sorgfältige Handhabung der Proben, um eine Kontaminierung mit
Calcium aus dem Glas zu vermeiden. Darüber hinaus ist die Gefahr einer Fehlbestimmung des Calciumgehaltes
durch einen Verlust an Niederschlag recht groß. All diese Faktoren vermindern die Verläßlichkeit der
Probe.
In jüngster Zeit hat sich zwar die Atomabsorptionsspektroskopie als angemessene Technik erwiesen,
jedoch wird zur Durchführung dieses Verfahrens eine besondere und kostspielige technische Ausrüstung
erfordert, die in den meisten klinischen Laboratorien nicht zur Verfügung steht.
Insbesondere in jüngerer Zeit sind verschiedene Verfahren bekanntgeworden, die die Veränderung der
Farbe von Farbstoffen durch Calcium ausnutzen (R. L Searcy, »Diagnostic Biochemistry«, McGraw-Hill,
New York, 1969, S. 135, 136). Unter diesen Verfahren sind solche, die Natriumchloranilat, Kresolphthalein-Komplexon, Eriochromblau SE, Glyoxal-bis-(2-hydroxyanilin) und Alizarin verwenden. Auch wurde Calcein
verwendet, dessen Fluoreszenz gemessen wurde.
Natriuinchloranilat zur Zeit das verbreiteste. Im
Rahmen dieser Methode muß jedoch das Calcium vor der eigentlichen Analyse gefällt (als Caiciumchloranilat)
und zentrifugiert werdea Da aber prinzipiell Verfahren ~>
oder Bestimmungsmethoden, die ein Zentrifugieren oder mehrere Verfahrensstufen erfordern, im klinischen
Laboratorium nicht sonderlich geeignet sind, da sie sowohl einen höheren Arbeitsaufwand als auch die
Gefahr einer Kontamination mit Fremdcalcium in sich
ίο bergen, besteht ein dringendes Bedürfnis nach einem
kann.
'"> fluoreszenzanalytischen Calciumbestimmungen im Serum ausführbar und sind auch ausgeführt worden, haben
jedoch bislang nur zu erratischen Ergebnissen geführt
Solche Fehlbestimmungen sind im wesentlichen auf Wechselwirkungen, insbesondere auf Maskierungsef-
-'» fekte oder Fällungseffekte, zurückzuführen, die durch
andere im Serum vorhandene Stoffe bewirkt werden. Unter diesen Wechselwirkungen sind insbesondere die
Einflüsse von Magnesium und Phosphat zu nennen. Während Magnesium mit den üblichen kolorimetri-
-'· sehen oder fluoreszenzanalytischen Reagenzien im
allgemeinen ebenfalls farbverändemd oder fluoreszierend reagiert, führt die Reaktion mit Phosphat im Serum
zur Bildung von Calciumkomplexen, die eine Reaktion des Calciums mit den Indikatorreagenzien unterbindet.
«ι Sowohl Magnesium als auch Phosphate sind normalerweise im Serum in verschiedenen Mengen vorhanden.
Bei einer Reihe bekannter Bestimmungsmethoden konnten die Störeinflüsse des Magnesiums bereits
erfolgreich eliminiert werden. Es ist bisher jedoch noch
i"> nicht gelungen, den zu einer Farbminderung führenden
Einfluß des Phosphats zu eliminieren. Calciumbestimmungen, die nach den bekannten Verfahren in
Gegenwart von Phosphat durchgeführt werden, führen also immer durch ein teilweises Abfangen der
■i» Calciumionen durch die Phosphationen zu fehlerhaften
Bestimmungen des Calciumspiegels im Serum.
Da sich die Störreaktionen im klassischen Clark/Collip-Verfahren nicht direkt und von selbst zeigen, sind die
klinischen Chemiker diesen Problemen zumindest seit
^ den zwanziger Jahren unseres Jahrhunderts nachgegangen. Kramerstellte 1921 (Kramer B.und F. F.Tisdall,»A
simple Technique for the Determination of Calcium and Magnesium in Small Amount of Serum«, J. Biol. Chem.
47, 475-481 [1921]) sein Verfahren, von dem das
r>() Clark/Collip-Verfahren eine Modifikation ist, auf hohe
Phosphatspiegel ab. Seit dieser Zeit fand das Problem des Serumphosphats eine zunehmend stärkere Beachtung; so betont Gradwohl 1942 (R. B. H. Gradwohl,
»Clinical Laboratory Methods and Diagnosis«, C. V.
« Mosby Comb, Si. Louis, 1943, Band I, S. 279) im
»die Phosphate unlösliche Calciumsalze bilden würden«.
der Einfluß der Calciumionen auf Farbstoffe ausgenutzt
W) wird, sind viele Versuche unternommen worden, den
Einfluß von Phosphat auszuschließen. 1954 gelang es Kenny (A. D. Kenny und S. U. Toverud, »Noninterference of Phosphate in an Ethylenediominetetrascetate
Method for Serum Calcium«, Anal. Chem. 26, 1059
hr> [1959]) im Rahmen eines solchen Verfahrens das
Calcium unter Eliminierung des Phosphateinflusses mit Äthylendiamintetraessigsäure zu titrieren. Diese Methode beinhaltei jedoch eine Titration, die im Rahmen
klinischer Routinebestimmungen weniger geeignet ist als es die direkten kolorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen
Bestimmungen sind.
Im Jahre 1965 ging Connerty (H. V. Connerty und A. R. Briggs, »Clinical Chemistry«, 11,716-728[1965])das
Problem dadurch an, daß er die Seren eine Stunde vor der eigentlichen Bestimmung mit Säure behandelt
Dieses Verfahren ist aber keine vollwertige Lösung der Aufgabe, da sich die störenden Komplexe nicht nur in
der folgenden alkalischen Stufe wieder bilden, sondern vor allem auch nicht wegen des hohen Zeitbedarfs
dieser Bestimmungsmethode.
Im Jahre 1969 gelang es Burr (R. G. Burr, »Clinical Chemistry«, 15, 1191-1197) das Phosphatproblem
dadurch zu reduzieren, daß er geringere Mengen Probenserum verwendete, wodurch er geringere Calciumphosphatmengen
in der Lösung erreichte. Diese Methode ist die vermutlich beste der bisher bekannten
Methoden zur Bestimmung von Calcium in Gegenwart von Phosphat, jedoch muß sie eine verminderte
Empfindlichkeit in Kauf nehmen, ohne dabei das Problem restlos zu lösen.
Trotz aller Versuche blieb also bislang, wie gezeigt die Aufgabe noch immer ungelöst ein schnelles und
genaues Verfahren zur Bestimmung des Calciumspiegels
im Blutserum zu finden, das insbesondere die Störeffekte des Phosphats ausschaltet und mit Standardgerät
durchgeführt werden kann, das in praktisch jedem klinischen Laboratorium bereitsteht.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur koiorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen
quantitativen alkalischen Calciumbestimmung im Blutserum vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß das Serum vor der Zugabe des Färb- bzw. Fluoreszenzindikators und der Lauge in saurer Lösung
mit Molybdat versetzt wird.
Durch eine solche Vorstufe, in der das Phosphat in saurer Lösung mit Molybdat, vorzugsweise in Gegenwart
von Polyvinylpyrrolidoii, vor der Zugabe der
alkalischen Farbstofflösung umgesetzt wird, wird der Störeinfluß des Phosphats bei der Calciumbestimmung
äußerst wirkungsvoll ausgeschaltet. Darüber hinaus wird die Unterbindung des Störeinflusses des Phosphats
in einer Weise erreicht, die die Bestimmung selbst nicht wesentlich komplizierter gestaltet. Außerdem entfällt
die Notwendigkeit einer Beschränkung auf kleine und kleinste Serumprobenmengen. Durch die Zugabe des
Polyvinylpyrrolidons wird die Bildung des Molybdatophosphats beschleunigt.
Angesichts der jahrzehntelangen vergeblichen Versuche, ein zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung des
Calciumspiegels im Blutserum zu finden, mag es verwunderlich erscheinen, daß die vorliegende Erfindung
nicht bereits früher gemacht wurde, und zwar selbst dann, wenn sie weitab von dem Bereich der
Bemühungen liegt, von dem die Verfahren nach dem Stand der Technik ausgingen. Schließlich ist die
Reaktion von Molybdat mit Phosphat in saurer Lösung dem analytischen Chemiker zumindest seit 1887 (M. F.
Osmond, Bull. Soc. Chim, Paris, 47, 745 [1887], zitieit in
R. J. Henry, »Clinical Chemistry«, Harper & Row, 1964, S. 414) bekannt Auch stammt die Phosphatbestimmung
von Fiske und Subbarow (C. H. Fiske und Subbarow, Biol. Chem. 66, 375 [1925]), die von der Molybdatreaktion
Gebrauch macht, bereits aus dem Jahre 1952 und ist seither verbreitet angewendet worden.
Noch erstaunlicher werden die Bemühungen nach dem Stand der Technik um eine störunanfäilige
Calciumbestimmung, wenn man sich vor Augen hält, daß
es im klinischen Laboratorium durchaus gebräuchlich ist die Calciumbestimmung und die Phosphatbestimmung
nacheinander und getrennt voneinander mit derselben Probe durchzuführen, da beide Bestimmungen
insbesondere für die Knochenphysiologie und für die Pathologie von höchster Bedeutung sind. Selbst
wenn jedoch diese beiden Bestimmungen mit derselben Blutprobe und nicht selten sogar vom selben Chemiker
oder Assistenten durchgeführt werden, so ist das merkwürdige Phänomen, daß die vorliegende Erfindung
über Jahrzehnte offensichtlich nicht naheliegend war, wahrscheinlich darin zu sehen, daß sowohl die
Calciumbestimmung als auch die Phosphatbestimmung nach getrennten Vorschriften und in getrennten
Arbeitsgängen nacheinander und getrennt voneinander durchgeführt wurden.
Ein weiterer Aspeki, der ein Vorurteil der Fachwelt gegen die vorliegende Erfindung begründet haben mag,
obwohl die analytischen Chemiker sich um eine Umgehung des Phosphatstöreinflusses bei der Calciumbestimmung
bemüht hatten und obwohl seit Jahrzehnten das Bedürfnis nach genauen Calciumbestimmungen
bestand und obwohl auch die Reaktion des Molybdats mit dem Phosphat bekannt war, mag darin zu suchen
sein, daß das bei der Umsetzung gebildete Molybdatophosphat gelb gefärbte Lösungen bildet, deren Störeinnüsse
auf die Farbreaktion des Calciums man offensichtlich fürchtete. Auf Grund der gelb gefärbten Molybdatophosphatlösungen
hat die Fachwelt zufolge des Standes der Technik offensichtlich die Gegenwart von Phosphationen
für das kleinere Übel im Vergleich zur Gegenwart von Molybdatophosphationen bei der
Calciumbestimmung gehalten.
Auch ist bereits Polyvinylpyrrolidon bei dei Umsetzung
von Molybdat mit Phosphat verwendet worden (J. W. Denney und L W. Denney, US-Patent 35 47 586,
erteilt am 15. Dezember 1970). Die nach diesem Stand der Technik in Verbindung mit dem Polyvinylpyrrolidon
verwendeten Molybdaikonzentrationen sind jedoch so hoch, daß sie im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu
unbrauchbaren Ergebnissen führen würden; ein Störeinfluß auf die Bildung der gefärbten oder fluoreszierenden
Calciumindikator-Komplexe wäre dann nicht mehr zu unterbinden.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens ist die zu erwartende Molybdatophosphatfarbe
jedoch kein Problem. Die gewünschte Beseitigung des Störeinflusses von Phosphat wird ohne Inkaufnahme
neuer Störeinflüsss oder Maskierungseffekte erreicht
Im folgenden ist die Erfindung anhand von zwei Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
B e i s ρ i e 1 1
a) Reagenzien
a) Reagenzien
Molybdänsäurereagenz
45 mg Natriummolybdat und
3 g Polyvinylpyrrolidon gelöst in
100 ml 0,2 η H2SO4
3 g Polyvinylpyrrolidon gelöst in
100 ml 0,2 η H2SO4
Farbreagenz
50 mg Glyoxal-bis-(2-hydroxyanilin) und Di-(2-
hydroxyphenylimino)-Äthan gelöst in
100 ml Methanol p.a.
100 ml Methanol p.a.
Natriumhydroxid
0,2 η
0,2 η
J(I
b) Verfahrensschritte
Es werden Blindversuche und Testversuche durchgeführt In die Test-Reagenzgläser und in das Reagenzglas
des Blindversuches werden je 1 mi Molybdänsäurereagenz gegeben. Den Reagenzgläsern werden 0,05 ml
Serum oder Standard zugeseU-U Es wird gut geschüttelt
und 1 min stehengelassen. Anschließend werden 2 ml des Farbreagenz und 2 ml Natriumhydroxid dazugegeben
und vermischt Die Absorption der Testreagenzgläser gegen das Blindreagenzglas wurde bei 550 ηιμ
gemessen. Die Absorption des unbekannten Serums ist der Absorption des Standards proportional. Der
Calciumwert d?:s Serums wird durch einen Vergleich der
gemessenen optischen Dichte mit einer Eichkurve erhalten, die aus wäßrigen Lösungen mit bekannten
Calciumgehalten nach dem gleichen Verfahren erhalten wurde.
Beispiel 2
a) Reagenzien
a) Reagenzien
Molybdatreagenz
18 mg Natriummolybdat und
3 g Polyvinylpyrrolidon gelöst in
100 ml 0,2 η H2SO4 ?>
3 g Polyvinylpyrrolidon gelöst in
100 ml 0,2 η H2SO4 ?>
Wasser
Ein ausreichend gut deionisiertes oder destilliertes Wasser.
KOH, 0,9 η i(l
44,4 g KOH reinst (unter der Annahme chemisch reiner KOH) werden gelöst und mit deionisiertem
Wasser auf 1 1 verdünnt. Die Lösung wird Polyäthylen aufbewahrt
Reagenzstammlösung
Es wird eine Stammlösung aus 1,00 mg/ml Calcein oder Fluoreszein-Komplexon in 0,9 η KOH hergestellt.
Die Lösung wird in Polyäthylen aufbewahrt und ist mindestens einen Monat lang bei 4°C im 4"
Dunkeln stabil.
Arbeitsreagenzlösung
7,0 ml der Stammreagenzlösung werden mit 0,9 η KOH auf 1 1 verdünnt. Die in Polyäthylen
aufbewahrte Lösung ist bei Zimmertemperatur eine Woche lang stabil.
b) Ausrüstung r>o
Ein Fluorometermodell 110 oder Modell 111 von
Turner, folgendermaßen ausgestattet:
Lampe: Nr. 110-850 (Standard) oder Nr. 110-851
(fernes UV) „
Filter: Primärfilter Nr. 110-816(2A)
+ Nr. 110-813(47B)
Sekundärfilter Nr. 110-818 (2A-12)
+ neutrale Filter zur Empfindlichkeitseinstellung b0
+ Nr. 110-813(47B)
Sekundärfilter Nr. 110-818 (2A-12)
+ neutrale Filter zur Empfindlichkeitseinstellung b0
Cuvetten: 12 χ 75 mm klar. Kunststoff (Polystyrol),
handelsübliche verfügbare Kulturröhrchen mit Kappenverschluß. Es werden einzeln verpackte Roh. chen bevorzugt
c) Probe
Serum oder heparinisiertes Plasma,
d) Verfahren
d) Verfahren
1. 1 ml Molybdatreagenz wird in jedes Reagenzglas pipettiert Es werden 0,02 ml Serum in jedes Glas
dazugegeben und 1 min lang stehengelassen.
2. 4,00 ml Arbeitsreagenz werden in eine 12 χ 75 mm Kunststoffcuvette gegeben.
3. Die Cuvette wird verschlossen und ihr Inhalt durch zehnmaliges Umkehren durchmischt
4. Die angesetzten Proben werden 10 min lang im Wasserbad bei einer auf ±1°C konstant gehaltenen
Temperatur zwischen 20 und 300C gereift.
5. Die Proben werden im Fluorometer gemessen und die abgelesenen Werte werden zur Bestimmung
anhand von Eichkurven verwendet, die mit Fluoreszenzeinheiten von Standardwerten mit
bekanntem Calciumgehalt nach dem vorstehenden Verfahren erhalten wurden.
Die vorstehend beschriebenen Vorschriften sind Beispiele für die Ausführung der Erfindung und können
mit anderen Indikatorreagenzien in gleicher Weise durchgeführt werden. Auch können andere Molybdate,
insbesondere solche einwertiger Kationen, wie beispielsweise Ammonium, verwendet werden, deren
molare Molybdatkonzentration im sauren Reagenz im wesentlichen derjenigen der beschriebenen Ausführungsbeispiele
entspricht. Die Menge Natriumhydroxid muß dabei so gewählt werder*, daß sie die in der ersten
Stufe verwendete Säuremenge genau titriert und einen End-pH liefert, der den speziellen Anforderungen des
Indikators, d. h. der gefärbten oder der fluoreszierenden Substanz, entspricht.
Das Molybdat oder das Molybdat und das Polyvinylpyrrolidon können im Reagenzglas zuvor getrocknet
werden, wodurch eine größere Stabilität des Molybdänsäurereagenzes erreicht wird. Bei der Ausführung des
Versuches mit einem derart vorbehandelten Ansatz wird 1 ml 2 η H2SO4 dazu gefügt
Eine auf die Weise durchgeführte quantitative Calciumbestimmung wird durch Phosphationen nicht
gestört, also auch nicht durch jene Phosphationen, die normalerweise in unterschiedlichen Mengen im Blutserum
und im Urin vorhanden sind. Bei allen anderen klinischen nach dem Stand der Technik bekannten
kolorimetrischen oder fluoreszenzanalytischen Calciumbestimmungen
führt die Gegenwart von Phosphationen dagegen zu unbrauchbaren Ergebnissen.
Dagegen bietet das Verfahren gemäß der Erfindung ein neues und klinisch vielseitig anwendbares kolonmetrisches
oder fluoreszenzanalytische-j Verfahren zur
Bestimmung von Serumcalcium; die zur Durchführung dieses Verfahrens erforderlichen Reagenzien sind
beschrieben worden.
Claims (5)
1. Verfahren zur kolorimetrischen oder fluoreszenzanaiytischen quantitativen alkalischen Calciumbestimmung im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum vor der Zugabe des
Färb- bzw. Fluoreszenzindikators und der Lauge in saurer Lösung mit Molybdat versetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum vor der Zugabe des
Indikators und der Lauge zusätzlich zum Molybdat mit Polyvinylpyrrolidon versetzt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum mit einer
sauren Molybdatlösung versetzt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum mit einer
schwefelsauren Lösung von Molybdat und Polyvinylpyrrolidon versetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Molybdat eines
einwertigen Kations benutzt wird.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DE2225275C3 DE2225275C3 (de) | 1981-01-22 |
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ID=22517831
Family Applications (1)
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-
1972
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- 1972-05-24 DE DE2225275A patent/DE2225275C3/de not_active Expired
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| FR2138988A1 (de) | 1973-01-05 |
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| DE2225275C3 (de) | 1981-01-22 |
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