DE2264193A1

DE2264193A1 - Verfahren zur herstellung von lysin enthaltenden peptiden

Info

Publication number: DE2264193A1
Application number: DE2264193A
Authority: DE
Inventors: Ralph Franz Hirschmann; Daniel Frank Veber
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-12-30
Filing date: 1972-12-29
Publication date: 1973-07-05
Also published as: FR2167175A5; JPS5058015A; CH590824A5; US3780015A; GB1379937A; NL7216799A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abschirmen von Aminogruppen bei einer Peptidsynthese und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Lysin enthaltenden Peptiden, bei dem die endständige Aminogruppe während der zur Bildung des Peptids führenden Kondensationen durch eine Pyridyl-h-methyloxycarbonyl-gruppe abgeschirmt wird und diese Gruppe, nachdem das gewünschte Peptid erhalten ist, selektiv durch Zink in .Säure abgetrennt wird.

Die Synthese von Peptiden, insbesondere Heteropeptlden, ist ein Problem., das die Fachwelt seit langem beschäftigt. Die Produkte dieser Synthesen sind für die Synthese von Proteinen

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verwendbar. Einige von ihnen sind therapeutisch aktiv. Außerdem werden sie für Studium und Analyse von Proteinen und insbesondere zur Aufklärung der Art der Wirkung von Enzymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wesentlichen Körperfunktionen verwendet.

Ein besonders schwieriges Problem ist die Synthese von Lysin enthaltenden Peptiden wegen der Anwesenheit einer weiteren endständigen Aminogruppe, die Anlaß zu Nebenreaktionen geben kann. Meistens wird die endständige Aminogruppe mit einer blockierenden Gruppe abgeschirmt, um zu verhindern, daß sie an der Peptidbildungsuniüetzung teilnimmt, und die abschirmende Gruppe wird wieder abgetrennt, wenn das gewünschte Peptid gebildet ist. Es sind schon eine Anzahl abschirmende Gruppen bekannt, die bei der Synthese von einen Lysinrest enthaltenden Peptiden verwendet werden können. Viele dieser bekannten abschirmenden Gruppen sind aber nur schwer während der Endstadien der Synthese abzutrennen oder sind einigen der im allgemeinen bei der Peptidsynthese verwendeten Reagenzien gegenüber instabil.

Von der zur Abschirmung der endständigen Aminogruppe von Lysin bei der Peptidsynthese verwendeten Gruppe ist zu fordern, daß sie bei den zur Abtrennung blockierender Gruppen, wie t-Butyloxycarbonyl, von anderen Teilen des synthetisierten Peptids angewandten sauren Reaktionsbedingungen stabil ist. Die t-Butyloxycarbonyl-gruppe kann unter sauren Bedingungen, beispielsweise durch Behandeln mit Trifluoressigsäure oder mit Chlorwasserstoff in wasserfreiem oder wäßrigem Medium, abgetrennt werden. Die die endstandige Aminogruppe von Lysin abschirmende Gruppe soll aber nicht nur unter diesen sauren Reaktionsbedingungen stabil sein, sondern soll auch vollständig abgetrennt werden, ohne daß dabei andere Teile des Peptide, angegriffen werden. Üblicherweise zur Abschirmung der funkt ioricllcn endständigen Arrrinogruppe von Lysin verwendete Gruppen «inc! Benzyl oxy carbonyl, Trifluoracetyl und p-Toluolsulfonyl. Die Β·.·η -

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-P- BAD ORIGINAL

zyloxycarbonyl-gruppe ist unter den zur Abtrennung der t-Butyloxycarbonyl-gruppe angewandten Bedingungen nicht vollständig stabil, und es kommt infolgedessen zu einem Teilverlust der endständigen Benzyloxyearbonyl-gruppe, sobald versucht wird, bei einer Peptidsynthese eine blockierende t-Butyloxycarbony1-gruppe selektiv zu entfernen. Die Abtrennung der abschirmenden Benzyloxycarbonyl-gruppe von einem Lysin enthaltenden Peptid kann durch Hydrieren in einem heterogenen System mit einem Edelmetallkatalysator erfolgen. Dieses Verfahren eignet sich zwar für kleine Peptide; große Peptide haben jedoch eine stark zusammengerollte oder -gefaltete "tertiäre" Struktur, so daß die abzutrennende Benzyloxycarbonyl-gruppe oft für den Katalysator nicht zugänglich ist. Außerdem ist die Entfernung der Benzyloxyearbonyl-gruppen durch katalytisehe Hydrierung nicht nur dann ungenügend, wenn das Molekül zu groß wird; sondern das Verfahren ist auch bei verhältnismäßig kleinen Molekülen dann nicht zufriedenstellend, wenn es sich um Schwefel enthaltende Peptide, wie Peptide, die Methionin oder Cystein enthalten, handelt.

Eine blockierende Trifluoracetylgruppe kann auch zur Abschirmung der endständigen funktionellen Aminogruppe von Lysin verwendet werden. Die Abtrennung dieser blockierenden Gruppe erfolgt bei schwach basischen Bedingungen, beispielsweise in wäßrigem Piperidin. Der Nachteil dieser blockierenden Gruppe besteht darin, daß viele zur Bildung von Peptiden führende Kondensationen in schwach basischen Medien durchgeführt werden, so daß es während der Peptidsynthese zu einem \^erlust an den Trifluoracetylgruppen und damit zu unerwünschten Hebenreaktionen kommt.

Die endständige Air.inogruppe von Lysin ist auch schon durch eine p-Toluolsulfonylgruppe abgeschirmt worden. Diese Gruppe ist zwar bei den zur Abtrennung der t -Butyl oxy carbonyl -gruppe und der Benzyloxycarbonyl-gruppe erforderlichen sauren Bedingungen stabil ,· die Abspaltung der p-Toluolsulfonylgruppe erfolgt aber zu

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gegebener Zeit durch Natrium in flüssigem Ammoniak,und diese Bedingungen geben bei vielen Peptlden Anlaß zu unerwünschten Nebenreakt ionen.

Auch die Pyridyl-3-methyloxycarbonyl-gruppe ist schon zur Abschirmung der endständigen,Aminogruppe von Lysin verwendet worden. Diese Gruppe kann durch katalytische Hydrierung oder durch Natrium in flüssigem Ammoniak von Peptiden abgetrennt werden. Die Abtrennung durch katalytische Hydrierung ist bei kleinen Peptiden möglich, eignet sich jedoch nicht für große Peptide oder für Schwefel enthaltende Peptide. Der Nachteil der Verwendung von Natrium in flüssigem Ammoniak besteht, wie oben erwähnt, darin, daß die Abtrennung der blockierenden Pyridyl-3-methyloxycarbonyl-gruppe von unerwünschten Nebenreaktionen begleitet ist.

Die gemäß der Erfindung zur Abschirmung der endständigen Aminogruppe von Lysin verwendete Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe hat gegenüber den oben erwähnten blockierenden Gruppen bestimmte Vorteile. Sie ist bei sauren oder basischen Bedingungen in dem pH-Bereich von 0 bis 12 stabil, so daß es beispielsweise

möglich ist, sogar die Benzyloxycarbonyl-gruppe in Anwesenheit des Pyridyl-4-methyloxycarbonyls beispielsweise mit wasserfreiem Fluorwasserstoff selektiv zu entfernen. Die gemäß der Erfindung verwendete blockierende Gruppe ist auch in wäßriger oder wasserfreier Chlorwasserstoffsäure bei Raumtemperatur stabil. Obwohl die abschirmende Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe bei den für die Peptidsynthese angewandten Reaktionsbedingungen stabil ist, kann sie bei reduzierenden Bedingungen, beispielsweise durch Zink in Gegenwart von Säure, vollständig entfernt werden, ohne daß dadurch andere Teile des Peptidmoleküls angegriffen worden.

Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird die Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe durch Umsetzen eines Lysin/Schwermetall-Kotr.plexes mit Pyridyl-4-methylsuccinimld-carbonat in die endständige Aminogruppe von Lysin eingeführt.

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Pyridyl^-methylsuceinimid-earbonat wird hergestellt, indem man Succinimidochlorformiat, das nach bekannten Verfahren erhalten wird, mit 4-Pyridylcarbinol umsetzt. Die Umsetzung wird durchgeführt, indem man das Succinimidochlorformiat, in einem organischen Lösungsmittel gelöst, einer Lösung des 4-Pyridylcarbinols in einem organischen Lösungsmittel zusetzt. Die Umsetzung erfolgt in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, Chloroform, Äthylacetat und dergl., bei niedriger Temperatur, vorzugsweise zwischen -20 und O⁰C. Das 4-Pyridylcarbinol wird langsam unter Rühren zugesetzt, so daß verhindert wird, daß die Reaktionstemperatur auf über O⁰C steigt. Die für diese Umsetzung verwendete Menge an Succinirr.idochlorformiat soll etwas größer sein als die dem verwendeten 4-Pyridylcarbinol äquimolare Menge. Vorzugsweise wird das Succinimidochlorforrniat in einem Überschuß von 1 bis 10 Mol-$ verwendet. Nach Beendigung der Zugabe des Pyridylcarbinols wird ein tertiäres organisches Amin, beispielsweise N-Methylmorpholin, Triäthylamin oder Pyridin, bei O⁰C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von 0 bis 5⁰C rühren gelassen und dann nacheinander mit einer Säure, beispielsweise Schwefelsäure, einer wäßrigen Base, beispielsweise Natriumbicarbonat, und dann mit Wasser extrahiert. Das Pyridyl-4-methylsueeinimid-carbonat wird dann nach bekannten Verfahren abgetrennt und gereinigt.

Der in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Metallkomplex von Lysin wird hergestellt, indem man 1 Moläquivalent Lysin mit etwa 2 Moläquivalent eines Metallsalzes in einem wäßrigen Medium umsetzt. Das Metallsalz ist ein Salz von Kupfer, Kobalt, Nickel, Aluminium und dergl. Der Lysin/Metall-Komplex wird erhalten, indem man die Reagenzien in einem wäßrigen Medium miteinander vermischt, und kann für die nächste Stufe des Verfahrens verwendet werden, ohne daß man ihn abtrennt oder reinigt.

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Die Herstellung yon N-8-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin erfolgt durch Umsetzen eines Metallkomplexes von Lysin mit Pyridyl-4-methylsuccinimido-carbonat in einem wäßrigen Medium. Die Umsetzung wird unter basischen Bedingungen, beispielsweise bei einem pH von 7 bis 12, vorzugsweise bei einem pH von 10, durchgeführt. Das pH des Reaktionsmediums wird durch Zugabe einer wäßrigen Base, beispielsweise 50/a-igem Natriumhydroxyd, auf 10 eingestellt. Das Pyridyl-4-methylsuccinimido-carbonat wird langsam zugesetzt, während das pH durch Zugabe von Base bei 9*5 gehalten wird. Die Zugabe erfolgt bei einer Temperatur von 0 bis 4o°C, vorzugsweise 20⁰C. Wenn der Verbrauch von Base aufgehört hat, wird das pH durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Essigsäure, auf 7>5 eingestellt, um den Metallkomplex von Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin auszufällen, wonach der Komplex abfiltriert werden kann.

Das freie Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin kann erhalten werden, indem man das Metallsalz in Wasser oder wäßriger Säure, beispielsweise 10^-iger Essigsäure, mit gasförmigem Schwefelwasserstoff umsetzt. Das Produkt kann nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise durch Abdampfen des Lösungsmittels und Umkristallisieren, von dem Reaktionsgemisch gewonnen werden.

In der α-Stellung abgeschirmte £-Pyridyl-4-methyloxycarbonyllysinverbindungen können hergestellt werden, indem man ein α-abgeschirmtes Lysin unter basischen Bedingungen, beispielsweise bei einem pH von 7 bis 12, vorzugsweise 9>5* mit Pyridyl-4-methylsuccinimido-carbonat umsetzt. Einer basischen wäßrigen Lösung des in α-Stellung abgeschirmten Lysins wird bei einer Temperatur von 0 bis 25⁰C langsam eine äquimolare Menge an Pyridyl-4-methyloxycarbonylsuccinimido-carbonat zugesetzt. Das pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von wäßriger Base, beispielsweise wäßrigem Natriumhydroxyd, auf dem gewünschten Wert gehalten. Nachdem der Verbrauch von Base aufgehört hat, wird das Gemisch mit einem organischen Lösungsmittel,

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beispielsweise Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid und dergl., extrahiert. Das pH der Lösung wird durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Schwefelsäure, auf 4,2 eingestellt, und die angesäuerte Lösung wird erneut mit dem gleichen Lösungsmittel wie oben extrahiert. Die von dem angesäuerten Reaktionsgemisch erhaltenen organischen Extrakte werden miteinander vereinigt, getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei das 6-pyrldyl-4-methyloxycarbonyl-a-abgeschirmte Lysin erhalten wird. Die Reinigung der Verbindungen kann nach üblichen Verfahren, wie Umkristallisieren und Chromatographie, erfolgen, η-substituierte Lysinverbindungen, die in dem obigen Verfahren verwendet werden können, sind beispielsweise Benzyloxycarbonyl-Iysin, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-lysin, p-Brombenzyloxycarbonyl-lysin, p-Methoxybenzyloxycarbonyllysin, t-Butyloxycarbonyl-lysin, o-Nitrophenylsulfenyllysin, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-lysin und dergl.

Die blockierende Pyridyl-4-methyloxyearbonyl-gruppe kann durch Umsetzung mit Zinkstaub in einem wäßrigen sauren Medium vollständig von Lysin oder einem einen Lysinrest enthaltenden Peptid abgetrennt werden. Diese Umsetzung wird durchgeführt, indem man das N-E-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin in 50#-iger wäßriger Essigsäure auflöst und dann der Lösung den Zinkstaub unter Rühren mit hoher Geschwindigkeit auf einmal zusetzt. Die Umsetzung wird zweckmäßig bei Raumtemperatur durchgeführt; jedoch können auch andere Temperaturen angewandt werden. Die Zeit, für die man die Reaktion ablaufen läßt, hängt von der Art der das Lysin enthaltenden Verbindungen oder des Peptids ab und kann zwischen 1 und 3 Stunden liegen. Die verwendete Menge an Zinkstaub kann zwischen iO und 200 Teilen ,je Teil Pyrldy1-4-methyloxycarbonyl-Iysinverbindung variieren. Die vollständige Abtrennung der blockierenden Gruppe wird durch Dünnschichtchromatographie festgestellt. Das bei der Abtrennung der blockierenden Gruppe erhaltene Peptid kann nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise durch Gelfiltration, isoliert werden.

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Für die Herstellung von Peptiden gemäß der Erfindung können die üblicherweise in der Peptidchemie angewandten Kondensationsmethoden, wie die Carbodiimid- oder die Azidmethode oder beispielsweise die Methode der gemischten Anhydride oder aktivierten Ester, angewandt werden. Die Peptide werden aus Aminosäuren aufgebaut,,indem man natürlich vorkommende α-Aminosäuren, aus solchen Aminosäuren aufgebaute Peptide oder Derivate davon, die als wenigstens eine Komponente Lysin enthalten, kondensiert. Die erfindungsgemäße Verbesserung dieses Peptldaufbaus besteht in der Abschirmung der £-Aminofunktion des Lysinrestes durch die Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe.

Unter "natürlich vorkommenden Aminosäuren" sind alle natürlich vorkommenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form, beispielsweise Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Cystin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxylysin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Ornithin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin, zu verstehen.

Ein Beispiel für.die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfin-'dung bei der Peptidsynthese ist die Herstellung des Nonapeptids T27 Phenylalanyl-seryl-tryptophanyl-glycyl-alanylglutamyl-glycyl-glutaminyl-lysin (im folgenden als Phe-Ser-Trp-GIy-Ala-Glu-Gly-GIn-Lys bezeichnet), das eine hochgradige encephalitogene Wirkung besitzt. Eine experimentelle allergische Encephalomyelitis ist eine experimentell erzeugte entzündliche und dimyelinierende Erkrankung des Zentralnervensystems, und eine Untersuchung der encephalitogenen Wirkung von Peptid T27 ergibt ein wertvolles Modell für die Untersuchung von Autoimmunerkrankungen. Das Peptid T27 kann durch. Blocksynthese hergestellt werden, indem zwei Peptidsegmente des Nonapeptids für sich synthetisiert und diese Segmente dann in der richtigen Reihenfolge zu dem gewünschten Peptid gekoppelt werden. Die beiden Peptidsegmente sind das Tetrapeptid: Glutamyl-glycyl-glutaminyl-(N-E-pyridy1-4-methyloxycarbonyI)-lysin und das Pentapeptld! t-Butyloxycarbonylphenylalanyl-

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seryl-tryptophanyl-glycyl-alanin-hydrazid. Das das Lysin enthaltende Tetrapeptid wird in an sich bekannter Weise durch stufenweise Kupplung erhalten, indem man N-E-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin nacheinander mit N-Carboxy-glutamin-anhydrid, N-Thiocarboxy-anhydrid von Glycin und N-Carboxyglutaminsäure-anhydrid umsetzt. Die Umsetzung wird zweckmäßig durchgeführt, indem man die Reaktionsteilnehmer in wäßriger Lösung bei O⁰C und einem pH von 10,2 kräftig miteinander verrührt. Die N-Carboxy-anhydride von Glutamin und Glutaminsäure und das N-Thiocarboxy-anhydrid von Glycin, hergestellt nach bekannten Verfahren, werden im allgemeinen innerhalb von 15 bis j50 Sekunden alle auf einmal zugesetzt. Alkali, beispielsweise Kaliumhydroxyd, wird zugesetzt, soweit es zur Erhaltung des pH notwendig ist. Die Umsetzung des N-Thiocarboxyanhydride von Glycin wird bei einem pH von 8,85 durchgeführt. Die Umsetzungen sind im allgemeinen innerhalb weniger als 5 Minuten beendet, wie daran erkennbar ist, daß kein Basenzusatz mehr erforderlich ist. Wenn die Umsetzung beendet ist, wird das pH durch Zugabe einer Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure, auf 3 eingestellt, und das System wird mit Stickstoff gespült, um Kohlendioxyd zu entfernen. Das Tetrapeptid wird durch Gefriertrocknen des Reaktionsproduktes isoliert und durch Gelfiltration, Chromatographie und Elektrophorese gereinigt.

Das Pentapeptidsegment wird nach dem Merrifield-Festphasen-Verfahren, ausgehend von t-Boc-alanin, hergestellt. Bei diesem Verfahren wird das Carboxylende von Alanin (und in den folgenden Stufen des Polypeptids) covalent an ein unlösliches Polymerharz, beispielsweise als Carboxylester des harzgebundenen Benzylalkohol in hydroxymethyl-substituiertem Polystyrol/Divlnylbenzol-Harz, gebunden. Die abschirmende t-Butyloxycarbonyl gruppe wird selektiv entfernt, indem man das abgeschirmte Amino acylharz mit wasserfreiem Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Dioxan, umsetzt. Das bei dieser Umsetzung erhaltene Aminoacylharz-hydrochlorid wird dann mit einer Lösung von Triäthylamin in Chloroform versetzt, um das

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Hydrochlorid zu neutralisieren und die freie Aminosäure in einer für die Kupplung mit der nächsten Aminosäure geeigneten Form in Freiheit zu setzen. Dann wird das t-Butyoxycarbony1-derivat der nächsten Aminosäure in der gewünschten Peptidkette zusammen mit Dicyclohexylcarbodiimid als Kupplungsmittel zugesetzt. Nacheinander werden die t-Butyloxycarbonyl-derivate der folgenden Aminosäuren - Glycin, Tryptophan, Serin und Phenylalanin - zugesetzt. Durch Abspaltung des Pentapeptids von dem Harz durch Umsetzen mit Hydrazin in Dimethylformamid wird das Pentapeptid-hydrazid erhalten.

Das'Pentapeptid-azid wird hergestellt, indem man das t-Boc-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-hydrazid in Dimethylformamid mit Isoamylnitrit in Gegenwart von Salzsäure umsetzt. Die Umsetzung wird bei -25 bis -J55°C durchgeführt. Die Azidkupplung wird durchgeführt, indem man das Tetrapeptid -Glu-Gly-Gln-fe-i-NocJ-Lys-, in Dimethylformamid gelöst, der obigen Azidlösung beim pH 5 bei -10⁰C zusetzt. Das pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von Diisopropylathylamin auf 7,2 eingestellt, und das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei -10⁰C gerührt, wobei ein klares dickes Gel, das bei Zugabe von Ä'ther einen Niederschlag erzeugt, erhalten wird. Der Feststoff wird abgetrennt und mit Äther, Methanol/Wasser und Wasser gewaschen. Das Produkt wird durch Gefriertrocknen der wäßrigen Waschflüssigkeiten und Trocknen des zurückbleibenden Feststoffes im Vakuum erhalten.

Die blockierende t-Butyloxycarbonyl-gruppe wird von dem Nonapeptid entfernt, indem man dieses mit Trifluoressigsäure, die Mercaptoäthanol als Kationendesoxydationsmittel zum Schutz des Trp-Kerns enthält, behandelt. Die Umsetzung wird bei 25⁰C für etwa 5 Minuten durchgeführt, und das Nonapeptid fällt bei Zugabe von Ä'ther und Petroläther aus. Das Peptid wird durch Abtrennen der Lösungsmittel isoliert und durch Chromatographie gereinigt. Die Abtrennung der blockierenden Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe von dem Nonapeptid erfolgt durch Behandeln des Peptids mit Zinkstaub in wäßriger Essigsäure. Die Um-

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Setzung wird 1 Stunde lang bei 25⁰C durchgeführt. Das Zink wird durch Zentrifugieren von dem Reaktionsgemisch abgetrennt, und das Nonapeptid wird durch Chromatographie gereinigt.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Für die Aminosäuren, ihre Derivate und einige gemäß der Erfindung bevorzugte abschirmende Gruppen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Aminosäure	Abkürzung
Alanin	Ala
Glutaminsäure	GIu
Glutamin	Gin
Glycin	GIy
Lysin	Lys
Phenylalanin	Phe
Serin	Ser
Trypt ophan	Trp
Abschirmende Gruppen	Abkürzung
t-Butyloxycarbonyl	t-Boc
Pyridyl-4-methyloxy-
carbonyI	i-Noc
Benzyl at her	OBz
Benzylester	Bz

Beispiel I

A. Herstellung von £-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysln 1. Pyridyl-4-methy1-sucoinimidocarbonat

6,54 g (0,06 Mol) 4-Pyridylcarbinol werden getrocknet, indem man zweimal je 75 ml Benzol abdestilliert, und dann in 45 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird auf 0° gekühlt, und eine Lösung von 11,75 g (O,O65 Mol) Sugginimidochlorformiat,

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hergestellt nach dem von D. Stevenson und G.T. Young, J. Chem. Soc. (c) 2389 (1969)* beschriebenen Verfahren, in 60 ml Methylenchlorid wird tropfenweise unter Rühren so zugesetzt, daß ein Erwärmen auf über 0 vermieden wird. Nach Beendigung der Zugabe wird eine Lösung von 5*88 g (0,058 Mol) N-Methylmorpholin in 8 ml Methylenchlorid innerhalb etwa 2 Minuten unter Rühren bei 0° zugesetzt. Die Lösung wird I5 Minuten bei 0 bis 5 gerührt und dann rasch mit I50 ml 0,1η Schwefelsäure, 150 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und I50 ml Wasser extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden mit 4o ml Methylenchlorid extrahiert, und die vereinigten Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet. Das Methylenchlorid wird im Vakuum abgedampft, der Rückstand wird einmal mit Hther gespült und mit Äther verrieben. Durch Filtration erhält man 10,4 g rohes Pyrldyl-4-methylsuccinimidocarbonat. Dieses Material wird in der Mindestmenge Äthylacetat gelöst, und die Lösung wird filtriert. Dann wird Hexan bis zum Trübungspunkt zugesetzt, und die Lösung wird erneut filtriert. Das Verfahren wird viermal durchgeführt. Nach der abschließenden Filtration hat die Lösung eine leicht gelbe Farbe. Nach Animpfen kristallisiert das Pyridyl-4-methylsuccinimidocarbonat langsam über Nacht: IR zeigt C=O bei 4,59, 5,59 und 7.75μ, F 92 bis 94°.

2. 6-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin

Eine Lösung von 1,82 g (0,01 Mol) Lysin-hydrochlorid in 10 ml Wasser wird mit einer Lösung von 0,935 g (0,005 Mol) CuCl₂.2H₂0 in 10 ml Wasser vermischt, und weitere 10 ml Wasser werden zugesetzt. Das pH der Lösung wird mit 50^-igem Natriumhydroxyd auf 10 eingestellt. 2,50 g (0,01 Mol) Pyridyl-4-methylsuccinimidocarbonat werden langsam unter Rühren zugesetzt, während das pH durch Zusatz von 50#-igem Natriumhydroxyd bei 9,5 gehalten wird. Wenn der Verbrauch von Base aufhört, wird das pH mit Essigsäure auf 7,5 eingestellt, und der ausgefallene Kupferkomplex von Pyridyl-4-methyloxycarbonyllysin wird abfiltriert. Dieser Niederschlag wird in 100 ml

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10$-iger Essigsäure suspendiert, und Schwefelwasserstoff wird zugesetzt, um Cu(II) auszufällen. Die Lösung wird du?ch Celit filtriert und zur Trockne eingedampft. Das erhaltene öl wird von V/asser/Äthanol umkristallisiert, wobei £-N-Pyridyl~4-methyloxycarbonyl-lysin, F 24θ bis 242⁰C, erhalten wird.

Die Abtrennung der blockierenden Gruppe von dem E-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin wird wie folgt durchgeführt:

10 mg N-£-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin werden in 1 ml 50^-iger Essigsäure gelöst, und 100 mg Zinkstaub werden zugesetzt. Das Gemisch wird 1 1/2 Stunden bei 25⁰C gerührt und dann durch Dünnschichtchromatographie analysiert, wobei festgestellt wird, daß eine vollständige Umwandlung zu Lysin erfolgt ist.

Beispiel II N-n-t-Butyloxycarbonyl-N-e-pyridyl^-methyloxycarbonyl-lysin

0,918 g (0,003 Mol) a-Butyloxycarbonylly-sinacetat werden in JO ml Wasser gelöst, und das pH der Lösung wird mit In Natriumhydroxyd auf 9,5 eingestellt. 0,750 g (0,003 Mol) Pyridyl-4-methylsuccinimidocarbonat werden langsam zugesetzt, und das pH wird durch Zugabe von In Natriumhydroxyd bei 9*5 gehalten. Wenn der Verbrauch von Base aufhört·, wird die Lösung dreimal mit je 75 ml Äthylacetat extrahiert, und das pH wird durch Zugabe von 2,5n Schwefelsäure auf 4,2 eingestellt. Die Tösung wird viermal mit je 75 ml Äthylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte vom pH 4,2 werden vereinigt, Über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Durch Umkristallisieren aus Äthylacetat/Ätyhläther erhält man 0,76 g N-a-t-Butyloxycarbonyl-N-£-pyridyl-4-methyl oxycarbonyl -Iy sin, F 69,5 bis 71,5⁰CJ IR zeigt N-H 3,03, C=O 5,85, 5,96μ.

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Die Abtrennung der blockierenden Gruppe von dem N-a-t-Butyloxycarbonyl-N-H-pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin wird wie folgt durchgeführt:

10 mg H-a-t-Butyloxycarbonyl-N-E-pyridyl-^-methyloxycarbonyllysin werden in 1 ml 50/£-iger wäßriger Essigsäure gelöst, und der Lösung werden 100 mg Zinkstaub zugesetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei 25⁰C gerührt und dann durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Es zeigt sich, daß eine vollständige Umwandlung zu dem N-ot-t-Butyloxycarbonyl-lysin erfolgt ist.

Wenn in dem Deblockierungsverfahren statt N-a-t-Butyloxycarbony1-N-E-pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestelltes N-α-t-Butyloxycarbony1-Ν-ε-pyridyl-3-methyloxycarbonyl-lysin verwendet und das Reaktionsgemisch 24 Stunden gerührt wird, werden nur etwa 5$ der blockierenden f-Pyridyl-^-methyloxycarbonyl-gruppe abgetrennt, wie die Dünnschichtchromatographie zeigt.

Beispiel III

Herstellung von Phenylalanyl-seryl-tryptophanyl-glycyl-alanylglutamyl-glycyl -glutamlnyl-lysin

A. Herstellung von Glutamyl-glycyl-glutaminyl-(N-£-pyridyl-4-methyloxycarbonyl) -lysin

421,7 g (1,5 mMol) des N-€-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysins und 20 ml Kaliumboratpuffer (pH 10,2) werden in einen Waring-Mischer bei O⁰C eingebracht. 0,276 mg (1,61 mMol; molarer Überschuß von 7/0 kristallines N-Carboxy-anhydrid von Glutamin werden unter raschem Rühren auf einmal zugesetzt. Das pH wird durch Zugabe von 0,55 ml 5n Kaliumhydroxyd bei 10,2 gehalten. Die Reaktion ist in etwa 2 Minuten beendet, und das pH wird dann durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf 3 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wird mit Stickstoff gespült, um Kohlendioxyd abzutrennen. Dann wird das pH des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 5n Kaliumhydroxyd auf 8,85 erhöht,

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■und 197 mg (1,675 mMol; molarer Überschuß 5$) N-Thiocarboxyanhydrid von Glycin werden auf einmal zugesetzt. Die Zugabe von 0,47 ml 5n Kaliumhydroxyd erfordert 1 1/2 Minuten, und das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten gerührt. Das pH wird durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf J5 eingestellt, und das Re akt ions gemisch wird mit Stickstoff gespült, um Kohlenoxydsulf id abzutrennen. Das pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von 5n Kaliumhydroxyd auf 10,1 eingestellt, und 300 mg (1,7^ mMol; molarer* Überschuß 3%) festes N-Carboxyglutaminsäure-anhydrid werden auf einmal zugesetzt. Das pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von 0,65 ml 5n Kaiiumhydroxyd beibehalten, und das Gemisch wird 1,75 Minuten beim pH 10,1 gerührt. Das pH wird durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure auf J5 eingestellt, und das Reaktionsprodtikt wird gefriergetrocknet,, wobei man 7,09 g erhält. Dieses rohe Produkt wird mit Methanol extrahiert (einmal mit 100 ml und viermal mit je 50 ml), und die Extrakte werden im Vakuum eingedampft. Man erhält 1,27 g Glu-Gly-Gln-(£.-i-Noc)-Lys. Das extrahierte Tetrapeptid wird wie folgt gereinigt: (a) zweimal auf Sephadex G-50 fein in 50^-iger Essigsäure chromatographiert; (b) auf einer Silicagelsäule unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Wasser (6O:4O:1O) als Eluierungsmittel chromatographiert; und (c) durch präparative Elektrophorese in Pyridin/Acetat-Puffer vom pH 6,4.

B. Herstellung von t-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-seryltryptophanyl-glycyl-alanln-hydrazid

Das Pentapeptid-hydrazid wird durch Festphasenpeptidsynthese wie folgt hergestellt:

1 g (0,77 mMol) t-Boc-AIa-Harz wird in 50 ml Methylenchlorid von Raumtemperatur suspendiert. Das Aminosäureharz wird wie folgt behandelt: (a) dreimal mit 15 ml Dioxan gewaschen; (b) die endständige t-Boc-Gruppe durch Umsetzen mit 15 ml 4n Salzsäure in Dioxan abgetrennt; (c) das debldckierte Material dreimal mit 15 ml Dioxan gewaschen; (d) dreimal mit

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15 ml Chloroform gewaschen; (e) mit 15 ml eines Gemisches von Triethylamin und Chloroform (1:9) neutralisiert; (f) das neutralisierte Material dreimal mit 15 ml Chloroform gewaschen; (g) dreimal mit. 15 ml Methylenchlorid gewaschen; (h) 3^8 mg t-Boc-Gly in Methylenchlorid zugesetzt; (i) durch Zugabe von 397,6 mg NjN-Dicyclohexylcarbodilmid in Methylenchlorid und Umsetzenlassen für 2 Stunden gekuppelt; (j) das t-Boc-Gly-Ala-Harz dreimal mit 15 ml Methylenchlorid gewaschen. Durch Wiederholen dieses Verfahrens mit den folgenden Aminosäurederivaten: t-Boc-Trp (586 mg), t-Boc-Ser (596 mg), t-Boc-Phe (510 mg) wird das Pentapeptid t-Boc-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Harz hergestellt. Nach dem Kuppeln von t-Boc-Trp wird die Deblockierung mit Salzsäure in Gegenwart von Mercaptoäthanol durchgeführt, um eine Alkylierung von Trp zu vermeiden. Das Peptidharz wird dreimal mit 15 ml Äthanol, dreimal mit 15 ml Essigsäure, dreimal mit 15 ml Äthanol und fünftnal mit 15 ml Methylenchlorid gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 1,3 g t-Boc-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Harz erhält.

1*3 E t-Boc-Phe-Ser-Trp-Oly-Ala-Harz werden mit 12 ml eines Gemisches von Hydrazin und Dimethylformamid (1:1) 2 Stunden umgesetzt. Das Harz wird abfiltriert und zweimal mit 10 ml Dimethylformamid gewaschen. Die Waschflüssigkeiten und das Filtrat werden vereinigt, und die Lösungsmittel werden im Vakuum abgetrennt, wobei ein öliger Rückstand erhalten wird. Das Produkt kristallisiert beim Stehenlassen. Der Peststoff wird fünfmal mit 20 ml Äthylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet, um Spuren von Äthylacetat abzutrennen. Der getrocknete Feststoff wird mit 15-ml-Anteilen Wasser gewaschen, bis Verunreinigungen durch Hydrazin und Dimethylformamid vollständig entfernt sind. Man erhält 378,1 mg t-Boc-Phe-Ser-Trp-GIy-Ala-hydraζid.

C. Azidkupplung der Peptidfragmente A und B

144,5 mg (0,210 mMol) t-Boc-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-NHNH₂ werden

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ft

in 1,5 ml Dimethylformamid suspendiert, und das Gemisch wird auf -40° gekühlt. Durch Zugabe von 0,150 ml HCl in Tetrahydrofuran wird eine klare Lösung vom pH 1 erhalten. Die Lösung wird bei -25 bis -J>0° gehalten und insgesamt J5J5A Isoamylnitrit, 116$ der.Theorie, werden innerhalb 18 Minuten in einzelnen Anteilen zugesetzt, bis ein schwach positiver Jod-Stärke-Test 12 Minuten konstant ist. Die Dünnschichtchromatographie in Chloroform/Methanol/toasser (85:15:1*5) an Silica ergibt, daß das gesamte Hydrazid in Tollens-Negativmaterial übergeführt ist. Durch einen Hypochlorit/Stärke/Jod-Spray wird ein im wesentlichen einzelner Azidfleck erkennbar.

150 mg (0,252 mMol, Überschuß 20;£) Glu-Gly-Gln-(€.-i-Noc)-Lys werden in 0,8 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird der mit 0,15 ml Diisopropyläthylamin auf pH 5 eingestellten Azidlösung zugesetzt. Das das Nukleophil enthaltende Reagenzglas wird zweimal mit je 0,2 ml und einmal mit 0,1 ml Dimethylformamid ausgewaschen. Das pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von 100λ Diisopropyläthylamin auf 7*2 eingestellt. Nach 10 Minuten bei -10° sind insgesamt 8 Äquivalente Amin verwendet. Die Dünnschichtchromatographie in Chloroform/Methanol/Wasser (6θ:4θ:1θ) und Chloroform/ Methanol/Wasser /Ammoniak (6O:j5Oi4:6) zeigt, daß die Umsetzung fast vollständig ist, wobei Ehrlich-, Ninhydrin-und Hypochlorit-Spray zur Erkennbarmachung der Produkte verwendet wird. Nachdem das Reaktionsgemisch 20 Stunden magnetisch bei -10° gerührt ist, ist es ein klares dickes Gel, das durch Zugabe von 20 ml Äther einen Niederschlag ergibt.

Das Gemisch wird bei 0° gehalten, bis eine klare überstehende Flüssigkeit erhalten ist. Der Niederschlag wird durch Zentrifugiren abgetrennt und mit 10 ml Ä'ther, zweimal mit 10^-igem Methanol/Äther und zweimal mit 10 ml Wasser gewaschen. Durch Gefriertrocknen der wäßrigen Waschflüssigkeiten erhält man I06 mg Produkt. Der feste Rückstand wiegt nach Trocknen im Vakuum 195 mg.

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Die wäßrigen Waschflüssigkeiten werden durch Gelfiltration gereinigt. Die 106 mg werden in 4 ml 50^-iger Essigsäure gelöst und auf eine Säule von Sephadex G-50, fein, aufgegeben.

Die Lösungsmittel werden im Vakuum abgetrennt, und der Rückstand wird gefriergetrocknet, wobei das t-Boc-Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-(£-i-Noc)-Lys erhalten wird.

Aminosäureanalyse nach 20 Stunden saurer Hydrolyse: ^Phei,oi ^Seri,oo ^Trpo,75 ^Gly2,oo ^Alai,oo ^Glui,99 ^Lysi,oo Molekulargewicht gefunden 1475.

Phe>Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-(£-i-Noc)-Lys

9^ mg" des obigen gewaschenen Feststoffs werden mit 1,5 ml Trifluoressigsäure, die \% Mercaptoäthanol als Kationendesoxydationsmittel zum Abschirmen des Trp-Kerns enthalten, vermischt. In 3 Minuten bei 25° löst sich der Feststoff vollständig auf, und die Lösung wird noch 2 1/2 Minuten bei 25° gehalten. Das deblockierte Peptid wird mit 10 ml kaltem Äther und 10 ml kaltem Petroläther gefällt und zweimal mit je 5 ml Äther gewaschen. Durch Trocknen im Vakuum erhält man 109 mg rohes Peptid.

Zur Reinigung wird das Produkt unter Kühlen im Eisbad in 6 ml 50^-iger Essigsäure gelöst. Es ist langsam löslich, d.h. zur vollständigen Auflösung sind 30 Minuten erforderlich. Die Lösung wird auf eine 2,5 χ 100 cm -Säule von Sephadex G-50, fein, aufgegeben und zweimal mit je 1 ml 50^-iger Essigsäure gewaschen.

In jeweils 20 Minuten werden Fraktionen von 6,2 ml aufgefangen. Die Fraktionen 64-72 werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet, wobei 78,50 mg Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-(e-i-Noc)-Lys erhalten werden.

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Aminosäureanalyse nach 20 Stunden saurer Hydrolyse:

^Pheo,99 ^Serl,oo ^Trpo,77 ^Gly2,oo ^Alai,oo ^Glu2,02 ^Lyso,₉9 Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Lys

Zn/Essigsäure-Abspaltung der blockierenden N-£-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe

Ein Gemisch von 5,94 mg Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-(e-i-Noc)-Lys in 0,7 ml 50^-iger Essigsäure und 18O mg Zinkstaub wird 1 Stunde bei 25° gerührt. Das Zink wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Eine Hälfte des Reaktionsgemisches wird auf eine 2,5 x 100 cm-Säule von Sephadex G-50, fein, aufgegeben. Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 8,5 ml/20 min. Auf die Trennung folgt ein UV-Monitor bei 280 nm. Die Fraktionen 46-49 werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet: Man erhält 1,43 mg Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-Glu-Gly-Gln-Lys. Das Produkt zeigt eine einzelne Zone bei der DünnschichtChromatographie in Chloroform/Methanol/Wasser (40:47:13) bei Verwendung von Hypochlorit-, Ehrlich- und Ninhydrin-Reagenzien.

Beispiel IV Herstellung von Glutamyl-glutamyl-lysyl-seryl-alanin

6,5 g (5 mMol) t-Boc-AIa-Harz werden wie folgt behandelt: (a) das Aminosäureharz wird dreimal mit 45 ml Methylenchlorid gewaschen; (b) dreimaliges Waschen mit 45 ml Ä'thanol; (c) dreimaliges Waschen mit 45 ml Essigsäure; (d) Abtrennen der endständigen abschirmenden t-Boc-Gruppe durch Behandeln des Aminosäurehar2,es mit wasserfreiem Chlorwasserstoff in Essigsäure für 30 Minuten; (e) Waschen des deblockierten Ala-Harzes dreimal mit Essigsäure; (f) dreimaliges Waschen mit Ä'thanol; (g) dreimaliges Waschen mit Methylenchlorid; (h) Neutralisieren des Ala-Harzes durch 1'0-minütiges Umsetzen mit 40 ml einer Lösung von Triäthylamin in Methylenchlorid (1:9); (i)-fünfmaliges Waschen mit Methylenchlorid; (j) Zugabe von 3,7 g (12,5 mMol) t-Boc-0-Bz-Serin in 30 ml Methylenchlorid und'Rühren für 10 Mi-

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nuten; (k) Kuppeln durch Zugabe von 12,5 mml N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid zu dem Reaktionsgemisch und 2-stündiges Rührenlassen; (m) Waschen des t-Boc-O-Bz-Ser-Ala-Harzes dreimal mit Methylenchlorid und dreimal mit Äthanol. Durch Wiederholen des obigen Verfahrens unter Verwendung der folgenden Aminosäuren: a-Boc-£-i-Noc-Lysin (4,9 g> 12,5 mMol), α-Boc-Jf-Bz-Glutaminsäure (4,3 g, 12,5 mMol) und a-Boc-lf-Bz-Glutaminsäure (4,3 g, 12,5 mMol) erhält man 10,9 g.des Penta-

pept ids Boc -Glu-Glu-T.ys -Ser-Ala-Harz. t t ι ι

Bz Bz WJoc OBz

Die Abtrennung des Pentapeptids von dem Harz erfolgt durch Kühlen eines Gemisches von 2,2 g (1 mMol) des obigen Produktes in 3 ml Veratrol auf 0,5⁰C und Zugabe von 10 ml Trifluoressigsäure. Dann werden 10 ml Fluorwasserstoff unter Verwendung eines Aceton/Trockeneis-Bades in das Reaktionsgemisch einkondensiert. Das Kühlbad wird entfernt, und das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Fluorwasserstoff und Trifluoressigsäure werden abgetrennt, indem man Stickstoff unter Rühren durch das Reaktionsgemisch leitet. Der Rückstand wird zw&- ■ mal mit 25 ml 5^-iger wäßriger Essigsäure versetzt. Das Harz wird abfiltriert und dreimal mit 15 ml Äthyläther gewaschen. Das wäßrige Filtrat wird zweimal mit 15 ml Äther gewaschen. Der wäßrige Anteil wird zweimal gefriergetrocknet, wobei 700 mg Glu-Glu-(£-i-Noc)-Lys-Ser-Ala erhalten werden.

Die blockierende Gruppe in der ε-Stellung des Lysins wird durch Vermischen von 10 mg Glu-Glu-(£-i-Noc)-Lys-Ser-Ala mit 100 mg Zinkstaub in 1 ml 50#-iger wäßriger Essigsäure bei Raumtemperatur für 1 1/2 Stunden abgetrennt. Die Dünnschichtchromatographie zeigt, daß die blockierende i-Noc-Gruppe vollständig abgetrennt ist.

Das für die Festphasenpeptidsynthese in den obigen Beispielen als Ausgangsmaterial verwendete t-Boc-Ala-Harz wird wie folgt hergestellt: 50 g (92,5 mÄqu. Cl) chlorrnethyliertes PoIy-

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styrol mit 1$ Vernetzung und 1,85 mÄqu. Cl/g (Bio-Beads S-XL 200-400 Mesh Chloromethylated, erhältlich von den Bio-Rad Laboratories) und 17*5 g (92,5 mÄ'qu.) t-Boc-Ala werden zu J55O ml peroxydfreiem Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff gerührt, und 8,4 g (8^,5 mA'qu.) Triäthylamin werden in 50 ml Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird im Ölbad 65 Stunden zum Rückfluß erhitzt und dann auf Raumtemperatur gekühlt und filtriert. Das feste Material wird zweimal mit 250 ml Äthanol, zweimal mit 250 ml Wasser, zweimal mit 25O ml Methanol und zweimal mit 500 ml Methylenchlorid gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhält 55*7 g t-Boc-Ala-Harz, die 0,770 mÄ'qu. trBoc-Ala/g Peststoff enthalten.

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Claims

P at ent ansprüche

1. Verfahren zum Synthetisieren von aus Aminosäuren aufgebauten Peptiden durch eine Reihe üblicher Peptidkondensationen von Aminosäuren und/oder aus Aminosäuren aufgebauten Peptiden, wobei wenigstens eine der Aminosäuren Lysin ist oder eines der Peptide Lysin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die C-Aminogruppe von Lysin während der Kondensationen durch eine Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe abschirmt.

2. Verfahren zum Synthetisieren von aus Aminosäuren aufgebauten Peptiden durch eine Reihe üblicher Peptidkondensationen von Aminosäuren und/oder aus Aminosäuren aufgebauten Peptiden, wobei wenigstens eine der Aminosäuren Lysin ist oder eines der. Peptide Lysin enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die £-Aminogruppe von Lysin während der Kondensationen durch eine Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe abschirmt und diese Gruppe durch Zinkstaub in Gegenwart einer Säure abtrennt .

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure zur Abtrennung der blockierenden Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-gruppe Essigsäure verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man 10 bis 200 Gewichtsteile Zinkstaub je Gewichtcteil Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin enthaltender Verbindung verwendet.

5. Verfahren nach olacm der vorhergehenden An;"t■ru'che, d a · durch g e 1; e π η ζ ο i c h η r t , ei^ man

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as

£-Pyridyl-4-methyloxycarbonyl-lysin durch Umsetzen eines Schwermetallkomplexes von Lysin mit Pyridyl-4-methylsuccinimid-carbonat unter basischen Bedingungen umsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5.» dadurch gekennzeichnet , daß man einen Lysin/Kupfer-Komplex verwendet .

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einem pH von 7 bis 12 durchführt.

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