DE2261695A1 - Teilchensortiervorrichtung - Google Patents

Description

United States Atomic Energy Commission, Washington, D.C, U.S.A.

Teilchensortiervorrichtung.

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur automatischen Analyse und Sortierung kleiner Teilchen, und zwar insbesondere auf eine Vorrichtung, in welcher das Volumen, die Form und die Fluoreszenz biologischer Zellen in Suspension in einem kontinuierlich fließenden Strömungsmittel schnell und automatisch gemessen und analysiert werden, um festzustellen, ob die Zellen normal oder abnormal erscheinen, wobei die als abnormal identifizierten Zellen körperlich von den normalen Zellen getrennt werden. Auf dem Gebiet der Zytologie wird es mehr und mehr erforderlich, eine automatische Zellanalyse und Zelldifferentiation vorzusehen. Derzeit erfolgt die Untersuchung zytologischen Materials, beispielsweise zur Feststellung krebsartiger oder bösartiger Zellen,durch zwei oder mehr Stufen von Untersuchungen. Anfangs werden die Zellproben visuell durch einen Betrachter voruntersucht, um die abnormale Zellen enthaltenden Proben herauszusuchen. Diese Proben werden dann für eine spätere Untersuchung durch einen ausgebildeten Zytotechnologen oder Pathologen zur Seite gestellt, der dann ein end-

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gültiges Urteil darüber fällt, ob die Zellen tatsächlich krebsartig sind. Obwohl dieses Verfahren derzeit zufriedenstellend funktioniert, hat es doch eine Reihe von Nachteilen. Zum einen ist es sehr zeitaufwendig und erfordert viel der Technikerzeit, so daß es auch kostspielig ist; ferner liefert es keine quantitativen Ergebnisse, da das benutzte Kriterium der Abnormalität weitgehend subjektiv ist. Wegen der Zeit und Kosten kann das bekannte Verfahren auch nicht ohne weiteres bei großen Zahlen verwendet werden, überdies sind viele, möglicherweise die meisten dem medizinischen Labor vorgelegten Zellproben normal. Beispielsweise haben bei der zytologischen Prüfung auf Uteruskrebs 98% der untersuchten Frauen keinen Krebs. Die Folge davon ist, daß - insbesondere wenn größere Bevölkerungsgruppen auf Krebs untersucht werden - der Aufmerksamkeitspegel und das Interesse derjenigen abgesenkt wird, die die Voruntersuchung durchführen. Dies hat mit der Zeit zur Folge, daß ein Test weniger quantitativ und teurer wird, da der Personalwechsel ansteigt.

Viele dieser Nachteile können durch die Anwendung von Strömungssystemverfahren bei der Zellanalyse zur Durchführung der Voruntersuchung überwunden werden. Die Strömungssystemanalyse gestattet die Beobachtung einzelner Zellen, wenn diese in einer Suspension nacheinander durch ein kleines Untersuchungs- oder Feststellungsvolumen fließen. Große Anzahlen von Zellen können in kurzen Zeitperioden beobachtet werden, und schnelle automatische Voruntersuchungsverfahren sind möglich. Die Lichtabsorption, die Fluoreszenz, die Streuung oder das Volumen der beobachteten Teilchen sind übliche Parameter. Die Literatur erhebt verschiedentlich den Anspruch, daß diese Parameter quantitativ beobachtet wurden; dabei besteht eine Hauptschwierigkeit darin, daß ein einziger Parameter häufig nicht ausreicht, um quantitativ zwischen normalen und abnormalen Zellen zu differenzieren oder zu unterscheiden. Die Mehrparameteranalyse erhöht die Fähigkeit, zwischen unterschiedlichen Zellarten zu unterscheiden. Weil die Mehrzahl der untersuchten Zellen normal ist, sind solche Mittel äußerst erwünscht, die die abnormalen Zellen aus den normalen Zellen aussortieren, so daß die für eine spätere Untersuchung erzeugte Probe

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ein Übergewicht von als abnormal betrachteten Zellen enthält. Diese verschiedenen Erwägungen sowie der augenblickliche Stand der Technik sind im einzelnen im Teil A der folgenden Literaturstelle beschrieben:"Automated Cytology: A Symposium by Correspondence", Acta Cytologica, Vol. 15, Nr. 1-3 (1971). Im US Patent 3 380 584 hat einer der Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung beschrieben, mit der kleine, in einem Strömungsmittel suspendierte Teilchen sortiert werden können. Das Sortieren erfolgt gemäß einem ausgewählten Parameter, der beispielsweise die Größe, das Volumen, das Vorhandensein von Radioaktivität, die Farbe, die Fluoreszenz, die Lichtabsorption oder irgendeine.andere Quantität, sein kann, die in eine elektrische Quantität überführbar ist. Die Teilchentrennvorrichtung gemäß US Patent 3 380 584 basiert jedoch auf der Messung eines einzelnen Parameters und nicht auf einer Mehrparametermessung.

Es ist nur eine Vorrichtung zum Sortieren abnormaler Zellen aus großen Populationen normaler Zellen auf der Basis der Mehrparameteranalyse bekannt. Kamentsky und Melamed beschreiben in "Science", Band 156, Seite 1364 (1967) eine spektrofotometrische Zellensortiervorrichtung, welche die.Zellen mit vorbestimmten optischen Eigenschaften körperlich von großen in Suspension befindlichen Zellpopulationen trennt. Das Sortieren erfolgt auf der Basis mehrfacher optischer Messungen, wobei das Trennsystem die Strömungsmittelschaltprinzipien benutzt, die ungefähr 1964 bei der Computer-Konstruktion benutzt wurden (Fluidics). Dieser spektrofotometrische Zellsortierer arbeitet verhältnismäßig langsam und ist nicht in der Lage, eine Probe zu erzeugen, die in erster Linie aus Zellen besteht, welche weiteruntersucht werden sollen. Beispielsweise ist es mit dieser Zeilsortiervorrichtung selbst bei größtem Bemühen nicht möglich, Endkonzentrationen der ausgewählten (d.h. gegenüber vorgegebenen Normen der Normalität abnormalen) Zellen von ungefähr 1:5 aus Anfangskonzentrationen im Bereich von 1:10 000 zu erzeugen.

Es ist bekannt, daß die Leistungsfähigkeit von Zellvolumenabfühlinstrumenten nach dem Prinzip des Coulter-Zählers - in dem eine

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Zelle die Impedanz einer engen öffnung ändert, wenn sie durch eine öffnung läuft - verbessert werden kann, wenn die Zellsuspension von einer Koaxialströmung aus zellfreier Flüssigkeit umgeben wird, wenn sie durch die öffnung läuft. Beispielsweise beschreiben Merrill et al. in Rev. Sei. Instru., Band 42, Seite 1157 (1971) einen Zellvolumenanalysator. mit Koaxialströmung der Zellsuspension innerhalb einer Umhüllung aus zellfreier Lösung durch die Abfühlöffnung. Diese Vorrichtung ist jedoch keine Zellensortiervorrichtung und arbeitet als Ein-Parameteranalysator. Obwohl Merrill et al vorschlagen, daß diese Vorrichtung auch zur Mehr-Parameteranalyse benutzt werden kann, ist jedoch dem Stand der Technik kein Hinweis zu entnehmen, daß dies tatsächlich geschehen ist.

Die Erfindung sieht unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-StrÖmungssystems und elektronischer und optischer .Abfühlung eine Vorrichtung vor, die zur schnellen und automatischen Analyse und Sortierung kleiner Teilchen dient, und zwar auf der Basis bestimmter vorgewählter Charakteristiken (Eigenschaften) oder Kombinationen dieser Eigenschaften. Diese Vorrichtung ist eine Weiterentwicklung der in US Patent 3 380 584 gezeigten Vorrichtung und gestattet die Teilchentrennung auf der Grundlage der Mehr-Parameteranalyse.'Die Vorrichtung ist insbesondere bei der Analyse und Sortierung biologischer Zellen verwendbar.

Bei einem Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, die zum Sortieren abnormaler (bösartiger) Zellen aus normalen Zellen verwendbar ist, wird Zellularvolumen, Kleinwinkellichtstreuung und Fluoreszenz für jede Zelle gemessen und mit vorgegebenen Standards (Normen) verglichen, wobei die diesen Standards nicht entsprechenden Zellen von den diesen Standards entsprechenden Zellen getrennt werden. Mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gefärbte Zellproben werden verdünnt und in einer physiologischen Salzlösung suspendiert und in eine Strömungskammer auf der Achse eines sich bewegenden Stromes der Salzlösung eingeführt, wobei letztere als eine Umhüllung wirkt, um den Zellstrom auf die Mittelachse des Systems zu beschränken. Innerhalb der Kammer fließen die Zellen der Reihe nach durch eine öffnung, die als ein Coulter-Volumen-

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fühler dient und wo das Zellvolumen elektronisch gemessen wird. Als nächstes durchschneiden die in Suspension in der Salzlösung strömenden Zellen einen Argon-Ionenlaserstrahl. Die einzelnen Zellen streuen das Licht und der an die Zellen gebundene Farbstoff wird zur Fluoreszenz angeregt. Das gestreute Licht liefert eine quantitative Information über Zellengröße und Form, während die Fluoreszenz eine quantitative Messung aller Zellbestandteile liefert, an die ein fluoreszierender Farbstoff gebunden ist, beispielsweise kann der DNA-Gehalt angegeben werden. Die Kleinwinkellichtstreuung wird in Vorwärtsrichtung gemessen und die Fluoreszenz senkrecht zum Zellstrom und Laserstrahl. Nach dem Durchlaufen des Laserstrahls spritzt die Zellsuspension durch eine koaxial ausgerichtete Düse am Austrittsende der Strömungskammer nach aussen in die Luft. Ein mechanisch mit der Strömungskammer gekoppelter piezoelektrischer Kristall wird zur Erzeugung gleichförmiger Tröpfchen verwendet, und zwar durch- regelmäßig Zerstreuung des austretenden Flüssigkeitsstrahls. Die meisten Zellen werden in wirksamer Weise in einzelne Tröpfchen getrennt, obwohl nicht alle Tröpfchen Zellen enthalten, und obwohl gewisse Tröpfchen zwei oder mehr Zellen enthalten können. Ausgewählte Zellen enthaltende Tröpfchen werden elektrisch aufgeladen und sodann durch ein statisches elektrisches Feld in ein gesondertes Gefäß abgelenkt. Ein Oszilloskop überwacht einzelne Signalimpulse„ während ein Mehrkanal-Impulshöhenanalysator, ein Drucker und ein Zeichner Impulsamplitudenverteilungen erzeugen und aufzeichnen, welche das Zellvolumen, die Lichtstreuung und die Fluoreszenz oder Kombinationen aus diesen Eigenschaften darstellen. Ein durch einen Einkanal-Impulshöhenanalysator getriggerter (ausgelöster), eine veränderbare Verzögerung aufweisender Impulsgenerator erzeugt Tröpfchenladeimpulse, die verzögert sind, um zu gestatten, daß die sortierte Zelle von der Abfühlzone zum Punkt der Tröpfchenformung und Ladung läuft.

Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich insbesondere auch aus den Unteransprüchen.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben

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sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen an Hand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 ein Blockschaltbild, welches darstellt, wie die erfindungsgemäße Vorrichtung in einem Krebsuntersuchungsprogramm verwendet werden kann;

Fig. 2 eine vereinfachte Ansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Strömungskammer und die Lade- und Ablenkplatten dargestellt sind, die zur Teilchensortierung benutzt werden;

Fig. 3 eine vergrößerte,vereinfachte geschnittene Ansicht des Abfühlteils der Strömungskammer;

Fig. 4 eine ins einzelne gehende Querschnittsansicht der Strömungskammer, die bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendbar ist;

Fig. 5 ein Blockdiagramm der optischen und elektrischen Elemente eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung;

Fig. 6 einen Teil eines logischen und Schalt-Blockdiagramms für die in Fig. 5 angedeutete Mehr-Parameter-Signalverarbeitungseinheit;

Fig. 7 eine Fortsetzung des Diagramms der Fig. 6.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ohne weiteres zur schnellen und automatischen Mehr-Parameteranalyse und zum Sortieren verschiedener Arten von Teilchen verwendet werden. Die Größe der zu analysierenden Teilchen ist durch die Größe der Coulter-Volumenfühlöffnung beschränkt. Ferner müssen die durch die erfindungsgemäße Vorrichtung zu analysierenden und zu sortierenden Teilchen einer Analyse auf der Basis ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften zugänglich sein.

Die hier gezeigten Figuren beziehen Sich auf ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, welches zur Analyse und Sortierung ab-

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normaler Zellen aus normalen Zellen verwendbar ist, und zwar in einem zytologischen Untersuchungsprogramm zur Bestimmung zervikalen Krebses. Das Schema ist in Fig. 1 dargestellt. Zunächst werden die Zellproben für die StrömungsSystemanalyse auf- oder vorbereitet, und zwar durch geeignete Verdünnung, Behandlung zur Vermeidung von Klumpen, Einfärben mit Fluoreszenzfarbstoffen; usw.; Diese Aufbereitung erfolgt entsprechend der speziellen Art der zu verwendenden automatischen Analyse. In diesem speziellen Aufbau werden die folgenden Zellparameter gemessen: Zellenvolumen, Kleinwinkellichtstreuung und Fluoreszenz. Die Fluoreszenzmessungen hängen von der Anwendung biochemischer spezifischer Farbstoffe ab. Die zur Durchführung dieser speziellen Messungen vorgesehenen Abfühl- oder Meßvorrichtungen sind miteinander kompatibel und auch mit der elektronischen Sortierung der Zellen. Das angewandte elektronische Sortierverfahren gleicht dem in dem US Patent 3 380 584 beschriebenen Verfahren. Wenn jede Zelle analysiert ist, wird ein Signal von jeder Abfühl- oder Meßvorrichtung an eine Mehr-Parameter-Signalverarbeitungseinheit geliefert und dort verarbeitet und mit vorgegebenen Kriterien der Abnormalität verglichen. Während sich somit die Zelle noch immer in der Nachbarschaft der Meßzone befindet, werden die von den Meßvorrichtungen abgegebenen, die gemessenen Zelleigenschaften darstellenden Signale in Verhältnisse, überlappungsfoereiche, usw. verarbeitet, die abnormale Zellen am wirkungsvollsten beschreiben. Die verarbeiteten Signale werden elektronisch mit spezifizierten Standardwerten (Normen) verglichen, wobei die entsprechende Zelle entweder als normal, abnormal oder zweifelhaft eingestuft wird. Die nach Erhalt der Signale zur Signalverarbeitung und Sortierungsentscheidung erforderliche Zeit liegt in der Größenordnung von 25 Mikrosekunden. Wenn eine Zelle als abnormal oder zweifelhaft klassifiziert wird, entsteht ein Signal, welches bewirkt, daß ein diese Zelle enthaltendes Tröpfchen von den normale Zellen enthaltenden Tröpfchen abgelenkt wird. Die Analyseresultate für diese Zelle können gesondert von den Daten für normale Zellen der Probe gespeichert werden. Die aussortierten abnormalen oder zweifelhaften Zellen werden zusätzlich eingefärbt und für die visuelle Untersuchung durch einen Zytologen bereitgehalten. Zur Unterstützung

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bei der Auswertung der sortierten Zellen sind für den Zytologen Verteilungen der verschiedenen gemessenen ZeI!eigenschaften oder Kombinationen der Eigenschaften der gesamten Probe oder nur der zu prüfenden abnormalen Zellen von der Datenverarbeitungsspeichervorrichtung verfügbar. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erzeugt sowohl Ausdrucke als auch eine Oszilloskopanzeige der Daten.

Das hier beschriebene spezielle Ausführungsbeispiel betrifft die Mehrparameteranalyse des Volumens, der Fluoreszenz und der Kleinwinke !lichtstreuung individueller Zellen; dem Fachmann ist aber klar, daß die hier dargestellten Analyse- und Sortierverfahren bzw. Vorrichtungen auch bei anderen Arten der Hochgeschwindigkeitsabfühlung oder Messung verwendbar sind, und daß die elektronischen und mechanischen Bauteile des Ausführungsbeispiels ohne weiteres so abgeändert werden können, daß auch die Messung anderer Parameter möglich ist. Beispielsweise kann mit der hier beschriebenen Strömungskammer die KleinwinkellichtstreuungsHiessung durch Meßvorrichtungen ersetzt werden, welche die Lichtabsorption oder Fluoreszenz bei einer weiteren Wellenlänge feststellen.

Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels.

In den Fig. 2 und 3 ist das Grundströmungssystem und die Abfühl- oder Meßzone der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Eine in geeigneter Weise vorbereitete Zellenprobe wird als kontinuierlich fließende Suspension in die Strömungskammer 3 eingeführt, und zwar durch ein von einem unter Druck stehenden Reservoir 72 kommenden Probeneintrittsrohr 1. Innerhalb der Kammer 3 ist das Rohr 1 zentriert und erstreckt sich teilweise durch ein größeres Rohr 19, welches sich zu einer an dessen unteren Ende befindlichen Düse 22 hin verjüngt. Eine kontinuierliche Strömung einer zellenfreien Flüssigkeit - die als ümhÜllungsflüssigkeit bekannt ist - wird in das Rohr 19 eingeführt, und zwar durch ein Hülleneingangsrohr 18, welches mit einem unter Druck stehenden Reservoir 70 in Verbindung steht; die Hüllflüssigkeit fließt dabei koaxial - vergleiche das Bezugszeichen 20 - um das

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Rohr 1 herum. Wenn der Zellenstrom aus dem Rohr 1 austritt, wird er in seinem Durchmesser 17 vermindert, da er die Geschwindigkeit der Hüllflüssigkeit erhält. Die relativen Geschwindigkeiten und Strömungsraten werden durch ein Differentialdruck-Regulatorsystem bestimmt. Es ist erforderlich, daß die Koaxialströmung der Hüllflüssigkeit und der in der Suspension befindlichen Zellen im wesentlichen laminar verläuft, so daß Turbulenzwirkungen vermieden werden, wenn die Hüllflüssigkeit und Zellsuspension durch die Volumenabfühl- oder Meßöffnung 21 in Düse 22 laufen. Das Druckdifferential zwischen der Hüllflüssigkeit 20 und der Zellströmung ist derart eingestellt, daß ein Zellstrom 28 durch die öffnung 21 tritt, welche einen solchen Durchmesser besitzt, daß die meisten Zellen einzeln hindurchtreten. Die Öffnung dient als eine Coulter-Volumenmeßöffnung, in der die Impedanz entsprechend dem Volumen der hindurchlaufenden Zelle geändert wird. Die laminar strömende Hüllflüssigkeit steuert nicht nur die Größe des durch die öffnung 21 gehenden Zellstroms, sondern dient auch zur Zentrierung innerhalb der Öffnung, so daß die die Volumenmessung beinflußenden Kantenwirkungen des elektrischen Feldes wesentlich reduziert werden.

Nach Verlassen der öffnung 21 schneidet der Zellstrom 28 einen Strahl 4 von intensivem Licht. Die Strömungskammer 3 ist ferner mit einer Einlaßöffnung 35 ausgestattet, durch welche dieser Strahl auf den Zellstrom fokussiert werden kann, öffnungen 36 {von denen eine in Fig. 2 nicht gezeigt ist) dienen als Auslässe für die Fluoreszenz 9 und die Lichtstreuung 11, die infolge des Zusammenwirkens 16 des Lichtes mit einer einzelnen Zelle erzeugt , werden, wenn die Zellen der Reihe nach im Zellstrom 28 fließen. Der Lichtstrahl 4 schneidet den Zellstrom 28 unter einem Winkel von annähernd 90°. Fluoreszenz wird in allen Richtungen abgestrahlt, aber nur in einem Konus 9 gemessen, der sich unter rechten Winkeln zur Schnittebene des Zellenstroms 28 und Lichtstrahls 4 erstreckt. Diese 90° Winkel sind insofern kritisch, als sie die erforderlichen optischen Messungen vereinfachen.

Der Zellstrom 28 wird aus der Strömungskammer 3 durch die Aus-

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trittsdüse 26 herausgespritzt. Es ist dabei wesentlich, daß die öffnung 21 ordnungsgemäß mit der Düse 26 ausgerichtet ist. Eine Fehlausrichtung kann wegen der Turbulenz die optischen Messungen stören, und kann die genaue Zeitsteuerung beeinflussen, gemäß welcher die einer speziellen Zelle zugeordneten Messungen in ein Sortiersignal übersetzt werden, weil nämlich die Zellen ihren gleichen Aufeinanderfolgeabstand innerhalb des Zellstromes 28 verlieren. Es ist auch erforderlich, daß der Zellenstrom und seine umgebende Umhüllungsflüssigkeit die Strömungskammer 3 mit einer hinreichend hohen Geschwindigkeit zur Bildung eines Strahles 10 verlassen. Wegen des mit der öffnung 21 verbundenen Druckabfalls ist eine zusätzliche Hüllflüssigkeitsquelleerforderlich, um einen ausreichenden Druck in der Zone 30 für die Ausbildung eines angemessenen Strahls 10 zu erzeugen. Diese zweite Hüllflüssigkeitseingabe 25 erfolgt über ein mit dem Hülleingangsrohr 12 verbundenes Rohr 54. Das Rohr 12 ist seinerseits mit einem unter Druck stehenden Hüllflüssigkeitsreservoir 71 verbunden. Die Eingabe 25 erfolgt hinreichend weit vom Zellstrom 28 entfernt, so daß abgesehen von der Steigerung der Geschwindigkeit durch die Düse 26 keine andere Wirkung auf den Zellfluß ausgeübt wird. Der Hüllflüssigkeitseingang hat den zusätzlichen Vorteil, daß auf diese Weise die Strömungskammer zur Entfernung angesammelter Gase durchgespült werden kann. Da die Volumenmessung die Verwendung eines elektrischen Stromes einschließt, besteht bei den in der Strömungskammer 3 vorhandenen Flüssigkeiten eine elektrolytische Dissoziationstendenz. Die Abmessungen der Strömungskammer sind hinreichend groß, so daß infolge einer derartigen Dissoziation entstehende Gasblasen in der Strömungskammer nach oben steigen können, wo sie zeitweise gespeichert werden, ohne die optische oder elektrische Messung zu stören. Jedoch ist das Vorhandensein gewisser Mittel zweckmäßig, um periodisch alle angesammelten Gase aus dem System herauszuspülen. Dies erreicht man in einfacher Weise durch das Eingangsrohr 12. Wenn ein Spülvorgang erforderlich ist, wird ein Ventil im Spülausgangsrohr geöffnet und zusätzliche Hüllflüssigkeit wird durch Einlaßrohr 12 der Strömungskammer 3 zugeführt.

Mit der Strömungskammer 3 ist durch eine Kupplungsstange 32 eine

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Vibrationsvorrichtung 31 gekuppelt. Die der Strömungskammer 3 aufgeprägten Vibrationen (Schwingungen) erzeugen sehr kleine Störungen oder. Aufblähungen 29 am Strahl 10. Durch Erzeugung dieser Störungen mit einer richtigen durch den Strahldurchmesser und die Geschwindigkeit bestimmten Frequenz, wachsen diese in der Amplitude durch die Oberflächenspannung, bis der Strahl 10 in Tröpfchen 13 aufgeteilt wird, die gleichen Abstand und Größe besitzen. Auf diese Weise werden die in Suspension befindlichen Zellen in Plussxgkeitströpfchen getrennt. Die Art und Weise, wie die Vibrationsmittel 31 mit der Strömungskammer 3 gekoppelt sind, ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß die Vibrationsfrequenz relativ konstant gehalten werden muß. Typischerweise verwendet man einen piezoelektrischen Kristall als Vibrations- oder Schwingungsquelle, wobei aber auch andere Mittel verwendbar sind.

Die auf diese Weise erzeugten Tröpfchen 13 laufen zwischen den Aufladungselektroden 5 hindurch, wo diejenigen Tröpfchen aufgeladen werden, die aufgrund der Analyse des Volumens, der Lichtstreuung und der Fluoreszenz jeder Zelle abnormale Zellen enthalten sollen. Die normale Zellen enthaltenden Tröpfchen werden nicht aufgeladen. Diese spezielle Reihenfolge ist deshalb vorgesehen, weil man annimmt, daß die meisten Tröpfchen normale Zellen enthalten, so daß es am einfachsten ist, nur die abnormale Zellen enthaltenden Tröpfchen aufzuladen. Es ist jedoch auch möglich, das genau umgekehrte Verfahren zu benutzen. Sodann laufen die Tröpfchen durch ein elektrostatisches Feld zwischen den Ablenkplatten 8. Unter dem Einfluß dieses Feldes werden die aufgeladenen Teilchen 14 in andere Gefäße 7 abgelenkt, als die ungeladenen Teilchen 15.

Fig. 4 ist ein ins Einzelne gehender Querschnitt einer zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Strömungskammer. Die in Suspension befindlichen Teilchen fließen in die Kammer durch Rohr 1 hinein. Dieses Rohr dient auch als eine Elektrode für die Coulter-Volumenmeßeinrichtung und kann aus irgendeinem geeigneten leitenden Material bestehen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht dieses Rohr aus einer Platin-Rodlum-Legierung, um

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Korrosionsprobleme zu vermeiden, die sich durch die Verwendung einer physiologischen Salzlösung ergeben, die sowohl als Trägerflüssigkeit für die biologischen Zellen und auch als Hüllflüssigkeit zur Umgebung der Trägerflüssigkeit benutzt wird. Das Rohr 1 ist mittels eines Führungssterns 16 koaxial innerhalb eines grösseren Rohres 19 ausgerichtet und mit einer Düse 47 versehen. Diese Düse kann aus Platin bestehen, aber es ist nicht erforderlich, daß dies der Fall ist. Ein nicht korrodierender Werkstoff, wie beispielsweise ein geeigneter Kunststoff, kann ebenso gut verwendet werden. Der Führungsstern 46 und die Düse 47 können kombiniert und aus dem gleichen Werkstoff ausgebildet sein. Das Rohr 19 endet in einer Düse 22, in der die Coulter-Volumenmeßöffnung 21 angeordnet ist. Das Rohr 19 kann aus irgendeinem nicht leitenden Werkstoff, wie beispielsweise Glas, bestehen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel befindet sich die Volumenmeßöffnung 21 in einem Saphireinsatz 34, der mit einem Glasrohr 19 verbunden ist. Saphir wird benutzt, weil er ohne weiteres verfügbar ist, jedoch kann der Einsatz 34 auch aus irgendeinem anderen geeigneten, nicht leitenden Material bestehen, in dem eine geeignete öffnung ausgebildet werden kann.

Durch ein Einlaßrohr 18 wird die Hüllflüssigkeit in Rohr 19 eingeführt. Die Hüllflüssigkeit tritt auch in Küvette 23 durch Einlaßrohr 12 und Spülrohr 54 ein. Das Spülrohr 54 dient auch als die zweite Elektrode für die Coulter-Volumenmeßvorrichtung, so daß die beiden Rohre 54 und 12 aus einem geeigneten leitenden Werkstoff bestehen müssen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht Rohr 12 aus Platin und Rohr 54 aus einer Platin-Rodium-Legierung. Das mit der Innenzone 30 der Küvette 23 verbundene Spülauslaßrohr 2 führt sämtliche in der Zone 30 erzeugten Gase ab. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Auslaßrohr 2 mit einem Ventil versehen; jedoch kann, wenn gewünscht, die Hüllflüssigkeit kontinuierlich vom Spülrohr 54 durch Küvette 23 und heraus durch das Auslaßrohr geführt werden.

Die Küvette 23 ist oben offen und kann aus irgendeinem Material bestehen, das ein Isolator ist und für Licht bei denjenigen Wellenlängen durchsichtig ist, die im Lichtstrahl 4 benutzt werden. Im

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bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht die Küvette 23 aus Quarz, und "zwar in erster Linie deshalb, weil eine Quarzküvette der gewünschten Größe ohne weiteres im Handel verfügbar ist. In der Basis der Küvette 23 ist eine Öffnung 58 mittig angeordnet, durch welche sich eine Düse 26 erstreckt. Um die Wandeinflüsse auf die Geschwindigkeit der durch die Düse 26 ausgestossenen Zellen kleinzuhalten, erstreckt sich die Düse 26 nahezu bis zur Ebene A-A, in der die optischen Messungen an den einzelnen Zellen ausgeführt werden. Diese Erstreckung gestattet auch eine einfachere Ausrichtung der Volumenmeßöffnung 21 mit der Öffnung 59 in Düse 26.

Die Küvette 23 ist von einem Mantel 24 aus Metall umgeben. Der Mantel 24 schützt die Küvette 23 und schirmt die Coulter-Volumenmeßeinrichtung gegenüber äußerem elektronischen Rauschen ab. An der Basis des Mantels 24 befindet sich eine Dichtungsendplatte 56 und eine Düsenhalteplatte 57. Die Endplatte 56 weist in ihrer Mitte eine kreisförmige Öffnung 60 auf, durch welche sich der langgezogene Teil der Düse 26 erstreckt. Die Düse 26 ist in die Mittelöffnung 61 der Endplatte 57 fest eingeschraubt.

Am oberen Teil des Mantels 24 befindet sich eine Anziehschraube 55, in welche eine Verschlußkappe 52 eingeschraubt ist. -Die Küvette ist abdichtend von Mantel 24 und Kappe 52 umschlossen, und zwar mittels eines in einer Vertiefung 62 der Endplatte 56 angeordneten O-Rings 48 und einer benachbart zur Kappe 52 vorgesehenen Dichtung 51. Die Verschlußkappe 52 erstreckt sich teilweise in die Küvette 23 zur Bildung einer Vertiefung 63 hinein. An der Basis an der Vertiefung 63 ist eine Kreisöffnung 64 mittig angeordnet, durch welche sich Rohr 19 erstreckt. Ein winkelförmiges einstellbares Dichtungs-Stopfbüchsenteil 44 ist in Vertiefung 63 einschraubbar, bis es mit der Oberseite der Abdeckkappe 52 eben liegt. Das Teil 44 weist in seinem Inneren in der Mitte eine konische abgestumpfte Vertiefung 65 auf, wobei eine Lippe 66 nahe dem oberen Ende vorgesehen ist. Die Vertiefung 65 besitzt eine Kreisöffnung 67 mittig in seiner Basis, durch welche das Röhr 19 verläuft.

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Um das obere Ende des Rohres 19 herum ist ein Dichtkragen 43 angeordnet und befestigt. Oberhalb des Abdichtkragens 43 und des Rohres 19 befindet sich ein Rohrverbindungs- und Positionierungsstück 41. Das Positionierungsstück 41 weist einen hindurchgehenden Kanal 68 auf, durch den das Rohr 1 in das Rohr 19 eintritt; es ist koaxial mit dem oberen Teil des Rohrs 19 ausgerichtet. Hüllflüssigkeitseinlaßrohr 18 tritt auch in das Positionierstück 41 ein, und durch Kanal 69 gelangt Hüllflüssigkeit in das Rohr 19. Die Einlaßrohre 1 und 18 sind durch ein Abschirmrohr 40 umgeben, welches das Eintreten von elektrischem Rauschen in die Strömungskammer durch Rohr 1 oder Rohr 18 vermeidet. Das Abschirmrohr 40 und das Positionierstück 41 werden in ihrer Lage am oberen Ende des Rohres 19 durch eine Druckverbindungskappe 42 gehalten, die auf den Abdichtring 43 aufschraubbar ist. Ein O-Ring 50 erzeugt eine Abdichtung zwischen Kragen 43 und Positionierstück 41. Bei eingesetztem Rohr 19 sind die Vertiefungen 65 und 67 von der Küvette 23 durch O-Ringe 70 abgedichtet. Die Dichtung dieser 0-Ringe kann durch Ein- oder Ausschrauben.des Dichtungsstopfbüchsenteils 44 gegenüber der Verschlußkappe 52 eingestellt werden; auf diese Weise kann das Rohr 19 je nach Wunsch in die Küvette 23 hineinbewegt oder aus ihr herausgezogen werden. Mit gleichem Abstand sind um das Dichtungsstopfbüchsenteil 44 vier Einstell-Festlegungsschrauben 45 angeordnet, wobei allerdings in Fig. 4 nur eine dieser Schrauben dargestellt ist. Diese Festlegungsschrauben 45 bilden ein zweckmäßiges Mittel zum Ausrichten der öffnung 21 am Ende des Rohres 19 mit der öffnung 59 in Düse 26. Wie bereits oben beschrieben, ist es für die richtige Arbeitsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung notwendig, daß diese beiden öffnungen genau ausgerichtet sind.

In Fig. 5 ist ein Blockschaltbild der elektrischen und optischen Elemente eines Ausführungsbeispiels der Erfindung dargestellt, die zur schnellen und automatischen Analyse und zum Sortieren abnormaler Zellen aus normalen Zellen zweckmäßig sind. Ein mit der Strömungskammer gekoppelter piezoelektrischer Kristall dient als Vibrations- oder Schwingungsquelle zur Erzeugung von Tröpfchen mit der gewünschten Frequenz. Die in diesem Ausführühgsbeispiel ver-

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wendete Lichtquelle ist ein Argon-Ionen-Laser, der in geeigneter Weise fokussiert ist, um den Zellenstrom in der Strömungskainitier zu durchschneiden. Der in die Strömungskammer eintretende Lichtstrahl hat normalerweise einen elliptischen Querschnitt, um bei der Analyse der Zellstruktur mittels der resultierenden Lichtstreuung und Fluoreszenz unterstützend zu wirken. Der Laserstrahl ist optisch derart geformt, daß er einen elliptischen Querschnitt am Schnittpunkt von Laserstrahl und Zellenstrom besitzt. Der elliptische Querschnitt erleichtert die Arbeitsweise (Ausrichtung), vergrößert die Signalstärke bei verbesserter Auflösung und gestattet die Kennzeichnung der Zellstruktur (Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis) und die Doppelstückfeststellung. Doppelstücke sind zwei Zellen, die durch die Strömungskammer in Berührung miteinander hindurchlaufen. Für die Volumenmeßvorrichtung erscheinen sie als eine unnormal große Zelle. Um nicht falsche Daten von den Meßvorrichtungen zu erhalten, muß daher irgendwie Vorbeuge getroffen werden.

Ein Argon-Ionen-Laser wird als Lichtquelle deshalb verwendet, weil Krebszellen normalerweise wesentlich mehr DNA enthalten, als normale Zellen, und die Fluoreszenz eines erregten biochemisch an das DNA in der Zelle gebundenen Feulgen-Farbstoffs ist eine quantitative Anzeige für das in der Zelle vorhandene DNA. Der Argon-Ionen-Laser emittiert Licht mit einer Wellenlänge, die zur Erregung dieses Farbstoffs für Fluoreszenz geeignet ist. Die von der Strömungskammer infolge des Zusammenwirkens des Lichtstrahls mit den Zellen kommenden Fluoreszenzimpulse werden durch ein ,Linsensystem auf ein Stecknadelloch und sodann auf eine Fotovervielfacherröhre fokussiert. Das Signal dieser Fotovervielfacherröhre wird verstärkt und einer Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit eingespeist.

Aus der Theorie■ergibt sich, daß die Kleinwinkellichtstreuung (bei Winkel zwischen 0,5 und 2,0°) durch sphärische Teilchen von 5-20 Mikron Durchmesser nahezu proportional dem Volumen ist. Da die meisten Säugetierzellen Durchmesser in diesem Bereich besitzen, ist die Lichtstreuung ein erfolgversprechendes Mittel

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zum Erhalt von Größen- und Struktur-Informationen für einzelne Zellen bei hoher Geschwindigkeit. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird zwischen 0,5 und 2,0° durch die Zellen gestreutes Licht durch ein Sammellinsensystem auf eine Fotodiode geleitet. Um weniger als 0,5 gestreutes Licht wird in eine Strahlenvernichtungsvorrichtung geleitet. Auf diese Weise wird die Fotodiode nicht durch solches Licht überlastet, welches nicht mit dem Zellstrom zusammengewirkt hat. Das Fotodiodensignal wird verstärkt und auch in die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit eingespeist.

Das durch das Durchlaufen einzelner Zellen durch die Coiilter-Volumenmeßöffnung erzeugte Signal hat den Vorteil» daß es bereits seiner Art nach elektrisch ist, so daß es lediglich verstärkt und in die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit eingespeist werden braucht.

Wie der Name bereits andeutet, verarbeitet die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit diese Eingangssignale, vergleicht sie mit bestimmten vorgegebenen Standards und erzeugt dann drei Arten von Ausgangssignalen. Ein Signal wird einem Mehrkanal-Impulshöhenanalysator zugeführt, der seinerseits digitale Ausdrucke, eine Impulshohenanalysatoranzexge und Histogramme der Daten erzeugt, die von der Mehrparameter-Signalverarbeitung erhalten wurden. Die Signale von der Verarbeitungseinheit können auch direkt durch eine Oszilliskopanzeige überwacht werden. Schließlich wird eine Ausgangsgröße der Verarbeitungseinheit durch einen Einkanal-Analysator geleitet, und durch Trenn-Logikvorrichtungen und einen Tröpfchenladegenerator, um Tröpfchenladeimpulse zu erfceugen, die zur Trennung ausgewählter Zellen aus dem Zells.trom dienen.Es ist offensichtlich, daß Zeitverzögerungsmittel In Verbindung mit der Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit verwendet werden, um sämtliche Abfühl- oder Meßsignale mit einer speziellen Zelle zu koordinieren.

Die von der Mehrparameter-Verarbeitungseinheit empfangenen Signale können auf verschiedenen Wegen verarbeitet werden, um ihre Abhängigkeit von der gemessenen Eigenschaft zu modifizieren.

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Beispielsweise kann ein zum Zellvolumen (r ) proportionales Signal so verarbeitet werden, daß es linear proportional zum ZeIl-

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radius (r) oder zur Fläche (r ) ist. Weil für jede Meßvorrichtung und für jede Zelle nur ein Datenelement erzeugt wird, ist die zu verarbeitende Datenmenge klein und die an die Elektronik gestellten Erfordernisse sind nicht groß. Durch Verwendung eines zweidimensionalen Impulshöhenanalysators kann eine Zweiparameter-Frequenzverteilung der Zellen erhalten werden. Eine Drei- oder Mehrparameteranalyse erfordert die Datenkapazität eines /kleinen Computers. Als Alternative zur Speicherung sämtlicher Information können dem Analyseschema logische Beschränkungen auferlegt werden, auf welche Weise die Elektronikanforderungen verringert werden. Wenn beispielsweise die Fluoreszenzverteilung sämtlicher Zellen innerhalb eines bestimmten Volumenbereichs gewünscht wird, so kann man dies dadurch erhalten, daß man die Fluoreszenz nur derjenigen Zellen analysiert, die ein Volumensignal entsprechend dem gewünschten Bereich erzeugen. In gleicher Weise kann das Volumen von Zellen innerhalb eines bestimmten Fluoreszenzbereichs erhalten werden. Wenn biologisch nützliche Information erzeugt wird, ist die Analyse auf der Basis von drei oder mehr derartigen logischen Erfordernissen möglich.

Alternativ können die verarbeiteten Signals von mehreren Meßvorrichtungen kombiniert werden als Verhältnisse(oder Summen , Differenzen, usw.) und die Frequenzverteilung der Kombination kann unter einer Population bestimmt werden. Beispielsweise kann durch Verwendung einer RNA-spezifischen Fluoreszenzeinfärbung und durch Meßvorrichtungen für Fluoreszenz und Volumen ein Verhältnis aus den verarbeiteten Signalen gebildet werden, um eine Verteilung der RNA-Dichte unter einer Population von Zellen zu erhalten. In gleicher Weise ergibt sich eine Art Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis durch Verwendung eines Kern-spezifischen Fluoreszenzfärbemittels, um eine Messung des Kernvolumens und eine Gesamtzellenvolumenmessung durch Streulicht oder die Coulter-Meßvorrichtung zu ergeben.·

/ nftfiß

Ein logisches und Schalt-Blockdiagrairwi füx eine Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit, die zur Analyse und Sortierung abnormaler Zellen aus normalen Zellen zweckmäßig ist, ist in den Fig. 6 und 7 dargestellt. Die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit ist die zentrale elektronische Verarbeitungseinheit für Einparameteranalyse, Verhältnisberechnung, Serien- oder Reihen-

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analyse und darauffolgende Zellsortierung. Grundsätzlich dient die Signalverarbeitungseinheit als eine zentrale analoge elektronische Berechnungszwischeneinheit (Interface) zwischen den Meßvorrichtungen, der Mehrkanal-Impulshöhenanalysiervorrichtung und der Zellen-Trennsteuerung (Einkanal-Analysator; Trennlogik; Tröpfchenladegenerator). Die Signalverarbeitungseinheit erzeugt auch x- und y-Ausgänge für einen Zweiparameter-Impulshöhenanalysator. Verstärkte Signalimpulse (0,4 bis 8,0 Volt) von der Coulter- oder Zellvolumen (CV)-, der Lichtstreuung (LS)- und der Fluoreszenz (FL)-Meßvorrichtung werden direkt in die Verarbeitungseinheit eingespeist. Die Einheit hat gesonderte Eingänge für die Volumen-,Lichtstreuungs- und Fluoreszenz-Signale. Wenn gewünscht, kann ein Fluoreszenz-Signal mit einer zweiten Wellenlänge, beispielsweise rot, an die Stelle des Lichtstreuungseingangssignals gesetzt werden oder ein Großwinkel-Lichtstreuungssignal kann an die Stelle des Fluoreszenzeingangs-Signals gesetzt werden.

Die Signalverarbeitungseinheit dient als eine gesteuerte-Signal-Spitze-Meß- und Halt-Vorrichtung, die sowohl zur Einzelverarbeitung und zur Dualverarbeitung der Meßsignale (Abfühlsignale) geeignet ist. Die Verarbeitungseinheit ist in drei Abschnitte eingeteilt: Eingangsbedingungen, Signalverarbeitung und Ausgangsführung, Der Eingangsbedingungsabschnitt (er ist in Fig. 6 dargestellt) besteht aus Betriebsarten- und CV-FL/LS-Verzögerungswählschaltern. Der acht Stellungen aufweisende Betriebsartenschalter gestattet die Einparameter-Zellanalyse, d.h. CV, LS und FL, und die Zweiparameter-Analyse von Zellen, d.h. CV und FL, CV und kein FL, CV und LS, LS und FL und schließlich LS und kein FL. Da das Coulter-Volumensignal sowohl vor den Lichtstreuungs- als auch den Fluoreszenzsignalen ankommt, wird ein variabler (0 bis 190 Mikrosekunden, in Stufen von 10 MikroSekunden) CV-FL/LS-Ver-

_ j y —

zögerungsschalter verwendet, um die richtige CV zu FL/LS Signalverzögerung einzustellen. Diese Verzögerung liegt in der Größenordnung von 170 Mikrosekunden. Die Verzögerung braucht nur bei der Zweiparameteranalysebetriebsart verwendet ,werden, wenn das Coulter-Volumen analysiert werden muß.

Der Signalverarbeitungsabschnitt besteht aus Verhältnis- und Serie (Eingang und Analyse)-Analysewählschaltern (vergleiche Fig. 7). Ein sechs Stellungen aufweisender Verhältniswählschalter gestattet die Berechnung folgender Verhältnisse: CV/FL, CV/LS, FL/CV, FL/LS, LS/CV und LS/FL. Es ist unbedingt erforderlich, daß der Betriebsarten- und Verhältniswählschalter übereinstimmen, beispielsweise befindet sich der Betriebsartenwähler in der LS und FL-Stellung und der Verhältniswähler befindet sich entweder in der LS/FL oder in der FL/LS-Verhältnisstellung. Es ist auch wichtig, daß die CV zu FL/LS-Signalverzögerung verwendet wird, wenn CV enthaltende Verhältnisse berechnet werden. Der Serien- oder sequentielle Analyseahschnitt besteht aus Eingabe- und Analysewählschaltern (jeder mit vier Stellungen). Der Serieanalyse-Eingabewählschalter wählt entweder CV, FL, LS oder Verhältnissignale, die einem externen Einkanal-Impulshöhenanalysator (Serie SCA) zugeführt werden. Wenn die Signalamplitude in eine am SCA-Fenster voreingestellte variable Breite (0,4 bis 8,0 Volt) fällt, wird ein SCA-Triggerimpuls erzeugt und an die Signalverarbeitungseinheit zurückgeführt, wodurch das Serieana- ^J lyse-Analyselineargatter getastet wird, so daß entweder das CV, FL, LS oder Verhältnis-Signal analysiert wird, wie dies durch den Serieanalyse-Analysewählschalter bestimmt ist. Sowohl die Serieanalyseeingangs- als auch die Analyse-Wählstellungen (CV, FL, LS und Verhältnis) müssen - wenn immer erforderlich - mit der Betriebsart, der CV-Fl/LS-Verzögerung und den Verhältniswählschaltern übereinstimmen, und zwar beispielsweise Serieanalyseeingang-CV, Serieanalyseanalysierung-FL, Betriebsart-CV und FL, CV-FL/LS-VerzÖgerung'-v' 180 ^sek und Verhältnis-Aus.

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Der Ausgangsführungsabschnitt (vergleiche Hg. 7) besteht aus einem Pulshöhenanalysator (PHA)-Eingang, einem Separator- oder Trenneingang und aus Zweiparameteranalysatoreingangswählschaltern. Der PHA-Eingang kann einzelne Parameter (CV, LS oder FL), Verhältnisse, Serieanalyseeingang und Analyseparameter zur externen Weiterführung an einen Mehrkanal-Impulshöhenanalysator auswählen, wohingegen der Separator-Eingangswähler einzelne Parameter, Verhältnisse oder Serieanalyse-Analysatorsignale der Separatorsteuerung zuführen kann. Der Zweiparameterimpulshöhenanalysatorwählschalter erzeugt folgende Ausgangsgrößen: CV -FL , CV -LS ,

LS -FL , CV -Verhältnis , FL -Verhältnis und LS -Verhältnis , xyx yx y χ y

wobei sich die Indizes χ und y auf die χ und y Achsen des Zweiparameter-PHA beziehen. Durch Vertauschen der χ und y Achseneingänge können die obigen Größen umgekehrt werden.

Reihenfolge des Arbeitsablaufs:

Die zu untersuchenden Zellpopulationen werden zunächst eingefärbt (fluoreszente Feulgen-Färbemittel, usw.)und in eine wässerige Suspension, wie beispielsweise eine normale Salzlösung, gebracht. Gebundene und ungebundene Zellen können gemessen werden. Bevor die Zellsuspension im Zellreservoir untergebracht wird, wird sie durch ein 60-70 Mikron Nylonmaschensieb gefiltert, um größere Verunreinigungen und Klumpen zu entfernen. Die Elektronik befindet sich dabei bereits in Bereitschaftsstellung, das System steht unter Druck und der Laser ist eingeschaltet. Vor den Zellmessungen wird das System ausgerichtet und eingestellt. Wenn das Sortieren der Zellen erforderlich ist, muß der den piezoelektrischen Kristall oder einen äquivalenten Wandler elektrisch antreibende Tröpfchengeneratoroszillatorverstärker eingeschaltet werden. Die Tröpfchenbildung wird durch Beleuchtung des austretenden Flüssigkeitsstrahls nahe der Strömungskammer mit einem stroboskopischen Licht oder einer äquivalenten Lichtquelle überprüft. Das Stroboskoplicht wird synchron mit der Oszillatorfrequenz aufgeblitzt. Die Tröpfchenausbildung kann dann unter Verwendung eines Mikroskops beobachtet werden. Für einen gegebenen Düsendurchmesser und eine gegebene Strömungsgeschwindigkeit kann die Tröpfchenausbildung durch Veränderung der an den piezoelektrischen Kristall angelegten Spannung

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und Frequenz geändert werden. Typiscne Werte sind 15 Volt_ef£ (sinusförmig) bei 40 bis 50 kHz. Die Tröpfchenladeelektrode ist zu beiden Seiten des Punktes der Tröpfchenausbildung (Trennung) angeordnet, und zwar ungefähr 5/16 Zoll (5/16 χ 2,54 cm) unterhalb der Strömungskammer, um maximale Tröpfchenaufladung sicherzustellen. Typische Ladeimpulse haben 50 Volt bei 100 bis 200 MikrοSekunden. Die elektrostatischen Ablenkplatten sind 2-3 Zoll (5,08cm - 7,62cm) unterhalb der Strömungskammer angeordnet und weisen einen Abstand von 1/2 Zoll bis 3/4 Zoll auf. An die Ablenkplatten ist normalerweise ein Differential von 15kV Gleichspannung angelegt. Ein Probensammlungsbecher oder ein anderes geeignetes Sammlungssystem ist 8 bis 9 Zoll von der Strömungskammerausgangsseite leicht versetzt gegenüber dem (ungeladenen) Hauptstrahl angeordnet, so daß nur die (geladenen) abgelenkten Tröpfchen gesammelt werden. Wenn das Aussortieren von Zellen nicht erwünscht ist, dann kann.die obige Verfahrensweise wegelässen werden.

Die suspendierten Zellen werden in einem unter Druck stehenden (23,4 psi, d.h. englischen Pfund pro Quadratzoll) Zellreservoir angeordnet. Die unter Druck stehende Hiallflüssigkeit Nr. 1 (24,0 psi) und die Hüllflüssigkeit Nr. 2 (20,0 psi) werden angestellt und man erreicht eine ordnungsgemäße Tröpfchenbildung, wenn Sortieren erwünscht ist. Die Hüllflüssigkeit Nr. 1 hat ohne Zellströmung eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 Milliliter pro Minute. Die Strömungsgeschwindigkeit der Hüllflüssigkeit Nr. 2 ist annähernd 3,9 Milliliter pro Minute, Die Gesamtströmungsrate durch die 86 Mikron Durchmesser-Austrittsdüse ist somit 4,2 Milliliter pro Minute. Für einen typischen Zellstromdurchmesser von ungefähr 20 Mikron entspricht der Zellreservoirdrück von 23,4 psi einer Zellenströmungsgeschwindigkeit von ungefähr 0,08 ml/Min. Die Strömungsgeschwindigkeit des Zellstrojnes kann leicht von 0 bis 0,3 ml/Min (100%) eingestellt werden, und zwar durch Einstellung des Zellreservoirdrucks bezüglich des Reservoirdrucks (- 0,2 psi) für die Hülle Nr.2, wobei der Reservoirdruck für die Hülle Nr. 1 fest bleibt. Normalerweise bleibt der Druck für Hülle Nr. T relativ zum Druck für Hülle Nr. 2 fest, kann jedoch, wenn gewünscht, verändert werden. Erhöht man den Druck für

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Hülle Nr. 1 relativ zu Hülle Nr. 2, so sirJ;t die Durchgangszeit für die Zellen durch die Strömungskairaner ab. Wenn das Proben-an/aus-Ventil eingeschaltet wird, laufen Zellen vom Zellreservoir über das Probeneinlaßrohr in die Strömungskairaner. Das Einlaßrohr dient als Coulter-Volumensignalelektrode. Vom Einlaßrohr laufen Zellen durch die Volumenineßöffnung (75 Mikron Durchmesser öffnung), wo das Zellvolumen gemessen wird. Es können auch Meßöffnungen mit anderen Größen verwendet werden. Eine teilchenfreie Hülle (Hülle Nr. 1) fließt koaxial um das Probeneinlaßrohr herum und dient zur mittigen Ausrichtung des Zellstroms, wenn er durch die Volumenmeßöffnung tritt, auf welche Weise die Auflösung der Zellvolumen- und Fluoreszenz-Lichtstreuraessungen verbessert wird. Typische Öffnungsgleichströme von der Volumensignalelektrode durch die öffnung können zwischen 0,05 und 1,0 mA eingestellt werden. Der Öffnungsstrom und der Verstärkungsfaktor können derart eingestellt werden, daß sich Volumensignalimpulse (0,4 bis 8,0 Volt) ergeben, die ihrerseits dem CV Eingang der Mehrparametersignalverarbeitungseinheit eingespeist werden. Die typische Volumensignalanstiegszeit beträgt ungefähr 20 Mikrosekunden, wobei die Impulsbreiten 40 Mikrosekunden sind.

Nach Erregung der Volumenmeßöffnung schneiden die Zellen den Laserstrahl und erzeugen dabei Lichtstreuung und Fluoreszenz. Typische Verzögerungszeiten zwischen» dem Beginn der Coulter-Volumenmessung und dem Fluoreszenz/Lichtstreu-Impuls liegen in der Größenordnung von 160 bis 180 Mikrosekunden. Die elektrooptisehen Fluoreszenz- und Lichtstreu-Impulse werden verstärkt »0,4 bis 8,0 Volt) und den entsprechenden Eingängen an der Signalverarbeitungseinheit zugeführt. Typische Anstiegszeiten liegen in der Größenordnung von 1 bis 2 Mikrosekunden, wobei die Impulsbreiten ungefähr 5 Mikrosekunden sind. Eine zweite teilchenfreie Hüllflüssigkeit (Hülle Nr. 2) aus einer normalen Salzlösung dient zur Verminderung der Wirkung des Druckabfalls, der durch die Coulter-Meßöffnung erzeugt wird.

Wenn die Eigenschaften der Zelle gemessen sind, verläßt diese die Strömungskammer über die Austrittsdüse, und zwar in einem

Flüssigkeitstropfchen, der darauffolgend getrennt werden kann. Die angenäherte Verzögerungszeit zwischen der Zellmessung und der Tropfenausbildung liegt in der Größenordnung von 1400 Mikrosekunden.

Die von den Volumen-, Lichtstreuungs- und Fluoreszenz-Meßvorrichtungen und Verstärkern kommenden Signale werden also zum Zwecke der darauffolgenden Analyse und Weiterführung in die Mehrparametersignalverarbeitungseinheit eingespeist. Die Verarbeitungseinheit dient als eine Zwischenstufe (Interface) zwischen dem Mehrkanalimpulshöhenanalysator, der Zellentrennlogik und dem Tröpfchenaufladgenerator/ sowie dem (in Fig. 5 nicht gezeigten) Zweiparameter-Impulshöhenanalysator. Die Signalverarbeitungseinheit muß in der richtigen Weise - wie oben erwähnt - aufgebaut sein, und zwar abhängig von den Anforderungen an jeden Versuchslauf.

Bei einem typischen Versuch zur Analyse und zum Heraussortieren abnormaler Zellen aus einer gegebenen Populationsmischung, kann eine Anzahl unterschiedlicher Lösungsmöglichkeiten sinnvoll sein. Der Mehrkanalimpulshöhenanalysator würde als erstes zur Anzeige von Frequenzverteilungshistogrammen von einzelnen Parametern (Volumen, Lichtstreuung und Fluoreszenz), Verhältnissen von Parametern oder möglicherweise zur Serienanalyse von Parametern verwendet werden, wie beispielsweise der Analyse der Fluoreszenz für einen gegebenen Zellvolumenbereich, usw. Der Dual- oder Zwei-Parameteranalysator könnte auch zur Analyse verschiedener Zweiparameterfrequenzverteilungshistogramme benutzt werden, die erforderlich sein können. Es ist möglich, aus der Mehrkanal-PHA-Anzeige oder aus der Zweiparameter-PHA-Anzeige, oder aus beiden Anzeigen, Abnormalitäten aus verschiedenen Histogrammen herauszulesen, beispielsweise ein abnormal großes Kern-zu-Zellenvolumen-Verhältnis. Aus dieser Art Information kann der Zelltrennungslogik-Tröpfchenladegenerator in die Lage versetzt werden, um diese Zellen mit fraglichen Eigenschaften für eine mikroskopische Überprüfung und Identifikation auszusortieren. Der untere und obere Schwellpegel des Einkanalimpulshöhenanalysators (SCA) ist derart eingestellt, daß er Impulsamplituden (Verhältnisse, usw.) von

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Zellen mit abnormalen Eigenschaften aufniitiiut. Der SCA löst den Tröpfchenladegenerator dann aus, der einen verzögerten (1400 Mikrosekunden) Tröpfchenladeimpuls (50 Volt Spitze bei 100 bis 200 Mikrosekunden) erzeugt. Wenn einmal die Abnormalitätseigenschaften erhalten sind,braucht es nicht mehr erforderlich sein, die abnormalen Zellen herauszusortieren, um sie dann unter einem Mikroskop zu überprüfen; vielmehr ist nur eine weitere Automatisierung des Analyseverfahrens erforderlich, um die schnelle Krankheitsdiagnose zu fördern.

Die Optimale Arbeitsweise läge dann vor, wenn sämtliche Zellen einzeln durch die Volumenmeßöffnung und den Lichtstrahl laufen würden, und wenn nur eine Zelle in jedem Tröpfchen gefangen wäre. In der Praxis ist dies äußerst schwer zu erreichen. Die Zellen sind häufig im Zellstrom mit großem Abstand voneinander angeordnet, so daß zahlreiche Tröpfchen keine Zellen enthalten. Dies stellt jedoch kein besonderes Problem dar; wenn jedoch zwei Zellen sich regelrecht berühren (und somit ein Doppelstück bilden) oder so benachtbart zueinander angeordnet sind, daß die Meßvorrichtungen nicht zwischen ihnen unterscheiden können, dann zeigen die Meßdaten abnormale Zellen an und ein Sortiersignal wird geliefert. Wenn, was bei der normalen Population von Zellen wahrscheinlich ist, das Doppelstück lediglich aus zwei normalen Zellen besteht, so hat dies eine Verdünnung der Reinheit der sortierten Probe zur Folge. Große Aufmerksamkeit bei der Probenzubereitung kann das Vorhandensein von Doppelstücken wesentlich reduzieren, und die Verwendung von Diskriminationsverfahren vermindert fehlerhafte Sortiersignale infolge des Vorhandenseins solcher Doppelstücke oder dicht benachbarter Zellen; beides bringt jedoch einen erhöhten Zeit- und Kostenbedarf bei der Analyse und beim Sortieren mit sich. Aus pragmatischen Erwägungen ist es daher häufig zweckmäßig, einen bestimmten kleinen Prozentsatz von Doppelstücken und dicht benachbarten Zellen zu den abnormalen Zellen aussortieren zu lassen. Obwohl auf diese Weise die Reinheit der sortierten Probe vermindert wird, behindert dies jedoch nicht die Analyse der Probe zu stark. Typischerweise werden 90% oder mehr der Zellen einzeln in Tröpfchen isoliert. D.h. also, 90% oder mehr der Zellen enthaltenden Tröpfchen enthalten nur eine einzige Zelle.

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Claims (17)

1. Patentansprüche

   Vorrichtung zur schnellen Analyse und zum Sortieren kleiner Teilchen auf der Grundlage vorgewählter Eigenschaften oder Kombinationen von vorgewählten Eigenschaften, gekennzeichnet durch folgende Elemente:

   a) Eine Strömungskammer (3),

   b) eine Hochintensitätslichtquelle (4),

   c) Mittel zum Einführen von in einer Suspension in einem Strömungsmittel befindlichen Teilchen in die Strömungskammer (3),

   d) Mehrfach-Meß- oder Fühlmittel zur Feststellung vorgewählter physikalischer und chemischer Eigenschaften der Teilchen in der Strömungskammer (3) und zur Erzeugung analoger elektrischer/ mit den Eigenschaften in Beziehung stehender Größen,

   e) Vergleichsmittel zum Vergleich der analogen elektrischen Größen mit ausgewählten Standardwerten für diese,Eigenschaften oder für Kombinationen dieser Eigenschaften und zur Erzeugung eines elektrischen Sortiersignals dann, wenn die Größen oder die Kombinationen dieser Größen außerhalb der vorgewählten Standardwerte liegen,

   f) Mittel zum Ausspritzen des Strömungsmittels aus der Strömungskammer (3),

   g) Mittel zur periodischen Störung des Strahls zum Zwecke der Erzeugung von Tröpfchen mit gleichmäßiger Größe, die hinreichend klein sind, so daß im wesentlichen jedes Teilchen in einem einzigen Tröpfchen isoliert ist,

   h) benachbart zur Strahlbahn an der Tröpfchentrenn- oder Separationszone angeordnete elektrische Lademittel (5),

   i) elektrische Verzögerungsmittel, wodurch das Sortiersignal die elektrischen Auflademittel dann aktiviert, wenn ein Teilchen mit Eigenschaften außerhalb der vorgewählten Standardwerte sich in der Tröpfchentrennzone befindet, wobei die Auflademittel in ihrem inaktiven Zustand verbleiben, wenn nicht das Sortiersignal empfangen wird,

   j) elektrische Ablenkmittel (8) zur Ablenkung der geladenen Tröpfchen in ein gesondertes Gefäß, um sie so von den ungeladenen Tröpfchen zu trennen.

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2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, d&Juich gekennzeichnet, daB die vorgewählten chemischen und physikalischen Eigenschaften die Kleinwinkelstreuung, Fluoreszenz und das Volumen sind.
3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Strömungskammer folgende Elemente aufweist:

   a) Mittel, um die Teilchen längs eines engen Stromes des Strömungsmittels zu führen, wobei der Strom durch eine erste Zone mit einer Coulter-Volumenmeßöffnung (21) läuft, in welcher die durch den Durchlauf jedes Teilchens erzeugte Impedanzänderung gemessen wird, und wobei der Strom durch eine zweite, als Beobachtungszone bezeiphnete Zone läuft, in der der Strom einen Lichtstrahl von der Hochintensitätslichtquelle schneidet,

   b) eine Zugangsöffnung für den Eintritt des Lichtstrahls in die Beobachtungszone,

   c) Mehrfach-Beobachtungsöffnungen zur Beoabachtung und Messung der optischen Eigenschaften der Teilchen, wobei schließlich das Strömungsmittel durch eine Düse an der Basis der Strömungskammer ausgespritzt wird,
4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hochintensitätslichtquelle ein Laser ist.
5. 5. Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Verzögerungsmittel zur Verzögerung des elektrischen Analogsignals, welches durch den Durchgang jedes Teilchens durch die Volumenmeßöffnung erzeugt wird, und um es mit den elektrischen Analogsignalen in Korrelation zu bringen, die von dem gleichen Teilchen durch die optischen Meßvorrichtungen erzeugt werden,
6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Meßvorrichtung oder Mittel eine Fotodiode und eine Fotovervielfacherröhre aufweisen.
7. 7. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

   die Mittel, welche bewirken, daß die Teilchen längs eines engen Stromes des Strömungsmittels laufen, folgende Elemente auf-

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   weisen:

   a) Ein Probeneinlaßrohr zum Einführen der Teilchen in Suspension in dem Strömungsmittel in die Strömungskammer, wobei sich das Probeneinlaßrohr um einen wesentlichen Betrag in die Strömungskammer hineinerstreckt,

   b) ein erstes Hüllflüssigkeitseinlaßrohr, welches das Probeneinlaßrohr konzentrisch umgibt und sich etwas über das Probeneinlaßrohr hinaus in die Strömungskammer hinein erstreckt, wobei das erste Hüllflüssigkeitseinlaßrohr an

   . seinem unteren Ende eine Düse aufweist, in der die Volumenmeßöffnung angeordnet ist, wodurch die genannten Teilchen beim Verlassen des Probeneinlaßrohres von einer koaxialen laminaren Strömung der Hüllflüssigkeit umgeben werden, welchletztere eine hinreichend hohe Geschwindigkeit aufweist, um die Strömung der Teilchen in Suspension auf einen Strom mit gewünschtem Durchmesser einzuengen, und um den Strom im wesentlichen koaxial zu umgeben, wenn er durch die Volumenmeßöffnung läuft.
8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Beobachtungszone von einem Reservoir der Hüllflüssigkeit umgeben ist, wobei sich das Reservoir im wesentlichen oberhalb der Beobachtungszone erstreckt.
9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reservoir durch ein zweites Hüllflüssigkeitseinlaßrohr gespeist ist.
10. 10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich das zweite Hüllflüssigkeitseinlaßrohr nahe an die Basis des Reservoirs heranerstreckt, weichletzteres an seinem oberen Ende eine Ausspülöffnung aufweist, durch welche in dem Reservoir erzeugte Gase periodisch oder kontinuierlich ausgespült werden können.
11. 11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Probeneinlaßrohr als eine Elektrode für die Volumenmeßöffnung dient, und daß das zweite Hüllflüssigkeitseinlaßrohr

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    als die zweite Elektrode für -3ie Meßöffmmg dieot.
12. 12. Vorrichtung nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch Mittel zur Steuerung der Drücke der Flüssigkeiten, die in die Strömungskanuner durch das Probeneinlaßrohr, das erste Hüllflüssigkeitseinlaßrohr und das zweite Hüllflüssigkeitseinlaßrohr eintreten.
13. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Drücke differentiell gesteuert werden.
14. 14. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur periodischen Störung des Strahls einen piezoelektrischen Kristall aufweisen, der mit der Strömungskanuner gekoppelt ist und mit der gewünschten Frequenz schwingt.
15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Düse in der Basis der Strömungskammer in das Reservoir hineinerstreckt, und zwar in die Nähe der Ebene der Beobachtungszone, wobei Mittel vorgesehen sind, um die Volumenmeßöffnung mit der Öffnung in der Düse auszurichten.
16. 16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausrichtmittel eine Vielzahl von Einstellschrauben aufweisen, die mit gleichförmigem Abstand um den ersten Hüllflüssigkeitseinlaß außerhalb der Strömungskammer herum angeordnet sind, wodurch das erste Hüllflüssigkeitseinlaßrohr um eine Achse gedreht wird, die teilweise innerhalb des Reservoirs angeordnet ist.
17. 17. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Generatormittel zur Erzeugung eines ersten elektrischen Signals proportional dem Volumen jeder Zelle, durch Meßmittel zur Messung der Streuung des Laserlichtes und zur Erzeugung eines zweiten elektrischen Signals proportional zu dem Streuungsbetrag, durch Auffang- und Meßmittel für das fluoreszente Licht zur Erzeugung eines dritten elektrischen Signals proportional der Menge des

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    fluoreszenten Lichtes, durch Mattel ?um Verzögern des ersten elektrischen Signals und zum Inkorrelationbringen dieses Signals für jede Zelle mit den zweiten und dritten durch diese gleiche Zelle erzeugten Signalen, und durch Vergleichsmittel, um diese Signale oder Kombinationen aus diesen Signalen mit vorgegebenen, als normal betrachteten Wertebereichen zu vergleichen, und um ein elektrisches Sortiersignal dann zu erzeugen, wenn eines der Signale oder Kombinationen der Signale außerhalb des vorbestimmten Wertebereiches liegen.