DE2163315B2 - Verfahren zum nachweis und/oder zur quantitativen bestimmung saurer prostata-phosphatase in biologischen fluessigkeiten - Google Patents
Verfahren zum nachweis und/oder zur quantitativen bestimmung saurer prostata-phosphatase in biologischen fluessigkeitenInfo
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Description
35
Diese Erfindung betrifft die qualitative und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase
in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere in Blutserum und anderen biologischen Flüssigkeiten.
Die qualitative und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten
wird insbesondere für die klinische Diagnose eines Prostatacarcinoms verwendet. Ein bekanntes Symptom
ist nämlich der erhöhte Gehall an saurer Prostata-Phosphatase in Blut, Urin und anderen biologischen
Flüssigkeiten.
Es sind einige Substrate, die auf die katalytische Aktivität der sauren Prostata-Phosphatase ansprechen,
bekannt. Die diesbezüglich bekanntesten Substrate sind Phenolphosphat, Phenolphthaleinrnonophosphat,
Λ-Naphthylphosphat, p-Nitrophenylphosphat und
/5-Glycerophosphat. Des weiteren ist die Verwendung
von Salzen des Thymolphthaleinmonophosphats bekanntgeworden. Es können jedoch auch andere saure
Phosphatasen als die Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten vorkommen. In bedeutenderen
Mengen kommen im allgemeinen im Blut die sauren Phosphatasen der Erythrocyten und der Blulplättchen
vor. Bei der Verwendung eines der hier genannten Substrate zum Nachweis der sauren Prostata-Phosphatase
entstehen Schwierigkeiten durch die Aktivität anderer saurer Phosphatasen, die, wenn vorhanden, eine
positive Reaktion vortäuschen. Von den obengenannten Substraten haben /J-Flycerophosphat und «-Naphthylphosphat
die größte Spezifität für saure Prostala-Phos-Dhatase, doch sogar diese sind nicht spezifisch genug.
Obwohl dieser Mangel mit Hilfe bekannter Inhibitoren,
wie Tartrat oder Formalin, und Vergleich der Ergebnisse wesentlich verringert werden kann, sind
solche Techniken doch relativ lästig. Überdies ist das Bestimmungsverfahren, das ]3-Glycerophosphat als
Substrat verwendet, ziemlich schwierig durchzuführen.
Auch bei einer Verwendung des Magnesiumsalzes des Thymolphthaleinmonophosphats als Substrat hat CoIeman
(vgl. Clinical Chemistry Y2 (1966), 529) das beschriebene Verfahren angewendet. Dieses Substrat
hat er mit dem Caiciumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats verglichen. Mit den beiden Substraten wurde
jeweils einmal mit und einmal ohne Inhibitor der saure Phosphatase-Gehalt bestimmt. Aus der Differenz beider
Ergebnisse erhält man die Menge an saurer Prostata-Phosphatase. Wenn nun in der Literaturstelle konstatiert
wird, daß als ausgewähltes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase das Caiciumsalz
des Phenolphthaleinmonophosphats zu verwenden sei, also dieser Verbindung der Vorgang gegenüber dem
Magnesiumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats gegeben wird, so beruht dies auf der raschen
Ansprechbarkeit des Phenolphthaleinmonophosphats. Bei der Nacharbeitung des in der Literatur nur sehr
knapp beschriebenen Versuchs sind zwar die jeweiligen Natriumsalze eingesetzt worden, doch konnte bestätigt
werden, daß das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats ganz bedeutend reaktionsfähiger als das
Natriumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats ist und deswegen sehr viel rascher mit anderen sauren
Phosphatasen als der sauren Prostata-Phosphatase reagiert. Wenn dementsprechend ein Serum mit einem
Gehalt an einem Gemisch saurer Phosphatasen mit den beiden Natriumsalzen als jeweiligen Substrat untersucht
wird, so zeigt das Natrium-phenolphthalein-monophos· phat eine größere Aktivität, und zwar aus zwei
Gründen. Einmal ist das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats bedeutend empfindlicher gegenüber
bestimmten anderen sauren Phosphatasen als gegenüber der sauren Prostata-Phosphatase. Zum
zweiten ist das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats gegenüber saurer Prostata-Phosphatase
reaktionsfähiger. Es ist jedoch bekannt, daß das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats eine
außerordentlich größere Reaktionsfähigkeit gegenüber anderen sauren Phosphatasen als gegenüber saurer
Prostata-Phosphalase besitzt, die ein erstes Problem darstellt, wenn sich die Untersuchung auf saure
Prostata-Phosphatase richten soll, da die stattfindende Reaktion ein positiv-falsches Ergebnis in dem Sinne
liefern kann, daß die angezeigte saure Phosphatase-Reaktivität in erster Linie auf anderen sauren
Phosphatasen als der sauren Prostata-Phosphatase beruht und daß somit das Vorliegen von saurer
Prostata-Phosphatase in klinisch signifikanten Mengen verschleiert werden kann. Unter den zahlreichen im
Blut aufgefundenen sauren Phosphatasen ist die saure Prostata-Phosphatase nur eine der Phosphatasen von
höchstem klinischen Interesse. Aus diesen Gründen war es bisher üblich, zwei saure Phosphatase-Bestimmungen
durchzuführen. Bei der ersten Bestimmung wird die gesamte saure Phosphatase Reaktionsfähigkeit unter
bezug auf das jeweilig eingesetzte Substrat, z. B. das Natriumsalz des Phenolphthaleinmonophosphats, gemessen.
Bei der zweiten Bestimmung wird in genau der gleichen Weise verfahren, jedoch mit der Ausnahme,
daß ein Inhibitor für die saure Prostata-Phosphatase vorhanden ist. Die Differenz bei der sauren Phosphata-
se-Aktivität bei den beiden Bestimmungen wird dann errechnet und als Maß für die Menge der vorliegenden
sauren Prostata-Phosphatase im Serum genommen. Auch dieses Verfahren zeigt nicht in wünschenswerter
Genauigkeit das Vorhandensein von saurer Prostata-Phosphatase an.
Aufgabe dieser Erfindung war es daher, ein Substrat zu finden, das spezifischer für saure Prostata-Phosphatase
als die bisher bekannten Substrate isL Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung war, ein zuverlässiges
diagnostisches Verfahren für die qualitative und die quantitative Bestimmung von saurer Prostata-Phosphatase
anzugeben, das einfach ist und mit den üblichen und bereits vorhandenen Laborgeräten durchgeführt werden
kann.
Gegenstand dieser Erfindung ist somit ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung saurer
Prostata-Phosphatase in biologischen Flüssigkeiten durch Inkubation einer Probe der biologischen Flüssigkeit
mit. einem Alkali- oder Erdalkalisalz desThymolphthaleinmonophosphats
als Substrat in einem wäßrigen Medium bei saurem pH-Wert und Messen der Menge des wahrend einer bestimmten Dauer umgesetzten
Substrats gegen einen Leerwert.
Dieses Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß sowohl der Meßwert als auch der Leerwert in einem
von Inhibitoren für saure Prostata-Phosphatase freien Medium bestimmt werden, wobei der Leerwert mit
einer reinen Lösung des als Substrat verwendeten Salzes des Thymolphthaleinmonoohosphats erhalten
wird.
Obwohl das Natriumsalz vorzuziehen ist, können noch andere Salze des Thymolphthaleinmonophosphats
verwendet werden, insbesondere die Salze der anderen Alkalimetalle, z. B. Kalium, und die Salze der Erdalkalimetalle.
Es versteht sich, daß zu den Salzen der Erdalkalimetalle die Magnesiumsalze gehören.
Gernäß einem Vorschlag kann das Magnesiumthymolphthaleinmonophosphat
als Substrat für den Nachweis und die quantitative Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Blutserum verwendet werden, wobei
man im allgemeinen bei ph IO in einer gepufferten Lösung arbeitet. Dieses Enzym tritt vor allem bei
Osteoblastentätigkeit bei Erkrankungen der Leber und der Galle bei Schwangerschaft sowie bei Ikterusverschluß
auf. Erniedrigte Werte werden bei Hypophosphatasie und Unterernähtung beobachtet. Daher
besteht kein Zusammenhang mit der Bildung der sauren Prostata-Phosphatase.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von allgemeinen Ausführungen und einem speziellen Ausführungsbeispiel
näher erläutert.
Die erfindungsgemäße Bestimmungstechnik ist einfach. Eine abgemessene Menge Serum oder anderer
biologischer Flüssigkeit wird zu einer auf einen sauren pn-Wert gepufferten Substratlösung zugesetzt. Es wird
bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit inkubiert. Während der Inkubation wird Thymolphenolphthalein
freigesetzt, am Ende der Inkubationszeit wird die Lösung alkalisch gemacht, dadurch die
Enzymreaktion gestoppt und die Farbe des Thymolphenolphthaleins voll entwickelt. Sie bleibt für mindestens
zwei Stunden stabil. Der Test wird gegen einen Leerwert bestimmt und die erhaltene Absorption mit
den Absorptionen, die mit reinen Thymolphenolphthaleinlösungen in verschiedenen Konzentrationen erhalten
wurden, verglichen. Die Ergebnisse werden in internationalen Einheiten (I.U.) angegeben, d. h. Mikromole
Substrat, die je Minute und je Liter biologischer Flüssigkeit umgesetzt werden. Der Vorteil der erfindungsgemäßen
Bestimmungsmethode liegt nicht nur in der einfachen Technik, sondern auch in der Verwendung
etabiler Reagentien, so daß die Möglichkeit der Eichung durch Verwendung einer Grundstandardlösung besteht.
Ein anderer Vorteil der Methode ist, daß die Reaktion, gegen die Inkubationszeit aufgetragen, über
einen großen Bereich der Enzymkonzentration nullter Ordnung ist. Bei entsprechenden Versuchen waren die
Aktivitäten aus verschiedenen Verdünnungen von Prostatacarcinom-Serum und Prostataextrakt der Enzymkonzentration
bis 110 LU. proportional, das entspricht etwa dem 300fachen der normalen oberen
Grenze. Bei Inkubationszeiten von 10 bis 120 Minuten war die Reaktion bis zu einer Aktivität von UO I.U.
linear.
Ein wesentlicher Vor! eil der erfindungsgemäßen Methode ist ihre gute Spezifität für saure Prostata-Phoi.phatase;
saure Nicht-prostata-Phosphatase-lsoenzyme,
die für das falsche positive Ergebnis auf saure Prostata-Phosphatase verantwortlich sind, stören weniger
als bei der Verwendung anderer bekannter Substrate.
Genauer gesagt ist die Aktivität oder Affinität der sauren Erythrocyten-Phosphatase zu Phenolphosphat
etwa 88mal größer als zu Natriumthymolphthalein-monopiosphat.
Das ist von größter diagnostischer Bedeutung, da die saure Erythrocyten-Phosphatase
gewöhnlich zusätzlich zu jeder sauren Prostata-Phosphatase
in Blutserum enthalten ist und ihre Reaktivität mit Phenolphosphat so groß ist, daß sie die Bestimmung
der sauren Prostata-Phosphatase stört oder verschleiert. Andererseits ist bei Verwendung des Natriumthy·
molphthalein-monophosphats als Substrat für ein Serjm, das saure Prostata-Phosphatase zusammen mit
saurer Erythrocyten-Phosphatase enthält, die Aktivität der sauren Erylhrocyten-Phosphatase verglichen mit
der Aktivität der sauren Prostata-Phosphatase so schwach, daß ein positives Ergebnis quantitativ für die
Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphatase im Serum spricht. Der erhaltene positive Wert liegt zwar
über den Standardwerten dieser Methode, bestimmt im Serum von Männern ohne Leber- oder Nierenerkrankungen
oder Geschwüren. Der Standardwert für diese Methode beträgt etwa von 0,04 bis 0,37 I.U.
Auch verglichen mit anderen bekannten Substraten folj;t die Spezifität des Natriumlhymolphthalein-monophosphats
diesem allgemeinen Schema. So sind Phenolphthaleinmonophosphat und p-Nitrophenolphosphat
500mal aktiver mit saurer Erythrocyten-Phosphatase als das Natriumsalz von Thymolphthaleinmonophosphat,
während «-Naphthylphosphat dreimal aktiver ist. Obwohl man die Aktivität der sauren
Ervthrocyten-Phosphatase, die die Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase stört, durch Tartrat oder
Formalin hemmen kann, hat die erfindungsgemäße Methode den praktischen Vorteil der größeren
Einfachheit, da solche Hemmstoffe nicht notwendig sind.
Ein anderes saures Phosphatasc-lsoenzym, das
gewöhnlich zusätzlich zur sauren Prostata-Phosphatase im Blutserum vorkommt, ist saure Blutplätlchen-Phosphatase.
Hier ist die Spezifität des Natriumthymolphthalein-monophosphats
auf saure Prostata-Phosphatase ebenfalls größer als bei den anderen Substraten. Phenolphosphat und Phenolphthaleinmonophosphat
sind etwa 5mal aktiver mit saurer Blutplättchenpho-
sphatase als das Natriumsalz des Thymolphthaleinmonophosphats.
a-Naphthylphosphat hat etwa die gleiche Aktivität, p-Nitrophenolphosphat ist etwa 16mal aktiver
und /J-Glycerophosphat etwa viermal aktiver. Außer bei
Phenolphthaleinmonophosphat kann weder Tartrat noch Formalin diese Störungen beseitigen.
Im normalen Blutserum kommen als störende saure
Phosphatasen in größeren Mengen nur saure Erythrocyten-Phosphatasen und saure Blutplättchen-Phosphatase
vor. Dementsprechend zeigt ein positives Ergebnis, das über dem Normalwert von Blutserum liegt, die
Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphatase an. Es ist nicht notwendig, weitere Tests mit einem Inhibitor, wie
Tartrat oder Formalin, durchzuführen.
Das Natriumsalz des Thymolphthalein-monophosphats kann auch zur Bestimmung der sauren Prostata-Phosphatase
in anderen Körperflüssig!: eiten, wie Urin, verwendet werden, obwohl die Störanfälligkeil der
erfindungsgemäßen Methode dann größer ist als mit Blutserum.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei saurem pn-Wert durchgeführt. Obwohl der pn-Werl nicht
kritisch ist, ist ein pn-Wert von 5,5 bis etwa 6,4 vorzuziehen, da normalerweise bei einem Pn-Wert von
6 die größte Aktivität erreicht wird. Diese pn-Wcric
werden bei 25°C gemessen. Jeder angemessene Puffer kann verwendet werden, obwohl gewöhnlich ein Citrat-
oder Acetatpuffer eingesetzt wird. Die Reaktion beginnt sofort und verläuft bis zu 35 Minuten linear. Im
Normalfall wird 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Konzentration des erfindungsgemäßen Substrats ist
nicht kritisch, da die Aktivität bis zu einem Optimum von etwa 2,2 mMol Substrat pro Liter steigt, um dann
wieder abzufallen. Die vorzuziehende Substrat-Konzentration liegt etwa bei 1,5 bis 3 mMol pro Liter.
Ausfühningsbeispiel
Zu einem 0,1 molaren Citratpuffer (Citronensäure
plus Natriumcitrat) wird genügend Natriumthymolphthalein-monophosphat
zugesetzt, um eine Konzentration von 2,2 mMol pro Liter zu erreichen. Der pn-Wert
der Lösung ist 6 bei 25" C. 1,0 ml des gepufferten Substrats wird mit 0,2 ml Serum 30 Minuten lang bei
37°C inkubiert. Bei Anwesenheit von saurer Prostata-Phosphatase wird aus dem Substrat Thymolphthalein
freigesetzt, und zwar in um so größeren Mengen, je mehr saure Prostata-Phosphatase in der Serumprobe
vorhanden ist. Am Ende der Inkubationszeit werden 5 ml eines Reagens, das 0,05 Mol Natriumcarbonat und
0,05 Mol Natriumhydroxid je Liter enthält, zugesetzt, wodurch die enzymatische Reaktion unterbrochen und
gleichzeitig die Farbe des freigesetzten Thymolphthaleins voll entwickelt wird. Die erhaltene Absorption
wird vorzugsweise mit einem Spektrophotometer bei 590 nm bestimmt und mit den Absorptionen, die mit
reinen Thymolphthaleinlösungen erhalten und gegebenenfalls auf einem Diagramm festgehalten wurden,
verglichen. Man kann auch ein Colorimeter verwenden. Der Test wird gegen einen Leerwert abgelesen und jede
Aktivität, die, wie oben beschrieben, über dem Standardwert liegt, wird in internationalen Einheiten
angegeben.
In der Praxis wird eine trockene Mischung von Substrat und Puffer in einer Ampulle vorbereitet, so daß
man nach Zugabe einer bestimmten Menge an destilliertem Wasser eine Lösung erhält, die eine vorher
festgelegte Molarität an Substrat und Puffer hat, um damit die gewünschte Anzahl von Bestimmungen
durchführen zu können.
Claims (4)
1. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase in biologisehen
Flüssigkeiten durch Inkubation einer Probe der biologischen Flüssigkeit mit einem Alkali- oder
Erdalkalisalz des Thymolphthaleinmonophosphats als Substrat in einem wäßrigen Medium bei sauren
pH-Wert und Messen der Menge des während einer bestimmten Dauer umgesetzten Substrats gegen
einen Leerwert, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl der Meßwert als auch der Leerwert in
einem von Inhibitoren für saure Prostata-Phosphatase freien Medium bestimmt werden, wobei der
Leerwert mit einer reinen Lösung des als Substrat verwendeten Salzes des Thymolphthaleinmonophosphats
erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Alkalisalz des Thymolphthaleinmonophosphats
dessen Natriumsalz verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 zur quantitativen Bestimmung saurer Prostata-Phosphatase
im Blutserum, dadurch gekennzeichnet, daß das Thymolphthaleinmonophosphat-Substrat in einer
gepufferten Lösung des Blutserums inkubiert und die Menge des umgesetzten Substrats bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymaiische Reaktion durch
Einstellen einei alkalischen pH-Wertes unterbrochen und die Menge des freigesetzten Thymolphthaleins
nach Entwickeln der Farbe kolorimetrisch bestimmt wird.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10034570 | 1970-12-21 | ||
| US00100345A US3823071A (en) | 1970-12-21 | 1970-12-21 | Prostatic acid phosphatase determination |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2163315A1 DE2163315A1 (de) | 1972-07-13 |
| DE2163315B2 true DE2163315B2 (de) | 1976-09-16 |
| DE2163315C3 DE2163315C3 (de) | 1977-05-05 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA975268A (en) | 1975-09-30 |
| IT965018B (it) | 1974-01-31 |
| US3823071A (en) | 1974-07-09 |
| GB1371209A (en) | 1974-10-23 |
| FR2120776A5 (de) | 1972-08-18 |
| JPS5137040B1 (de) | 1976-10-13 |
| ES397269A1 (es) | 1974-04-16 |
| DE2163315A1 (de) | 1972-07-13 |
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