DE2150593A1 - Neues Antibiotikum WS-4545 und dessen Derivate - Google Patents

Description

Neues Antibiotikum.WS-4545 und dessen Derivate

Die -vorliegende Erfindung betrifft ein neues und sehr wirksames Antibiotikum und Derivate davon, die gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen aktiv sind. Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung das neue und wirksame Antibiotikum W3-4545 und dessen Aoyl-Derivate, Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindungen als Wirkstoff enthalten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das neue Antibiobiku WS-4545 und dessen Derivate der allgemeinen Formel IV

CH₂ OR₅

C C- CO

KH

co

>0 C ITH

HC-OR₀ I ²

HO-C-CH₅

" CHoOR₁

wor.tn R₁, R_? und IU jeweils für Waaserstoff oder eine Acylgruppe stehen.

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Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotkums WS-4545 und dessen Derivaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptorayce sapporonensis ATGC 21532 oder nahe verv/andte Mutanten davon, unter aeroben Bedingungen in einem Nährmediura züchtet, gegebenenfalls, das.Antibiotikum aus dem Nährraediun gewinnt, reinigt und/oder aeyliert.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zubereitungen, die als Wirkstoff das Antibiotikum WS-4545 und/ oder dessen Derivate der obigen Formel IY enthalten, gegebenen falls zusammen mit einem pharmazeutischen Trägerstoff oder Excipienz. Die pharmazeutischen Zubereitungen können z.B. in Form von 'Tabletten, Pillen, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen oder wässrigen Suspensionen zur parenteralen Verabreichung vorliegen.

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Das neue Antibiotikum WS-4545 und dessen Acy !-Derivate sind wirksam gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen, insbesondere gramnegative Mikroorganismen wie solche der Gattung Escherichia und Salmonella.

Das neue Antibiotikum WS-4545 kann dure'h Fermentation von StreptOmyces sapporonensis und dessen Mutanten in einem ITährmedium hergestellt werden.

Durch Acylierung des Antibiotikums WS-4545 können Acyl-Derivat •dieses Antibiotikums hergestellt werden.

Pharmazeutische Präparate und Zubereitungen können als wirksames antibakterielles Mittel das neue Antibiotikum Y/S-4545_f dessen Acyl-Derivate sowie Salse davon enthalten. Diese pharmazeutischen Zubereitungen sind dazu geeignet, um Infektionskrankheiten, die bei Mensch und Tier durch Bakterien verursacht sind, zu heilen.

Der Mikroorganismus

Der sur Herstellung des neuen Antibiotikums WS-4545 geeignete Mikroorganismus ist eine neu entdeckte Art der Gattung Streptoiryces, der isoliert wurde aus einer Bodenprobe, die in der Stadt Sapporo in Japan entnommen wurde. Eine Kultur des lebenden Organismus ist in der American Type Culture Collection hinterlegt worden und erhielt die ITunmer ATCC 21552 Der Mikroorganismus wird nachfolgend als Streptomyces sapporonensis bezeichnet.

Die Herstellung des neuen Antibiotikutas gemäß der Erfindung isi nicht auf die Verwendung dieses speziellen nachfolgend im einseinen beschriebenen Organismus beschränkt oder auf solche Organismen, die vollständig die gleichen Wachstums-Ei geii s c hilft en und mikroskopischen Charakterietike aufweisen, die nachfolgend beispielsweise angegeben sind. Das neue

2 Ö 9 ä 1 6TTT8T~~ " "~ ■"' " *"^J '

Antibiotikum gemäß der Erfindung kann auch unter Verwendung von Mutanten hergestellt v/erden, die aus dem beschriebenen Organismen nach konventionellen Verfahren, z.B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettem Licht oder durch Behandlung mit Stickstoff-Senfgas, usw. erzeugt werden können.

Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 seigt die nachfolgend beschriebenen morphologischen, makroskopischen, mikroskopischen und biochemischen Eigenschaften. Mikroskopische Morphologie:

Die Morphologie von Streptoroyces sapporonensis ATCC 21532 nach einem Wachstum auf Sucrosenitrat-Agar und Stärkeamraonium-Agar vätrend 10 bis 14 Tagen bsi 30 C ist nachfolgend angegeben Die Luftmyce!fäden sind lang und gradlinig und haben eine Windung. Das Konidium ist kettenähnlich.

Kultureigenschaften und physiologische Eigenschaften:

Die Kultureigenschaften und physiologischen Eigenschaften.des. neuen Stammes Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 in mehreren Medien sind nachfolgend angegeben. Die Peststellungen wurden nach einer 10 bis 14 Tage andauernden Inkubation bei 30 ⁰C getroffen. Die Inkubationsperiode und die Temperatur sind die hier angegebenen, sofern nicht etwas anderes gesagt ist. ·

Czapek"s-Agar: ·

Weiß, schwaches Wachstum, kein Luftraycel, kein lösliches Pigment.

Stärkeammonium-Agar:

Schwach oranges Wachstum in kleinen Kolonien mit schwach . oranger Oberfläche, kein luftmycel, kein lösliches Pigment, Die diastatische Wirkung ist schwach.

Crlucose-Asparagin-Agar:

Braunes Wachstum in kleinen Kolonien, dünnes und weiases pulverförmiges Lu.ftmyoel, kein lösliches Pigment, _ r _

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ORIGINAL

Caloium-malat-Agar:

Weisses Wachstum, dünnes und schwach bräunlich-weisses pulverförmiges Luftmycel, kein lösliches Pigment.

Tyrosin-Agar:

Dunkelbraunes Wachstum in kleinen Kolonien, kein Luftmycal, kein lösliches Pigment.

Bouillon-Agarι

Schwach gelbes Kolonie-ähnliches Wachstum» tfeisses pulverförmiges Luftmycel, kein lösliches Pigment.

Bennett's Agar:

Braunes Kolonie-ähnliches Wachstum, mit flacher und schrumpliger Oberfläche, dünnes und weisses pulverförmiges Luftmycel, kein lösliches Pigment. Diese Kultur wächst gut bei 37 ⁰G und auch bei 30 ⁰C.

Glucose-Bouillon:

Wachstum in weissen sedimentierten Klumpen, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment.

Glucose-Czapek¹s Lösung:

Weieses Kolonie-ähnliches Wachstum, Sedimentation, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment.

Lackmusmilch:

Schwaches Wachstum, kein Luftraycel, kein lösliches Pigment. Es tritt eine schwache Peptonisierung und eine negative Coagulation ein.

Gelatinestich:

(15 bis 20 ⁰C, 20täg.ige Inkubation) Schwaches Wachstum, kein luftmycel, kein lösliches Pigment, eine schwach.« positive

Verflüssigung wird beobachtet.

~ 20981 S/ 1 "~~ ~

--- 215Ό593

KartoffelTÖJopf: ·

Hellbraunes Kolonie-ähnliches Wachstum mit schrumpliger Oberfläche, schwach braunes pulverförmiges Luftmycel, kein lösliches Pigment. -. " -

Zellulose: . . ■ .

Kein Wachstum.

Optimale Bedingungen für das Wachstum:

Temperatur: 15 bis 37 ⁰C, pH: 6 bis 8. Ausnutzung, von Kohlenstoff σ üe Ilen:

Die Ausnutzung von Kohlenstoffquellen wurde nach der Pridhara~Gottlieb Methode bestimmt. Die Feststellungen wurden nach siebentägiger Inkubation bei 30 ⁰C getroffen.

Kohlenstoffeuelle Wachstum -

Xylose -

Arabinose -

Mannose

!Fructose -

Glucose

RharaDse -

Sucrose

Lactose

Irehalose *

Bafflnose

Mannit -

Inosit ^±

Salicin

Negative Kontrolle -

Anmerkung: Das Symbol "+" bedeutet Ausnutzung, "±" bedeutet wahrscheinliche Ausnützung und "-" bedeutet keine Ausnutzung.

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Da 3 AirtiM otikum

Das Antibiotikum WS-4545 gemäß der Erfindung wird erzeugt, wenn Streptomyces sapporonensis, das oben beschrieben wurde, auf einem Nährmediura unter kontrollierten submersen aeroben Bedingungen gezüchtet v/ird. Es kann eine grosse Zahl von Nähraedien in der Wachstumastufe des Fermentations-Prozesses verwendet werden.

Es wurde gefunden, daß besonders gute Ergebnisse tJ3.it .einem wässrigen IJährmediua erhalten werden, daß eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle oder ein proteinhaltigeα Material enthält.

Assimilierbare Quellen sind beispielsweise polyhydrische Alkohole und-Mono-, Di- und Polysaocaride, wie Glucose, Fructose, Maltose, lactose, S'jccose, Zucker, Stärke, Maisstärke, Dextrin, Molasse, Glycerin usw.

Geeignete assimilierbare Stickstoffquellen und proteinhaltige Materialien sind beispielsweise natürliche Stickstoffquellen wie Maisquellwasser, Sojabohneniaehl, Sojabohnenöl, Baumwollsaroenmehl, Glutirjmehl, Maismehl, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Peptoii, tierische Peptonflässigkeiten, fleischextrakt, Oaseinhydrolysai; usw* sowie anorganische und organische Stickntoffquellen v/ie Ammoniumsalse (z.B. Ammoniumnitrat, Ammonium sulfat, Amtconiuwphosphat usw.), Harnstoff usw.

Die Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen, die vorteilhafterweise in Kombination verwendet werden, müssen nicht in reiner Form eingesetzt werden, da die weniger reinen Stoffe, die Spuren, von Wachstumsfaktoren und beträchtliche Mengen an Mineral-Mährstoffen enthalten, auch für die Verwendung geeignet sind. Falls gewünscht,, können zu dem Medium MineralsalsG gegeben werden wie Calciumcarbonate Natrium- oder Kaliumpho&phat, Natrium- oder Kaliumchlorid, Kagnesiumsalze, Ki;pierr.alzc usw. Falls gewünscht kann insbesondere dann, v/enn

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ein merkliches Schäumen im Kulturmedium eintritt, au dem Permentationsraedium ein Entschäumungsmittel wie flüssiges Paraffin, Fettöl, Pflanzenöl, Mineralöle Silicone usw. gegeben v/erden.

Zur Erzeugung des neuen Antibiotikums sind submerse aerobe Bedingungen bevorzugt, wie sie-für die übliche Produktion von anderen Antibiotika bevorzugt sind. Zur Erzeugung geringerer Mengen des Antibiotikums kann die submerse Kultur in kleinen Kolben oder I¹Iasehen durchgeführt werden, die mittels geeig-

neter mechanischer Vorrichtungen geschüttelt oder gerührt werden. Große Mengen des geimpften liährmediums können in grossen Tanks oder Bütten fermentiert werden, wie sie üblicher weise in de:r. Permentationsindustrie e-ingesetzt werden. Zur Erzeugung grosser Mengen des Antibiotikums ist es bevorzugt, die vegetative Forra des Mikroorganismus zum Impfen in die Tarfs oder Bütten zu geben, um eine Wachstumsverzögerung im Verfahren der Herstellung des Antibiotikums zu vermeiden. Es ist deshalb zweckmässig zunächst ein vegetatives Inoculat des Mikroorganismus dadurch herzustellen, daß eine verhältnismäßig geringe Menge des Kulturmediums mit der Spuren- oder Mycel-Porm des Mikroorganismus geimpft viird, und dass dann das vegetative Inoculat aseptisch in die grossen Tanks oder Bütten überführt wird. D3s Medium, in dea das vegetative Inoculat erzeugt wird, kann das gleiche oder ein anderes sein als das Medium, das zur Produktion des Antibiotikums verwendet wird.

Das Rühren und Belüften des Kulturgemisches kann in verschiedener Weise erfolgen. Das Rühren kann mittels eines Propellers oder einer ähnlichen mechanischen Rührvorrichtung durchgeführt werden, durch Drehen oder Schütteln des Fermentationsapparates, durch verschiedene Pumpvorrichtungen oder durch die Durchleitung von steriler Luft durch das Medium. Pie Belüftung kann dadurch erfolgen,'daß durch das Permentationagemisch sterile Luft geleitet wird.

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Die Fermentation wird in der Regel bei einer !Eeraperatur zwischen etwa 25 und 37 ⁰C, vorzugsweise "bei etwa 30 ⁰G für eine Dauer von 30 bis 50 Stunden durchgeführt. Am Ende dieser Periode ist eine wesentliche Menge des Antibiotikums gebildet worden.

um das Antibiotikum WS-4545 zu isolieren, kann das Mycel von •der Kulturflüssigkeit in ansich bekannter Weise getrennt werden, beispielsweise durch Zentrifugieren oder nitrieren. Der grösste Teil de3 Antibiotikums wird im Filtrat gefunden. Das Antibiotikum kann aus dein Piltrat nach konventionellen Methoden gewonnen werden, beispielsweise mittels Extraktions- oder Adsorptions-Verfahren, wie sie üblicherweise zur Gewinnui? anderer Antibiotika eingesetzt werden.

Die Extraktion kann dadurch erfolgen, daß das Piltrat mit einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum behandelt wird, z.B. Pyridin, einem Alkohol wie Methanol, Äthanol, Butanol usw., oder wässrigen Lösungen von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, z.B. einem wässrigen Alkohol wie wässrigem Methanol, Äthanol und Butanol. Es kann auch ein Gemisch von Alkoholen mit anderen organischen Lösungsmitteln wie einem Keton (z.B. Aceton), einem halogenierten Kohlenwasserstoff (s.B. Chloroform), einem Alkylester einer Fettsäure (z.B. Äthylacetat),, Benzol, Pyridin usw. verwendet werden.

In alternativer Weise kann das Antibioticum aus dem Piltrat mittels einer Adsorbtionsmittels gewonnen werden wie Diatomeenerde, aktiviertes Aluminiumoxyd, Silicagel, Aktivkohle» Kieselsäure usv/. Das, an einem solchen Adsorptionsmittel adsorbierte Antibiotikum wird dann vom Adßorbtionsmittgl vollständig eluiert unter Verwendung eines geeigneten organischen Lösungsmittel, in dem das Antibiotikum löslich ist. Beispiele für solche Lösungsmittel sind Pyridin, Alkohole, wässrige Alkohole sowie Geioiache von Alkoholen mit anderen

lösungsmitteln. '

- 10 *

209616/17 88 *"" ~~" ""^

10 -

Ein geeignetes Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums aus' dem Extrakt oder Eluat besteht darin, daß das lösungsmittel auf ein verhältninmässig geringes Volumen eingeengt und das Antibiotikum durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels, in dem das Antibiotikum unlöslich ist, ausgefällt wird.

Das Antibiotikum wird durch Utnkristallisation oder Chromatographie gereinigt. Zum Umkristallisieren können als Lösungsmittel beispielsweise verwendet werden Aceton, wäsgriges Aceton, Alkohole (z.B. Methanol, Äthanol), wässrige Alkohole* Äthylaoetat usw. Adsorbtionsmittel,wie sie zur Gewinnung des Antibiotikums eingesetzt werden, können in v/irksamer Weise auch zur Reinigung mittels Chromatographie verwendet werden. Als Eluiermittel können die gleichen verwendet werden, die auch zur Gewinnung des Antibiotikums eingesetzt werden.

Nachfolgend werden die Eigenschaften des Antibiotikums WS-4545 angegeben, das in dieser Weise isoliert wurde. Das Antibiotikum WS-4545 besitzt die folgenden physikalischen . und chemischen Eigenschaften.

WS-4545 kristallisiert in Form von weissen Kristallen. Es ist löslich in Wasser, Methanol, Äthanol und Pyridin, wenig löslich in Aceton und Äthylacetat und unlöslich in Äther, Chloroform, Benzol und n-Hexan.

Durch Massenspektrografie wurde das Molekulargewicht 302 ermittelt.

Die spezifische Drehung beträgt: CdG^ =63.5°(C=1.00 Prozent (Gewicht/Volumen) in Methanol).

Die Elementaranalyse ergab die folgenden Wertes Kohlenstof 47.44 Prozent; Wasserstoff = 6.16 Prozent; Stickstoff * 9.36 Prozent; Sauerstoff (Restvert) - 37.04

2 09816/1788

Aufgrund der obigen Werte "wird -für die Verbindung Υ/Β*·454!5 die Sunraienforrael Ό^Η-.οί^Ογ errechnet.

Daa Antibiotikum WS-4545 ergibt die folgenden Farbreaktionen: Positiv im Fehling- und Molisch-Teet; Entfärbung von Kaliumpermanganat-Lösung; schwach positiv In .der Reaktion mit Ferrichlorid; negativ im Ninhydrin-, Tollen- und Ehrlich-Test.

Das Antibiotikum WS-4545 wurde der Dünnschichtchronjatographie an Silicagel (unter Verv/endung von Kieselgel G der Firma Merck, Warenzeichen) mit verschiedenen Entwicklungslösungsmittel-Systemen unterworfen. Als Färbemittel wurde eine einproaentige Kaliuraperraanganat-Lösung enthaltend 2 $ Natriumcarbonat angewendet. Es wurden die folgenden Rf-Werte ermittelt:

TABELLE

Rf-V/erte von WS-4545

Lösungsmittel-System -Rf

n-Butanol:Essigsäure:Wasser^

(4:1:5) °·⁴¹

n-Butaiiol:Pyridin:Wasser

(4 ι 1 : D °*⁵⁵

Chloroform : Methanol

(5:1) °-W

Äthylacetat : Methanol

(1:1) °·⁶³

Benzol :Kethanol.: Chloroform

(1:1:1) °·⁴¹

Bs wurde die obere Schicht alemex Mischung verwendet.

• - 12

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Je nach den angewandten Bedingungen bei der Kristallisation kristallisiert das Antibiotikum V<^rS-4545 in verschiedenen Kristallformen, Durch mikroskopische Untersuchung wurde festgestellt, daß die im Beispiel 1 erhaltenen Kristalle Im rhoiobi-. sehen System und die im Beispiel 2 erhaltenen Kristalle in monoclinen System kristallisieren. Die .Kristalle dieser-System haben die folgenden Eigenschaften, die durch Röntgenbeugungs-Analyse ermittelt wurden: " ~ .

Kristalle von Kristalle von

Beispiel 1 Beispiel 2 .

Kristallsystem: Rhombisch Monoclin

Gitterabstand: a=*11.7Ä a=10.1 S, /3=101°

Ί)=12.7 S b=1Q.9 S

c=3.8 1 c=6.6 Ä

Dichte 1.54 g/cm' 1.46 g/cm*

Die Kristalle des rhombischen Systems schmelzen bei 187 bis 189 ⁰C (Zersetzung). Das tJitraviolettspektrura ist in der Figur 1 der beiliegenden Zeichnung wiedergegeben; es zeigt keine spezifische Absorption. Das Infrarotspektrum suspendiert itt»Nu;jolnull" ist in Pigur 2 wiedergegeben. Es enthält Spitzen bei den folgenden Frequenzen (cm"" ):

3400, 3300, 3160, 2900, 2840, 1703, 1670, 1450,

1390, 1370, 1295» 1260, 1220, 1195, 1140, 1120,

1080, 1030, 970, 960, 935, 895, 870, 820,

785, 725, 680. .

Dis Kristalle des monoclinischen Systems·schmelzten bei 188 bis 191 ⁰C (Zersetzung). Das Ultraviolettspektruns iet in Figur '3 angegeben und sseigt keine fjpezifisclaen Absorptioaeii,

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Das Infrarotspektrum suspendiert in "Nujolnull¹¹ ist in Pigur 4 wiedergegeben und zeigt Spitzen bei den folgenden Prequenzen (cia"¹):

3500, 3400, 3270, 2900, 2840, 1685, 1640, 1455,

1417, 1375,. 1330, 1300, 1260, 1245j 1210, 1160,

1155» 1125, 1105, 1085, 1050, 1010, 995, 980,

940, 920, 900, 685, 870, 840, 805, 795,

760, 725, 690, 675«

Die Kristalle dieser beiden verschiedenen Kristallisationssysteme sind leicht ineinander unwandelbar, in^dem ein kleines Stück des einen Kristalls zu der Lösung des anderen Kristall3 unmittelbar vor Beginn des Kristallisationsprozesses gegeben wird. Mit anderen V/orten: Wenn Kristalle des rhombischen Systems aus einem Lösungsmittel, z.B. warmem V/asser, heisaem wässrigen Äthanol, heissem Aceton, heissem Methanol oder beissem Äthanol umkristallisiert werden, führt die Zugabe eines kleinen Stückchens eines Kristalls des monoclinischen Systems zur Lösung vor der Bildung des Niederschlags in der Lösung zur Bildung der Kristalle des monoclinischen Systems. Menu auf der anderen Seite Kristalle des monoclinischen Systeme aus einem Lösungsmittel, z.B. v/armem Wasser, heissem wässrigen Äthanol oder heissem Aceton umkristallisiert werden? führt die Zugabe eines kleinen Stückes der Kristalle des rhombischen Systems zur Losung unmittelbar vor der Bildung des Niederschlages zur Erzeugung, von Kristallen des rhombischen Systems. Daraus ist zu schließen, das zwischen den Xrisia des rhombischen und des rjono-clinischen Systems die Beziehung der Polymorphie besteht.

Das magnetische Kernresonanzspektrum de3 Antibiotikums

in ~do VS-4545 ergab die folgenden Sigiale (<fc(ppm) ;/DMSO/Lösung, TMS all

Internal Standard).

L..

. - 14 -2 0 9816/1788

- 14 -

- 7.67

-

t

ί 3H

2-1-50593

Dublett

: folgenden Strukturformel

CH0 OH · fl 2 I η , ,-» , (

CiI

ι, daß

das Antibiotikum

•

1 ü-aia zaMcyo'iQt4 12 *

8

■6.87

I

ί 2Η

Siiiglett

Multiplett t

Chemische Struktur: .

\j —·——— \j I^ 9C4 löKH 2I Ί 9C3 9CO

entspricht.

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7

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Multiplett

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H H

IA

; 1-(1,2,3-Trihydrory~2-raethyl)pT0pyl-5~

6

4

: 2Η

Multiplett

Singlett

TT

TD8thylen-6-hydroxy-7»9-dioxo<~2~oza-8f

6

ί 1Η

Multiplett

Singlett

κ) ■ ' ν ha HC-OH HO-C-CH, j J

6,

1

ί 1Η

Dublett

? Auswertung der

CH0OH

5«

: 1Η

Triplett .

physikalischen und chemischen Eigenschaften

Name

4

Multiplett

kann mit Vertrauen angenommen werden

4.

: 1 H Singlett

WS-4545 dei

4.

: 1Η

4.

! 1Η

<

3.

ϊ 1Η

1.

1Η

, 1.

ί 1Η

Aufgrund der Röntgenstrahlenbeugung und dei

Chemischer

.81

oben erwähnten

.45 -

.30 -

.10 -

.09

.58

95

Sj

,87

63

,27

38

05

209816/17 88

Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Antibiotikum WS-4545 "besitzt ein spezifisches antibiotisches ■ Spektrum und zeigt eine extrem starke Aktivität gegen gramnegative Bakterien, einschliesslich solchen der Gattung Escherichia, Salmonella und Shigella. Wenn das Antibiotikum durch Injektion verabreicht wird, wird es in das Serum mit einen verhältnisraässig hohen Spiegel überführt und durch den Urin in hoher Konzentration ausgeschieden. Dementsprechend ist dieses Antibiotikum sehr nützlich zur Behandlung von Infektionskrankheiten, die beim Mensch und Tier durch'derartige Bakterien verursacht werden, wobei die Verabreichung vorzugsweise durch Injektion erfolgt. In den nachfolgenden Tests ist der antibakterielle Serumspiegel und die Urin-Abscheidung beschrieben.

Minimale Inhibierungskonzentration (M.I.C.) der M.I.C.-Test wurde nach der üblichen Agar-Serien-Verdünnungsmethode durchgeführt, wobei Herzlnfusionsagar für das Bakterium, ein Glucose-Bouillon-Medium für das Mycobacterium und ein Malzextrakt-Medium für den HLz und die Hefe verwendet wurden, die 24 bis 72 Stunden bei 30 C inkubiert· wurden. Der M.I*C.-Wert·ist angegeben als die geringste Konzentration von WS-4545 (mcg/ral), die das Wachstum des Mikroorganismus inhibiert. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

• - 16 -

200816/1788

.- 16 -

Test-Mikrο orflani smus Escherichia coll Salmonella typhosa Shigella flexneri Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sai'cina lutea Proteus vulgaris Mycobacteriuni phlei Candida albicans Penicillium ehr y3οgenura

M.I.C. (inog/ial) 25 - 50 25-50 12.5 -25 >200 >200 >200 >200 >200

>200 >2G0

Schutzef.fekt bei experiraentellen Kausinfektionen: Die in vivo Aktivität von WS-4545 gegen E.coli, die gegenüber anderen Antibiotika resistent- sind, wurde unter Verwendung von männlichen Mäusen voa ICR-Starao untersucht. Die Mäuse wogen jeweils 27 bis 30 g. Jede Versuchsgruppe bestand aus 10 Tieren. Die infizierenden Mikroorganismen wurden über Nacht bei 37 ⁰C in einer BHI-Brühe gezüchtet. 0,5 ml der Brühe wurden intraperitoneal inoculiert, und die Behandlung erfolgte einmal durch subcutane Verabreichung eine Stunde nach der Erregung. Infizierte, nicht behandelte Kontrolltiere starben unter diesen Umständen innerhalb 48 Stunden. Die Versuchstiere wurden 10 Tage lang auf das Überleben beobachtet und die Ergebnisse wurden als mittlere wirksame Dosis berechnet. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:

209316/1788

2150993

Stamm	312	Antibioticum	■ . ^5O (mg/Maus)
B.coli		WS-4545	3.05
	320	Chloramphenicol	>28
E.coli		WS-4545	0.87
	323	Streptomycin	17.09
E.coli		WS-4545	4.05
	324	Kanamycin	>28
E.coli		WS-4545	0.69
	335	Tetracycline	>28
E.coli		WS-4545	0.88
	Ha1idixinaäure	0.54

Serumspiegel und Urinexcretion bei freiwilligen Versuchspersonen nach intramuskulärer Verabreichung; Die Serum- und Urinspiegel wurden bei 5 freiwilligen Versuchspersonen bestimmt. Fünf erwachsene männliche Personen mit einem Gewicht von 60.0 bis 75.0 kg erhielten Jeweils eine einzelne Dosis von 1,000 mg und 500 mg der Verbindung WS-4545 intramuskulär verabreicht. Jeweils 0.5» 1» 2,-3 und 5 Stunden nach der Verabreichung wurden Blutproben entnommen. Urinproben würden jeweils 0-1, 1-3, 3-6, 6-8, 8-10 und 10-24 Stunden nach der Verabreichung gesammelt. Die Konzentrationen an WS-4545 im Serum und im Urin wurden nach der Cup-Methode ermittelt. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten!

- 18 -

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* a»

- 18 -

Urin ■(meg/ml)

mg mg

O-lhr l-3hr 3-6hr 6-8hr 8-10hr 10-24hr

620 1256 (18#) (38%

1501 . 2266

97 (4*)

593 ₍

⁷²⁶

54

15*:

73

94.0

94.8

er um , _/o, (mcg/ml) ^1/2hr mg a«

14.7 31.1

Ihr 2hr 3hr 5hr

13.7 15.6 ζ 15.0 <15_t0 31.9 21.6 18.8 15.0

Eine andere äußerst wichtige Eigenschaft von WS-4545 besteht darin, daß aie die nachfolgend angegebene extrem niedrige Toxizität besitzt.

Akute Toxizität (einmalige Yerabreichune;)

	Geschlecht	i.v.	ID50(IBi	5Ag)*	p.OJ
		>20O0 >2000	i.p.	S. C.	>4000 >4000
Gattung	weiblich	>2000 >2000	>4000 >4000	>4000 >4000	>4000 >4000
	männlich weiblich		>4000 >4000	>4000 >4000
Maus '*"
Ratte

*: Die Tiere wurden nach der Yerabreichung sieben Tage lang beobachtet.

- 19 -

2 0 98 16/ 17

-19- t1§§§§§

Verbesserte Aeyl-Derivate. des Antibioükrmasr WS-4545

Ss wurde gefunden, daß das Antibiotikum WS-4545, das Hydroxy1-Gruppen enthält, mit einem Acylierungsmittel leicht acyliert werden kann, wobei die entsprechenden Acylderivate erhalten v/erden. Hit anderen Worten: Das Antibiotikum WS-4545 wird mit einer Carbonsäure oder einem reaktiven Derivat davon unter Bildung eines Esters dieser Carbonsäure mit WS-4545 umgesetzt.

Dementsprechend können Acylderivate des Antibiotikums* WS-4545 durch Acylierung dieses Antibiotikums WS-4545 mit einem Acylierungsmittel hergestellt werden.

Acylierungsmittel« die im Sinne der/rorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind beispielsweise Garbonsäuren der folgenden Formel \jlQ : R-OH worin R für eine carboxylifiche Ac3^rlgruppe steht, sowie deren reaktive Derivate an der Carboxy!-Gruppe. Beispiele hierfür sind aliphatische Carbonsäuren, aromatische Carbonsäuren, heterozyclische Carbonsäuren und ihre reaktive Derivate an der Carboxy1-Gruppe.

Beispiele für aliphatische Carbonsäuren der obigen Formel \xf\ : R-OH sind solche, worin R für eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoff-Carbony!gruppe steht wie Alkanoyl (z.B. Acetyl, Propionyl, Butyryl, Isobutyryl, Yaleryl, Isovaleryl, Pivaloyl, 2-Äthylbutyryl, Caproyl, Palmitoyl, Stearoyl, usw.) mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, und Alkenoyl (z.B. Acryloyl, meta-Acryloyl, Crotonoyl, Oleoyl, Linoleoyl, Idiiolenoyl, usw.) mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, oder für eine gesättigte oder ungesättigte aliphatische Syclokohlenwasserstoff-Carbonylgruppe steht wie Cycloallcancarbonyl (z.B. Cyolohexylcarbonyl) und Cycloalkenoarbonyl (s.B. Cyclohexenylcarbonyl); oder für eine durch aliphatiBphta Zyclokohlenwaaserstoff substituierte aliphatische Kohlenwasser stoff-Carbony!gruppe steht wie Cycloalkanalkanoyl (z.B. Cyelohexylacetyl, Cyclohexylpropropinoyl, uav;.) nsit 7 bis

Kohlenstoffatomen.

' - 20 -

209816/1788 ORiQfNAL

"2150533

Die aliphatischen Kohlenwasserstoffreste dieser aliphatischen Carbonsäuren können gradkettig oder verzweigt sein und durch Heteroatome wie Sauerstoff oder Schwefel unterbrochen sein. ■ Beispiele hierfür sind Methoxyacetyl, Methylthioacetyl, Butylthioacetyl, Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Cyclohesylthioacetyl, usw.

Beispiele für aromatische Carbonsäuren der obigen SOnuel til] ί R-OH, sind solche, worin R für Aryloyl (z.B. Benzoyl» Toluoyl, Xyloyi, Haphthoyl, usw.) steht, oder für durch Aryl substituierte aliphatische Kohlenwasserstoff-Carbonylgruppen wie Aralkanoyl (z.B. Phenylaoetyl» Phenylpropionyl, Hydratropoyl, usw.) und Aralkenoyl (z.B. Ginnamoyl, usw.). Der aliphatische Kohlenwasserstoff-Teil (d.h. Alkan oder Alken) mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen einer solchen durch Aryl substituierten aliphatischen Kohlenwasserstoff-Carbonylgruppe (d.h. Aralkanoyl und Aralkenoyl) kann durch Heteroatome wie Sauerstoff und Schwefel unterbrochen sein. Beispiele hierfür sind Phenoxyacetyl, Phenylthioacetyl usw.

Beispiele für heterozyclische Carbonsäuren der obigen Formel \Jj} : R-OH sind solche, worin R für eine Carbonylgruppe mit einem faeterozyclischen Ring, oder einem mit^einem Benzolring kondensierten heterozyclischen Ring steht, die ^/eils mindestens ein Heteroatom, nämlich ; Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalt. Beispiele hierfür sind Nicotinoyl, Isonicotinoyl, 2-Puroyl, 2-Thenoyl, Benzofuroyl, Benzothenoyl, usw. * z.B. monoheterozyclischen oder dihetero

zyclischen

Andere Beispiele sind aliphatische Kohlenwaeserstoff-Carbonyl-Gruppen (s.B. Alkanoyl oder Alkenoyl), die durch die oben genannten heterozyclischen Ringe oder mit Benzolrinfcen kondensierten heterozyclischen Ringe substituiert sind, wie 1R-(oder 2H-) Tetrazoly!acetyl, Thieny!acetyl, Purylaoetyl, 2-Benzothiazoly!acetyl, 2-0xo-3-benzothiazoly!acetyl,3-Indoly!acetyl, Morpholinoacetyl, usw. Der genannte aliphati-

Kohlenwasserstoffteil (d.h. Alkan oder Alken) kann öurcb wobei der heterozyclisohe Ring 5-6 Ringatoae und

-21- 21505^3

Heteroatome wie Sauerstoff oder Schwefel unterbrochen sein und 1 "bis 6 Kohlenstoffatom enthalten. In den oben erwähnten aliphatischen Carbonsäuren, aromatischen Carbonsäuren und heterozyclischen Carbonsäuren kann der aliphatische Kohlenwasserstoffteil (d.h. Alken, Alkan , Cycloalkan und C^rcloalken), der aromatische Ring (d.h. Aryl) und der heterozyclinche Ring' substituiert sein durch ein oder mehrere mögliche Substituenten wie Halogen (z.B. Chlor, Brom, Fluor, usw»), Alkoxy (z.B. Methoxy, Äthoxy, usw.)» Amin.o, Acylamino (z.B. Acetylamino), AcyloÄy -(z.B. AQetoxy) Nitro, Hydroxy, usw.-

Beispiele für derartige Verbindungen sindi Chloreasigsäure, Trichloressigsäure, Ürichlorpropionsäure, Benzoly!glycin, Brouibenzosäure, Chlorbenzoesäure, Nitrobenzoesäure, Methoxybenzoesäure, 3,4-Dimethoxybenzoesäure, 3,4-Dimethy!benzoesäure, 3»4,5-!Drimethoxybenzoesäure, 3,4-Dimethoxyzinitsäure, 4~Chlorzimtsäure, Chlorphenylpropion-· säure, Chlorphenoxyessigsäure, 5-Kitrofuran-2-carbonsäure, 5-Chlorbenzofuran-2-carbonsäure, 5-Chlor-2-oxo~3-benzothiazolylessigsäure, usw.

Beispiele für reaktive Derivate der Garbonsäuren der Formel Viii sind Halogenide (z.B. Säurechloride, Säurebromide usw.), Säureanhydride {z^ffSSyleS^eielBkirB^ . . Alkylphosphorsäurea, aliphatische oder aromatischen Carbonsäuren, usw.), Säureamide (z.B. Säureamide mit Imidazol, Säureamide mit 4-substituiertem Imidazol, usw.), Säureester (z.B. Methylester, Äthylester, Cyanomethylester, p-Nitrophenylester» usw.). Wenn die Carbonsäure als solche oder in Form eines Salzes (z.B. liatriumsalz, Kaliurasalz uew.) verwendet wird, kann es vorteilhaft nein bei der Reaktion ein Kondensation^· · mittel zu verwenden. Beispiele für solche Kondensationßißittel sind ^,F'-DicyclohexyloarbodiiiDid, Polyphosphorsäur·» Äthylpolyphosphat, Isopropy!phosphat, usw.

Die Reaktion wird in der Regel in einem inerten $b*sungaraittel

~ 22 -

209816/1788

* » ·β »ess a

—«.— ■ , ; a „η, . s t. if, „ι m

wie ¥a3ser, Aceton, Dioxarij Ace.tontril, Pyridin, Chloroform, Äthylacetat, ^tetrahydrofuran, Äthylendlchlorid, DimetfayX-sulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, usw. durchgeführt. Falls erforderlich, kann bei der Reaktion eine basische Substanz (z.B. Alkalimetallcarbonat, Alkalimetallhydrogencarbonat, !Trialkylamin, Fyridin, usw.) vorliegen. Die Reaktionateinperatur ist nicht besonders beschränkt. In der Regel wird die Reaktion jedoch unter Kühlung oder bei Ziimaerteiaperatur durchgeführt. Die acylierte Verbindung kann naoh üblichen Verfahren isoliert und gereingt werden.

Bei der Acylietungsreaktion gemäß der Erfindung können ein Honoacy 1-De.rivat, Diacyl-Derivat oder Üriacyl-Derivat des Antibiotikums WS-4545 oder Gemische davon je nach der Menge des bei der Reaktion verwendeten Acylierungsmittels erhalten werden.

Mo!äquivalent eine ι

Mit anderen V/orten: Wenn das. Antibiotikum 1'<;St4545 mit einem /

dieses Ausgangsproaukt Acylierungsmittels be zogen aul j acyliert wird,

ι ,so wird hauptsächlich

das Monoacyl-Derivat erhalten. Die Acylierung von-WS-4545

ä.Q uiva Tent unter Verv/endung von etwa 2 Mol- / eines Acylierungsmittels führt hauptsächlich zu dem Diacyl-Derivat. Wenn das WS-4545

äQuivalent
mit mehr als 3 Mol/eines Acylierungsraittels behandelt wird, wird hauptsächlich das Iriacy!-Derivat davon erhalten. Bei der Herstellung eines Gemisches von Mono-, Di- und Triacyl-Derivaten in dieser Reaktion, können die einzelnen Acyl-Derivate nach üblichen Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, beispielsweise unter Anwendung der Chromatografie _f oder durch Kristallisation. |

AusserdeiB kann ein | äquivalent Monoacyl-Derivat mit mindestens einem Mol/eines Aeyüerimgs- |

mittels, das ein anderes Acylradikal als das Monoacyl-Derivat j

aufweist, acyliert werden, wobei Di~ oder iriacy!-Derivate J

Die Reaktion ist anhand der folgenden Strukturformeln

- 23 -

20Ι816/17ΒΦ öriqinal inspected

erläutert. Die Acylierungsreaktion kann durch die folgende Reaktiondbrmel dargestellt werden:

- CH OH H ²J

⁰⁰

R-OH Πι Κ

H-C-OH
HO-C-CH

-NH

L * CH^OK

3 ti]

[hi]

worin Rj eine Acylgruppe darstellt und R-j-j und
jeweils Wasserstoff oder eine Acylgruppe bedeuten.

In den obigen Formeln sind Monoacyl-Derivate des Antibiotikuins WS-4545 solche Verbindungen der Pormel CjliJ ,worin R₁ eine Acylgruppe darstellt und R₁₃. und Rjjt ^^ ^asserstoffatorae stehen. Diacyl-Derivate sind Verbindungen der 3?orinel(lllj _f. worin R,- und R-rj jeweils eine Acylgruppe darstellen und Rttt eln Wasserstoffatom bedeutet. Triacyl-Derivate sind Terbindungen der Formel ^HiI » worin R₃., R^₁ und Rjjj jeweile eine Acylgruppe'darstellen.

Beispiele für Acyldorivate des Antibiotikums WS-4545 (d.h. Carbonsäureester von WS-4545), die gemäß den nachfolgenden Beispielen hergestellt werden können, jsind in dei nachfolgenden Tabelle unter Bezugnahme euf die chemische Struktur der Poriael ^IIlJ zusammengestellt.

209816/1788

■·* fit * a»

-■24

-■- ig ii - ,

99 T if *

• «

Beispiel Hr.	Verbindung	der Eoriael [III]	RIII
1	RI	R11	H
	Acetyl	H	H
' 3	Propionyl	H ·	H
4	Balmitoyl	H	H
5	örotonoyl	H.	H
6	Cyclohexyl Carbonyl	H	Acetyl
7(A)	Acetyl	Acetyl	H
7(B)	Bityryl	H	H
8	Butyryl	Butyryl	H
9	Benzoyl	H	H
10	p-Chior - benzoyl	H	H
11	m-Brom. - benzoyl	H	H
12	p-Brom> - benzoyl	H	H
13	3,4- Dimethyl- benzoyl	H	H
U	p-Acetoxy- . benzoyl	H	H
15	p-Ghior- phenoxy- acetyl	H	H '
16	G innamoyl	H	H
17(A)	ß-Phenyl- propionyl	H ' '	Benzoyl
Benzoyl	Benzoyl

209816/1788

ORiQINAL INSPECTEO

^:*' ' * 21Ö05Ö3

17(B)	Benzoyl	B enzoyl	H
18	Nicotinoyl	H	H
1.9	2~Thenoyl .	H	H
20	5-Chlor -2- oxo-3-benzo- thiazolinyl- acetyl	H	H
21(A)	2-Furoyl	. H	H
21(B)	2-51UrOyI	2-Furoyl	H
' 22	p-Brom - benzoyl	Acetyl	Acetyl
23	p-Brom· - benzoyl	Benzoyl	Benzoyl
24	m-Brom. - benzoyl	Acetyl	Acetyl ·

Die so hergestellten. Acyl-Derivate von WS-4545 werden bei oraler Verabreichung im Körper in einer viel grösseren Konzentration absorbiert als die Verbindung WS-4545, und sie können in WS-4545 übergeführt werden, das gegen pathogene Bakterien aktiv ist-. Dementsprechend sind die Acyl-Derivate als Antibiotika nützlich, die nach oraler Verabreichung bei der Behandlung von Infektionskrankheiten beim Mensch und Tier wirksam sind. Dies ergibt sich aus den nachfolgend beschriebenen pharmakologischen Versuchen.

Urin-Ausscheidung naoh oraler Verabreichung bei Ratten:

209816/1788

	Beispiel Nr.	Acylderivat	0-3	- ........ .	3-6	hr	%	6 -	24 hr	I C- CVi I	Total	mg	%
	8	von WS-4545	mcg/ml	hr	meß/ml	13.1	Bicg/ml	*	15.31	SO.5
	15	Benzoyl	7112		3569	23.7	718	12.7	I3.IO	72-8
	7(A)	Ginnamoyl	7520	57.4	8350	20.3	796	14.6	15,04	94.0 '
	9	Butyryl	16660	34.5	9839	18.7	506	12.3	19.34	113.7
	12	p- Chlor^enzoyl	9273	61.4	6352	36.8	640	16.7	15.76	98.5
	3	benzoyl	3466	78.2	11947	43.0	962	19.0	16.72	104.5
I VO ..	5	Palmitoyl	3331	42.8	15686	19.5	1400.	. 28.2	17.67	IOO.3 βί
CM I		Cyclohexyl- carbonyl	16703	33.4	4358	5.8	411	9.3	4-72	24.1
		KbntroILe US-4545)	1057	71.6	1455		442	9.7
		' 8.5

Anmerkungen;

Tier: SD-Ratte, 170-200g

Dosis : 100 mg/kg

Bestimmung: Die Konzentration von WS-4545 im Urin wurde nach der

CUP-Methode unter Verwendung von Escherichia coli bestimmt

fs»

cn CK

Soruospiegel und Urin-Ausscheidung nach oraler Verabreichung aex Äeyl-Derivate von WS-4545 bei freiwilligen Versuchspersonen:

Die Serum- und Urin-Spiegel wurden bei drei freiwilligen Personen bestimmt. Drei erwachsene märcLiche Personen mit einem Gewicht von 60.O bis 75.0 kg erhielten orale Verabreichungen in einer einseinen Dosis von 1,000 mg und 500 mg. Blutproben wurden 1, 2, 3, 5 und 8 Stunden nach der Verabreichung entnommen. Urinproben wurden in den Zeiträumen 0-1, 1 - 3t 5-6, 6-9 und 9-24 Stunden nach der Verabreichung gesammelt. Die Konzentrationen von WS-4545 in» Serum und im Urin wurden nach der Cup-Methode bestimmt. Ss wurde der gleiche Urin-Ausscheidungs-Test wie beim Antibiotikum WS-4545 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.

- 28 -

209318/1788

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H · CVl CM

H O

43V?, O	cn * CM
10-24	cr>o
8-10	CMO
co I VD	• in O · ΙΛΟ
VD	• H VO · inn
»d- - I CM	LCVO
CM O	• VD in ·
η Kn	ί545
Urir (mci	^j co 3s

209816/17IS

Acyl-

Ό«-ί_ο-«4_ΛΊ derivat

Beispiel _χ ^ ₂ ^

• ^ΛΓ· Serum

.■ (mcg/ml)

8	Benzoyl	25	.2	25	.8	20	.1	14	.0 <	14.0
7(A)	Butyryl	16	.9	20	• I	15	.7	<10	.0- <	10.0
3	Paimi"fc oyi	12	.4	16	.6	15	.1	11	•9 <	10.0

2150393

Der Einfachheit halber und sur umfassenden Darstellung des Antibiotikums WS-4545 und der Acyl-Derivate davon können alle Verbindungen durch die folgende Formel

[IV]

worin R-, R₂ und R₃ jeweils für Wasserstoff oder eine Äcylgruppe stehen,

dargestellt werden.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung können für die Verabreichung in 3eder geeigneten Weise wie andere antibiotische Substanzen formuliert werden.

Die Verbindungen gemäß der Erfindung können demgemäß in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden, beispieIs weise in fester, halbfester oder flüssiger Form, die die aktive WS-4545-Substanz und/oder ein Acyl-Derivat davon in Mischung mit eineo pharmazeutischen organischen oder anorganischen Träger oder einem Exclpienz geeignet für äußere oder innere Anwendung enthalten. Der aktive Bestandteil kann beispielsweise mit den üblichen Trägern für Tabletten, Pillen, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, wässrigen Suspensionen oder anderen für die Anwendung geeigneten Formen

2 0-9· 18/1781

eompounöiert werden. Als Träger können "beispielsweise verwendet v/erden Glucose» Lactose, Gum acacia, Gelatine, Mannit, Stärkepaste j Magnesiuratrisilicat, Talg, Maisstärke, Keratin, colloidales Siliciurodioxyd, Kartoffelstärke, Harnstoff oder andere auf diesem Gebiet übliche Träger in fester, halbfester oder flüssiger Form. Zusätzlich können,Hilfsstoffe, Stabilisiermittel, Verdickungsmittel, Farbstoffe und/oder Gescfaraacks- und Geruchsstoffe verwendet werden. Die Zubereitungen gemäß der !Erfindung können auch Konservierungsmittel oder bacteriostatische Mittel enthalten, wodurch der aktive Bestandteil in der gewünschten Zubereitung aktiv erhalten wird. Die aktive WS-4545-Substanz und/oder deren acylierte Derivate werden in die Zubereitungen gemäß der Erfindung in einer solchen Menge eingearbeitet, als ausreicht, um den gewünschten therapeutisch Effekt auf den bakteriell infizierten Prozeß oder Zustand zu erreichen. V/'enn auch die Dosis oder die therapeutisch wirksame Menge der Verbindung in Abhängigkeit vom Alter und dem Zustand der jeweiligen Patienten, die behandelt werden sollen, schwanken, so ist es doch bevorzugt eine tägliche Dosis von etwa 0.5 bis 5 g, vorzugsweise 1 - 2 g an aktivem Bestandteil zur Behandlung von Krankheiten zu verabreichen, gegen die das Antibiotikum oder die Derivate nützlich sind.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Herstellung des Antibiotikums WS-4545
Beispiel 1

E3 wurden 6 Kolben mit einem Inhalt von 500 ml verwendet·

Jeder Kolben enthielt 100 ml des folgenden mit Leitungswasser hergestellten vegetativen Mediums:

Stärke 2 # '

getrocknete Hefe 1 5^

Baumwollsamenmehl 1 $

Glutinraehl 1 #

Erdnußssehl 1 °ß>

KH₂PO₄ 2.10 5^

Na_?HPü₄.12H₂O " 1.43 ^ ' -32 -

209816/1788

-32- 2150S93

Dieses Medium wurde dadurch sterilisiert, daß es in. einem Autoklaven etwa 50 Minuten lang auf 120 ⁰C erhitzt wurde. Dann wurde abgekühlt. Jeder Kolben wurde mit Sporen und Myeel von Streptomyces aapporonensis ATCC 21532 geimpft, die auf einer Agar-Schrägkultur gezüchtet worden waren. Die Organismen wurden auf einem Schüttelapparat 48 Stunden lang bei etwa 30 ⁰C wachsen gelassen.

Außerdem wurden in einen 30Liter-Tank aus rostfreiem Stahl 20 liter eines Fermentationsmediums gegeben,daß die gleichen Bestandteile wie oben angegeben erhielt. Das Medium wurde dadurch sterilisiert, daß es 30 Minuten unter Druck auf etv/a 120 ⁰C erhitzt wurde. Das abgekühlte Fermentationsmedium wurde unter' aseptischen Bedingungen inifc der oben beschriebenen vegetativen Impflmltmr in einer Menge von 3 Yolumprozent bezogen auf das Medium geimpft. Dann wurde der Organismus 48 Stunden bei 30 ⁰C gezüchtet. Während der Züchtungsperiode wurde die Brühe mit einem Propeller gerührt, der 300 Umdrehungen pro Minute machte. Sterile Luft wurde durch die Brühe in einer Menge von etwa 20 Liter Luft pro Minute durchgeleitet.

Nach Beendigung der fermentation wurde die Kulturflüssigkeit filtriert, um das Mycel zu entfernen. Die Filtration wurde durch Zugabe von 1 i> "Radiolite" (Warenzeichen für ein PiI-terhilfsstoff der Firma Showa Chemical Company).erleichtert. Das Filtrat wurde auf pH 7.0 eingestellt, und es wurden 500 g Aktivkohle zugesäbzt. Das Geraisch wurde 5 Minuten gerührt, und dann wurde durch Filtration der Filterkuchen von Aktivkohle abgetrennt. Zu diesem Filterkuchen wurden 10 Liter Wasser gegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Der Filterkuchen aus Aktivkohle wurde wiederum durch Filtration ge- . sammelt. Dann wurde der Filterkuchen aus Aktivkohle, der das wirksame Antibiotikum enthielt, mit 5 Liter von 50^igera wässrigen Aceton extrahiert, wobei 5 Minuten gerührt wurde. Diese Eztraktions-Operation wurde 2 χ durchgeführt. Die vereinigten wässrigen Acetonschichten wurden konzentriert, wobei eine Sirup-ähnliche Substanz erhalten wurde. ,.,

209818/1781

Diese Substanz wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit Zellulose gefüllt war. Es wurde mit wässrigen? Butanol eluiert Zur Untersuchung wurden die einseinen aufeinanderfolgenden Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die eine antimikrobiell Aktivität besaßen, wurden vereinigt und konzentriert, wobei eine gelbe, ölige Substanz erhalten wurde. Diese,ölige Substanz wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit Kieselsäure gefüllt war. !Nachdem die Kolonne mit Chloroform gewaschen worden war, wurde mit einem Geraisch aus Chloroform und Methanol (5 : 1) eluiert.· Die aufeinanderfolgenden Fraktionen v/urden jeweils gesammelt. Diejenigen Fraktionen, die eine "antimikrobielle Aktivität besaßen, wurden vereinigt und konzentriert, Der Rückstand wurde der Gefriertrocknung unterworfen, wobei 350 rag eines weissen Pulvers erhalten wurden. Das Pulver wurde in 20 ml heissera Aceton gelöst. Die Acetonlösung wurde in einem Kühlschrank aufbewahrt., wobei 300 mg des Antibiotikums \IS-4545 in Form von Kristallen (rhombisches System) erhalten wurden.

Beispiel 2

Zu einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe wurden 1 i» Radiolite gegeben, und es wurde filtriert. Zu 14 Liter des Filtrats, das auf pH 7.0 eingestellt war, wurden 400 g Aktivkohle gegeben, und das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt. Nach Filtrieren wurde der Filterkuchen aus Aktivkohle mit 5' Liter Wasser gewaschen und dann mit 3 Liter eines Gemisches aus Äthylacetat und Methanol (5:1) extrahiert. Diese Extraktion wurde zweimal durchgeführt. Die Extrakte wurden vereinigt und unter vermindertem. Druck konzentriert, wobei etwa 50 ml erhalten wurden. Zu diesem Konzentrat (einer Sirup-ähnlichen Substanz) wurden 20 al Aceton gegeben, und die Acetonlösung wurde filtriert, um Verunreinigungen ztjfentfernen. Das Filtrat wurde konzentriert. Der Rücketand wurde getrocknet und dann durch eine Kolonne geleitet, die mit Silicagel gefüllt war. Dann wurde mit Chloroform aufgefüllt, und Chloroform wurde durch die Kolonne geleitet, um. Verun-

' - 34 -

209816/1781

reinigungen .zu entfernen. Das Eluieren vnirde mit Aceton § durchgeführt. Die aufeinanderfolgenden Fraktionen wurden zur Untersuchung gesammelt. Diejenigen Fraktionen, die eine antimikrobiell Aktivität zeigten, wurden vereinigt und konzentriert, wobei 1.25 g weisse Kristalle erhalten wurden. Die Kristalle wurden durch Zugabe einer geringen Menge Methanol pulverisiert, und dann wurde das Pulver aus Aceton umkristallisiert, wobei 1.0 g des Antibiotikums WS-4545 in Form von weissen Nadeln (monoclinischeö System) erhalten wurden.

Beispiel 3

In 6 Kolben mit einem Fassungsvermögen von jeweils 500 ml wurden jeweils 100 ml des nachfolgenden mit Leitungswasser hergestellten vegetativen Mediums gegeben:

Stärke.	2	.18
Baumwollsamenmehl	1	.43
Glutinmehl	1
MgGl2·6H2O	1
KH2PO4	2
Ha2HPO4-' 12H2O	1

Dieses Medium wurde in üblicher Weise sterilisiert,- und jeder Kolben wurde mit Sporen und Mycel von Streptomyces sapporonensis ATCO-21532 geimpft. Der Organismus wurde 48 Stunden lang auf einem Si
dieaem Medium gezüchtet.

Stunden lang auf einem Schüttelapparat bei etwa 30 ⁰G in

In einen 30Liter-Tank aus rostfreiem Stahl wurden 20 Liter eines Fermentationsmediums gegeben, daß die gleichen Bestand« teile wie oben enthielt. Das Kulturmedium wurde dadurcfc ster lisiert, daß es etwa 30 Minuten lang auf etwa 120 ⁰C unter Druck erhitzt wurde. Dann wurde abgekühlt. Das Medium wurde aseptisch mit der oben besohriebenen vegetativen Impfkultur geimpft in einer Menge voi* 3 Volumprozent "besogen auf da β Medi::3. Dazsi A'urde dar Ox^snicaus 42- Stunden bei 30 ⁰C ge- -

209118/178

züchtet. Während der Wachstumsperiode wurde die Brühe mit einem Propeller gerührt, der 300 Umdrehungen pro Minute nachte. Sterile Luft in einer Menge von 20 Liter steriler Luft pro Minute wurde durch die Brühe geleitet.

Nach Beendigung der Fermentation wurde die Kulturflüssigkeit filtriert, um das Mycel zu entfernen. Die Filtration wurde durch Zugabe von 1 £ "Radiolite" als Filterhilfsstoff erleichtert. Zum Filtrat wurden etwa 200 g Aktivkohle gegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt. Handera das Gemisch filtriert worden war, wurden zum Filterkuchen aus Aktivkohle 10 Liter Wasser gegeben, und dieses Gemisch wurde gerührt und dann filtriert. Zu dem gesammelten Filterkuchen aus Aktivkohle wurde ein Gemisch aus 4 Liter Äthylacetat und 2 Liter Äthanol gegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt und dann filtriert, wobei ein Filtrat und der Filterkuchen aus Aktivkohle erhalten wurden. Dieser Filterkuchen wurde wiederum mit einem Gemisch aus 2 Liter Äthylacetat und 1 Liter Methanol in gleicher Weise behandelt, wobei ein Filtrat erhalten wurde. Beide Filtrate wurden kombiniert und konzentriert, wobei eine Sirup-ähnliche Substanz erhalten wurde. Zum Sirup wurden 100 g "Radiolite" gegeben, und das Geraisch wurde unter vermindertem Druck bei 30 ⁰C getrocknet. Die getrockEte Substanz wurde mit einem Gemisch aus 300 ml Aceton und 100 ml Methanol extrahiert. Diese Extraktion wurde zweimal durchgeführt. Die so erhaltenen Extrakte wurden vereinigt und konzentriert, wobei ein gelber, öliger Rückstand erhalten wurde. Diese ölige Substanz wurde durch eine mit Kieselsäure gefüllte Kolonne geleitet. Anschlieseend wurde Chloroform durch die Kolonne geleitet, um Verunreinigungen zu entfernen. Die Eluierung wurde mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (5:1) durchgeführt. Die Fraktiontn, die eine antimikrobiell Aktivität besaßen, wurden gesammelt und konzentriert. Das Konzentrat wurde stehengelassen, wobei 900 mg weisse Prismen-Kristalle erhalten wurden. Diese Kristalle wurden aus einem Gemisch aus Methanol und Aceton umkristallisiert, wobei 800 mg des Antibiotikums WS-4545 a la Kristalle

- 36 -

209816/1788

erhalten wurden die mit dem in Beispiel 1 erzeugten WS-4545 identifiziert wurden. .

Herstellung von Acyl-Derivaten des Antibiotikums WS-4545

Das Antibiotikum V/S-4545 wurde als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Acyl-Derivaten verwendet und nachfolgend hierfür als "WS~4545-Su'bstanz^lt bezeichnet.

Beispiel 1

Zu einer Lösung von WS-4545-Substanz (100 mg) in Pyridin (0.5 nl) wurde tropfenweise unter Kühlung auf -10⁰G Essigsäureanhydrid (0.5 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Zum Reaktioiisgeroisch wurde Eiswaser gegeben, und die Lösung wurde der Gefriertrocknung unterworfen. Die gefriergetrocknete Substanz wurde aus einem Gemisch aus Aceton und Äther umkristallisiert, wobei Kristalle erhalten wurden, die aus Aceton umkristallisiert wurden. Dabei wurden 50 mg des Essigsäureesters 4er WS-4545-Substanz in Fora von Prismen erhalten, die bei 213 bis 215 C schmolzen.

Analyse:	C14H20°8N2	C	83	5	H	N	14
		48.	91	5	.86	8.	08
	berechnet :	48.			.81	8.
	gefunden :
Beispiel 2

(12.08 g in Pyridin (48 ml) ) Zu einer Lösung von WS-4545-Substanz/wurde tropfenweise Propionsäureanhydrid (7.8 g) unter Rühren und Kühlen auf -5 bis -10⁰G gegeben, was 1.5 Stunden in Anspruch nahm. Zu diesem Reaktionsgemische da3 über Nacht stehen gelassen worden war, wurde Wasser (100 ml) gegeben, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser (100 al) gelost, und die Lösung wurde mit Äthylacetat ^_____ · - 37

209816/1788

gewaschen und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei 4.6 g Propionsäureester der WS-4545-Substanz als farblose !Tadeln mit dem Schmelzpunkt 178 bis 179 ⁰C erhalten wurden..

	Analyse:	C15H22IT2O8	C	27	6	H	7	N
			50.	18	6	.19	7	.82
		berechnet:	50.			.25		.51
		gefunden :
Beispiel	3

Zu einer Lösung von WS-4545-Substanz (6.04 g) in Pyridin (350 ml) wurde tropfenweise Palmitoylchlorid (5.81 g) unter Rühren und Kühlung in einem Eisbad gegeben. Dies dauerte eine Stunde. Das Gemisch wurde bei dor gleichen Temperatur eine v/eitere Stund ο und dann bei Zimmertemperatur eine Stunde gerührt. Zum Reaktionsgeraisch wurde kaltes Wasser (60 ml) gegeben, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit Wasser, 2.5#iger Salzsäure, wässriger Natrium bicarbonat-Lcsung und Wasser nacheinander gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abdestilliert, und der Rückstand wurde zweimal aus einem Gemisch aus Acetonitril und Isopropyläther umkristallisiert. Dabei wurden 5.0 g des Palmitinsäureesters von ViS-4545-S-ubstanz als farblose Kristalle miljaem Schmelzpunkt 156 bis 157 ⁰C erhalten.

Analyse

C28H48N2°8	C	.20	H	95	5	N
berechnet:	62	.14	8.	17	5	.18
gefunden :	62	9.		.05

Im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren, wie es in den obigen Beispielen beschrieben, wurde, wurden die Acyl-Derivate (d.h. Carbonsäureester?) von Wß-4545-Substanz erhalten, die

209816/1788

in den nachfolgenden Beispielen 4 und 5 erwähnt sind. Beispiel 4

Ausgangsmaterial:

Substanz VS-4545 : 3.02 g
Crotcnsaureanhydrid : 3.02 g

iiößungsiDittel für das Umkristallisieren:

G-eiaisch aus Acetonitril und Isopropyläther.

AIc Acylderivat wurde der Crotonsäureester.von WS-4545-Substanz erhalten in Form von farblosen !!adeln. Ausbeute: 1.0 g,

P.	•	148 bis 150	0C.	C	88	5	H	7	II
	Analyse :	C16H22N2O8	51.	92	6	.99	7	.56
			51.			.09		.40
		berechnet :
Bei		gefunden : ·
spiel 5

Ausgangsstoffe :

Substanz WS-4545 : 3.0 g
Cyclohexancarbonylchlorid : 1.6 g

lösungsmittel für die Umkristallisation: Äthylacetat.

Als Acylderivat wurde der Cyclohexancarbonsäureester in Porin von farblosen Prismen erhalten. Ausbeute: 1.5 g. P. 183 "bis 185 ⁰C (Zersetzung).

Analyse :

berechnet: gefunden :

C	33	6	H „	6	N
55.	07	6	.84	6	.79
55.		.86	.60

- 59 -

209816/1788

Beispiel 6

Eine Lösung der WS-4545-3ubstanz (500 rag) in Pyridin (200 ml) wurde tropfenweise mit Essigsäureanhydrid (2 ml) bei Zimmertemperatur versetzt, und das Gemisch wurde 5 Stunden gerührt. Durch Eins teilen·des Reaktionsgemisches in Eiswasser wurden Kristalls abgeschieden. Die Kristalle wurden durch Filtration ge ca an;-alt und mit Wasser gewaschen und dann mit Methanol umkristallisiert, wobei 600 mg des Tri-Essigsäureesters der WG-4545-SubEtans erhalten wurden in Form von farblosen Priscien, die bei 247 bis 250 C (Zersetzung) schmolzen.

Anal-yse : ^ci8^II24⁰

berechnet: gefunden :

C	46	5	H	N
50.	42	5	.65	6.54
50.		.55	6.73

Beispiel 7

(A) Zu einer Lösimg der WS-4545-Substanz (30.2 g) in Pyridin (90 al) wurde tropfenweise n-Butteraäureanhydrid (17.4 g) bei Zimmertemperatur unter Rühren gegeben. Dies dauerte eine Stunde. Das Gemisch wurde dann eine Stunde gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde Wasser gegeben, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit wässriger 17atriuiabicarbonat-Lö3ung und dann mit Wasser gewaschen. Anschliessend wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert* und der Rückstand v/urde mit Isopropyläther gewaschen, wobei rohe Kristalle erhalten wurden. Die Kristalle wurden aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Benzol umkristallisieirt, wobei Kristalle erhalten wurden, die dann mit Isopropyläther gewaschen und getrocknet wurden. Dabei wurden 24.3 g des n-Buttersäureesters von WS-4545-Substsnz als farblose Kristall mit dem Sobnielspualct 139 bis 140 ⁰G erhalten.

■ - 40 -

209818/178t

Analyse : C₁₆H₂₄N₂O₃

	C	60	6	H	7	Ή
berechnet:	51.	53	6	.50	7	.52
gefunden :	51.		.58	.34

(B) Die bei der obigen Umkristallisation erhaltene Mutterlauge wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde unter 'Verwendung einer mit Silicagel gefüllten Kolonne der Chromatographie unterworfen. Da3 Eluieren wurde mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (15 : 1) durchgeführt. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der Rückstand vurde aus einem G-emisch aus Äthylacetat und Benzol umkristsillisiert. Dabei wurden 2.0 g Di-n-buttersäureester von WS-4545-Substanz als farblose Kristalle mit dem Schmelzpunkt 160.5 bis 162.5 ⁰C erhalten.

Analyse :	G2OH3ON2O9	C	.29	6	H	6	N
		54	.10	6	.83	6	.33
	berechnet:	54			.84		.16
	gefunden :
Beispiel 8

Zu einer Lösung von WS-4545-Substanz (12.08 g) in Pyridin (36 ml) wurde tropfenweise Benzoylchlorid (6.7 g) bei Zimmertemperatur unter Rühren gegeben. Das dauerte eine Stunde. Das Gemisch wurde eine weitere Stunde lang gerührt. Dann wurde Wasser zugefügt. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser, wässriger ITatriumbicarbonat-Lösung und Wasser nacheinander gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdeatilliert, und der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Äther umkristalliaiert, wobei 12.0 g des Benzoesäureester von WS-4545-Substanz erhalten wurden. Die sind farblose Ilrictalle mit dea Schmelzpunkt 135 C

- 41 -

209816/1788

Analyse j C^gH₂2^2 °8

"berechnet: gefunden :

O	15	5	H	N
56.	92	5	.46	6.89
55.		.42	6.69

Beispiel 9

Zu einer Lösung der WS-4545-Substanz (2.0 g) in Pyridin (6 ml) wurde tropfenweise p-Chlorbenzoylchlorid (1.4 g) unter Kühlung mit einem Eiebad gegeben. Dies dauerte etwa 30 Minuten Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur eine Stunde stehengelassen. Danach wurde das Eisbad weggenommen und die Reaktion wurde 3 Stunden lang fortschr-eiten gelassen. Dann wurden 50 ml Eiswasser zum Reaktionsgemisch gegeben, und die Lösung/mix Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit Wasser, 2^iger wässriger Natriurabicarbonat-Iösung und Wasser nacheinander gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wurde abdestilliert, und der Rückstand wurde aus Äthylacetat umkristallisiert. Diese UmkristaO sation wurde zweimal durchgeführt. Dabei wurden 0.9 g p-Chlorbenzoesäureester von WS-4545-Substanz als farblose Kristalle mit dem Schmelzpunkt 135 bis 137 ⁰C erhalten.

51	.84	4	.79	6	.34	8	.03
51	.67	4	.75	6	.23	8	.30

Analyse : C₁OH₂₁₂₈

C H F Gl

berechnet: gefunden :

In gleicher Weire wie in den Beispielen 8 und 9 wurden die Acyl-Derivate (d.h. Carbonsäureester) von WS-4545-Substanz erhalten, die in den nachfolgenden Beispielen 10 bis 16 "beschrieben sind.

Beispiel 10

Ausgangsstoffe :

Subßtanz WS-4545 : 6.04 g ϊη-Brümtenzoylehlorid : 4.8 fr.

- 4a -

209816/1788

lösungsmittel für das Umkristallisieren ι Äthylaoetat

Als Acyl-Derivat wurde der m-Broiabenzoeeäureester von WS-4545-Substanz als farblose Kristalle erhalten. Ausbeute: 6.0g. • I JO Kj ·

Analyse :	O1QH21Ii2S10S	C	.02	4	H	5	N
		47	.96	4	.36	6	.77
	berechnet:	46			.35		.04
	gefunden :
Beispiel 11

Ausgangsstoffe :

Substanz V/S-4545 : 6.04 g ■

p-Bromöenzoylchlorid : 4.8 g

lösungsmittel für die Umkristallisation : Äthylacetat.

Als Acylderivat wurde der p-Brombenzoesäureester von V/S-4545-Substanz in Form von farblosen Nadeln erhalten. Ausbeute: 6.8 g. F, 144 bis 145 ⁰C.

N.M.R. Spectrum :*F(ppm) = 1.96 - 2.33 (Triplett) Beispiel 12

Ausgangsstoffe :

Substanz V/S-4545 : 3-0 g 3,4-Dimethylbenzoylchlorid : 1.85 g.

lösungsmittel für das Umkristallisieren : Äthylacetat.

Als Acylderivat wurde der 3,4-Dimethy!benzoesäureester von WS-4545~Substan2i in Form von farblosen Kristallen erhalten. Ausbeute: 1.8 g, F. 128 bis 130 ⁰C.

' - 43 -209816/1780

C	.06	6	H	6	H
58	.30	6	.03	6	.45
58		.26	.32

Analyse: C₂₁Hp^lT₂Og

berechnet: gefunden :

Beispiel 13

Ausgangsstoffe :

Substanz WS-4545 : 2.0 g
p-Acetoxybenzoylchlorid : 1.6 g.

Lösungsmittel für das Umkristallisieren : Gemisch aus Äthylacetat und Benzol.

Als AcyIderivat wurde der p-Acetoxybenzoesäureester von WS-4545-Substanz in Form von farblosen Kristallen erhalten. Ausbeute: 0.5 g. F. 130 bis 13?- ⁰C

N.M.R. Spectrum : *Γ(ρρΐο)

7.68 (Singlett 3H)

2.69 (Dublett 2H)
1.94 (Dublett 2H)

I.R. Spectrum : 1760 cm~

Beispiel 14

Ausgangsstoffe :

Substanz V/S-4545 : 2.4 g
p-Chlorphenoxyacetjrlchlorid : 2.6 g.

Lösungsmittel für das Umkristallisieren : Äthylacetat.

Als Acylderivat wurde der p-ChlorphenoXyessigsäureeeter von WS-454i5"Substanz in Form von fablosen seidigen »adeln erhalten. Ausbeute: 1.3 &'* F. 128 - 131 ⁰C.

Analyse :

C H N Ol

berechnet: 51.02 4.92 5.95 7.53

gefunden : 50.78 4.88 5.97 7.60

2099 ^6/T 788

Beispiel 15

Ausgangsstoffe :

Substanz WS-4545 : 3.0 g Cinnaiocylchlorid : 1.9 g.

Lösungsmittel für das UiDkristalliöieren : Gemisch au3 ChI roforra und Äther (1 : 1).

Als Aoylderivat wurde der Zimtsäureester von WS-4545-Substanz in Form von farblosen Prismen erhalten. Ausbeute: 1.5 g. P. 150 ⁰C (Zersetzung).

Analyse: ^C21^H24^N2°8

•	■	berechnet:	C	33	UI	H	(Tv	N
	Beispiel	gefunden :	58.	16	5	.59	6	.48
	16	58.			.•62		.20

Ausgangsstoffe :

Substanz WS-4545 : 3.0g P-Phenylpropionylchlorid : 1.7 g.

Lösungsmittel für das Umkristallisieren : Acetonitril.

Als Acylderivat wurde der #~Phenylpropionsäureester von WS-4545-Substanz in Form von farblosen Nadeln erhalten. Ausbeute: 1.6 g. P. 153 ⁰C (Zersetzung).

Analyse : ^Co-|^H26^N2°8

berechnet: gefunden :

Beispiel 17

(A) Zu einer Lösung von WS-4545-Substanz (6.04 g) in Pyridin (18 ml) wurde tropfenweise Benzoylchlorid (7.0 g) untfcr Rühren

C	06	6	H	6	N
58.	95	6	.03	6	.45
57.		.18	.31

209816/178S

bei Zimmertemperatur gegeben. Dies dauerte eine Stunde. Das Gemisch wurde eine v/eitere Stunde lang gerührt und dann über Nacht stehen gelassen. Zum Reaktionsgenlsch wurde Wasser gegeben, und das lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck destilliert. Der Rückstand wurde in Ithylacetat gelöst. Die Lösung v/urde mit Wasser, wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser nacheinander gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in einer Kolonne auf Silicagel adsorbiert. Die gewünschte Verbindung, die in der Kolonne am Silicagel adsorbiert war, wurde mit einem 'Gemisch aus Chloroform und Äthylacetat (9:1) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde aus Benzol umkristallisiert, wobei 1.C2 g Tribenzoesäureester von WS-4545-Substanz als farblose Kristalle mit dem Schmelzpunkt 165 ⁰C erhalten wurden.

Analyse : ^ß33

C	.49 ■	4	H	4	N
64	.19	4	.92	4	.56
64		.88	.36

berechnet: gefunden :

(3) Nachdem der Tribenzoesäureester von WS-4545 wie oben beschrieben eluiert worden war, wurde die Silicagel-Kolonne mjt einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (19 : 1) wiederum eluiert. Das Eluat wurde konzentriert, und der Rückstand wurde aus Chloroform umkristallisiert, wobei 2.01 g des Dibenzoesäureester WS-4545-Substanz als farblose Kristalle erhalten wurden, die bei 209 ⁰C schmolsen. Anal7/se : ^26^26^2^9

berechnet: gefunden :

C	17	5	H ·	N
61.	30	5	.13	5.49
61.		.12	5/45

209816/1788

Beispiel 18

Zu einer Lösung von WS-4545-Substanz (2.0 g) in Pyridin (12 ml) wurde unter Kühlung in einem Eiewasserbad Nikotinsäure anhydrid (0.8 g) gegeben, und da3 Gemisch v/urde 1.5 Stunde lang gerührt. Danach wurde das Kühlbad weggenommen, und das Reaktionsgemisch weitere 5 Stunden gerührt. Zum Reaktionsgemisch wurde Wasser gegeben, und die lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit Äthylacetat extrahiert^ und die Äthylacetatschicht wurde mit. wäßriger Natriurabicarbonatlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wurde abdestilliert, und der Rückstand wurde aus Äthylacetat umkri3tallisiert, wobei 0.8 g Ilikotinsäureester von WS-4545-Substans als schwach ge'lbe Kristalle mit dem Schmelzpunkt 143 ⁰C erhalten wurden.

Anal3^rse : C₁QHo₁OoN^

	C	07	5	H	N	32
berechnet:	53.	79	5	.20	10.	09
gefunden :	52.		.33	10.

In der gleichen V/eise, wie sie im Beispiel 18 beschrieben wurde, wurden die Acylderivate (d.h. Carbonsäureester) von VS-4545-Sabstanz erhalten, die in den nachfolgenden Beispielen 19 und 20 beschrieben sind.

Beispiel 19

Ausgangsstoffe :

Substanz WS-4545 : 3.02 g 2-Thenoylchlorid : 1.57 g.

Lösungsmittel für die Umkristallisation : Gemisch aus Äthylacetat und Benzol.

Ils Acylderivat wurde der 2-Thiopher.carbonsäureester in Form von Kristallen erhalten. Ausbeute: 2.27 g. i¹. 125 ⁰C.

- 47 -

209816/1788

Ana Iy 3 e : C.. ^H₂q^^t

	C	H	II
berechnet:	49.51	4.89	6.79
gefunden :	49.45	4.70	6.57
.Be.ic ρ:IeI 20	•

Ausgangsstoffe :

Substanz Y.'S--4545 : 1.0 g
5~Chlor-2-bensothiazolinon-3-acetylchlorid : 0.75 g.

Lösungsmittel für daa Umkristallisieren :

Gemisch aus Acetonitril und Äthylacetat.

Als Acyiderivat wurde der 5-Chlor-2~benzothiazolinon-3-e.°aigsäureester von Y/S~4545-Substanz in Form von farblosen Plättchen erhalten. Ausbeute: 0.7 g. F. 159 bis 160 ⁰C (Zer-

setsung),	C21H22O9Ii	•	C	•	.77	4	H	7	N	6	S	6	Cl
Analyse :		-SCl	47		.84	4	.20	8	.96	6	.07	6	.72
	berechnet	47			.34		.04		.33		.79
	gefunden
	21
Beispiel

(A) Zu einer lösung von WS-4545-Substanz (3.02 g) in Pyridin (13 al) v/aräe tropfenv/eise 2-Puroylchlorid (1.43 g) unter Kühlen auf -5 bis-3O⁰C und Rühren gegeben. Dies dauerte 30 Minuten. Das"Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 2 Stunden lang gerührt. Dann wurden 40 ml Wasser zugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde in Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit Äthylacetat gewaschen und dann mit natriumchlorid gesättigt. Die Lösung wurde dann mit Äthylacetat extrahiert, und die Äthylacetatschicht wurde mit wässriger Natriumbicarbonatlöüung rewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert,

- 43 -

209816/1703 ORIGINAL

und der Rückstand wurde aus einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol urakristallisiert, wobei 0.93 g 2-ITurancarbonsäureester von V/S~4545-Substanz als farblose Kristalle mit dem Schmelzpunkt 125 ⁰C erhalten wurden.

Analyse : C^

C	.51	5	H	7	Ν
51	.32	Ul	.09	7	.07
51		.03	.11

berechnet: gefunden :

(B) Die bei der obigen !^kristallisation erhaltene Mutterlauge

wurde unter verminderten Druck konzentriert, und der Rückstand v/urde an Silicagel in einer Kolonne adsorbiert. Dann wurde mit einem Geroisch aus Chloroform und Methanol (15 : 1) eluiert. Daβ Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, und der Rückstand wurde aus einem Gemisch aus Chloroform und Methanol unakristallisiert, wobei 0.6 g Di-2-furancarbonsäureester von VS-4545-Substanz als farblose· liristalle mit dem Schme

Analyse :

dem Schmelzpunkt 183 bis 184 C erhalten wurden.

C	88	4	H	5	N
53.	66	4	.52	.71
53.		.33	.53

berechnet: gefunden :

Beispiel 22

Zu einer Lösung von p-Brombsnzoesäureester von VS-4545

(1»ö g), der gemäß Beispiel 11 erhalten worden war, in Pyridin (3 ml) wurde tropfenweise Essigsäureanhydrid (3.0 ml unter Rühren bei Zimmertemperatur gegeben. Dies dauerte 20 Minuten* Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur weitere 4 Stunden lang gerührt. Dann wurde Wasser zugefügt. Die Lösung wurde unter verminderten» Druck konzentriert, und der Rückstand wurde in Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser, wässriger Natriumbicarbonatlösung und Wasser nacheinander gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verminderte« Druck abdestilliert, und der Rückstand wurin

- 49 -

2 0 9 3 16/1788

BAD

1

einer Kolonne an Silicagel adsorbiert und mit einem Gemisch aus Chloroform und i'ithylacetat (8 : 2) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei rohe Kristalle erhalten wurden. Diese wurden aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Benzol umkristallisiert, wobei 0.5 Di-acetyl - p-broabenzoyl-Derivat von WS-4545-Substanz als .farblose Kristalle mit dem Schmelzpunkt 210 ⁰C erhalten wurden.

Analyse	: C23H25IT2BrO10	48.	52	4	.43	4	.92
	berechnet:	48.	56	4	.78	4	.47
	gefunden :
Beispiel	23

Zu einer Lösung von p-Brombenzoesäureester von VS-4545-Substanz (2.0 g) in Pyridin (6 ml) wurde tropfenweise Benzoylchlcrid (1.45 g) bei Zimmertemperatur unter Rühren gegeben. Dies dauerte 30 Minuten. Das Gemisch wurde bei Zimmertemperatur weitere 5 Stunden gerührt und über Nacht stehengelassen. Zum Reaktionogeraisch wurde Wasser gegeben, und es wurde unter verhindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser, wässriger Natriumbicarbonatlösung und V/asser gewaschen. Nachdem die Lösung getrocknet wprden war, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde in einer Kolonne, an Silicagel adsorbiert, und e3 wurde mit Chloroform eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei rohe Kristalle erhalten wurden. Diese wurden aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei 1.51 g Dibenzoyl-p-bronbenzoyl-Derivat von W3-4545-Substanz als farblose Nadeln mit dem Schmelzpunkt 177 bis 178 ⁰C erhalten wurden.

Beispiel 24

Zu einer Lösung von m-Brombenzoesäureester von WS--4545 (2.0 g), der gemäß Beispiel 10 erhalten worden war,

-

209816/1788 ^BAD ORiQtNAL

in Pyridin (6 ml) wurde tropfenweiae Essigsäureanhydrid (40 ml) unter Kühlung und Rühren gegeben. Dies dauerte 30 Minuten. Bas Gemisch wurde weitere 3 Stunden gerührt und in einem Kühlschrank über Nacht stehengelassen. Zum Reaktionsgelaisch wurde V/asser gegeben, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei rohe Kristalle (2.2 g) erhalten wurden. Diese wurden aus Aceton umkristallisiert, wobei das Diacetyl-m-brorabenzoylderivat von WS-4545-Substanz als Kristalle mit dem Schmelzpunkt 217 bis 218 ⁰G erhalten wurde.

Beispiel 25

Pharmazeutische Zubereitung zur Injektion. Die benötigten Mengen des sterilen Antibiotikums V/S-4545 und steriler Harnstoff wurden eingewogen. Diese wurden gleichmässig vermischt und in Ampullen gegeben, so daß jede Ampulle 250 ng der aktiven Substanz enthielt. Die Ampullen wurden hermetisch verschlossen, um Bakterien fernzuhalten. Wenn die Ampullen verwendet werden, wird eine entsprechende Menge von sterilem pyrogenfreiern Wasser in die Ampulle gegeben, und der Inhalt der Ampulle wird verabreicht.

Beispiel 26

Eine geeignete Zubereitung für eine Tablette besteht aus den

folgenden Bestandteilen;

(1) Benzoesäureester von 2 WS-4545

(2) Mannit 90

(3) Stärke 6

(4) Magnesiuiostearat 2

- 51 --

209816/1788

Eeicpiel 2?

Eine geeignete Zubereitung für ein Suppositorium besteht aus den folgenden Bestandteilen:

(1) Essigsäureester von 2,500 WS-4545

(2) Dihydrat dec Dinatriumcalzes 900 der Jvthylendiarcintetra-

eaeigsäure

(3) Witspsol H 12 124,000

(Suppocitoorienmarse der Cheirischen Werke V/itten; V/a renn eichen)

Patentansprüche :

?P9S1G/1789

Claims (28)

1. Patentansprüche

   "CL/ Neues Antibiotikum WS-4545 und dessen Derivate der allgemeinen Formel IV

   CH₀ OR_x

   [IV]

   v/orin R₁, R₂ und R~ jeweils für Wasserstoff oder eine Äcylgruppe stehen.
2. 2. Heues Antibiotikum WS-4545, . dadurch

   gekenn, ze.i c hne t, daß es die folgenden chemischen und physikalischen Eigenachaften hat:

   a) Es kristallisiert in "basis;heft.und weissen Kristallen; I)) Es ist löslich in Wasser, Methanol, Äthanol und Pyrldin, wenig löslich in Aceton und Äthylacetat und unlöslich in Äther, Chloroform, Benzol und n-Hexan;

   c) Das Molekulargewicht beträgt durch Bestimmung nach Massenspektrografie 302;

   d) Die spezifische Drehung ist CoG-p = 63.5° (c = 1.00 Prozent (Gewicht/Volumen) in Methanol);

   e) Die -Elementaranalyse ergibt die folgenden Vierte in Prüzent: Kohlenstoff = 47.44, Wasserstoff = 6.16, Stickstoff = 3.36 und Sauerstoff (Differenz) - 37.04;

   20 9 818/1788

   ORIÖINAI-

   — Oj — «

   f) Die Summenformel ist C₁₂H₁ONpO₇;

   g) Die Farbreaktion ist positiv in Fehling's und Molisch¹3 Test, Entfärbung von Kaliumpermanganat-Lö'sung, schwach positive Reaktion mit Ferrichlorid und negativ in ITinhydrin, Tollen¹s und Ehrlich¹s Test;

   h) Die Rf-Werte sind 0.41 (n-Butanol: Essigsäure:

   Wasser = 4 : 1 : 5), 0.55 (n-Butanol: Pyridin: Wasser= 4:1: 1), 0.39 (Chloroform: Methanol = 5 : 1), 0.63 (Äthylacetat: Methanol =1 : 1) und 0.41 (Benzol: Methanol: Chloroform =1:1:1);

   i) Das magnetische Kernresonanzspektruu ergibt die folgenden "Werte : (t(ppm): DMS0-d6 Lösung, TMS,internal standard) : 8.81 (3H Singlett), 7.45-7.67 (2H Kulfciplett), 6.30-6.87 (2H Multiplett), 6.10-6.40 (211 Multiplett), 6.09 (1H Dublett), 5.53 (1H Triplett), 4.95 (1H Multiplett), 4.93 (1K Singlett), 4.87 (1H Dublett), 4.63 (1H Multiplett), 3.27 (1H Singlett), 1.38 (IH Singlett) und 1.05 (1H Singlett);
3. 3) Bei Kristallisation im rhombischen System beträgt der Schmelzpunkt 187 bis 189 ⁰C (Zersetzung); das Röntgsnbeugungsspektrum ergibt die folgenden Werte: Gitter: a = 11.7^f b β 12.7X und C = 8.8?, Dichte: 1.54 g/cin⁵; das ültraviolettspektrum entspricht Figur 1; das Infrarotspektrura entspricht Figur 2 und hat Spitzen bei den folgenden Frequenzen (cm"¹); 3400, 3300, 3160, 2900, 2840, 1703, 1670, 1450, 1390, 1370, 1295, 1260, 1220, 1195, 1140, 1120, 1080, 1030, 970, 960, 935, 870, 820,-785, 725 und 680;

   bei Kristallisation im monoclinen System beträgt der Schmelzpunkt 188 bis 191 ⁰C (Zersetzung); das RÖntgenbeuguiif;s£pektrum ergibt die folgenden Werte: Gitter: a. = 10.1A, β = 101°, b = 10.9^ und c = 6.6Ϊ, Dichte: 1.46 g/cra³;

   d3G Ultraviolettspectrum entspricht Figur 3; da» lufrarotspektruia entspricht Figur 4 und enthält fjpitzen bei den folgenden Frequenzen: (cnf ) : 3500,

   209816/1788 _BAD

   3400, 3.270, 2900, 2840, 1685, 1640, 1455, 1417, 1375,

   1330, 1300, 1260, 1245, 1210, 1160, 1135, 1125, 1105,

   1085, 1050, 1010, 995, 930, 940, 920, 900, 885, 870, 840, 805, 795, 760, 725, 690 und 675.

   3. Neues Antibiotikun WS-4545 nach Ansprüchen I bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß es der Formel IV entspricht, worin IL, Rp und R-, Wasserstoff bedeuten.
4. 4. Monoacy!derivate des Antibiotikums ¥3-4545.
5. 5. Diacylderivate des Antibiotikums V/S—4545-
6. 6. Triaoy!derivate des Antibiotikums V/S-4545.
7. 7. Acylderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine aliphatische, aromatische oder heterozyklische Carbonsäureacylgruppe ist.
8. 8. Acylderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine aliphatische Kohlenwasserstoffcarbonylgruppe, eine aliphatische Zyklokohlenwasserstoffcarbonylgruppe, eine Arylcarbonylgruppe, eine Carbony!gruppe enthaltend einen heterozyklischen Ring oder einen mit einem Benzolring kondensierten heterozyklischen Ring, oder eine aliphatische Kohlenwasserstoffcarbonylgruppe ist, die substituiert ist durch Zyklokohlenwasserstoff, Aryl, heterozyklischen Ring oder mit Benzolring kondensierten heterozyklischen Ring, wobei der aliphatische Kohlenwasserstoffteil der Aeylgxuppen gradkettig oder verzweigt ist und gegebenenfalls durch Heteroatome v/ie Sauerstoff oder Schwefel unterbrochen ist, und wobei die einzelnen Acylgruppen weitere Substituenten tragen können.

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9. 9. Monoacylderivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine Alkanoyl- oder Alkenoyl-Gruppe ist.
10. 10. Monoacylderivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine Cycloalkancaraiiyl-Gruppe ist.
11. 11» Monoacylderivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine gegebenenfalls substituierte Arylcarbonyl-Gruppe ist. ' .
12. 12. Konoacylderivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine Aralkanoyl- oder Aralkenoyl-Gruppe ist, deren Aryl-'JCeil durch eine oder mehrere mögliche Substituenten substituiert und dessen aliphatischer Kohlenwasserstoi'fteil gegebenenfalls durch ein Heteroatom unterbrochen sein kann.
13. 13. Monoacylderivate nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine Carbonylgruppe enthaltend einen zeterozyklischen Ring oder einen mit einem Benzolring kondensierten heterozyklischen Ring oder eine Alkanoyl-Gruppe ist, die durch einen solchen heterozyklischen Ring substituiert ist, wobei der heterozyklische Ring 5 bis 6 Ringatoae aufweist und mindestens ein Sauerstoff-Stickstoff- und/oder Schwefelatom, und wobei die beterozyklische Carbonylgruppe gegebenenfalls durch einen oder mehrere mögliche Substituenten substituiert sein kann.
14. 14. Honoacylderivate nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe eine Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Palmitoyl-, Crotoncyl-, Cyclohexy!carbonyl-, Benzoyl-, p-Chlorbenzoyl-, ra-Brombenzoyl-, p-Brombenzoyl-, 3»4~ Birae-tbylbenzoyl-, p-Acetoxybenzoyl-, /7-Phenylproplonyl-, p-Chlorphenoxyacetyl-, Cinnamoyl-, Nicotinoyl-, 2-i'henoyl-, 2-Puroyl-, oder 5-

    acetyl—Gruppe ist.

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    -po-
15. 15. Diacylderivate nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppen Alkanoyl-, Arylcarbonyl- oder Carbonyl-GL'uppen mit einem 5 oder 6 Glieder enthaltenden hetero zyklischen Ring sind. ·
16. 16. Diacylderivate nach Anspruch 5, da'dureh gekennzeichnet, daß die Acylgruppen Acetyl-, Butyryl-, Benzoyl- oder

    . . 2-I¹UrOy 1-Gruppen sind,
17. 17. TriacyIderivate nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppen Alkanoyl-, Aryl/Carbonyl- oder sub- * stituierte Aryl/Carbonyl-G-ruppen s.ind.
18. 18. !Eriacylderivate nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppen Acetyl-, Benzoyl-, p-Brombensoyl- oder m-Brombenzoyl~Gruppen sind.
19. 19. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums WS-4545 und dessen Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sapporonensis ATCC 21532 oder nahe verwandte Hutänten davon unter aeroben Bedingungen in einem Nährmediuiu züchtet, gegebenenfalls das Antibiotikum aus dem Nährroedium gewinnt, reinigt und/oder acyliert.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in einem wässrigen nährmedium enthaltend assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff oder proteinhaltiges Material durchführt.
21. 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation bei einer Temperatur von etwa 25 bis 37 ⁰C, vorzugsweise etwa 30 ⁰C, für eine Dauer von 30 bis 50 Stunden durchführt.
22. 22. Verfahren nach einen der Ansprüche 19 bic 21, dadurch

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    gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum WS-4545 durch !Extraktion ait einem organischen Lösungsmittel für das Antibiotikum, wie Pyridin, einem Alkohol, einem wässrigen Alkohol oder einem Gemisch aus einem Alkohol und den anderen organischen Lösungsmitteln gewinnt.
23. 23, Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibioticum WS-4545 mit einem Mol-Äquivalent eines Acylierungsmittels unter Hertellung eine3 Monoacylderivates umsetzt.
24. 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daB man das Antibiotikum WS-4545 mit etwa 2 Mol-Äquivalenten eines Acylierungsmittels oder das man ein Monoacylderivat mit roinäefje^^gjw^gjni Mol-Äquivalent eines Acylierungsmittels/umsetzt.
25. 25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch, gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum WS-4545 mit mindestens drei Mol-Äquivalenten eines Acylierungsmittels oder daß man das Diaoylderlvat ™iS_u?£SSiS^e5i Mol-Äquivalent eines Acylierungsraitteis/umsetzt
26. 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel eine Verbindung der Formel R - OH,- worin R eine Garbonsäureacylgruppe z.B. von einer aliphatischen, aromatischen oder heterozyklischen Carbonsäure bedeutet, oder ein hinsichtlich dar Carboxylgruppe reaktives Derivat davon verwendet
27. 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß raan als AeylierungBiaittel eine Verbindung der Formel R - OH oder ein an der Carboxylgruppe reaktives Derivat davon verwendet, worin R . eine aliphaticche Kohlenwasserstoffcarbonylgruppe, eine aliphatische Zyklokohlenwasserstoffcarbonylgruppe, eine Arylcarbonylgruppe, eine Carbonylgruppe enthaltend einen

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    heterozyklischen Pang oder einen mit einem Benzolring kondensierten heterozyklischen Ring, oder eine aliphatisch Kohlenwasserstoffcarbonylgruppe ist, die substituiert 1st durch ZyklokohlenvmsserstDff, Aryl, heterozyklischen Ring. oder mit Benzolring kondensierten heterozyklischen Ring, wo"bei der aj.iphatische Kohlenwasserstoff teil der Acylgruppen. gradkettig oder'verzweigt ist und gegebenenfalls durch Heteroatome wie Sauerstoff oder Schwefel unterbrochen ist, und wobei die einzelnen Acylgruppen weitere Substituenfen tragen können.
28. 28. Pharmazeutische Zubereitungen, dadurch gekennzeichnet₉ daß sie als Wirkstoff das Antibiotikum YJS-4545 und/oder dessen Derivate nach Ansprüchen 1 bis 27 enthalten.

    Dr.E/hu

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