DE2148452A1

DE2148452A1 - Verfahren zur Herstellung von Praeparaten aus haemolytischen Streptococcen und diese Praeparate enthaltende Arzneimittel zur Behandlung maligner Geschwuelste

Info

Publication number: DE2148452A1
Application number: DE19712148452
Authority: DE
Inventors: Haruki Ogawa; Yutaka Sugawara; Shigeo Suzuki; Yoshio Takagaki; Akihiro Yamamoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-09-30
Filing date: 1971-09-28
Publication date: 1972-04-06
Also published as: JPS496096B1; CH567421A5; DE2148452C3; DE2148452B2; FR2108094A1; CA971895A; FR2108094B1; US3786141A; GB1333996A

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von Präparaten aus hämolytisehen Streptoeoccen und diese Präparate enthaltende Arzneimittel zur Behandlung maligner Geschwülste "

Priorität; 30. September 1970, Japan, Hr. 85 006/70

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Präparaten aus hämolytisehen Streptoeoccen sowie diese Präparate enthaltende Arzneimittel zur Behandlung maligner Geschwülste.

Die lebenden Zellen hämolytischer Streptoooccen besitzen bekanntlich eine beachtliche zerstörende Wirkung gegenüber Turaorzellen. Nach der japanischen Patentanmeldung Nr. 6690/1968 erhält man brauchbare Präparate zur Behandlung maligner Tumoren, wenn man hämolytische Streptococcenzellen in penicillinhaltigen Bernhelmer's Basalmedium (BBM) in verhältnismässig hoher

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Konzentration etwa 20 Minuten "bei einer Temperatur von etwa. 37⁰C inkubiert und anschliessend die Zell&nsuspension etwa 30 Minuten auf etwa 45°C erwärmt und hierdurch die Toxizität "beträchtlich vermindert» die Aktivität des Präparates jedoch "beträchtlich erhöht, Biese Präparate werden abgekürzt mit PCB-45 "bezeichnet. Fach der "britischen Patentschrift ΐ 153 113 erhält man ähnliche Präparate nach gleichen Verfahren, "bei denen an Stelle eines Penicillins Cephalosporin G oder Cycloserin verwendet wird. Bas mit Cephalosporin C erhaltene Präparat wird als CEB-45 und das mit Cycloserin hergestellte Präparat als CYB-45 "bezeichnet.

Die nach den "bekannten Verfahren erhaltenen Präparate "besitzen zwar eine beachtliche Wirkung gegenüber malignen Geschwülsten, sie haben jedoch den Nachteil, dass sie Entzündungen und Fieber sowie am Behandlungsort Schmerzen erzeugen. Diese Nebenwirkungen rühren von verschiedenen Bestandteilen in den Zellen, insbesondere im Cytoplasma und der Zellmembran, her.

Es sind ferner verschiedene Verfahren zur Herstellung von Präparaten aus hämolytischen Streptococcen bekannt, die als Wirkstoff eine wasserlösliche Fraktion enthalten. Es ist bekannt, dass derartige Präparate durch Extraktion der -Zellen mit Wasser oder einer wässrigen lösung eines anorganischen Salzes und Ausfällung des Wirkstoffes mit einem organischen Lösungsmittel" hergestellt werden können; vgl. japanische Patentanmeldung Nr. 1647/1963. Nach dem Verfahren der britischen Patentschrift Nr. 1 163 865 kann man die Zellen der hämolytischen Strepto--

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coccen auch mit einem lytischen Enzym, wie Lysozym, Cellulase oder Protease, "behandeln und die wasserlösliche Fraktion als Wirkstoff abtrennen.

Sämtlichen vorgenannten "bekannten Präparaten ist gemeinsam, dass sie aus wasserlöslichen Fraktionen der Zellen der Streptococcen stammen. Ihre tumorstatische Aktivität ist ungenügend im Vergleich zu der von PCB-45, einem Präparat aus Streptoeoccenzellen. Diese Präparate enthalten noch zahlreiche andere Bestandteile neben den tumorstatisch wirkenden Substanzen, die Entzündung, Fieber oder Schmerzen erzeugen.

Aufgabe der Erfindung war es, aus hämolytischen Streptococcen neue Präparate mit tumorstatischer Wirkung zu schaffen, die keine Entzündung, Fieber und Schmerzen erzeugen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren aur Herstellung von Präparaten aus hämolytischen Streptococcen durch Behandlung der Streptococcen mit einem zell-lytisehen Enzym, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die wasserunlösliche Fraktion des Lysats gewinnt. Im erfindungsgemässen Verfahren können alle hämolytischen Streptococcen verwendet werden, deren Zellen eine tumorstatische Wirkung besitzen« Bevorzugt verwendete hämolytische Streptococcen sind Streptococcus heniolyticus Su (Ai¹CG Nr. 21060), Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC Nr. 21059), Streptococcus hemolyticus C203S (ATCC Nr. 2154-6), Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC Nr. 21547) und Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC Nr. 21548).

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Me hämolytischen Streptoeoccen v/erden nach üblichen Verfahren und in üblichen Nährmedien, wie Fleischbrühe oder einem Hefeextrakt enthaltenden Nährmedium,gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die lebenden Zellen abgetrennt und mit physiologischer Kochsalzlösung oder einer anderen geeigneten Pufferlösung gewaschen.

Die im Verfahren der Erfindung verwendeten zell-lytischen Enzyme stammen vorzugsweise aus Bakterien und Actinomyceten oder

von
sie werden aus dem Iysat/mit Bakteriophagen infizierten Strep-

tococcen hergestellt. Spezielle Beispiele für bevorzugt verwendete Enzyme sind :

(1) Ein lytisches Enzym, das aus dem Iysat von mit Bakterio-

sp. phagen ATCC" Nr. 21597-b infizierten Streptococcen/der Gruppe C

(ATCC Nr. 21597) hergestellt wurde;

(2) das Enzym 1-11, gebildet von Flavobacterium sp. (ATCC Nr. 21044);

(3) das lytische Enzym, das von Streptomyces albus IFO 3422 (ATCC Nr. 3381) gebildet wird;

(4) das lytische Enzym, das dux'cli Streptomyces rutgersensis IAM 0085 (ATCC Nr. 3350) gebildet wird und

(5) das lytische Enzym, das von Streptomyces grieeus gebildet wird.

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Die Herstellung lytischer Enzyme ist bekannt. Beispielsweise kann ein lytisches Enzym aus dem Lysat von mit Bakteriophagen infizierten Bakterien nach dem in der Zeitschrift Biochemistry, Bd. 57 (1965), Seite 67 "beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Ferner kann ein lytischeo Enzym aus der Gärmaische eines Mikroorganismus nach dem in der Zeitschrift Biochemistry, Bd.5. (1966), S. 2764 "beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Sofern die zell-lytisehen Enzyme eine Protease enthalten, die eine ungünstige Wirkung auf die tumorstatische Aktivität ausübt, wird das Enzym vorzugsweise vor der Verwendung von der Protease befreit.

Die Behandlung der Zellen der hämolytischen Streptococcen mit dem zell-lyti sehen Enzym wird in einem Medium durchgeführt, in welchem die Zellen suspendiert sind. Als Medium werden vorzugsweise eine hypertonische Lösung von Natriumcitrat, Natriumsuccinat oder Sucrose verwendet. Es können jedoch auch Salzlösungen sowie Pufferlösungen verwendet werden. Der pH-Wert des Suspendiermediums hängt von der Art des verwendeten Enzyms ab. Vorzugsweise liegt der pH-Wert im Bereich von 6 bis 8, um die tumorstatischen Substanzen während der Behandlung zu stabilisieren. Die Behandlungstemperatur und -zeit hängt ebenfalls von der Art des verwendeten Enzyms ab. Im allgemeinen liegt die Behandlungstemperatur bei 10 bis 4O⁰C und die Behandlungszeit beträgt 10 bis 120 Minuten. Die bevorzugte Behandlungstemperatur beträgt 10 bis 50⁰C und die bevorzugte Behandlungszeit 10 bis 60 Minuten, um die Aktivität der tumorstatisch wir-

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kenden Substanzen nicht zu vermindern.

Nach "beendeter Lysis der Zellen werden die aktiven Substanzen als wasserunlösliche Stoffe aus dem Lysat, z.B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und danach mit einer geeigneten Flüssigkeit, wie physiologischer Kochsalzlösung, einer Pufferlösung oder destilliertem Wasser, gewaschen.

^ Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Präparate sind die Protoplastmembranfraktion, die die Lysis der Zellen der hämolytischen Streptococcen überstehen. Dies wurde durch elektronenmikroskopische Aufnahmen "bei einer Vergrösserung von 60 000 festgestellt. Die Fraktion enthält weder die Zellwand noch Cytoplasma, in welchem die Nebenwirkungen nervorrufenden Stoffe enthalten sind. Die erfindungsgemäss hergestellten Präparate erzeugen auch keine Entzündungen, kein Fieber und keine Schmerzen, wie dies bei den bekannten Präparaten der Fall ist. Die tumorstatische Wirkung der erfindungsgemäss hergestell-

" ten Präparate ist wesentlich höher als die der bekannten Präparate mit den wasserlöslichen Wirkstoffen.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel zur Behandlung maligner Geschwulste, die die erfindungsgemäss hergestellten Präparate enthalten. Zu diesem Zweck werden die Präparate in einem pliarmakologisch verträglichen Trägerstoff und bzw. oder Verdünnungsmittel suspendiert. Beispiele für bevorzugte Trägerstoffe bzw. Verdünnungsmittel sind Bernheimer's Basalmedium oder physiologische Kochsalzlösung.

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Da die erfindungsgemäss hergestellten Präparate in Form einer Suspension selbst "beim Aufbewahren im Kühlschrank verhältnismassig Instabil sind, werden sie gefriergetrocknet. Zu diesem Zweck v/erden die Suspensionen z.B. mit einem der vorgenannten Medien gefriergetrocknet. Man erhält auf diese Weise Trockenpräparate, die durch Zusatz von Wasser leicht in eine applizierbare Form gebracht werden können. Besonders stabile Trokkenpräparate können durch Gefriertrocknung einer Suspension der erfindungsgeniäss hergestellten Präparate erhalten werden, die als Stabilisator eine Aminosäure, ein Saccharid oder ein wasserlösliches Kohlenhydrat in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 bis 50 i 1, bezogen auf das Trockengewicht der aktiven Fraktion, enthält. Beispiele für geeignete Aminosäuren sind Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin, Isoleucin, Leucin, Ornithin, Prolin, Serin, Threonin und Valin. Beispiele für geeignete Saccharide sind Sucrose, Maltose, Raffinose und Lactose. Beispiele für geeignete wasserlösliche Kohlenhydrate sind Dextran und lösliche Stärke.

Die Beispiele und Versuchsbeispiele erläutern die Erfindung.

Bernheimer's Basalmcdium hat folgende Zusammensetzung: 675 mg Maltose, 6 ml einer 20prozentigen v/ässrigen Lösung von Kaliuradihydrogenphosphat, auf pH 6,9 bis 7,0 mit Natriumhydroxid eingestellt, 12 ml einer 2prozentigen wässrigen Lösung von Magnesiumoulfat-heptahydrat und 66 ml destilliertes Wasser.

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Beispiel 1

Streptococcus hemolyticus Su (ATCG Wr. 21060, ein nahezu avirulenter Stamm) wird 24 Stunden bei 37⁰G in Fleischbrühe gezüchtet. 100 ml der Kultur werden in 2 1 eines 5prozentigen Hefeextraktmediums überimpft, das durch Auflösen von 100 g Hefeextrakt in 1,5 1 destilliertem Wasser, Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf pH 7,4 mit Natronlauge, 60minütiges Erhitzen auf 100⁰C, Abkühlen, Filtrieren und Auffüllen mit Wasser auf 2 1
und lOminütiges Dampfsterilisieren "bei 1 atü hergestellt wurde. Die Züchtung in diesem Nahrmedium wurde 20 Stunden "bei 37 0
durchgeführt. Die erhaltene Gärmaische wurde mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in BBM suspendiert und die Absorption wurde auf einen Wert von 8,00 bei 660 nm eingestellt. Die Absorption zeigt, dass die Suspension 5 mg Zellen, ausgedrückt in Zellentrockengewicht,
pro ml der Suspension enthielt. Das Volumen der Suspension betrug 95 ml. 20 ml der Zellensuspension wurden unter Kühlung
zentrifugiert und die abgetrennten Zellen wurden in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratlösung suspendiert. Diese Lösung wurde durch Vermischen von 5 Volumteilen einer 1 molaren Hatriumcitratlösung mit 1 Volumteil einer 0,2 molaren Phosphatpufferlösung
(pH 7_f2), 1 Volumteil einer 2prozentigen Natriumthioglykolatlösung und 3 Volumteilen destilliertem Wasser hergestellt.
Die Suspension wurde mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt, das aus dem Lysat von mit Bakteriophagen ASCC Wr. 21597-b
infizierten Streptococcus sp. der Gruppe C (ATCC Nr. 21597)

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nach dem in Journal of Biochemistry, Bd. 57 (1965), S. 67 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Die Suspension wurde 30 Minuten "bei 25 C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und 30 Minuten "bei 10 000 g zentrifugiert. Die Fällung wurde zweimal mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 20 ml BBM suspendiert, das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27 000 IE/ml enthielt. Das Präparat enthielt unlösliche Wirkstoffe in einer Menge von 0,88, ausgedrückt als Absorption bei 660 im.

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus Sv (ATOC Nr. 21059) verwendet. Das Präparat enthielt aktive Substanzen in einer Menge von 0,90, ausgedrückt durch die Absorption bei 660 nm.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus 0203S (ATGG Nr. 21 546) verwendet. Das Präparat hat einen Absorptionswert von 0,96 bei 660 nm.

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC Ur. 21 547) verwendet. Das Präparat hat eine Absorption von 0,92 bei 660 nm.

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- ίο -

Beispiel 5

Das Beispiel 1 vrarde wiederholt, jedoch wurde Streptococcus heinolyticus Blackmore (ATCC Nr. 21 548) verwendet. Das Präparat hat eine Absorption von 0,95 "bei 660 nm.

Beispiel 6

Geinäss Beispiel 1 wurden gezüchtete Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (ATCC ITr. 21060, nahezu avirulenter Stamm) hergestellt. Die Zellen wurden in BBH suspendiert, und die Absorption wurde auf einen Wert von 9»20 bei 660 nm eingestellt. Dieser Wert entspricht einer Konzentration der trockenen Zellen von 6 mg/ml. 40 ml der Suspension wurden mit 8 ml physiologischer Kochsalzlösung versetzt, die das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 1,6 χ 10 IE/ml enthielt, und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Suspension 30 Minuten auf 45⁰C erwärmt und hierauf sofort abgekühlt. Die erhaltene Suspension entspricht dem bekannten Präparat PCB-45. Dieses Präparat PCB-45 enthielt die Streptococcenzellen in einer Menge von 5 mg/ml, ausgedrückt als trockene Zellen (Absorptionswert 8,00 bei 660 nm).

Aus 20 ml der erhaltenen Suspension wurden die Zellen abzentrifugiert und in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcit rat lösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt, das aus einem Lysat von mit Bakteriophagen (ATCC Nr. 21597-b) infizierten Streptococcen sp. der Gruppe C (ATCC Nr. 21597) erhalten wurde. Die Suspension wird

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30 Minuten "bei 25°C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die erhaltene Fällung wurde geiaäss Beispiel 1 weiter verarbeitet. Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 1,20 bei 660 nm erhalten.

Beispiel 7

20 ml des gemäss Beispiel 6 hergestellten Präparates PCB-45 wurden mit 80 mg eines lytischen Enzyms versetzt, das aus einem Lysat von mit Bakteriophagen (ATGC Nr. 21597~b) infizierten Streptococcen sp. der Gruppe C (ATCO ITr. 21597) erhalten wurde. Die weitere Verarbeitung erfolgte gemäss Beispiel 1. Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionswert von 0,98 bei 660 nm erhalten.

Beispiel 8

20 ml des gemäss Beispiel 6 hergestellten Präparates PCB-45 wurden zentrifugiert. Die abgetrennten Zellen wurden in 20 ml einer 0,5 molaren Natriumcitratlösung suspendiert. Die Suspension wurde mit 160 mg eines teilweise gereinigten lytischen Enzyms versetzt, das aus einer Gärmaische von Streptomyces albus IPO 5422 (ATCC Nr. 3381) erhalten wurde. Die Peptidase wurde nach der in der Zeitschrift Biochemistry, Bd. 5 (1964), S.2764 beschriebenen Methode abgetrennt. Die mit dem lytischen Enzym versetzte Suspension wurde 40 Minuten bei 37°C stehengelassen, danach mit Eis abgekühlt und zentrifugiert. Die Fällung wurde geinäss Beispiel 1 aufgearbeitet. Es wurde ein Präparat mit einem Absorptionowert von 1,05 bei 660 nm erhalten.

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Beispiel9

Das gemäss Beispiel 1 erhaltene Präparat wurde mit einem gleichen Volumen einer Iprozentigen wässrigen DL-Methioninlösung versetzt. Jeweils 2 ml des Gemisches wurden in Reagenzgläser abgefüllt. Die Reagenzgläser wurden 2 Stunden auf -3O⁰C eingefroren und hierauf 20 Stunden hei einer Temperatur unterhalb 2O⁰C und einem Druck von 0,01 Torr gefriergetrocknet. Danach wurde das Vakuum mit getrockneter Luft aufgehoben, und die Reagenzgläser wurden dicht verschlossen. Bs wurde ein Trockenpräparat erhalten.

Beispiel 10

Die gemäss Beispiel 6 erhaltene Fällung wurde in 20 ml BBM suspendiert, das kein Penicillin enthielt. Die erhaltene Suspension wurde mit einem gleichen Volumen einer Iprozentigen wässrigen DL-Methioninlösung versetzt und gemäss Beispiel 9 gefriergetrocknet. Es wurde ein Trockenpräparat erhalten.

.Beispiel 11

Beispiel 10 wurde wiederholt, an Stelle von Dl-Methionin wurde L-Arginin verwendet. Es wurde ein Trockonpräpa3*at erhalten.

Beispiel 12

Beispiel 10 wurde wiederholt, an Stelle von DL-Methionin vmrde Sucrose verwendet. Ea wurde ein Trockenpräparat erhalten.

Zum Vergleich der tumorötatiochon Y'irluin^, der

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erregenden und schWsrgerregenden Eigenschaften der erfindungs-r gein^ss hergestellten P-räparate Bii-fc befcq-nnten Präparaten wurden einige bekannte Präparate auf die in den folgenden Vergleichs*" beispielen beschriebene Weise hergestellt»

Vergleichshei spiel 1

Zellen van Streptococcus hernolyticus Su (ATOC Nr-, 21060) wurden in BBM suspendiert ι da9 das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration vpn 27 000 ΙΕ/ml enthielt. Me Suspension wurde 20 Minuten bei 37⁰G inkubiert und ansehliessend 30 Minu<ten auf 45⁰C erwärmt« Das als PGB^-45 bezeichnete Präparat hat einen Absorptionswert von 8,00 bei 660 nra; vgl. Beispiel 6.

Vergleichsbeispiel 2

Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt, an.Stelle von Penicillin G vmrde Cephalosporin 0 (Cephaloridin) verwendet. Das mit CEB-45 bezeichnete Präparat hatte einen Absorptionswert von 8,OQ bei 660 um.

Vergleichsbeispiel 3

Vergleichsbeispiel 1 wurde wiederholt, an Stelle von Penicillin G wurde Cycloserin verwendet. Das mit GYB-45 bezeichnete Präparat hat einen Abs.orptionnwert von 8,00 bei 660 nm«

V α τ· g 1 ο i ο h s b e i ο ρ ie]. 4 Jioiicn von Stxx'pLoooccuE! hemolyticus üu (Ai¹OC Nr. 2ΊΟ6Ο) wurden

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pit Aluminiumpulver in einem Mörser vermählen und mit einer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,2 extrahiert. Der Extrakt. Würfle langsam mit kaltem Aceton versetzt» Die hierbei auftre·?- tende Fällung wurde abgetrennt, getrocknet und in destillier^ tem Wasser gelöst.

Yergleiehsbeispiel 5.

Der titerstand des im Verfahren gemäss Beispiel 1 erhaltenen r Lysats vpn Streptococcus hemolytieus Su (AICO Ir. 21060) wurde abgetrennt ·.

Vergleichsheispiel

Zellen von Streptococcus hemolyticus Su (AIOC Hr. 21060) vmrden in destilliertem Wasser suspendiert und mit Glaspulver in einem Zellenhomogenisator der Firma Braun vermählen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Überstand abgetrennt und in einem Cellophanschlauch gegen Ammoniumsulfatlösung dialysiert, Eine w Fraktion, die zwischen 50 und SOprozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat ausfiel, wurde abzentrifugiert. Diese Fraktion wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert. Es wurde ein tumorstatisphes Präparat erhalten,

Versuch A

In diesem Versuch wurde die entzündungserrelende Wirkung dor erfindungsgemäss hergestellten Präparate und bekannter Präpai^ate untersucht.

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Versuchsmethodik

Die in .den Beispielen und Vergleichsbeispielen beschriebenen Präparate wurden subcutan in den Rücken von männlichen Mäusen des ddY-Stammes mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 28,5 g in der in Tabelle I angegebenen Menge injiziert. Mach 3 Stunden wurde in die gleiche Stelle eine 0,5prozentige Evana Blau-Löoung injiziert. Nach 30 Minuten wurden die Mäuse getötet und die Häute abgezogen und auf das Auslaufen des Pigmentes untersucht. Das Auslaufen des Pigments zeigt eine Entzündungswirkung mit ihr vorausgehender Vasodilatation an. Für jeden Versuch wurde eine Gruppe von 5 Mäusen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

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	Anmerkungen	Tabelle I	Zahl der Mäuse mit
Präparat von	verabfolgte	positiver Reaktion
Beispiel Nr.	Dosis* 7)	0
1	30	0
2	30	0
3	30	0
4	30	0
VJl	30	0
6	30	0
8	30
Präparat von
Vergleichsbeispiel
Nr.		VJl.
1	100	VJI
2	100	VJl
3	100	VJl
4	70	VJl
* 5	50	VJl
6	20	Dosen beziehen sich auf
: Die angegebenen

das Trockensubstanzgewicht. Im Falle der Präparate von Beispiel 1 bis 6 und 8 sowie dor Präparate d&r Vergleichaljeispiele 4 bis 6 bedeutet die Dosis die Wirkst off menge aus 100"/ Trockengewicht
Streptococceiizellen. Im Falle der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 3
bedeutet die Dosis die Heiige an Stroptocoecenzellen.

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- 17 Versuch B

In diesem Versuch werden die Fieber erzeugenden Eigenschaften der erfindungsgemäss hergestellten Präparate und der "bekannten Präparate untersucht.

Versuchsmethadik

Die gleichen Präparate wie in Versuch A wurden intravenös in

das Ohr von Kaninchen (japanischer weisser Stamm) indiziert,

und die Körpertemperatur wurde rektal in stündlichen Anständen

bis 12 Stunden nach der Injektion gemesson.

Me Ergebnisse sind in I'abelle II zusammengestellt. Die !Temperaturerhöhung bei den Präparaten der Beispiele 1 bis 6 und 8 beträgt höchstens 0_f5°C, während die Temperaturerhöhung der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 6 mehr als 1⁰C betrug.

815/16 6

Präparat von Beispiel ITr.

Tabelle II

verabfolgte Dosis, i~

Körpertemperatur (rektal)

Stunden nach V-erabf olgung des Präparats

12

1	150
	300
	750
	1500
2	150
3	150
4	150
5	150
6	150
8	150
Präparat von Vergleichs beispiel Hr.
1	500
2	500
3	500
4	350
5	250
6	100
Anmerkungen ϊ Die a	ngegeb

38,8	38,9	38,9	39,3	39,1
38,8	38,7	39,2	39,2	39,1
39,3	39,6	39,5	39,4	39,3
39,0	39,5	39,5	39,4	39,3
38,8	38,9	38,8	38,9	38,8
39,0	39,0	38,9	39,2	39,0
38,9	39,1	39,1	39,2	39,2
39,1	39,1	39,4	39,4	39,3
39,3	39,2'	39,3	39,1^:	39,1
38,9	38,9 ^;	39,0	39,0	39,2

38,8 38,8 40,7 40,1 38,9 39,0 38,9 41,0 39,9 39,6

39.0 38,9 40,9 40,2 39,2 38,6 38,6 40,3 38,9 38,7 39,2 39,2 41,1 40,1 39,8

39.1 39ι·1 40,7 39,8 39,3

kensubstansgewicht. Im Falle von Beispiel 1 bedeuten die Dosen die Menge an aktiven Substanzen, die aus 500,1000,2500 u.5000i (Trockengewicht) Streptococcenzollen erhalten wurden. In-Falle der Beisp.2-6 Uo8 sowie d.Vergleichsbeisp_t4-r6 bedeuten d.Dosen d.Menge an aktiven Substanzen, die aus 500 i (Trockengewicht) der Str&püococcenzollen erhalten wurden. Im PaIDe d.Vergl.Beir.p. 1-3 bedeiiten die Dosen die Mengen an--StreptococcenKollen.

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BAD ORIGINAL

Versuch C

In diesem Versuch wurden die schmerzerregenden Eigenschaften der erfindungsgemäss hergestellten Präparate und der "bekannten -Präparate untersucht. Es wurden die gleichen Präparate verwendet wie in Versuch A, die intraperitoneal 5 Wochen alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20,6 g injiziert wurden.

Das Verhalten der Mäuse wurde während einer Stunde nach der Injektion der Präparate "beobachtet. Die mit den erfindungsgemäsfj hergestellten Präparaten gespritzten Mäuse zeigten kein anormales Verhalten, während die mit den "bekannten Präparaten gespritzten Mäuse Krümmungssyndrome zeigten, d.h. Verdrehung des Körpers, Einziehen der Bauchdecke und Strecken der Hinterbeine .

Versuch D

In diesem Versuch wird die tumorstatische Wirkung der erfindungsgemäss hergestellten Präparate und der "bekannten Präparate untersuchte

5 V/οclien alten männlichen Mäusen vom ddY-Stamm wurden Ehrlich ascites Carcinomzellen intraperitoneal in einer Menge von 10 Zellen pro Maus injiziert. Pro Gruppe wurden 10 Mäuse verwendet. Die Präparate der Beispiele 1 "bis 3, 5 und 10 und der Vergleichs"beispiele 1 "bis .6 wurden den,Mäusen 24 Stunden nach der Beimpfung mit den Carcinomzellen.intraperitoneal in einer Menge von 0,1 ml pro Maus täglich während 4 ^rJ?agen injiziert.

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BAB ORIGINAL

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Als Blindpro "be wurde EEM injiziert, das das Kaliumsalz von Penicillin G in einer Konzentration von 27 000. ΙΕ/ml enthielt. Nach 40 Tagen wurde die tumorstatische Wirkung an Hand der Zahl der -überlebenden Tiere in jeder Gruppe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Präparate von
Beispiel Ur.

verabfolgte Dosis,5

Zahl der überlebenden" Mäuse

1
2

10

Präparat von Vergleichsbeispiel.llr.

1
2
3
4
5
6
Blindversuch

75 75 75 75 75

250 250 250 175 125 50

7 6 6 5 7

10

Anmerkungen; Die angegebenen Dosen beziehen sich auf das Trokkensubstanzgewicht. Im Falle des Präparats von Beispiel 1 bic 3, 5 und 10 sowie der Präparate der Vergleichsbeispiele. 4 bis 6 bedeuten die Dosen die Wirkst off mengen aus 250 ^ (Trockengewicht) Streptococcenaellen. Im Falle der Präparate der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 bedeuten die Dosen die Mengen an Streptococcen- zellen.

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Claims

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- 21 Patentansprüche ;

1* Verfahren zur Herstellung von Präparaten aus häaiolyti sehen Streptococcen durch Behandlung der Streptococcen mit einem zell-lytischen Enzym, dadurch gekennzeichnet , dass man die wasserunlösliche Fraktion des Lysats gewinnt.
2. Verfahren nach Ansprp-ch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als hämolytisene Streptococcen Streptococcus hemolyticus Su (ATCC Hr _t 21060), Streptococcus hemolyticus Sv (ATCC Hr. 21059), Streptococcus hemolyticus C 203 S (ATCC Hr. 21546), Streptococcus hemolyticus S-43 (ATCC Hr.

21547) oder Streptococcus hemolyticus Blackmore (ATCC Hr.

21548) verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadtirch gekennzeichnet, dass man ein lytisches Enzym verwendet, das aus der Kulturhrühe von Streptomyces albus IPO 3422 (ATCC Hr. 3381), Streptomyces rutgersensis IAM 0085 (ATCC Hr. 3350) oder Streptomyces griseus gewonnen worden ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als lytisches Enzym das Enzym L-11 verwendet» das von Flavobacterium sp. (ATCC Hr. 21044) gebildet worden ist.

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5. Verfahren nach, Anspruch .1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein lyfcisab.es Enzym verwendet, das aus dem Iysat von mit Bacteriophagen (Al¹CG Hr. 21597-b) infizierten Streptococcen sp. der Gruppe C (ATGC Hr. 21597) erhalten

worden ist. ■ . ^!
6. Verfahren nach Ansjjrueh 1 "bis 5» dadurch gekennzeichnet, dass man die Zell-Lysis in einer hypertonischen wässrigen Lösung durchführt, die Hatriumcitrat. liatriumsuceinat oder Sucrose enthält_o
7. Verfahren nach Anspruch. 1 "bis 6, dadurch gekennzeichnet,, dass man die Zell-Lysis 10 Ms 120 Minuten "bei 10 bis 4O⁰G durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zell-Lysis "bei einem pH-Wert von 6 Ms 8 durchführt.
9. Arzneimittel zur Behandlung maligner Geschwülste, enthaltend ein geniäss Anspruch 1 hergestelltes Präparat und

oder

pharmakologisch verträgliche Trägerstoffe und bzw*/Verdünnungsmittel.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass der physiologisch verträgliche Trägerstoff Bernheimer's Basalmedium oder physiologische Kochsalzlösung ist.

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11. Arzneimittel nach Anspruch 9 und .10, dadurch gekennzeichnet, dass es in gefrxergetroclaaeter Form vorliegt.
12. Arzneimittel nach Anspruch 9 "bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es als Trockenpräparat vorliegt und eine Aminosäure, ein Saccharid oder ein -wasserlösliches Kohlenhydrat als Stabilisator enthält.
13. Arzneimittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Stabilisator in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 "bis 50 : 1, "bezogen auf das Trockengewicht der aktiven Fraktion, vorliegt.
14. Arzneimittel nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Alanin, Asparaginsäure, Citrullin, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Hydroxyprolin, Isoleucin« Leucin, Ornithin, Prolin, Serin, Threonin oder Valin, ist.
15. Arzneimittel nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Saccharid Sucrose, Maltose, Eaffinose oder Lactose ist.
16. Arzneimittel nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Kohlenhydrat Dextran oder lösliche Stärke ist.

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