DE2148011C3

DE2148011C3 - Verfahren zum Herstellen nichtthrombogener Kunststoffoberflächen

Info

Publication number: DE2148011C3
Application number: DE2148011A
Authority: DE
Inventors: J G Eriksson; H R Lagergren
Original assignee: Aminkemi AB
Current assignee: Ird Biomaterial Stockholm Se AB
Priority date: 1970-10-05
Filing date: 1971-09-25
Publication date: 1978-11-09
Also published as: IT941100B; DE2148011B2; CH564575A5; DE2148011A1; US3810781A; FR2109951A5; CA948105A; JPS4948336B1

Description

Es ist bekannt, Kunststoffoberflächen durch Bindung von Heparin auf ihnen nichtthrombogen zu machen, um eine Blutgerinnung zu verhindern, wenn in der Medizin und medizinischen Technologie Gegenstände mit solchen Kunststoffoberflächen in Berührung mit Blut gebracht werden, wie beispielsweise beim Katheterisieren, bei der Verwendung von Herzventilen und Gefäßprothesen, bei Bluttransfusionen, bei der Trokkenlegung von Wunden und in Herz-Lungen-Maschinen.

Eine Methode, Heparin auf Kunststoffoberflächen zu <o binden, besteht darin, zunächst kationische Gruppen an die Kunststoffoberflächen chemisch zu binden und sodann die Oberfläche mit den kationischen Gruppen mit einer Lösung von Natriumheparin zu behandeln, wobei das Heparin ionisch an die Kationen der Kunststoffoberfläche gebunden wird. Solche Verfahren sind beispielsweise in Science, 152, Seite 1625 (1966); Trans. Am. Soc. Artif. Int. Organs, 12, Seite 151 (1966); J. Biomed. Mater. Res. 1, Seite 239 (1967) und Trans. Am. Soc. Artif. Int Organs, 12, Seite 139 (1966) beschrieben, so Diese Art der Bindung von Heparin an Kunststoffoberflächen hat den Vorteil, daß sie sehr leicht erfolgt und universell anwendbar ist, da auch in nichtionische Kunststoffe leicht kationische Gruppen eingeführt werden können. Der Nachteil dieser Bindungsart besteht aber darin, daß die ionische Bindung des Heparins relativ schwach ist, so daß das Heparin relativ schnell wieder von den Kunststoffoberflächen abgelöst und mit dem Blut mitgerissen wird, was zur Folge hat, daß das abgelöste Heparin die Gerinnung dieses Blutes verhindert und daß die ursprünglich nichtthrombogene Oberfläche des Kunststoffgegenstandes mehr und mehr thrombogen wird.

Aus diesem Grund ist man mehr und mehr dazu übergegangen, Heparin kovalent an Hydroxylgruppen des Kunststoffes zu binden, wie etwa gemäß der DT-OS 19 36 387. Diese Methode hat aber die Nachteile, daß sie auf Kunststoffe mit Hydroxylgruppen beschränkt ist und daß die kovalente Bindung vielfach nur unter relativ scharfen Reaktionsbedingungen möglich ist, die ihrerseits zur Zerstörung des Heparins führen können. Bei dem Verfahren der DE-OS 19 36 387 muß außerdem die Oberfläche des Kunststoffes bei der Behandlungstemperatur eine bestimmte Wassermenge aufnehmen, um eine ausreichende Umsetzung mit dem Heparin zu bekommen, was die Anwendbarkeit der Methode weiter einschränkt Schließlich werden auf der so heparinisierten Kunststoffoberfläche Thrombozyten relativ stark absorbiert, was die Brauchbarkeit solchermaßen nichtthrombogen gemachter Gegenstände einschränkt

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, ein neues Verfahren zum Herstellen nichtthrombogener Kunststoffoberflächen durch ionische Bindung des Heparins an diese Kunststoffoberflächen ohne die Nachteile bisher bekannter ionischer Bindungsmethoden, d. h. mit Dauerhaftung des Heparins an den Kunststoffoberflächen, zu bekommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen nichtthrombogener Kunststoffoberflächen, in dem man Heparin an kationische Gruppen in der Kunststoffoberfläche bindet, ist dadurch gekennzeichnet daß man die heparinisierten Oberflächen anschließend mit einem Dialdehyd mit 0 bis 4 CH2-Gruppen zwischen den beiden Aldehydgruppen behandelt

Bei dieser Behandlung reagiert der Dialdehyd mit OH-Gruppen in verschiedenen Heparinketten, wobei sich Quervernetzungen ausbilden und ein Heparinnetz entsteht das an vier Punkten über die kationischen Gruppen an die Kunststoffoberfläche gebunden ist Auf diese Weise wird das Heparin dauerhaft an die Kunststoffoberflächen gebunden, obwohl das Verfahren von den Vorteilen der ionischen Bindungsmethoden Gebrauch macht insbesondere von der leichten Anfangsbindung an die kationischen Gruppen unter milden Bedingungen.

Der Dialdehyd wird zweckmäßig in verdünnter wäßriger Lösung benützt, wobei Diaidehyde mit 3 oder 4 CH2-Gmppen zwischen den beiden Aldehydgruppen bei höheren wie auch bei niedrigeren Oberflächenkonzentrationen des Heparins brauchbar sind, während Diaidehyde mit 0 bis 2 CHrGruppen zwischen den beiden Aldehydgruppen nur bei höheren Oberflächenkonzentrationen an Heparin brauchbar sind. Der bevorzugt verwendete Dialdehyd ist Glutardialdehyd mit drei CH2-Gruppen zwischen den beiden Aldehydgruppen. Der Dialdehyd kann auch in situ in der Reaktionslösung durch Zersetzung des entsprechenden Acetals gebildet werden.

Der pH-Wert der wäßrigen Behandlungslösung sollte zweckmäßig geringer als 10, vorzugsweise geringer als 7, doch nicht niedriger als 2 sein. Ein höherer pH-Wert könnte eine Kondensation des Dialdehyds bewirken, ein niedrigerer pH-Wert als etwa 2 kann zu einer hydrolytischen Zersetzung des Heparins führen, besonders bei erhöhten Temperaturen. Wenn man von dem Dialdehyd selbst ausgeht, kann der pH-Wert beispielsweise bei 4 bis 5 liegen. Wenn man vom entsprechenden Acetal ausgeht, ist ein Ansäuern, beispielsweise mit HCI, erforderlich, so daß der pH-Wert bis etwa 2 heruntergehen kann.

Die übrigen Reaktionsbedingungen, wie Konzentration, Temperatur und Umsetzungszeit, können je nach dem verwendeten Dialdehyd oder Acetat variieren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei den unterschiedlichsten Kunslstoffmaterialien anwendbar, wie bei

Polyäthylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polystyrol, Polytetrafluorethylen bei anderen Thermoplasten, Elastomeren und Cellulosederivaten.

Die kationischen Gruppen können an die Kunststoffoberfläche zunächst in an sich bekannter Weise, etwa nach dem Verfahren der GB-PS 11 30 345 gebunden werden. Hierzu verwendet man ein kationisches oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise in einem wäßrigen Medium, bei erhöhter Temperatur. Um eine feste Bindung des oberflächenaktiven Mittels zu bekommen, ist es bevorzugt, ein solches zu verwenden, das eine Kohlenwasserstoffkette mit wenigstens vier, vorzugsweise mit 12 bis 13 Kohlenstoffatomen enthält Diese sind beispielsweise primäre, sekundäre und tertiäre Amine und deren Salze sowie quaternäre Ammoniumverbindungen, Pyridinium- und Guanidiumsalze die wenigstens eine Alkylgruppe in einer Kette mit mehr als zwei Kohlenstoffatomen und vorzugsweise mit mehr als etwa acht Kohlenstoffatomen enthalten. In den sekundären, tertiären und quaternären Ammoniumverbindungen kann das Stickstoffatom ein, zwei oder drei Kohlenwasserstoffgruppen tragen, wie beispielsweise niedermolekulare Alkylgruppen, wie Methyl-, Äthyloder Propylgruppen, einen Benzylrest oder eine Alkylolgruppe, oder das Stickstoffatom kann auch ein oder zwei Kohlenwasserstoffgruppen mit einer beliebigen Kettenlänge tragen. Eine andere Klasse brauchbarer kationischer oberflächenaktiver Mittel sind die Alkylammoniumsalze der allgemeinen Formel

XNHj-(CH₂)^NH₃X

worin X ein Halogenatom und y eine Zahl von wenigstens vier und vorzugsweise von & bis 18 bedeutet

Da primäre Amine festere Heparinkomplexe als andere Ammoniumsalze äquivalenter Kettenlänge ergeben, ist es bevorzugt, primäre Amine als oberflächenaktive Mittel bei der Behandlung chemisch inerter Kunststoffe zu verwenden. Die primären Amine werden allgemein in der Salzform verwendet, insbesondere als Hydrochloride, Hydrobromide und Hydrojodide, und zweckmäßig in wäßriger Lösung.

Die anschließende erfindungsgemäße Behandlung erfolgt mit dem Dialdehyd, zweckmäßig mit einer 0,1 bis 5 Gew.-% Glutardialdehyd enthaltenden wäßrigen Lösung während 1 Minute bis 3 Stunden bei einer Temperatur zwischen 20 bis 80⁰C, vorzugsweise mit einer l%igen Giutardialdehydlösung während etwa 10 Minuten bei etwa 50° C. Allgemein gesagt, verwendet man günstigerwdse eine Behandlungslösung, in der die Konzentration des Glutardialdehyds in Gew.-% multipliziert mit der Behandlungszeit in Minuten gleich oder größer als 5 ist, wobei die Behandlungszeit gleich oder kleiner als 3 Stunden ist.

In der Zeichnung ist F i g. 1 eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Glutardialdehydkonzentration, die zur Behandlung der heparinisierten Oberfläche verwendet wird, und der Heparinmenge, die von der Oberfläche bei nachfolgendem Waschen zurückgehalten wird, und

F i g. 2 eine grafische Darstellung der Beziehung zwischen der von der heparinisierten Oberfläche zurückgehaltenen Heparinmenge und der Behandlungszeit bei verschiedenen Temperaturen.

In den Fig. 1 und 2 sind die Ergebnisse von Versuchen mit Glutardialdehyd gezeigt. In alien Füllen wurden Versuchsröhren aus Polypropylen zunächst mit einer 1 mM Octadecylaminopropylaminhydrochloridlösune während 2 Stunden bei 95"C behandelt, um kationische Gruppen in die Oberflächenzone einzuführen.

Sodann wurde die Heparinisierung mit 10 IE/ml Heparinlösung, die mit ³⁵S gekennzeichnetes Heparin enthielt, während 4 Stunden bei 75° C durchgeführt 1,2 IE/cm² ist etwa die resultierende Oberflächenkonzentratior. an Heparin auf behandeltem Polypropylen unmittelbar nach der Heparinisierungsstufe. Nach der Hcparinisierungsstu^fe erfolgte die Behandlung mit

to Glutardialdehyd. Zur Bestimmung des erhaltenen Stabilisierungsgrades wurde die Zählgeschwindigkeit von ³⁵S gemessen, nachdem man während 5 Stunden anschließend eine 25%ige Natriumchloridlösung bei 37° C ausgesetzt hatte. In Fällen, wo keine Behandlung mit Glutardialdehyd durchgeführt wurde, führte eine solche Nachbehandlung mit 25%iger Natriumchloridlösung normalerweise zu einer fast vollständigen Eluierung von Heparin, so daß die zurückbleibende Oberflächenkonzentration nur einer Zählgeschwindigkeit von 400 cpm (Anschläge je Minute) entsprach. Unter diesen Bedingungen entspricht eine I E/cm² etwa 3000 cpm.

F i g. 1 erläutert die zurückbleibende Oberflächenkonzentration, gemessen in cpm, als eine Funktion der Glutardialdehydkonzentration in der Behandlungslösung bei einer Behandlungstemperatur von 50° C und einer Behandlungszeit von 60 Minuten ohne Zugabe irgendeiner Säure. Es ist ersichtlich, daß man eine ausreichende Stabilität innerhalb so weiter Konzentrationsgrenzen, wie von 0,1 bis 5 Gew.-% erhält Aus diesem Diagramm ist auch ersichtlich, daß bereits bei einer Konzentration von etwa 0,025% ein bemerkenswerter Stabilisierungseffekt beobachtet werden kann.
F i g. 2 erläutert die restliche Oberfläehenkonzentration von Heparin, gemessen in cpm, als eine Funktion der Behandlungszeit bei verschiedenen Temperaturen, bei pH =2 und mit einer Glutardialdehydkonzentration von 3,6%. Aus dem Diagramm ist ersichtlich, daß man eine zufriedenstellende Stabilität durch Auswahl einer Behandlungszeit erhält, die bei 40 bis 80°C 5 Minuten nicht zu übersteigen braucht, und daß die Wirkung nicht vermindert wird, wenn die Behandlungszeit auf 60 Minuten oder mehr ausgedehnt wird. Die Behandlung bei Raumtemperatur (20°C) erfordert längere Behandlungszeiten, etwa 90 Minuten für eine zufriedenstellende Stabilisierung. Als Faustregel ist zu sagen, daß eine Behandlung mit Glutardialdehyd bei 5O⁰C optimale Ergebnisse zu ergeben scheint.

Es wurde weiter gefunden, daß zu einer vollen

so Bewahrung der biologischen Heparinaktivität es wichtig ist, daß die Behandlung mit angesäuerter Dialdehyd-(oder Acetal-)lösung nicht während zu langer Zeiten fortgesetzt wird. In Säurelösung (pH < 3) und besonders bei erhöhter Temperatur tritt eine allmähliche hydrolytische Zersetzung von Heparin auf, die zu einer Abnahme der biologischen Aktivität führt (siehe Versuch Nr. 4 in den Tabellen 1 und Il nachfolgend). Daher sollten die Bedingungen für die Stabilisierung mit 0,1 bis 5%iger Giutardialdehydlösung bei 50°C so ausgewählt werden, daß die Konzentration in Gewichtsprozent multipliziert mit der Behandlungszeit in Minuten > 5 beträgt und daß die Behandlungszeit < 180 Minuten beträgt. In der Praxis fand man, daß eine Behandlung mit l°/oiger Lösung von Glutardialdehyd

n"> ohnr Zusatz von Säure während 10 Minuten bei 50"C bequem und zufriedenstellend ist.

Die Stabilisierungswirkung der Behandlung von heparinisierten Oberflächen gemäß der F.rfindung sowie

einige Eigenschaften bei der Berührung mit Blut solchermaßen behandelter heparinisierter Oberflächen sind durch Testwerte erläutert, die in den Tabellen Il und III zusammengestellt sind. In Tabelle I ist festgestellt, wie die entsprechenden Proben hergestellt wurden. In allen diesen Fällen erfolgte die Heparinisierung gemäß der britischen Patentschrift 11 30 345.

Tabelle 1

Herstellung der Proben

Proben
Nr.

Kunststoff

Behandlung mit kationischem Tensid

Heparinisicrung

Stabilisierungsbehandlung

Polypropylen
(Versuchsröhren)

Polyvinylchlorid
(Röhren)

Polypropylenversuchsröhre

Polyäthylen

Polyäthylenkatheter
Polyäthylenkatheter

Polyäthylenkatheter

1 mM Cetylaminhydrochlorid, 2 Std, 95° C

1 mM Octadecylaminopropylamin-hydrochlorid,

2 Std., 90⁰C

1 mM Octadecylaminopropylamin-hydrochlorid,

2 Std., 90⁰C

1 mM Octadecylaminopropylamin-hydrochlorid,

2 Std., 90⁰C

1 mM Octadecylaminopropylaminhydrochlorid, 0,5 Std., 95° C

1 mM Octadecylaminopropylaminhydrochlorid,

2 Std., 90° C

1 mM Octadecylaminopropylaminhydrochlorid,

2 Std., 90° C

1 mM Cetylaminhydrochlorid, 2 Std, 90° C

1 mM Octadecylaminopropylaminhydrochlorid, 2Sid, 95° C

1 mM Octadecylaminopropylaminhydrochlorid,

2 Std, 95° C

I E/ml, 4 Std 75°C, pH = 3

I E/ml, 4 Std. 75° C, pH = 3

I E/ml, 4 Std. 75°C, pH = 3

IE/ml, 4 Std 75°C, pH = 3

I E/ml, 4 Std. 75°C, pH = 3

lOIE/ml, 4 Std 75° C, pH = 3

IE/mI, 4 Std. 75° C, pH = 3 IE/ml,4Std 75° C, pH = 3

I E/ml, 4 Std 75° C, pH = 3

3,6% Glutardialdehyd, pH = 2, 10 Min., 60⁰C

die gleiche, aber bei 50° C

1% Glutardialdehyd ohne Zusatz von Säure, 10 Min., 50° C

3,6% Glutardialdehyd, pH = 2, 24 Std, 75° C

3,6% Glutardialdehyd, pH = 2, 60 Min., 60°C

2% 1,1,3,3-Tetraäthoxypropan pH = 2, 60 Min., 60"C

1 % Glyoxal ohne Zusatz von Säure, 10 Min, 60⁰C

3,6% Glutardialdehyd, pH = 2, 10 Min, 60⁰C

3,6% Giutardialdehyd, pH = 2, 10 Min, 6O⁰C

1% Glutardialdehyd ohne Zusatz von Säure, 10 Min, 55° C

Nach jeder Behandlung wurden die Teststücke mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen.

Tabelle Il

Ergebnisse der Versuche in vitro

Probe	Behandlung für den	Restliche Oberflächenkon	\nfangskon-	Koagulierungszeit für Blut in	der Probe/	Glas (Min.)	Entsprechende Koagu-
Nr.	Stabilisierungstest	zentration des Heparins.		Berührung mit	Koagulierungszeit für das	ohne Stabili	lierungszeiten nach
		Prozent der j		gleiche Blut bei nachfolgender	sierung	Behandlung der Test
		zentration	ohne Stabili	Berührung mit	>120/>60	stücke gemäß Spalte 2
			sierung	mit Stabili	> 120/> 120	dieser Tabelle
		mit Stabili	1	sierung		mit Stabili
		sierung	10	> 120/8	>120/>120	sierung
1	Plasma, 15 Std, 37°C	75		> 180/12	>120/>120
2	25%ige Natriumchlorid	80	10			> 120/10
	lösung, 5 Std, 37° C		10	> 180/12	>120/>120
2	Plasma, 15 Std, 37° C	70		> 120/11		> 120/9
3	25%ige Natriumchlorid	65	5		> 120/9
	lösung, 5 Std, 40°C			> 120/11
3	Blut mit Citrat, 4 Std,	60		> 120/7
	37° C Rühren

21 48 Oil

Fortsetzung

Probe	Behandlung für den	Restliche Oberflächenkon	Koaguliemngszeit für Blut in	Entsprechende Koagu-
Nr.	Stabilisicrungsiest	zentration des Heparins.	Berührung mit der Probe/	lierungszeilen nach
		Prozent der Anfangskon	Koagulierungszeii für das	Behandlung der Tcsi-
		zentration	gleiche Blut bei nachfolgender	stiicke gemiill Spähe 2
			Berührung mil Glas (Min.)	dieser Tabelle
		mit Stabili- ohne Stabili	mit Slabili- ohne Stabili	mil Stabili
		sierung siciung	sierung sicrung	sierung
4	Plasma, 3 Std., 37⁰C	95 60	24* >120/>120	17*
5	Blut, 3 Std., 37°C	85 50	>120/>60 > 120/ > 120	120/15
6	25%ige Natriumchlorid	35 10
	lösung, 5 Std., 37° C
7	Blut mit Citrat,	65 50
	2 Std., 37° C

*) Es trat Koagulierung auf, und daher konnte die nachfolgende Berührung mit Glas nicht durchgeführt werden.

Tabelle III

Ergebnisse der Versuche in vivo

Probe Spezialbehandlung nach
Nr. der Stabilisierungsstufe

Behandlung zur Prüfung der Stabilität

Restliche Oberflächenkonzentration des Heparins in Prozent
der Anfangskonzentration

mit Stabili- ohne Stabilisierung sierung

Thrombosezeit in Stunden

mit Stabilisierung

ohne Stabilisierung

Behandlung im Strom
einer physiologischen
Natriumchloridlösung,
1 Std. 6O⁰C

Behandlung im Strom
einer physiologischen
Natriumchloridlösung,
1 Std. 60° C

strömendes Blut in vivo, 3 Std.

strömendes Blut in vivo, 9 Std.

4
25

> 9

Tabelle Il zeigt, daß nicht das gesamte Heparin durch die Stabilisierungsbehandlung stabil an die Oberfläche gebunden wurde. Somit tritt normalerweise bei der Berührung mit Blut oder Plasma eine Desorption einer bestimmten Menge an instabil gebundenem Heparin ein. Solches Heparin kann vor der Verwendung entfernt werden, wie beispielsweise durch Behandlung mit 25%iger Natriumchloridlösung bei 37° C Blut, das mehrere Tage in einem Kessel mit heparinisierter und mit Glutardialdehyd behandelter Oberfläche, die außerdem mit 25°/oiger Natriumchloridlösung bei 37°C nach der Stabilisierangsstufe behandelt wurde, gehalten wird, koaguliert bei der Oberführung in eine Glasröhre normalerweise innerhalb von 5 bis 10 iAm. Dies zeigt, daß kein Heparin in das Blut eluiert wurde. Eine Nachbehandlung mit 24%iger Natriumchloridlösung nach der Stabilisierungsstufe hat somit die Wirkung, daß die heparinisierte Oberfläche praktisch vollständig stabil gegen die Berührung mit Blut wird. In einigen Fällen kann die Entfernung von nicht stabilisiertem Heparin auch in der Weise erfolgen, daß man mit destilliertem Wasser oder mit physiologischer Kochsalzlösung bei etwa 50 bis 80° C spült (siehe Probe 10 in den Tabellen I nod III oben, worin der sehr hohe Wert [1ÖO%] für die verbleibende Oberflächenkonzentration auf die Tatsache zurückzuführen ist daß die Behandlung mit strömendem Blut mit einer Probe durchgeführt wurde, bei der alles nicht stabilisierte Heparin mit der Natriumchloridlösung weggespült worden war).

Hierzu I Blatt Zeichnungen 809645/120

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen nichtthrombogener Kunststoffoberflächen indem man Heparin an kationische Gruppen in der Kunststoffoberfläche bindet, dadurch gekennzeichnet, daß man die heparinisierten Oberflächen anschließend mit einem Dialdehyd mit 0 bis 4 CH2-Gruppen zwischen den beiden Aldehydgruppen behandelt t ο

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die anschließende Behandlung mit einer verdünnten wäßrigen Lösung des Dialdehyds mit einem pH-Wert geringer als 10 und nicht niedriger als 2 durchführt

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Dialdehyd durch Zersetzung ,des entsprechenden Acetals in der Behandlungslösung in situ herstelle.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die anschließende Behandlung mit einer 0,1 bis 5 Gew.-% Glutardialdehyd enthaltenden wäßrigen Lösung während 1 Minute bis 3 Stunden bei einer Temperatur zwischen 20 bis 8O⁰C durchführt.