DE202019006070U1

DE202019006070U1 - Microfluidic device

Info

Publication number: DE202019006070U1
Application number: DE202019006070.7U
Authority: DE
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2024-07-10
Anticipated expiration: 2029-03-30

Abstract

Mikrofluidische Vorrichtung (1) zum Thermozyklieren eines Reaktionsgemisches (5), umfassend:
eine Einlassöffnung (42);
eine Auslassöffnung (43);
einen Strömungskanal (3), der die Einlassöffnung (42) und die Auslassöffnung (43) verbindet und eine Strömungsrichtung von der Einlassöffnung (42) durch den Strömungskanal (3) zu der Auslassöffnung (43) definiert, und
eine Anordnung von Wells (32; 32'; 32"), die in der ersten Strömungskanaloberfläche (31) für eine Fluidverbindung mit der Einlassöffnung (42) und der Auslassöffnung (43) bereitgestellt ist,
wobei die mikrofluidische Vorrichtung (1) für digitale PCR oder biochemische Assays einer Probe verwendet wird, die in Form des Reaktionsgemisches (5) mittels des Strömungskanals (3) in jedem der Wells (32) bereitgestellt wird,
wobei die mikrofluidische Vorrichtung (1) dazu angepasst ist, dass die Wells (32; 32'; 32") mit einem wässrigen dPCR-Reaktionsgemisch auf passive Weise befüllt werden, und dazu, dass die mit dem wässrigen dPCR-Reaktionsgemisch befüllten Wells (32; 32'; 32") unter Aufbringung eines aktiven Fülldrucks mit einem Siegel- oder Trennfluid fluidisch voneinander getrennt werden, so dass eine fluidische Trennung zwischen benachbarten befüllten Wells (32; 32'; 32") gewährleistet werden kann, und
wobei die mikrofluidische Vorrichtung (1) angepasst ist, um ein Einschließen von Gasblasen in den Wells (32; 32'; 32") zu vermeiden und ein vollständiges Befüllen der Wells (32; 32'; 32") mit dem wässrigen dPCR-Reaktionsgemisch zu erreichen. Microfluidic device (1) for thermocycling a reaction mixture (5), comprising:
an inlet opening (42);
an outlet opening (43);
a flow channel (3) connecting the inlet opening (42) and the outlet opening (43) and defining a flow direction from the inlet opening (42) through the flow channel (3) to the outlet opening (43), and
an array of wells (32; 32';32") provided in the first flow channel surface (31) for fluid communication with the inlet opening (42) and the outlet opening (43),
wherein the microfluidic device (1) is used for digital PCR or biochemical assays of a sample provided in the form of the reaction mixture (5) by means of the flow channel (3) in each of the wells (32),
wherein the microfluidic device (1) is adapted to fill the wells (32; 32';32") with an aqueous dPCR reaction mixture in a passive manner, and to fluidically separate the wells (32; 32';32") filled with the aqueous dPCR reaction mixture by applying an active filling pressure with a sealing or separating fluid, so that fluidic separation between adjacent filled wells (32; 32';32") can be ensured, and
wherein the microfluidic device (1) is adapted to avoid entrapment of gas bubbles in the wells (32; 32';32") and to achieve complete filling of the wells (32; 32';32") with the aqueous dPCR reaction mixture.

Description

FACHGEBIETSPECIALIST AREA

Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung das Fachgebiet der mikrofluidischen Vorrichtungen für diagnostische Assays, bei denen es häufig ein Ziel ist, mehrere verschiedene Assays mit einer oder mehreren Testproben auf derselben mikrofluidischen Vorrichtung durchführen zu können, üblicherweise in Form einer Einwegvorrichtung. Dadurch kann ein unabhängiges Analysieren einer oder mehrerer Testproben mit mehreren verschiedenen Reagenzien im Verlauf eines einzigen analytischen Verfahrens erreicht werden, wobei nur geringe Mengen an Testprobe erforderlich sind. Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, die eine Einlassöffnung, eine Auslassöffnung und einen Strömungskanal oder mindestens einen Strömungskanal umfasst, wobei der Strömungskanal die Einlassöffnung mit der Auslassöffnung verbindet und wobei innerhalb des Strömungskanals eine Anordnung von Wells bereitgestellt ist, die in Fluidverbindung mit der Einlassöffnung und der Auslassöffnung steht, wobei die Wells beispielsweise als Reaktionskammern für chemische bzw. biologische Reaktionen mindestens einer darin bereitgestellten Probe vorgesehen sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine verbesserte mikrofluidische Vorrichtung, mit der das Probenflüssigkeitsvolumen so gründlich und produktiv wie möglich genutzt wird.In general, the present invention relates to the field of microfluidic devices for diagnostic assays, where it is often an objective to be able to perform several different assays with one or more test samples on the same microfluidic device, usually in the form of a disposable device. This allows independent analysis of one or more test samples with several different reagents in the course of a single analytical procedure, with only small amounts of test sample being required. In particular, the present invention relates to a microfluidic device comprising an inlet opening, an outlet opening and a flow channel or at least one flow channel, wherein the flow channel connects the inlet opening to the outlet opening and wherein an arrangement of wells is provided within the flow channel which is in fluid communication with the inlet opening and the outlet opening, wherein the wells are provided, for example, as reaction chambers for chemical or biological reactions of at least one sample provided therein. In particular, the present invention relates to an improved microfluidic device that utilizes the sample fluid volume as thoroughly and productively as possible.

HINTERGRUNDBACKGROUND

Auf dem Gebiet der Technologie für diagnostische Assays besteht ein allgemeiner Bedarf, diagnostische Assays schneller, kostengünstiger und einfacher durchzuführen und dabei die Präzision und Effizienz herkömmlicher Laborverfahren zu erreichen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um eine Miniaturisierung und Integration verschiedener Assayvorgänge zu erreichen, um die Anzahl paralleler Assays auf einer einzigen Vorrichtung erhöhen zu können. Beim Reduzieren der Reaktionskammervolumina zum Erzeugen derartiger mikrofluidischer Konstruktionen treten jedoch mehrere neue Probleme auf, wie Fertigungseinschränkungen in Bezug auf die größtmögliche Miniaturisierung der Reaktionskammern, Kreuzkontamination zwischen benachbarten Reaktionskammern, Einschluss von Gasblasen in einer oder mehreren Reaktionskammern, Flüssigkeitsverdampfung sowie einen zunehmenden Mangel an Genauigkeit und ausreichender Dosierung der Probenflüssigkeit in die miniaturisierten Reaktionskammern. Als derartige mikrofluidische Vorrichtungen sind insbesondere mikrofluidische Chips bekannt, die auch als digitale Polymerase-Kettenreaktionschips (Digital Polymerase Chain Reaction Chips - dPCR-Chips) bezeichnet werden, wobei die Chips Kanäle im Mikromaßstab zum Aufnehmen von Proben im Mikroliter- oder Nanolitermaßstab in Form einer strömbaren Flüssigkeit bereitstellen. Im Allgemeinen weisen derartige dPCR-Chips eine Einlassöffnung und eine Auslassöffnung auf, die durch einen Strömungskanal verbunden sind, der eine Strömungskammer bereitstellt, die eine Vielzahl von Reaktionsstellen in Form einer Anordnung kleiner Wells oder Mikrowells enthält.There is a general need in the field of diagnostic assay technology to perform diagnostic assays more quickly, cheaply and easily while achieving the precision and efficiency of traditional laboratory procedures. To achieve this goal, considerable efforts have been made to achieve miniaturization and integration of different assay procedures in order to be able to increase the number of parallel assays on a single device. However, when reducing the reaction chamber volumes to create such microfluidic designs, several new problems arise, such as manufacturing limitations related to the greatest possible miniaturization of the reaction chambers, cross-contamination between adjacent reaction chambers, entrapment of gas bubbles in one or more reaction chambers, liquid evaporation, and an increasing lack of accuracy and sufficient dosing of the sample liquid into the miniaturized reaction chambers. Known as such microfluidic devices are, in particular, microfluidic chips, also referred to as digital polymerase chain reaction chips (dPCR chips), which chips provide microscale channels for receiving microliter or nanoliter-scale samples in the form of a flowable liquid. In general, such dPCR chips have an inlet opening and an outlet opening connected by a flow channel that provides a flow chamber containing a plurality of reaction sites in the form of an array of small wells or microwells.

Zur Durchführung eines dPCR-Assays wird der bekannte dPCR-Chip zunächst mit einem wässrigen dPCR-Reaktionsgemisch, üblicherweise bestehend aus einer biologischen Probe und einem PCR-Mastermix, befüllt, wobei das dPCR-Reaktionsgemisch mittels einer Pipette oder dergleichen in die Einlassöffnung eingebracht wird und typischerweise durch Kapillarkräfte passiv in die Anordnung der Wells des Chips strömt, bis das Kapillarfüllverfahren zum Stillstand kommt. Anschließend wird ein nicht mischbares Trenn- oder Siegelfluid, wie Silikonöl oder dergleichen, durch die Einlassöffnung in den Strömungskanal gepresst, das zunächst jedes restliche dPCR-Reaktionsgemisch in jedes noch leere Well drückt und die gefüllten Wells bedeckt, wodurch die einzelnen Wells fluidisch von ihrer Umgebung und insbesondere voneinander getrennt werden, um eine Kreuzkontamination oder Verunreinigung zu vermeiden. Nachdem das anfängliche Füllverfahren und das anschließende Versiegelungsverfahren abgeschlossen sind, wird der dPCR-Chip normalerweise einem Thermozyklieren unterzogen, wobei im Verlauf einer typischen PCR-Durchführung eine bestimmte Zielnukleinsäure durch eine Reihe von Wiederholungen eines Zyklus von Schritten, bei dem im dPCR-Reaktionsgemisch vorhandene Nukleinsäuren (a) bei relativ hohen Temperaturen, beispielsweise bei einer Denaturierungstemperatur von mehr als 90°C, üblicherweise etwa 94-95 °C, zur Trennung der doppelsträngigen DNA denaturiert werden, dann (b) das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur abgekühlt wird, bei der kurze Oligonukleotidprimer an die einzelsträngige Zielnukleinsäure binden, beispielsweise bei einer Annealing-Temperatur von etwa 52-56 °C für die Primerbindung an den getrennten DNA-Strängen, um Templates (Annealing) bereitzustellen, und danach (c) die Primer unter Verwendung eines Polymerase-Enzyms, beispielsweise bei einer Verlängerungstemperatur von etwa 72 °C, zur Schaffung neuer DNA-Stränge vergrößert/verlängert werden, sodass die ursprüngliche Nukleinsäuresequenz repliziert wurde. Im Allgemeinen ergibt jedes Well, das ein oder mehrere Ziele enthält, ein positives Signal, wobei das Verhältnis von positiven und negativen Signalen nach dem Thermozyklieren ein genaues Berechnen der anfänglichen Zielkonzentration in der Probe ermöglicht, beispielsweise mittels Lumineszenztestmessungen. Derartige Technologien ermöglichen das gleichzeitige Durchführen einer Vielzahl von Assays in einem miniaturisierten Maßstab.To perform a dPCR assay, the known dPCR chip is first filled with an aqueous dPCR reaction mixture, usually consisting of a biological sample and a PCR master mix, whereby the dPCR reaction mixture is introduced into the inlet opening by means of a pipette or the like and typically flows passively into the arrangement of the wells of the chip by capillary forces until the capillary filling process comes to a standstill. Subsequently, an immiscible separation or sealing fluid, such as silicone oil or the like, is pressed through the inlet opening into the flow channel, which initially presses any remaining dPCR reaction mixture into each still empty well and covers the filled wells, thereby fluidically separating the individual wells from their surroundings and in particular from each other in order to avoid cross-contamination or contamination. After the initial filling process and subsequent sealing process are completed, the dPCR chip is typically subjected to thermal cycling, where, in the course of a typical PCR run, a particular target nucleic acid is subjected to a series of repetitions of a cycle of steps in which nucleic acids present in the dPCR reaction mixture are (a) denatured at relatively high temperatures, for example at a denaturation temperature of greater than 90°C, usually about 94-95°C, to separate the double-stranded DNA, then (b) the reaction mixture is cooled to a temperature at which short oligonucleotide primers bind to the single-stranded target nucleic acid, for example at an annealing temperature of about 52-56°C for primer binding to the separated DNA strands to provide templates (annealing), and thereafter (c) the primers are annealed using a polymerase enzyme, for example at an extension temperature of about 72 °C to create new DNA strands so that the original nucleic acid sequence has been replicated. In general, each well containing one or more targets will give a positive signal, with the ratio of positive to negative signals after thermocycling allowing an accurate calculation of the initial target concentration in the sample, for example by luminescence assay measurements. Such technologies enable the simultaneous performance of a large number of assays on a miniaturized scale.

Um innerhalb einer solchen mikrofluidischen Vorrichtung Probenflüssigkeit ohne Verdampfung bereitstellen zu können, beschreibt die US 6,143,496 A eine mikrostrukturierte fluidische Vorrichtung für analytische Zwecke, bestehend aus mehreren Schichten in Form eines Substrats und einer Abdeckung, die aneinander befestigt sind, mit einem dazwischen bereitgestellten Durchflusskanal und einer gemusterten weiteren Schicht, die zwischen dem Substrat und der Abdeckung bereitgestellt und am Substrat befestigt ist, um eine Vielzahl von Reaktionsstellen bereitzustellen, wobei die gemusterte Schicht - gemäß einer spezifischen Ausführungsform - hydrophobe Eigenschaften zeigen kann und die der gemusterten Schicht zugewandte Oberfläche der Abdeckung hydrophile Eigenschaften zeigen kann. Demgemäß offenbart die US 6,143,496 A ein mikrofluidisches Verbrauchsmaterial, das aus mehreren unterschiedlichen Schichten hergestellt ist, die auf komplexe Weise und in einer bestimmten Reihenfolge zusammengesetzt werden müssen. Als weiteren bekannten Stand der Technik offenbart die US 6,027,695 A eine andere mikrostrukturierte fluidische Vorrichtung, die eine Vielzahl von benachbarten Mikrowells umfasst, wobei sich die Wände benachbarter Mikrowells derart schneiden, dass sie eine nach oben weisende Kante bilden, wobei die Mikrowells, beispielsweise in Form von hexagonalen Kammern, nach Art einer Bienenwabenkonfiguration angeordnet sind. In Bezug auf die Verwendung der mikrostrukturierten fluidischen Vorrichtung aus der US 6,027,695 A werden die Wells durch Fluten der gesamten Vorrichtung mit einer Lösung gefüllt, die Kügelchen umfasst, die sich mit der Zeit absetzen und somit in die Wells eingetragen werden, sodass in jedem Well mindestens ein Kügelchen bereitgestellt ist. Danach wird die Lösung abgedampft und die Wells werden fluidisch voneinander getrennt, was im Allgemeinen erfordert, dass das Kügelchen dichter als die Flüssigkeit ist. Ein derartiges Abdampfungsverfahren zum Trennen der Wells ist jedoch recht zeitaufwändig und die Bereitstellung einer bestimmten Lösungsmenge für jedes Well ist ein kritischer Punkt, da Unterschiede zwischen dem Inhalt jedes Wells so gering wie möglich sein sollten.In order to be able to provide sample liquid without evaporation within such a microfluidic device, the US 6,143,496 A a microstructured fluidic device for analytical purposes, consisting of a plurality of layers in the form of a substrate and a cover, which are attached to one another, with a flow channel provided therebetween and a patterned further layer provided between the substrate and the cover and attached to the substrate to provide a plurality of reaction sites, wherein the patterned layer - according to a specific embodiment - can exhibit hydrophobic properties and the surface of the cover facing the patterned layer can exhibit hydrophilic properties. Accordingly, the US 6,143,496 A a microfluidic consumable made of several different layers that have to be assembled in a complex manner and in a specific order. Another known prior art is disclosed by US 6,027,695 A another microstructured fluidic device comprising a plurality of adjacent microwells, wherein the walls of adjacent microwells intersect to form an upwardly facing edge, wherein the microwells are arranged in a honeycomb configuration, for example in the form of hexagonal chambers. With respect to the use of the microstructured fluidic device from the US 6,027,695 A the wells are filled by flooding the entire device with a solution comprising beads that settle over time and are thus introduced into the wells so that at least one bead is provided in each well. The solution is then evaporated and the wells are fluidically separated from each other, which generally requires the bead to be denser than the liquid. However, such an evaporation process for separating the wells is quite time consuming and providing a specific amount of solution for each well is a critical point since differences between the contents of each well should be as small as possible.

Im Allgemeinen müssen auf dem aktuellen technischen Gebiet der Technologie für diagnostische Assays und insbesondere auf dem Gebiet der dPCR, die mit einer bekannten mikrofluidischen Vorrichtung oder einem solchen Chip durchgeführt wird, mehrere technische Anforderungen erfüllt sein, um die vorstehend genannten Probleme des bekannten Stands der Technik zu überwinden:

Es wurde festgestellt, dass nicht nur die Anzahl der dPCR-Reaktionswells/- kammern, sondern auch deren jeweiliges Volumen für einen bestimmten Bereich auf einer mikrofluidischen Vorrichtung maximal sein sollte. Das Herstellungsverfahren einer derartigen mikrofluidischen Vorrichtung, üblicherweise mittels Spritzgießen, bringt jedoch bestimmte Einschränkungen bezüglich der maximal möglichen Anzahl von Wells sowie deren jeweiligen maximalen Volumens in einer zu spritzgießenden mikrofluidischen Vorrichtung mit sich.

In general, in the current technical field of diagnostic assay technology, and in particular in the field of dPCR performed using a known microfluidic device or chip, several technical requirements must be met to overcome the above-mentioned problems of the known state of the art:

It has been found that not only the number of dPCR reaction wells/chambers but also their respective volume should be maximized for a given area on a microfluidic device. However, the manufacturing process of such a microfluidic device, usually by injection molding, imposes certain limitations on the maximum possible number of wells as well as their respective maximum volume in a microfluidic device to be injection molded.

Des Weiteren sollte jedes Well im Verhältnis zu dessen Länge und Breite eine bestimmte Tiefe erreichen, und ein bestimmtes Aspektverhältnis von Welllänge zu Strömungskanalhöhe sowie eine minimale Breite jeder Art von Rand zwischen benachbarten Wells könnten erwünscht sein, sind aber ebenfalls durch die limitierenden Herstellungsverfahrensbedingungen eingeschränkt.Furthermore, each well should reach a certain depth relative to its length and width, and a certain aspect ratio of well length to flow channel height as well as a minimum width of any type of edge between adjacent wells might be desirable, but are also limited by the limiting manufacturing process conditions.

Es kann auch erwünscht sein, dass die Wells auf passive Weise durch Kapillarkraft mit dPCR-Reaktionsgemisch befüllt werden sollen. In dieser Hinsicht ist es jedoch schwierig, eine ausreichende passive Befüllung von Wells der mikrofluidischen Vorrichtung durch Kapillarkraft umzusetzen, da die Miniaturisierung der mikrofluidischen Vorrichtung und somit des Strömungskanals und der Wells zu dem Problem führt, dass jede Flüssigkeit, wie ein dPCR-Reaktionsgemisch, möglicherweise nicht ohne Weiteres in die Wells oder bereits in den Strömungskanal selbst eingetragen wird.It may also be desirable that the wells should be filled with dPCR reaction mixture in a passive manner by capillary force. In this respect, however, it is difficult to implement sufficient passive filling of wells of the microfluidic device by capillary force, since the miniaturization of the microfluidic device and thus of the flow channel and the wells leads to the problem that any liquid, such as a dPCR reaction mixture, may not be easily introduced into the wells or even into the flow channel itself.

Darüber hinaus sollte, selbst wenn ein ausreichendes Befüllen der mikrofluidischen Vorrichtung auf die eine oder andere Weise erreicht wird, die Befüllung ohne die Erzeugung von Gasblasen und somit ohne anfänglichen Einschluss von Gasblasen in den Wells erreicht werden. Der Einschluss von Blasen in einigen oder allen Wells und/oder im Strömungskanal ist jedoch immer noch ein anspruchsvolles Problem, das zu unerwünschten dPCR-Analysefehlern führt, da jede in einem Well eingeschlossene Gasblase bereits ein in dem Well zu erzeugendes Nachweissignal verfälscht, und zusätzlich dehnt sich, wenn die mikrofluidische dPCR-Vorrichtung auf die erforderliche maximale Thermozyklierungstemperatur von ungefähr 95 °C erwärmt wird, eine solche Gasblase derart aus, dass eine sichere Trennung von benachbarten Wells nicht länger gewährleistet werden kann und eine unerwünschte Kreuzkontamination sehr wahrscheinlich ist.Furthermore, even if sufficient filling of the microfluidic device is achieved in one way or another, the filling should be achieved without the generation of gas bubbles and thus without initial entrapment of gas bubbles in the wells. However, entrapment of bubbles in some or all wells and/or in the flow channel is still a challenging problem leading to undesirable dPCR analysis errors, since any gas bubble trapped in a well already corrupts a detection signal to be generated in the well, and in addition, when the microfluidic dPCR device is heated to the required maximum thermal cycling temperature of approximately 95 °C, such a gas bubble expands such that safe separation from neighboring wells can no longer be ensured and undesirable cross-contamination is very likely.

Als weitere Anforderung an jede mikrofluidische Vorrichtung ist es oft erwünscht, die Wells bis zu einem bestimmten Maximum in Bezug auf ihr Nennvolumen zu füllen. Hierbei kann jedoch beim Befüllen der mikrofluidischen Vorrichtung mit einem nicht mischbaren Siegelfluid zur Trennung der zunächst mit dPCR-Reaktionsgemisch befüllten Wells ein erheblicher Teil des in jedes Well gefüllten dPCR-Reaktionsgemisches durch das Siegelfluid wieder verdrängt werden, da das eingetragene Siegelfluid beim Eintragen in jedes Well häufig einen Meniskus bildet und somit das in das Well gefüllte dPCR-Reaktionsgemisch erneut aus dem Well herausdrückt. Dadurch wird das tatsächlich nutzbare dPCR-Reaktionsgemischvolumen der mikrofluidischen dPCR-Vorrichtung erheblich verringert, was zu einer schlechteren Analyseleistung der Vorrichtung führt. Zusätzlich macht die Ungenauigkeit beim Bestimmen der Gesamtmenge an dPCR-Reaktionsgemisch in der mikrofluidischen Vorrichtung aufgrund der unerwünschten Verdrängung von dPCR-Reaktionsgemisch aus den Wells jedes Analyseergebnis ungenau.As a further requirement for any microfluidic device, it is often desired to fill the wells to a certain maximum in relation to their nominal volume. However, filling the microfluidic device with a non- miscible sealing fluid to separate the wells initially filled with dPCR reaction mixture, a significant portion of the dPCR reaction mixture filled in each well is displaced again by the sealing fluid, since the introduced sealing fluid often forms a meniscus when introduced into each well and thus pushes the dPCR reaction mixture filled in the well out of the well again. This significantly reduces the actually usable dPCR reaction mixture volume of the microfluidic dPCR device, which leads to poorer analysis performance of the device. In addition, the inaccuracy in determining the total amount of dPCR reaction mixture in the microfluidic device due to the undesirable displacement of dPCR reaction mixture from the wells makes every analysis result inaccurate.

Darüber hinaus muss die fluidische Trennung der Wells nach dem Befüllen der Vorrichtung mit dPCR-Reaktionsgemisch und Trennen der Wells mittels eines nicht mischbaren Fluids während des Verfahrens des Thermozyklierens auf stabile Weise aufrechterhalten werden, d. h., es sollte kein Austreten von dPCR-Reaktionsgemisch aus einem Well in ein anderes Well auftreten. Eine vollständige fluidische Trennung benachbarter Wells wird normalerweise jedoch nur selten erreicht und führt - wenn sie nicht erreicht wird - zu unerwünschtem Austreten zwischen benachbarten Wells. Aus diesem Grund können dPCR-Produkte von einem Well in ein anderes wandern und diese dadurch kontaminieren, was zu einem falsch positiven Signal führt, was - letztendlich - zu falschen dPCR-Ergebnissen führt.Furthermore, after filling the device with dPCR reaction mixture and separating the wells using an immiscible fluid, the fluidic separation of the wells must be maintained in a stable manner during the thermocycling process, i.e., there should be no leakage of dPCR reaction mixture from one well to another well. However, complete fluidic separation of adjacent wells is usually rarely achieved and, if not achieved, leads to undesirable leakage between adjacent wells. For this reason, dPCR products can migrate from one well to another, thereby contaminating them, resulting in a false positive signal, which - ultimately - leads to false dPCR results.

Die vorstehende Liste der Anforderungen und Probleme mikrofluidischer Vorrichtungen ist selbstverständlich nicht vollständig, sondern führt lediglich einige der aktuellsten Probleme auf. Im Allgemeinen besteht auf dem aktuellen technischen Gebiet der Bedarf, eine mikrofluidische Vorrichtung bereitzustellen, mit der es möglich ist, jedes einzelne Well einer Anordnung von Wells zuverlässig und ausreichend zu befüllen, und in dieser Hinsicht insbesondere eine mikrofluidische Vorrichtung, die in der Lage ist, die Erzeugung von Blasen während des Befüllens zu vermeiden und eine angemessene Trennung zwischen den befüllten Wells zu gewährleisten.The above list of requirements and problems of microfluidic devices is of course not exhaustive, but merely lists some of the most current problems. In general, there is a need in the current technical field to provide a microfluidic device with which it is possible to reliably and sufficiently fill each individual well of an array of wells and, in this respect, in particular a microfluidic device capable of avoiding the generation of bubbles during filling and ensuring adequate separation between the filled wells.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNGSUMMARY OF THE INVENTION

Die vorliegende Erfindung geht auf den vorstehend beschriebenen Bedarf ein und stellt eine verbesserte mikrofluidische Vorrichtung zum Thermozyklieren eines Reaktionsgemisches bereit, wobei die Vorrichtung alle vorstehend genannten Probleme löst und die aufgeführten Anforderungen erfüllt.The present invention addresses the need described above and provides an improved microfluidic device for thermocycling a reaction mixture, which device solves all of the problems and meets the requirements set out above.

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine mikrofluidische Vorrichtung zum Thermozyklieren eines Reaktionsgemisches bereitgestellt, wobei die Vorrichtung eine Einlassöffnung als Einlass für ein Fluid, eine Auslassöffnung als Auslass für ein Fluid und einen Strömungskanal umfasst, der die Einlassöffnung mit der Auslassöffnung verbindet und als Kanal für einen Fluidstrom von dem Einlass zu dem Auslass dient, wobei durch diese bauliche Anordnung eine Strömungsrichtung von der Einlassöffnung durch den Strömungskanal zu der Auslassöffnung definiert ist. Die mikrofluidische Vorrichtung kann in ihrer Gesamtheit ein Verbrauchsartikel sein und aus einem transparenten Material wie cyclischem Olefincopolymer, COC, oder cyclischem Olefinpolymer, COP, bestehen, das üblicherweise einen Kontaktwinkel von etwa 80° bis 90° bereitstellt, wobei die Transparenz des Materials für die visuelle Analyse der dPCR-Ergebnisse vorteilhaft ist. Ferner umfasst der Strömungskanal oder insbesondere das innere Volumen des Strömungskanals eine erste Strömungskanaloberfläche und eine der ersten Strömungskanaloberfläche gegenüberliegende zweite Strömungskanaloberfläche, wobei in der ersten Strömungskanaloberfläche eine Anordnung von Wells oder Mikrowells bereitgestellt ist, sodass eine Fluidverbindung zwischen der Anordnung von Wells und der Einlassöffnung sowie der Auslassöffnung hergestellt wird. In Bezug auf die spezifischen Eigenschaften des Strömungskanals stellt die erste Strömungskanaloberfläche und vorzugsweise insbesondere ein mit Wells bedeckter Flächenteil der ersten Strömungskanaloberfläche eine erste Hydrophilie bereit/umfasst diese, und mindestens ein Teil der zweiten Strömungskanaloberfläche, der vorzugsweise der dem mit Wells bedeckten Bereich direkt gegenüberliegende Teil der zweiten Strömungskanaloberfläche ist, stellt eine zweite Hydrophilie bereit/umfasst diese, wobei die erste Hydrophilie, d. h. die jeweilige Oberflächeneigenschaft der ersten Strömungskanaloberfläche, größer ist als die zweite Hydrophilie, d. h. die jeweilige Oberflächeneigenschaft der der ersten Strömungskanaloberfläche gegenüberliegenden zweiten Strömungskanaloberfläche. Hier zeigt sich die erste Hydrophilie, d. h. die Hydrophilie der ersten Strömungskanaloberfläche, beispielhaft mit einem Oberflächenkontaktwinkel in einem Bereich von etwa 30° bis 50°, z. B. 40°, kann aber auch < 30° betragen, und die zweite Hydrophilie, d. h. die Hydrophilie der zweiten Strömungskanaloberfläche, zeigt sich mit einem Oberflächenkontaktwinkel in einem Bereich von etwa 80° bis 90°, was dazu führt, dass die erste Strömungskanaloberfläche der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung hydrophiler ist als die zweite Strömungskanaloberfläche. Dieser spezifische Aufbau mit der definierten Beziehung zwischen der ersten Strömungskanaloberfläche, in der die Anordnung von Wells bereitgestellt ist, und deren gegenüberliegender zweiter Strömungskanaloberfläche, die auf einer der Anordnung von Wells gegenüberliegenden Seite angeordnet ist, erreicht eine hydrophile Beziehung innerhalb des Strömungskanals, die zu einer verbesserten Befüllleistung der mikrofluidischen Vorrichtung führt, siehe auch weitere Einzelheiten dazu unten.According to a first aspect of the present invention, a microfluidic device for thermocycling a reaction mixture is provided, the device comprising an inlet opening as an inlet for a fluid, an outlet opening as an outlet for a fluid and a flow channel connecting the inlet opening to the outlet opening and serving as a channel for a fluid flow from the inlet to the outlet, this structural arrangement defining a flow direction from the inlet opening through the flow channel to the outlet opening. The microfluidic device may be a consumable in its entirety and may consist of a transparent material such as cyclic olefin copolymer, COC, or cyclic olefin polymer, COP, which typically provides a contact angle of about 80° to 90°, the transparency of the material being advantageous for the visual analysis of the dPCR results. Furthermore, the flow channel or in particular the inner volume of the flow channel comprises a first flow channel surface and a second flow channel surface opposite the first flow channel surface, wherein an arrangement of wells or microwells is provided in the first flow channel surface so that a fluid connection is established between the arrangement of wells and the inlet opening and the outlet opening. With regard to the specific properties of the flow channel, the first flow channel surface and preferably in particular a surface part of the first flow channel surface covered with wells provides/comprises a first hydrophilicity, and at least a part of the second flow channel surface, which is preferably the part of the second flow channel surface directly opposite the area covered with wells, provides/comprises a second hydrophilicity, wherein the first hydrophilicity, i.e. the respective surface property of the first flow channel surface, is greater than the second hydrophilicity, i.e. the respective surface property of the second flow channel surface opposite the first flow channel surface. Here, the first hydrophilicity, i.e. the hydrophilicity of the first flow channel surface, is shown by way of example with a surface contact angle in a range of about 30° to 50°, e.g. 40°, but can also be <30°, and the second hydrophilicity, i.e. the hydrophilicity of the second flow channel surface, is shown by a surface contact angle in a range of about 80° to 90°, which results in the first flow channel surface of the device of the present invention being more hydrophilic than the second flow channel surface. This specific structure with the defined relationship between the first flow channel surface in which the arrangement of wells is provided and its opposite second flow channel surface, which is on one of the arrangement from the wells opposite side achieves a hydrophilic relationship within the flow channel, which leads to improved filling performance of the microfluidic device, see also further details below.

Aufgrund des Befüllens der in der ersten Strömungskanaloberfläche bereitgestellten Wells fließt das anfänglich eingefüllte Fluid üblicherweise schneller an der zweiten Strömungskanaloberfläche, die keine Wells umfasst, als an der ersten Strömungskanaloberfläche, die die Anordnung von Wells umfasst. Somit fließt das während des anfänglichen Befüllens durch den Strömungskanal fließende Fluid an der zweiten Strömungskanaloberfläche schneller als an der ersten Strömungskanaloberfläche, was dazu führt, dass das Fluid während des Befüllens der Wells Gas in den zu befüllenden Wells einschließen kann, was zum unerwünschten Einschließen von Gasblasen führt. Bei der mikrofluidischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung bewirkt ein Modifizieren einer inneren Oberfläche des Wellbereichs der mikrofluidischen Vorrichtung in der ersten Strömungskanaloberfläche in einer Weise, dass sie im Vergleich zur Hydrophilie der dem Wellbereich gegenüberliegenden Strömungskanaloberfläche hydrophiler ist, eine Hydrophiliebeziehung von gegenüberliegenden Strömungskanaloberflächen, sodass die vorstehend beschriebenen unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten des Fluids vermieden werden können und sodass eine Frontfläche oder Frontlinie eines Fluidvolumens, das innerhalb des Strömungskanals der mikrofluidischen Vorrichtung fließt, eine im Wesentlichen aufrechte Lage/vertikale Ausrichtung einnimmt. Mit anderen Worten strömt ein Kontaktbereich einer Front eines anfänglich eingefüllten Fluids mit der zweiten Strömungskanaloberfläche des Strömungskanals, wobei das Fluid in die Einlassöffnung eingetragen wird und durch den Strömungskanal in Richtung der Auslassöffnung strömt, mit einer höheren Geschwindigkeit durch den Strömungskanal als der Kontaktbereich der Front des anfänglich eingefüllten Fluids mit der ersten Strömungskanaloberfläche, d. h., die Geschwindigkeit des Stroms des anfänglich eingefüllten Fluids, der über die Oberfläche der Wells strömt, ist höher als die Geschwindigkeit des anfänglich eingefüllten Fluids, das der gegenüber dem Wellbereich angeordneten inneren Seitenoberfläche des Strömungskanals folgt. Dies führt dazu, dass das Befüllen der Wells mit dem anfänglich eingefüllten Fluid schneller erfolgt als das allgemeine Befüllen des Strömungskanals selbst, wodurch das Einschließen von Luftblasen unter dem eingefüllten Fluid in den Wells verhindert wird, wenn das eingefüllte Fluid die Luftblasen in den Wells überdeckt. Somit ist die Fortbewegung von Fluid durch den Strömungskanal auf beiden Strömungskanaloberflächenseiten im Wesentlichen gleich, was dazu führt, dass die Wells vollständig mit Fluid befüllt werden können und das Einschließen von Luftblasen vermieden werden kann. Im Hinblick auf das Durchführen von digitaler PCR mit der vorliegenden erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung ist dies für das anfängliche Befüllen der Wells mit einem wässrigen dPCR-Reaktionsgemisch, auch als dPCR- oder PCR-Mastermix bezeichnet, wie z. B. LightCycler 480^® Mastermix, besonders wichtig, da das anfängliche Befüllen auf passive Weise durchgeführt wird und die verschiedenen Kapillarkräfte wichtig sind, während bei einem anschließenden Trennverfahren, bei dem die befüllten Wells fluidisch voneinander getrennt werden, aktiver Fülldruck ausgeübt wird. Dementsprechend führt durch Bereitstellen einer die Anordnung von Wells umfassenden Seite des Strömungskanals mit höherer Hydrophilie als die andere Seite die erhöhte Affinität zwischen der Seite des Strömungskanals mit der Anordnung von Wells und dem wässrigen dPCR-Reaktionsgemisch zu einer verbesserten Befüllleistung der mikrofluidischen Vorrichtung und somit zur Vermeidung von Blaseneinschlüssen. Mit anderen Worten ist es gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, die mikrofluidische Vorrichtung auf eine Weise zu konstruieren, dass die nicht mit Wells bedeckte Seite des Strömungskanals weniger affin gegenüber dem dPCR-Reaktionsgemisch ist als der Wellbereich, um ein blasenfreies Befüllen zu erreichen.Due to the filling of the wells provided in the first flow channel surface, the initially filled fluid typically flows faster at the second flow channel surface, which does not include wells, than at the first flow channel surface, which includes the array of wells. Thus, the fluid flowing through the flow channel during the initial filling flows faster at the second flow channel surface than at the first flow channel surface, which results in the fluid being able to entrap gas in the wells to be filled during the filling of the wells, resulting in the undesirable entrapment of gas bubbles. In the microfluidic device of the present invention, modifying an inner surface of the well region of the microfluidic device in the first flow channel surface in a manner that is more hydrophilic compared to the hydrophilicity of the flow channel surface opposite the well region causes a hydrophilic relationship of opposing flow channel surfaces so that the above-described different flow velocities of the fluid can be avoided and so that a front surface or front line of a volume of fluid flowing within the flow channel of the microfluidic device assumes a substantially upright position/vertical orientation. In other words, a contact area of a front of an initially filled fluid with the second flow channel surface of the flow channel, the fluid being introduced into the inlet opening and flowing through the flow channel toward the outlet opening, flows through the flow channel at a higher speed than the contact area of the front of the initially filled fluid with the first flow channel surface, that is, the speed of the flow of the initially filled fluid flowing over the surface of the wells is higher than the speed of the initially filled fluid following the inner side surface of the flow channel disposed opposite the well area. This results in the filling of the wells with the initially filled fluid being faster than the general filling of the flow channel itself, thereby preventing the entrapment of air bubbles under the filled fluid in the wells when the filled fluid covers the air bubbles in the wells. Thus, the movement of fluid through the flow channel is substantially equal on both flow channel surface sides, resulting in that the wells can be completely filled with fluid and the entrapment of air bubbles can be avoided. With regard to performing digital PCR with the present inventive microfluidic device, this is particularly important for the initial filling of the wells with an aqueous dPCR reaction mixture, also referred to as dPCR or PCR master mix, such as LightCycler 480 ^® Mastermix, since the initial filling is carried out in a passive manner and the various capillary forces are important, while active filling pressure is exerted in a subsequent separation process in which the filled wells are fluidically separated from each other. Accordingly, by providing one side of the flow channel comprising the array of wells with higher hydrophilicity than the other side, the increased affinity between the side of the flow channel with the array of wells and the aqueous dPCR reaction mixture leads to an improved filling performance of the microfluidic device and thus to the prevention of bubble entrapment. In other words, according to the present invention, it is advantageous to construct the microfluidic device in such a way that the side of the flow channel not covered with wells has less affinity to the dPCR reaction mixture than the well region in order to achieve bubble-free filling.

Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die erste Hydrophilie und/oder die zweite Hydrophilie entweder durch Materialeigenschaften der mikrofluidischen Vorrichtung, durch Oberflächenbehandlung der ersten Strömungskanaloberfläche und/oder der zweiten Strömungskanaloberfläche, wie mittels Plasmahydrophilisierungsbehandlung, oder durch eine hydrophile Beschichtung auf der ersten Strömungskanaloberfläche und/oder der zweiten Strömungskanaloberfläche, wie eine SiO₂-Beschichtung, bereitgestellt. Als Beispiel für Vergleichszwecke wurde im Rahmen eines von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experiments ein Wellbereich einer mikrofluidischen Vorrichtung mit einer SiO₂-Beschichtung beschichtet und mit einer mikrofluidischen Vorrichtung ohne jegliche Hydrophilisierungsbehandlung verglichen. Dann wurde LightCycler 480^® Mastermix mit 100 nM Fluorescein durch die Einlassöffnung und in den Strömungskanal in die mikrofluidische Vorrichtung gefüllt und anschließend innerhalb der Wells durch Pumpen eines Siegel- oder Trennfluids, wie Silikonfluid, z. B. PMX Silicon Fluid 200 50 cs, in den Strömungskanal versiegelt. Mit dem Experiment konnte nachgewiesen werden, dass bei der unbehandelten mikrofluidischen Vorrichtung kein oder nur unzureichendes passives Füllen beobachtet wurde, wohingegen das passive Füllen bei Verwendung der hydrophilierungsbehandelten mikrofluidischen Vorrichtung erfolgreich war und keine oder fast keine Gasblaseneinschlüsse auftraten.According to a specific embodiment of the present invention, the first hydrophilicity and/or the second hydrophilicity is provided either by material properties of the microfluidic device, by surface treatment of the first flow channel surface and/or the second flow channel surface, such as by plasma hydrophilization treatment, or by a hydrophilic coating on the first flow channel surface and/or the second flow channel surface, such as a SiO ₂ coating. As an example for comparison purposes, in an experiment conducted by the inventors of the present invention, a well region of a microfluidic device was coated with a SiO ₂ coating and compared to a microfluidic device without any hydrophilization treatment. LightCycler 480 ^® Mastermix with 100 nM fluorescein was then filled into the microfluidic device through the inlet opening and into the flow channel and subsequently sealed within the wells by pumping a sealing or separating fluid, such as silicone fluid, e.g. B. PMX Silicon Fluid 200 50 cs, sealed into the flow channel. The experiment demonstrated that no or only insufficient passive filling was observed with the untreated microfluidic device, whereas passive filling was observed when using the hydrophilic-treated microfluidic device. was successful and no or almost no gas bubble inclusions occurred.

Darüber hinaus kann die Form der Wells ein wichtiger Faktor sein, um Blaseneinschlüsse zu vermeiden. Dabei stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass eine runde Form eines Wells das Einschließen von - üblicherweise runden - Gasblasen unterstützt, da eine solche runde Gasblase tatsächlich ein vollständiges rundes Well mit vollem Randkontakt verschließen kann, wohingegen eine Form eines Wells, die eine Minimierung des Kontaktbereichs zwischen einer eingeschlossenen Gasblase und der Innenwand eines Wells bereitstellt, dazu führen kann, dass ein Blaseneinschluss zusätzlich vermieden werden kann, da ein derart verringerter Kontakt zwischen einer Gasblase und den Innenwänden eines Wells das Entfernen von Gasblasen aus den Wells unterstützt. Somit weist gemäß einer weiteren spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens ein Teil der Anordnung von Wells eine Wellform in der ersten Strömungskanaloberfläche in Form eines Hexagons auf, wobei alle Wells eine Wellform in der ersten Strömungskanaloberfläche in Form eines Hexagons aufweisen können. Unter „Wellform“ ist in diesem Sinne die Form eines Wells bei Betrachtung aus der Draufsicht auf die erste Strömungskanaloberfläche zu verstehen. Die Wahl einer hexagonalen Form der Wells bewirkt zusätzlich nicht nur den Effekt einer optimierten Wellgeometrie zum Verringern des Einschlusses von Gasblasen während des Füllverfahrens, sondern auch den Effekt, dass eine Anzahl von Wells und deren jeweiliges Innenvolumen maximiert werden kann, beispielsweise wenn die Anordnung hexagonaler Wells in einer Wabenstruktur in Betracht gezogen wird, die eine verbesserte Raumausnutzung in einem Gitter bereitstellt. Als ein Beispiel für übliche Abmessungen eines hexagonalen Wells einer mikrofluidischen Vorrichtung für dPCR kann die Form des hexagonalen Wells Abmessungen von Breite × Länge × Tiefe im Bereich von etwa 25 µm × 50 µm × 25 µm bis etwa 150 µm × 300 µm × 200 µm aufweisen. Dementsprechend kann jedes Well eine Welllänge in Strömungsrichtung in einem Bereich von 50 µm bis 300 µm und/oder eine Wellbreite senkrecht zur Welllänge in einem Bereich von 25 µm bis 150 µm und/oder eine Welltiefe in einem Bereich von 25 µm bis 200 µm aufweisen. Ferner kann es in dieser Hinsicht vorteilhaft sein, wenn die Wells eine Form eines länglichen Hexagons aufweisen, d. h. eine längliche oder gestreckte hexagonale Wellform, beispielsweise in der durch den Strömungskanal von der Einlassöffnung zur Auslassöffnung bestimmten Strömungsrichtung verlängert, wobei die längliche hexagonale Wellform zusätzlich den Kontakt zwischen einer Gasblase und den Innenwänden des Wells verringern kann und das Innenvolumen jedes Wells vergrößern kann.In addition, the shape of the wells can be an important factor in avoiding bubble entrapment. The inventors of the present invention found that a round shape of a well supports the entrapment of - usually round - gas bubbles, since such a round gas bubble can actually close a complete round well with full edge contact, whereas a shape of a well that provides a minimization of the contact area between a trapped gas bubble and the inner wall of a well can lead to bubble entrapment being additionally avoided, since such reduced contact between a gas bubble and the inner walls of a well supports the removal of gas bubbles from the wells. Thus, according to another specific embodiment of the present invention, at least part of the arrangement of wells has a corrugation in the first flow channel surface in the form of a hexagon, wherein all wells can have a corrugation in the first flow channel surface in the form of a hexagon. In this sense, "corrugation" is to be understood as the shape of a well when viewed from a top view of the first flow channel surface. In addition, choosing a hexagonal shape of the wells not only provides the effect of an optimized well geometry to reduce the entrapment of gas bubbles during the filling process, but also the effect that a number of wells and their respective internal volume can be maximized, for example when considering the arrangement of hexagonal wells in a honeycomb structure, which provides an improved space utilization in a grid. As an example of typical dimensions of a hexagonal well of a microfluidic device for dPCR, the shape of the hexagonal well may have dimensions of width × length × depth in the range of about 25 µm × 50 µm × 25 µm to about 150 µm × 300 µm × 200 µm. Accordingly, each well may have a well length in the flow direction in a range from 50 µm to 300 µm and/or a well width perpendicular to the well length in a range from 25 µm to 150 µm and/or a well depth in a range from 25 µm to 200 µm. Furthermore, it may be advantageous in this respect if the wells have a shape of an elongated hexagon, i.e. an elongated or elongated hexagonal well shape, for example extended in the flow direction determined by the flow channel from the inlet opening to the outlet opening, wherein the elongated hexagonal well shape can additionally reduce the contact between a gas bubble and the inner walls of the well and can increase the internal volume of each well.

Im Hinblick auf die spezifische Anordnung der hexagonalen Wells innerhalb der ersten Strömungskanaloberfläche stellt eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit, dass ein Vertex jedes hexagonalen Wells, auch als eine Ecke der hexagonalen Form des Wells bezeichnet, in der Strömungsrichtung ausgerichtet und der Seite der Einlassöffnung zugewandt ist, wobei zwei einander gegenüberliegend angeordnete Vertices/Ecken jedes hexagonalen Wells parallel zu der durch den Strömungskanal von der Einlassöffnung zur Auslassöffnung definierten Strömungsrichtung ausgerichtet sind. Da der Strömungskanal der mikrofluidischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung von der Seite der Einlassöffnung mit dem dPCR-Reaktionsgemisch befüllt wird, kann eine Ausrichtung eines Vertex jedes hexagonalen Wells an der Strömungsrichtung die Befüllleistung der mikrofluidischen Vorrichtung in dieser Hinsicht erheblich verbessern. Mit anderen Worten wird durch die Anordnung der Well-Hexagone derart, dass eine der sechs Ecken des Hexagons in die Befüllrichtung, d. h. in Richtung der Einlassöffnung, weist, der Kapillarsog von dieser Ecke verbessert, was das anfängliche Befüllen des Wells mit dPCR-Reaktionsgemisch erheblich erleichtert. Dementsprechend ist die hexagonale Geometrie der Wells optimalerweise auf eine Weise gewählt, die das Befüllen des Strömungskanals durch Kapillarkraft unterstützt, insbesondere durch Bereitstellen einer Ecke des Hexagons in Strömungsrichtung, was die Eintragung von Fluid in jedes Well erleichtert und insbesondere verhindert, dass das eingetragene Fluid einfach über das Well strömt, ohne dieses zu befüllen. In dieser besonderen Hinsicht kann eine längliche hexagonale Wellform im Vergleich zu einer isohexagonalen Form vorteilhafter sein, da eine längliche hexagonale Wellform im Falle eines Gasblaseneinschlusses, wie bereits vorstehend beschrieben, nicht nur die Kontaktfläche einer Blase mit den Innenwänden des Wells verringern kann, sondern auch den Effekt erreichen kann, dass große Gasblasen in eine längliche Form gezwungen werden, was energetisch ungünstig ist und das Austreten der Blase aus dem Well erleichtert. Ein derartiger Effekt kann bei Verwendung einer runden oder isohexagonalen Wellform nicht erreicht werden.With regard to the specific arrangement of the hexagonal wells within the first flow channel surface, a specific embodiment of the present invention provides that a vertex of each hexagonal well, also referred to as a corner of the hexagonal shape of the well, is oriented in the flow direction and faces the inlet opening side, wherein two oppositely arranged vertices/corners of each hexagonal well are oriented parallel to the flow direction defined by the flow channel from the inlet opening to the outlet opening. Since the flow channel of the microfluidic device of the present invention is filled with the dPCR reaction mixture from the inlet opening side, aligning a vertex of each hexagonal well with the flow direction can significantly improve the filling performance of the microfluidic device in this regard. In other words, by arranging the well hexagons such that one of the six corners of the hexagon faces the filling direction, i.e. towards the inlet opening, the capillary suction from this corner is improved, which greatly facilitates the initial filling of the well with dPCR reaction mixture. Accordingly, the hexagonal geometry of the wells is optimally chosen in a way that supports the filling of the flow channel by capillary force, in particular by providing a corner of the hexagon in the flow direction, which facilitates the introduction of fluid into each well and in particular prevents the introduced fluid from simply flowing over the well without filling it. In this particular respect, an elongated hexagonal well shape may be more advantageous compared to an isohexagonal shape, since in the case of gas bubble entrapment, as already described above, an elongated hexagonal well shape may not only reduce the contact area of a bubble with the inner walls of the well, but may also achieve the effect of forcing large gas bubbles into an elongated shape, which is energetically unfavorable and facilitates the exit of the bubble from the well. Such an effect cannot be achieved when using a round or isohexagonal waveform.

Gemäß einer weiteren spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine der Seite der Einlassöffnung zugewandte Kante jedes Wells in der ersten Strömungskanaloberfläche eine abgerundete Kante. Der Begriff „abgerundete Kante“ bezieht sich hier auf eine Kante zwischen der ersten Strömungskanaloberfläche und der Innenwand des Wells, wobei die Kante keine scharfe Ecke bereitstellt, sondern eine gekrümmte Oberfläche aufweist, d. h. eine Kurve, die die Strömungskanaloberfläche und die entsprechende Innenwand des Wells verbindet. Das Versehen jedes Wells mit einer derartigen abgerundeten Kante kann die Fülleigenschaften jedes Wells erheblich verbessern und dadurch das ausreichende Befüllen jedes Wells mit dem dPCR-Reaktionsgemisch weiter verbessern. Als Beispiel für eine solche gekrümmte Kantenoberfläche kann jede abgerundete Wellkante mit einem Radius von weniger als (<) 10 µm abgerundet sein. Alternativ oder zusätzlich kann zwischen benachbarten Wells ein Rand zur fluidischen Trennung der benachbarten Wells bereitgestellt sein. Unter einem Rand ist in diesem Zusammenhang ein Stück der ersten Strömungskanaloberfläche zu verstehen, das benachbarte Wells voneinander trennt, wobei ein derartiger Rand eine Breite oder Dicke von mehr als (>) 10 µm aufweisen kann, um zum weiteren Verbessern der fluidischen Trennung zwischen benachbarten Wells nach dem Befüllen derselben einen ausreichenden Abstand zwischen benachbarten Wells zu erreichen. Dementsprechend wird eine spezifische Geometrie eines Rands zwischen benachbarten Wells derart implementiert, dass fluidische Schichten zwischen der ersten Strömungskanaloberfläche und einem Trennfluid ausreichend unterdrückt werden. Dadurch kann eine fluidische Trennung zwischen benachbarten Wells nach dem Befüllen gewährleistet werden. Zusätzlich kann die chemische Zusammensetzung des dPCR-Reaktionsgemisches auf eine Weise verändert werden, dass keine fluidischen Brücken über dem Randbereich auftreten können.According to a further specific embodiment of the present invention, an edge of each well in the first flow channel surface facing the side of the inlet opening is a rounded edge. The term "rounded edge" refers here to an edge between the first flow channel surface and the inner wall of the well, wherein the edge does not provide a sharp corner, but has a curved surface, i.e. a curve connecting the flow channel surface and the corresponding inner wall of the well. Providing each well with such a A sufficiently rounded edge can significantly improve the filling properties of each well and thereby further improve the sufficient filling of each well with the dPCR reaction mixture. As an example of such a curved edge surface, each rounded well edge can be rounded with a radius of less than (<) 10 µm. Alternatively or additionally, a rim can be provided between adjacent wells for fluidic separation of the adjacent wells. In this context, an rim is understood to mean a piece of the first flow channel surface that separates adjacent wells from one another, wherein such an rim can have a width or thickness of more than (>) 10 µm in order to achieve a sufficient distance between adjacent wells to further improve the fluidic separation between adjacent wells after filling thereof. Accordingly, a specific geometry of an rim between adjacent wells is implemented such that fluidic layers between the first flow channel surface and a separation fluid are sufficiently suppressed. This can ensure fluidic separation between adjacent wells after filling. In addition, the chemical composition of the dPCR reaction mixture can be changed in such a way that no fluidic bridges can occur over the edge region.

Gemäß einer weiteren spezifischen Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung liegt ein Aspektverhältnis h/l zwischen einer Höhe h des Strömungskanals und der Länge l jedes Wells in einem Bereich zwischen 0,3 und 0,7, beispielsweise bei etwa 0,5, was ein optimales Aspektverhältnis h/l bereitstellt, um zusätzlich zu den bereits diesbezüglich beschriebenen Merkmalen eine ausreichende fluidische Trennung zwischen benachbarten befüllten Wells gewährleisten zu können. Beispielsweise kann die Höhe h des Strömungskanals in einem Bereich von 25 µm bis 200 µm liegen und eine Welllänge l kann in einem Bereich von 50 µm bis 300 µm liegen, wobei innerhalb dieser Bereiche das vorstehend definierte Aspektverhältnis eingehalten werden sollte. Zur Veranschaulichung würde ein Aspektverhältnis h/l von weniger als 0,3 zu einem Befüllen der Wells mit zu geringem Fluidvolumen führen, wohingegen ein Aspektverhältnis h/l von etwa 1,0 ebenfalls zu ausreichend gefüllten Wells führen könnte, allerdings mit dem Problem, dass benachbarte Wells nicht mehr ausreichend fluidisch voneinander getrennt sind. Im Allgemeinen ist in dieser Hinsicht unter der Länge l jedes Wells die Längsausdehnung eines Wells parallel zur Strömungsrichtung zu verstehen und unter der Höhe h des Strömungskanals ist der Abstand zwischen der ersten Strömungskanaloberfläche und der zweiten Strömungskanaloberfläche des Strömungskanals der mikrofluidischen Vorrichtung zu verstehen. Um eine angemessene Trennung der Wells zu erreichen, muss die Kanalhöhe h kleiner als die Welllänge l sein, sodass - aufgrund der Oberflächenspannungskräfte - ein Teil des anfänglich eingefüllten dPCR-Reaktionsgemisches aus jedem Well herausgedrückt wird. Dementsprechend wird die Kanalhöhe h innerhalb des gegebenen Aspektverhältnisses geändert, um eine klare Trennung der Wells mit nur minimaler Verdrängung des dPCR-Reaktionsgemisches aus dem Well zu ermöglichen.According to a further specific embodiment of the microfluidic device of the present invention, an aspect ratio h/l between a height h of the flow channel and the length l of each well is in a range between 0.3 and 0.7, for example approximately 0.5, which provides an optimal aspect ratio h/l in order to be able to ensure sufficient fluidic separation between adjacent filled wells in addition to the features already described in this regard. For example, the height h of the flow channel can be in a range from 25 µm to 200 µm and a well length l can be in a range from 50 µm to 300 µm, within which ranges the aspect ratio defined above should be maintained. To illustrate, an aspect ratio h/l of less than 0.3 would result in the wells being filled with too little fluid volume, whereas an aspect ratio h/l of about 1.0 could also result in sufficiently filled wells, but with the problem that neighboring wells are no longer sufficiently fluidically separated from each other. In general, in this respect, the length l of each well is to be understood as the longitudinal extent of a well parallel to the flow direction and the height h of the flow channel is to be understood as the distance between the first flow channel surface and the second flow channel surface of the flow channel of the microfluidic device. In order to achieve adequate separation of the wells, the channel height h must be smaller than the well length l, so that - due to surface tension forces - part of the initially filled dPCR reaction mixture is pressed out of each well. Accordingly, the channel height h is changed within the given aspect ratio to enable a clear separation of the wells with only minimal displacement of the dPCR reaction mixture from the well.

Gemäß einer anderen spezifischen Ausführungsform der mikrofluidischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung besteht die mikrofluidische Vorrichtung aus zwei aneinander befestigbaren Teilen, wobei die Vorrichtung entlang deren Längsachse in die beiden Teile geteilt ist. Genauer gesagt ist der Strömungskanal mit der Anordnung von Wells in einem Teil der Vorrichtung bereitgestellt, das die erste Strömungskanaloberfläche bereitstellt, wie ein Substrat, und das andere Teil stellt ein Abdeckteil dar, das die zweite Strömungskanaloberfläche sowie die Einlassöffnung und die Auslassöffnung bereitstellt, vorzugsweise eine flache Komponente in Form einer dünnen Abdeckfolie, die den Strömungskanal abdeckt und einen Einlass zum Einströmen von Fluid in den Strömungskanal und einen Auslass zum Ausströmen von Fluid aus dem Strömungskanal bereitstellt. Alternativ können die Einlassöffnung und die Auslassöffnung auch in dem die erste Strömungskanaloberfläche bereitstellenden Teil der Vorrichtung bereitgestellt sein, wobei in diesem Fall das andere Teil der Vorrichtung lediglich ein Abdeckteil, beispielsweise in Form einer dünnen Abdeckfolie, darstellt. Eine derartige mikrofluidische Vorrichtung kann für digitale PCR, dPCR oder biochemische Assays einer Probe verwendet werden, die in Form eines Reaktionsgemisches mittels des Strömungskanals in jedem der Wells bereitgestellt wird. Hier kann das dPCR-Reaktionsgemisch mit einem Detergens, wie TWEEN^® 20 bereitgestellt werden, um die verbesserte Befüllbarkeit der mikrofluidischen Vorrichtung zu unterstützen, d. h., die chemische Zusammensetzung des wässrigen dPCR-Reaktionsgemisches wurde auf eine Weise eingestellt, dass das Füllverfahren, beispielsweise mittels Zugeben des Detergens, erleichtert wird.According to another specific embodiment of the microfluidic device of the present invention, the microfluidic device consists of two parts attachable to each other, the device being divided into the two parts along its longitudinal axis. More specifically, the flow channel with the arrangement of wells is provided in a part of the device providing the first flow channel surface, such as a substrate, and the other part represents a cover part providing the second flow channel surface as well as the inlet opening and the outlet opening, preferably a flat component in the form of a thin cover film covering the flow channel and providing an inlet for fluid to flow into the flow channel and an outlet for fluid to flow out of the flow channel. Alternatively, the inlet opening and the outlet opening can also be provided in the part of the device providing the first flow channel surface, in which case the other part of the device merely represents a cover part, for example in the form of a thin cover film. Such a microfluidic device can be used for digital PCR, dPCR or biochemical assays of a sample provided in the form of a reaction mixture by means of the flow channel in each of the wells. Here, the dPCR reaction mixture can be provided with a detergent such as TWEEN ^® 20 to support the improved fillability of the microfluidic device, ie, the chemical composition of the aqueous dPCR reaction mixture has been adjusted in a way that facilitates the filling process, for example by adding the detergent.

Mit anderen Worten können zum Bereitstellen einer mikrofluidischen Vorrichtung, die ein zuverlässiges Befüllen jedes Wells gewährleisten kann, (a) eine Abdeckfolie oder -platte mit geringerer Affinität gegenüber dem dPCR-Reaktionsgemisch, (b) eine bestimmte Wellform, Konstruktion des Wells und Ausrichtung und (c) ein bestimmtes Aspektverhältnis von Strömungskanalhöhe h zu Welllänge l eine erhebliche Verbesserung beim Verlangsamen des anfänglichen Fluidstroms während des Befüllens bereitstellen, was ermöglicht, dass die Flüssigkeit die Wells über einen längeren Zeitraum als sonst füllt, sowie auch bei der anschließenden Trennung benachbarter befüllter Wells. In dieser Hinsicht wird üblicherweise nach dem anfänglichen Befüllen von Teilen des Strömungskanals und einiger der Wells ein mit dem dPCR-Reaktionsgemisch nicht mischbares Siegelfluid durch den Strömungskanal gedrückt, wobei das Siegelfluid das dPCR-Reaktionsgemisch durch den Rest des Strömungskanals und in die verbleibenden Wells drückt, die somit ebenfalls befüllt werden. Darüber hinaus drückt das Siegelfluid das gesamte nicht in die Wells gefüllte dPCR-Reaktionsgemisch aus dem Strömungskanal und trennt die gefüllten Wells fluidisch voneinander. Um, wie vorstehend erwähnt, eine angemessene Trennung der Wells zu erreichen, sollte die Strömungskanalhöhe etwa die Hälfte der Länge eines Wells betragen und die Wells müssen durch einen Rand mit einer bestimmten Breite getrennt sein, um die Trennungsfähigkeit der mikrofluidischen Vorrichtung weiter zu verbessern. Zusätzlich kann die Geschwindigkeit des Trennungsverfahrens, d. h. die Kraft, mit der das zweite Fluid durch den Strömungskanal gedrückt wird, erhöht sein, um die Verdrängung von dPCR-Reaktionsgemisch aus den Wells zu minimieren. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass das Verhältnis von Hydrophilie der Innenflächen des Strömungskanals einen größeren Einfluss auf die Verbesserung des anfänglichen Befüllens der Wells mit dPCR-Reaktionsgemisch zu haben scheint, wohingegen das Aspektverhältnis von Strömungskanalhöhe zu Welllänge nicht nur das anfängliche Befüllen der Wells mit dPCR-Reaktionsgemisch verbessert, sondern aufgrund der unterschiedlichen Dynamik des passiven anfänglichen Befüllens von Wells basierend auf verschiedenen „Zugkräften“ angesichts der aktiven Druckausübung während der Trennung auch eine erhebliche Verbesserung der Trennbarkeit von benachbarten Wells voneinander mit dem Siegel- oder Trennfluid bereitstellt. Daher kann mit der hier vorgestellten mikrofluidischen Vorrichtung eine Gesamtverbesserung der Eigenschaften beim anfänglichen Füllen sowie beim anschließenden Versiegelungsverfahren erreicht werden.In other words, to provide a microfluidic device that can ensure reliable filling of each well, (a) a cover film or plate with lower affinity to the dPCR reaction mixture, (b) a particular well shape, well design and orientation, and (c) a particular aspect ratio of flow channel height h to well length l can provide a significant improvement in slowing the initial fluid flow during filling, allowing the liquid to fill the wells for a longer period of time than otherwise. fills, as well as in the subsequent separation of adjacent filled wells. In this regard, typically after the initial filling of parts of the flow channel and some of the wells, a sealing fluid immiscible with the dPCR reaction mixture is forced through the flow channel, whereby the sealing fluid forces the dPCR reaction mixture through the rest of the flow channel and into the remaining wells, which are thus also filled. In addition, the sealing fluid forces all the dPCR reaction mixture not filled into the wells out of the flow channel and fluidically separates the filled wells from each other. As mentioned above, to achieve adequate separation of the wells, the flow channel height should be about half the length of a well and the wells must be separated by a rim of a certain width to further improve the separation capability of the microfluidic device. Additionally, the speed of the separation process, i.e., the force with which the second fluid is pushed through the flow channel, may be increased to minimize the displacement of dPCR reaction mixture from the wells. In general, it was found that the ratio of hydrophilicity of the inner surfaces of the flow channel seems to have a greater impact on improving the initial filling of the wells with dPCR reaction mixture, whereas the aspect ratio of flow channel height to well length not only improves the initial filling of the wells with dPCR reaction mixture, but also provides a significant improvement in the separability of neighboring wells from each other with the sealing or separation fluid due to the different dynamics of the passive initial filling of wells based on different “pulling forces” in the face of the active pressure application during separation. Therefore, an overall improvement in the properties during the initial filling as well as the subsequent sealing process can be achieved with the microfluidic device presented here.

Wie hier und in den anhängenden Ansprüchen verwendet, schließen die Singularformen „ein“, „eine“ und „der/die/das“ Pluralformen ein, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Ebenso sind die Wörter „umfassen“, „enthalten“ und „beinhalten“ als einschließend und nicht ausschließend auszulegen; das heißt im Sinne von „einschließlich, aber nicht beschränkt auf“. Ebenso soll das Wort „oder“ auch „und“ einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes angibt. Die Begriffe „Vielzahl“, „mehrere“ oder „Mehrzahl“ beziehen sich auf zwei oder mehr, also 2 oder > 2, mit ganzzahligen Vielfachen, wobei sich die Begriffe „einzeln“ oder „einzig“ auf eins beziehen, d. h. = 1. Des Weiteren ist unter „mindestens eins“ eins oder mehrere, also 1 oder > 1, auch mit ganzzahligen Vielfachen, zu verstehen. Dementsprechend schließen Wörter, die die Singular- oder Pluralzahl verwenden, auch die Plural- bzw. Singularzahl ein. Zusätzlich beziehen sich die Wörter „hierin“, „vorstehend“, „zuvor“ und „nachstehend“ und Wörter mit ähnlicher Bedeutung, wenn in dieser Beschreibung verwendet, auf die Beschreibung als Ganzes und nicht auf bestimmte Abschnitte der Beschreibung.As used herein and in the appended claims, the singular forms “a,” “an,” and “the” include plural forms unless the context clearly dictates otherwise. Likewise, the words “comprise,” “include,” and “include” are intended to be inclusive and not exclusive; that is, to mean “including, but not limited to.” Likewise, the word “or” is intended to include “and,” unless the context clearly dictates otherwise. The terms “plurality,” “several,” or “plurality” refer to two or more, i.e., 2 or > 2, with integer multiples, where the terms “single” or “only” refer to one, i.e., = 1. Furthermore, “at least one” is intended to mean one or more, i.e., 1 or > 1, also with integer multiples. Accordingly, words that use the singular or plural number also include the plural or singular number, respectively. In addition, the words "herein," "above," "previously," and "hereinafter," and words of similar meaning, when used in this specification, refer to the specification as a whole and not to specific portions of the specification.

Des Weiteren werden bestimmte Begriffe aus Gründen der Zweckmäßigkeit verwendet und sollen die vorliegende Erfindung nicht einschränken. Die Begriffe „rechts“, „links“, „oben“, „unten“, „unter“ und „über“ beziehen sich auf Richtungen in den Figuren. Die Terminologie umfasst die explizit genannten Begriffe sowie deren Ableitungen und Begriffe mit ähnlicher Bedeutung. Auch räumlich bezogene Begriffe wie „unterhalb“, „unter“, „untere“, „über“, „obere“, „proximal“, „distal“ und dergleichen können verwendet werden, um die Beziehung eines Elements oder Merkmals zu einem anderen Element oder Merkmal, wie in den Figuren dargestellt, zu beschreiben. Diese räumlich bezogenen Begriffe sollen zusätzlich zu der in den Figuren gezeigten Position und Ausrichtung unterschiedliche Positionen und Ausrichtungen der Vorrichtungen im Einsatz oder Betrieb beinhalten. Wenn beispielsweise eine Vorrichtung in den Figuren auf dem Kopf steht, wären Elemente, die als „unter“ oder „unterhalb von“ anderen Elementen oder Merkmalen beschrieben werden, „über“ oder „oberhalb von“ den anderen Elementen oder Merkmalen ausgerichtet. Somit kann der beispielhafte Begriff „unter“ Positionen und Ausrichtungen sowohl „über“ als auch „unter“ beinhalten. Die Vorrichtungen können anderweitig ausgerichtet sein (um 90 Grad oder in anderen Ausrichtungen gedreht), und die hierin verwendeten räumlichen Beziehungsbezeichnungen können entsprechend ausgelegt werden.Furthermore, certain terms are used for convenience and are not intended to limit the present invention. The terms "right," "left," "top," "bottom," "below," and "over" refer to directions in the figures. The terminology includes the explicitly stated terms as well as derivatives thereof and terms of similar meaning. Also, spatially related terms such as "below," "under," "lower," "over," "upper," "proximal," "distal," and the like may be used to describe the relationship of one element or feature to another element or feature as shown in the figures. These spatially related terms are intended to include different positions and orientations of the devices in use or operation, in addition to the position and orientation shown in the figures. For example, if a device in the figures is upside down, elements described as "below" or "below" other elements or features would be oriented "above" or "above" the other elements or features. Thus, the exemplary term "under" can include positions and orientations both "above" and "below." The devices can be oriented differently (rotated 90 degrees or in other orientations), and the spatial relationship terms used herein can be interpreted accordingly.

Um Wiederholungen in den Figuren und den Beschreibungen der verschiedenen Aspekte und veranschaulichenden Ausführungsformen zu vermeiden, ist zu verstehen, dass viele Merkmale vielen Aspekten und Ausführungsformen gemeinsam sind. Die Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Offenbarung erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit und soll die Offenbarung nicht auf die genaue offenbarte Form beschränken. Obwohl die spezifischen Ausführungsformen und Beispiele der Offenbarung hierin zur Veranschaulichung beschrieben sind, sind verschiedene gleichwertige Modifikationen im Rahmen des Umfangs der Offenbarung, wie er in den anhängenden Ansprüchen definiert ist, möglich, wie der Fachmann auf dem betreffenden Gebiet erkennen wird. Bestimmte Elemente der vorstehenden Ausführungsformen können kombiniert oder durch Elemente anderer Ausführungsformen ersetzt werden. Darüber hinaus wurden im Kontext dieser Ausführungsformen zwar Vorteile beschrieben, die mit bestimmten Ausführungsformen der Offenbarung verbunden sind, doch auch andere Ausführungsformen können derartige Vorteile aufweisen und nicht alle Ausführungsformen müssen notwendigerweise derartige Vorteile aufweisen, um in den Umfang der Offenbarung, wie er in den anhängenden Ansprüchen definiert ist, zu fallen. Das Weglassen eines Aspekts aus einer Beschreibung oder Figur bedeutet nicht, dass der Aspekt in Ausführungsformen fehlt, die diesen Aspekt beinhalten. Stattdessen wurde der Aspekt möglicherweise aus Gründen der Klarheit und zur Vermeidung von Weitschweifigkeit weggelassen. In diesem Zusammenhang gilt für den Rest dieser Beschreibung Folgendes: Wenn eine Figur zur Verdeutlichung der Zeichnungen Bezugszeichen enthält, die nicht in dem unmittelbar zugehörigen Teil der Beschreibung erläutert sind, wird auf vorhergehende oder nachfolgende Abschnitte der Beschreibung verwiesen. Wenn in einem Abschnitt einer Zeichnung ferner aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht alle Merkmale eines Teils mit Bezugszeichen versehen sind, wird auf andere Abschnitte derselben Zeichnung verwiesen. Gleiche Zahlen in zwei oder mehr Figuren stellen gleiche oder ähnliche Elemente dar.To avoid repetition in the figures and the descriptions of the various aspects and illustrative embodiments, it is to be understood that many features are common to many aspects and embodiments. The description of specific embodiments of the disclosure is not intended to be exhaustive and is not intended to limit the disclosure to the precise form disclosed. Although the specific embodiments and examples of the disclosure are described herein for illustration purposes, various equivalent modifications are possible within the scope of the disclosure as defined in the appended claims, as will be appreciated by those skilled in the art. Certain elements of the foregoing embodiments may be combined or replaced with elements of other embodiments. Moreover, while advantages have been described in the context of these embodiments, ben associated with particular embodiments of the disclosure, but other embodiments may also have such advantages and not all embodiments must necessarily have such advantages to fall within the scope of the disclosure as defined in the appended claims. The omission of an aspect from a description or figure does not mean that the aspect is absent from embodiments incorporating that aspect. Rather, the aspect may have been omitted for the sake of clarity and to avoid prolixity. In this context, the following applies to the remainder of this description: When a figure contains reference numerals for the purpose of clarifying the drawings that are not explained in the immediately related part of the description, reference is made to preceding or subsequent sections of the description. Furthermore, when in a section of a drawing not all features of a part are provided with reference numerals for the sake of clarity, reference is made to other sections of the same drawing. Like numbers in two or more figures represent like or similar elements.

Die folgenden Beispiele sollen verschiedene spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Daher sind die im Folgenden erörterten spezifischen Modifikationen nicht als Einschränkungen des Umfangs der vorliegenden Erfindung aufzufassen. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass verschiedene Äquivalente, Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, und es versteht sich somit, dass derartige äquivalenten Ausführungsformen hierin eingeschlossen sind. Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung besonderer, in den Figuren dargestellter Ausführungsformen.The following examples are intended to illustrate various specific embodiments of the present invention. Therefore, the specific modifications discussed below are not to be construed as limitations on the scope of the present invention. It will be apparent to those skilled in the art that various equivalents, changes and modifications can be made without departing from the scope of the present invention, and it is therefore to be understood that such equivalent embodiments are included herein. Further aspects and advantages of the present invention will become apparent from the following description of particular embodiments illustrated in the figures.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGENBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

1 is an exploded schematic view of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention;
2a -d are schematic representations of a movement of an aqueous fluid through a flow channel with an exemplary well of the microfluidic device of 1 in a cross-sectional view with similar hydrophilicity of the inner surfaces of the flow channel for comparison purposes;
3a -d are schematic representations of a movement of a fluid through a flow channel with an exemplary well of the microfluidic device of 1 in a cross-sectional view with different hydrophilicity of the inner surfaces of the flow channel according to the present invention;
4a -c are schematic representations of an array of hexagonal wells of a microfluidic device in top view with different degrees of extension of the hexagonal wells for size comparison;
5a -c are schematic representations of one of the hexagonal wells from 4a -c in cross-section along lines AA, BB and CC, as shown in the 4a -c shown for comparison of aspect ratio;
6a -d are schematic representations of the movement of a separation or sealing fluid through a flow channel with wells made of 4a and 5a in cross section according to the present invention;
7a -d are schematic representations of a movement of a fluid through a flow channel with an exemplary well made of 4b and 5b in cross section;
8a -d are schematic representations of a movement of a fluid through a flow channel with an exemplary well made of 4c and 5c in cross section; and
9a and b are schematic representations of different hexagonal well dimensions in plan view with a gas bubble enclosed within for comparison.

LISTE DER BEZUGSZEICHENLIST OF REFERENCE SIGNS

11: mikrofluidische Vorrichtungmicrofluidic device
22: SubstratSubstrat
33: StrömungskanalFlow channel
3131: erste Strömungskanaloberflächefirst flow channel surface
31'31': erste Strömungskanaloberflächefirst flow channel surface
3232: längliches hexagonales Mikrowellelongated hexagonal microwave
32'32': isohexagonales Mikrowellisohexagonal microwave
32"32": mehr oder stärker verlängertes hexagonales Mikrowellmore or more elongated hexagonal microwell
321321: MikrowellvertexMicrowavevertex
322322: MikrowellkanteMicrowave edge
3333: Rand zwischen MikrowellsEdge between microwaves
44: Abdeckungcover
4141: zweite Strömungskanaloberflächesecond flow channel surface
41'41': zweite Strömungskanaloberflächesecond flow channel surface
4242: EinlassöffnungInlet opening
4343: AuslassöffnungOutlet opening
55: dPCR-ReaktionsgemischdPCR reaction mixture
5151: Frontlinie/-fläche des dPCR-ReaktionsgemischesFront line/area of the dPCR reaction mixture
66: Gas-/LuftblaseGas/air bubble
77: Trenn-/SiegelfluidSeparating/sealing fluid

DETAILLIERTE BESCHREIBUNGDETAILED DESCRIPTION

1 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 1 gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mittels einer explodierten perspektivischen Ansicht. Die mikrofluidische Vorrichtung 1 umfasst grundsätzlich zwei Teile, nämlich ein Substrat 2 und eine Abdeckung 4 in Form einer Platte oder Folie, wobei die Teile 2, 4 aneinander befestigt werden können. In einer Oberfläche des Substrats 2 ist ein Strömungskanal 3 bereitgestellt, wobei der Strömungskanal 3 eine erste Strömungskanaloberfläche 31 bereitstellt, in die eine Anordnung von hexagonalen Wells/Mikrowells 32 in Form einer beispielhaften Wabenstruktur eingebracht ist, wobei ein Bereich, in dem die Anordnung von Wells 32 angeordnet ist, auch als Strömungskammer der mikrofluidischen Vorrichtung 1 bezeichnet wird. Aus Gründen der Veranschaulichung ist hier nur eine kleine Anzahl von leeren Wells 32 innerhalb der Strömungskammer gezeigt. 1 shows a schematic representation of a microfluidic device 1 according to a specific embodiment of the present invention by means of an exploded perspective view. The microfluidic device 1 basically comprises two parts, namely a substrate 2 and a cover 4 in the form of a plate or foil, wherein the parts 2, 4 can be attached to each other. A flow channel 3 is provided in a surface of the substrate 2, wherein the flow channel 3 provides a first flow channel surface 31 into which an arrangement of hexagonal wells/microwells 32 in the form of an exemplary honeycomb structure is introduced, wherein an area in which the arrangement of wells 32 is arranged is also referred to as a flow chamber of the microfluidic device 1. For the sake of illustration, only a small number of empty wells 32 within the flow chamber are shown here.

Im Hinblick auf den Einschluss von Gasblasen ist die Form des Wells ein wichtiger Faktor. Wie bereits vorstehend beschrieben, unterstützt eine runde Form eines Wells den Einschluss von - in der Regel runden - Gasblasen, da eine solche runde Gasblase tatsächlich ein vollständiges rundes Well mit vollflächigem Randkontakt verschließen kann. Dementsprechend werden nicht runde Wells bevorzugt, da derartige Wellformen eine Minimierung des Kontaktbereichs zwischen einer eingeschlossenen Gasblase und der Innenwand eines Wells bereitstellen können. Hier ist eine längliche hexagonale Wellform gegenüber einer isohexagonalen Form vorteilhafter. Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführte Experimente führten zu dem Ergebnis, dass bei runden Wells etwa 40 % der Wells eingeschlossene Blasen enthielten und etwa > 80 % kleiner isohexagonaler Wells eingeschlossene Blasen enthielten, wohingegen nur > 1 % größerer hexagonalen Wells eingeschlossene Blasen enthielten und nur eine signifikante Anzahl von weniger als 0,01 % länglicher hexagonaler Wells, wie des Wells 32 der mikrofluidischen Vorrichtung 1, eingeschlossene Blasen enthielt. Als veranschaulichendes Beispiel zeigt 9a eine isohexagonale Form eines Wells 32', in dem eine Gasblase 6 eingeschlossen ist, wobei die Blase 6 immer noch sechs Kontaktpunkte 61 mit der Innenwand des Wells erreichen kann, während eine längliche hexagonale Form des Wells 32 der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 1 die Anzahl der potenziellen Gasblasenkontaktpunkte 61 auf zwei reduziert, siehe 9b. Dementsprechend kann eine längliche hexagonale Form des Wells 32 den Oberflächenkontakt der Blase 6 mit den Innenwänden des Wells 32 im Falle eines Gasblaseneinschlusses verringern. Außerdem würden größere Gasblasen bei einer derartigen länglichen Wellform in eine längliche Form gezwungen, was energetisch ungünstig ist und somit das Austreten der Blase 6 aus dem Well 32 erleichtert.With regard to the entrapment of gas bubbles, the shape of the well is an important factor. As already described above, a round shape of a well supports the entrapment of - usually round - gas bubbles, since such a round gas bubble can actually close a complete round well with full-surface edge contact. Accordingly, non-round wells are preferred, since such well shapes can provide a minimization of the contact area between an enclosed gas bubble and the inner wall of a well. Here, an elongated hexagonal well shape is more advantageous than an isohexagonal shape. Experiments conducted by the inventors of the present invention resulted in the result that for round wells, about 40% of the wells contained trapped bubbles and about > 80% of small isohexagonal wells contained trapped bubbles, whereas only > 1% of larger hexagonal wells contained trapped bubbles and only a significant number of less than 0.01% of elongated hexagonal wells, such as well 32 of the microfluidic device 1, contained trapped bubbles. As an illustrative example, 9a an isohexagonal shape of a well 32' in which a gas bubble 6 is enclosed, whereby the bubble 6 can still reach six contact points 61 with the inner wall of the well, while an elongated hexagonal shape of the well 32 of the microfluidic device 1 according to the invention reduces the number of potential gas bubble contact points 61 to two, see 9b Accordingly, an elongated hexagonal shape of the well 32 can reduce the surface contact of the bubble 6 with the inner walls of the well 32 in the event of gas bubble entrapment. In addition, larger gas bubbles would be forced into an elongated shape with such an elongated well shape, which is energetically unfavorable and thus facilitates the escape of the bubble 6 from the well 32.

Ferner und unter erneuter Bezugnahme auf 1 stellt eine Oberfläche der Abdeckung 4, die gegenüber der erwähnten Oberfläche des Substrats 2 angeordnet ist, eine der ersten Strömungskanaloberfläche 31 gegenüberliegende zweite Strömungskanaloberfläche 41 bereit. Im Allgemeinen stellen das Substrat 2 und die Abdeckplatte 4, wenn sie aneinander befestigt sind, die mikrofluidische Vorrichtung 1 derart bereit, dass ein durchgehender Kanal hergestellt wird, der an einer Einlassöffnung 42 in der Abdeckung 4 beginnt und sich mit dem Strömungskanal 3, begrenzt durch die erste Strömungskanaloberfläche 31 und die zweite Strömungskanaloberfläche 41, fortsetzt und schließlich in der Auslassöffnung 43 endet, was auch eine Strömungsrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung 1 von der Einlassöffnung 42 zur Auslassöffnung 43 definiert, d. h. parallel zu einer Längsachse des Strömungskanals 3 innerhalb des Substrats 2. In der mikrofluidischen Vorrichtung 1 sind die Wells 32 in Strömungsrichtung ausgerichtet, was bedeutet, dass eine Längsachse der länglichen hexagonalen Form der Wells 32 parallel zur Strömungsrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung 1 angeordnet ist, d. h., ein Vertex 321 jedes hexagonalen Wells 32 ist in Strömungsrichtung ausgerichtet und zu der Seite der Einlassöffnung 42 gewandt, was die Befüllleistung der mikrofluidischen Vorrichtung 1 erheblich verbessert, da ein Kapillarsog vom Wellvertex 321 das Befüllen des Wells 32 erleichtert.Furthermore, and with further reference to 1 a surface of the cover 4, which is arranged opposite the mentioned surface of the substrate 2, provides a second flow channel surface 41 opposite the first flow channel surface 31. In general, the substrate 2 and the cover plate 4, when attached to each other, provide the microfluidic device 1 such that a continuous channel is established starting at an inlet opening 42 in the cover 4 and continuing with the flow channel 3, delimited by the first flow channel surface 31 and the second flow channel surface 41, and finally ending in the outlet opening 43, which also defines a flow direction of the microfluidic device 1 from the inlet opening 42 to the outlet opening 43, i.e. parallel to a longitudinal axis of the flow channel 3 within the substrate 2. In the microfluidic device 1, the wells 32 are aligned in the flow direction, which means that a longitudinal axis of the elongated hexagonal shape of the wells 32 is arranged parallel to the flow direction of the microfluidic device 1, i.e., a vertex 321 of each hexagonal well 32 is aligned in the flow direction and to the side of the inlet opening 42, which significantly improves the filling performance of the microfluidic device 1, since a capillary suction from the well vertex 321 facilitates the filling of the well 32.

Als Abmessungsbeispiel kann die mikrofluidische Vorrichtung, d. h. deren beiden Teile 2, 4, eine Gesamtlänge von etwa 75 mm und eine Gesamtbreite von etwa 25 mm aufweisen, wobei eine Breite am Strömungskanal 3 etwa 6 mm und eine Länge des mit Wells 32 bedeckten Bereichs des Strömungskanals 3 etwa 47 mm beträgt. Hier kann eine Anzahl von hexagonalen länglichen Wells 32 mehr als 16.000 betragen, wobei jedes Well 32 eine Länge von etwa 60 µm, eine Breite von etwa 30 µm und eine Tiefe von etwa 60 µm umfasst und wobei ein Rand 33 zwischen benachbarten Wells eine Breite von mehr als 10 µm umfasst. Des Weiteren beträgt eine Höhe des Strömungskanals 3 30 µm, was zu einem günstigen Aspektverhältnis von Strömungskanalhöhe h zu Welllänge l von 0,5 führt, um eine ausreichende fluidische Trennung zwischen benachbarten Wells 32 nach deren Befüllen mit anfänglichem Fluid, z. B. mit dPCR-Reaktionsgemisch 5, und deren fluidische Trennung mittels Siegelfluid 7 zu gewährleisten.As a dimension example, the microfluidic device, i.e. its two parts 2, 4, may have a total length of about 75 mm and a total width of about 25 mm, wherein a width at the flow channel 3 is about 6 mm and a length of the area of the flow channel 3 covered with wells 32 is about 47 mm. Here, a number of hexagonal elongated wells 32 may be more than 16,000, wherein each well 32 comprises a length of about 60 µm, a width of about 30 µm and a depth of about 60 µm and wherein an edge 33 between adjacent wells comprises a width of more than 10 µm. Furthermore, a height of the flow channel 3 is 30 µm, which leads to a favorable aspect ratio of flow channel height h to well length l of 0.5 in order to ensure sufficient fluidic separation between adjacent wells 32 after their filling with initial fluid, e.g. with dPCR reaction mixture 5, and their fluidic separation by means of sealing fluid 7.

Im Hinblick auf den Effekt der erfindungsgemäßen Bereitstellung unterschiedlicher Hydrophilie für die erste Strömungskanaloberfläche 31 und die zweite Strömungskanaloberfläche 41 zeigen 2a bis 2d die Fortbewegung des anfänglichen dPCR-Reaktionsgemisches 5 durch den Strömungskanal 3, wobei ein beispielhaftes Well 32 der mikrofluidischen Vorrichtung 1 wie vorstehend beschrieben ist, wobei eine erste Strömungskanaloberfläche 31' und eine zweite Strömungskanaloberfläche 41' als Ausgangssituation zum Vergleich die gleiche oder eine ähnliche Hydrophilie aufweisen. Dementsprechend zeigen sowohl die erste Strömungskanaloberfläche 31' als auch die zweite Strömungskanaloberfläche 41' die gleiche oder eine ähnliche Affinität gegenüber dem dPCR-Reaktionsgemisch. Hier fließt das während des Befüllens durch den Strömungskanal 3 fließende dPCR-Reaktionsgemisch 5, wie in 2a bis 2d gezeigt, mit seiner Frontlinie 51 schneller an der zweiten Strömungskanaloberfläche 41' als an der ersten Strömungskanaloberfläche 31', was dazu führt, dass das in das Well 32 eingetragene dPCR-Reaktionsgemisch 5 beim Befüllen des Wells 32 zuvor vorhandenes Gas, wie Luft, in dem Well 32 einschließt, was bedeutet, dass eine Gasblase in Form einer Luftblase 6 von dem dPCR-Reaktionsgemisch 5 in dem Well 32, genauer gesagt an dessen Boden und in Kontakt mit einer Seitenwand des Wells 32, eingeschlossen wird.With regard to the effect of the provision according to the invention of different hydrophilicity for the first flow channel surface 31 and the second flow channel surface 41, 2a to 2d the movement of the initial dPCR reaction mixture 5 through the flow channel 3, wherein an exemplary well 32 of the microfluidic device 1 is as described above, wherein a first flow channel surface 31' and a second flow channel surface 41' as a starting situation for comparison have the same or a similar hydrophilicity. Accordingly, both the first flow channel surface 31' and the second flow channel surface 41' show the same or a similar affinity to the dPCR reaction mixture. Here, the dPCR reaction mixture 5 flowing through the flow channel 3 during filling flows as in 2a to 2d shown, with its front line 51 faster at the second flow channel surface 41' than at the first flow channel surface 31', which results in the dPCR reaction mixture 5 introduced into the well 32 enclosing previously present gas, such as air, in the well 32 when filling the well 32, which means that a gas bubble in the form of an air bubble 6 is enclosed by the dPCR reaction mixture 5 in the well 32, more precisely at its bottom and in contact with a side wall of the well 32.

Nun zeigen 3a bis 3d, im Gegensatz zu 2a bis 2d, eine mikrofluidische Vorrichtung 1, die im Wesentlichen baulich identisch zu der in 2a bis 2d gezeigten mikrofluidischen Vorrichtung 1 ist, mit dem wesentlichen Unterschied, dass - im Einklang mit der vorliegenden Erfindung - die erste Strömungskanaloberfläche 31 und die zweite Strömungskanaloberfläche 41 unterschiedliche Hydrophilie aufweisen, wobei die erste Strömungskanaloberfläche 31 der mikrofluidischen Vorrichtung 1 mit einer SiO₂-Beschichtung beschichtet wurde. Dabei stellt aufgrund von Materialeigenschaften die erste Strömungskanaloberfläche 31 eine erste Hydrophilie mit einem Oberflächenkontaktwinkel in einem Bereich von etwa 30° bis 50° bereit, und mindestens ein Teil der zweiten Strömungskanaloberfläche 41 stellt eine zweite Hydrophilie mit einem Oberflächenkontaktwinkel in einem Bereich von etwa 80° bis 90° bereit, was dazu führt, dass die erste Hydrophilie größer oder ausgeprägter ist als die zweite Hydrophilie. Wie in 3a bis 3d beim Beobachten der Fortbewegung des anfänglichen dPCR-Reaktionsgemisches 5 durch den Strömungskanal 3 zu sehen, fließt die Frontlinie 51 des dPCR-Reaktionsgemisches 5 im Vergleich zu 2a bis 2d im Wesentlichen aufrecht innerhalb des Strömungskanals 3. Dementsprechend strömt ein Kontaktbereich der durch den Strömungskanal 3 zur Auslassöffnung 43 fließenden Frontlinie 51 mit der ersten Strömungskanaloberfläche 31 und mit der zweiten Strömungskanaloberfläche 41 mit einer Geschwindigkeit durch den Strömungskanal 3, die an der ersten Strömungskanaloberfläche 31 höher ist als die Geschwindigkeit der Flüssigkeit an der zweiten Strömungskanaloberfläche 41, was dazu führt, dass ein Befüllen des Wells 32 schneller erfolgt als ein Befüllen des Strömungskanals 3, siehe insbesondere 3b und 3c. Dadurch kann ein Einschließen von Luftblasen vermieden werden, da die Fortbewegung von Fluid durch den Strömungskanal 3 an beiden Strömungskanaloberflächen 31, 41 im Wesentlichen gleich ist, was dazu führt, dass das Well 32 vollständig mit dPCR-Reaktionsgemisch 5 ohne Luftblaseneinschluss gefüllt wird, und was zu einer verbesserten Befüllleistung der mikrofluidischen Vorrichtung 1 führt.Now show 3a to 3d , as opposed to 2a to 2d , a microfluidic device 1 which is essentially structurally identical to that in 2a to 2d shown microfluidic device 1, with the essential difference that - in accordance with the present invention - the first flow channel surface 31 and the second flow channel surface 41 have different hydrophilicities, wherein the first flow channel surface 31 of the microfluidic device 1 has been coated with a SiO ₂ coating. Due to material properties, the first flow channel surface 31 provides a first hydrophilicity with a surface contact angle in a range of about 30° to 50°, and at least a part of the second flow channel surface 41 provides a second hydrophilicity with a surface contact angle in a range of about 80° to 90°, which results in the first hydrophilicity being greater or more pronounced than the second hydrophilicity. As in 3a to 3d When observing the movement of the initial dPCR reaction mixture 5 through the flow channel 3, the front line 51 of the dPCR reaction mixture 5 flows in comparison to 2a to 2d essentially upright within the flow channel 3. Accordingly, a contact area of the front line 51 flowing through the flow channel 3 to the outlet opening 43 with the first flow channel surface 31 and with the second flow channel surface 41 flows through the flow channel 3 at a speed which is higher at the first flow channel surface 31 than the speed of the liquid at the second flow channel surface 41, which leads to filling of the well 32 taking place faster than filling of the flow channel 3, see in particular 3b and 3c . This allows the entrapment of air bubbles to be avoided since the movement of fluid through the flow channel 3 is substantially the same on both flow channel surfaces 31, 41, resulting in the well 32 being completely filled with dPCR reaction mixture 5 without the entrapment of air bubbles, and resulting in an improved filling performance of the microfluidic device 1.

4a bis 4c zeigen zu Vergleichszwecken unterschiedliche Versionen von Anordnungen von Wells, die innerhalb der ersten Strömungskanaloberfläche 31 bereitgestellt sind. Hier zeigt 4a eine Wabenstruktur von Wells 32 mit einer in Draufsicht länglichen hexagonalen Form, wobei der Wellvertex 321 auf der linken Seite in Richtung der Einlassöffnung 42 ausgerichtet ist und eine Wellkante 322 die Form eines Hexagons aufweist, 4b zeigt eine Wabenstruktur von Wells 32' mit einer regelmäßigen hexagonalen Form oder einer isohexagonalen Form in der Draufsicht und 4c zeigt eine Wabenstruktur von Wells 32" mit einer stärker verlängerten hexagonalen Form in der Draufsicht. Auf der linken Seite jeder Figur ist mindestens ein Teil der Wabenstruktur der Wells gezeigt, wobei auf der rechten Seite jeder Figur ein vergrößerter Ausschnitt bereitgestellt wird, in dem insbesondere die Form eines jeweiligen repräsentativen Wells in einer Draufsicht gezeigt ist. 5a bis 5c zeigen jedes der Wells 32, 32', 32" aus 4a-c in einer Querschnittsansicht entlang der Linien A-A, B-B und C-C in 4a-c, wobei 5a das längliche hexagonale Well 32 aus 4a in einer Querschnittsansicht entlang der Linie A-A im vergrößerten Ausschnitt aus 4a zeigt, 5b das isohexagonale Well 32' aus 4b in einer Querschnittsansicht entlang der Linie B-B im vergrößerten Ausschnitt aus 4b zeigt und 5c das stärker verlängerte hexagonale Well 32" aus 4c in einer Querschnittsansicht entlang der Linie C-C im vergrößerten Ausschnitt aus 4c zeigt. In allen 5a bis 5c bleibt die Höhe h des Strömungskanals 3 gleich, während die Länge der Wells 32, 32', 32" variiert. Insbesondere erfüllt die Welllänge l des in 5a gezeigten Wells 32 ein Aspektverhältnis h/l von 0,5, das ein optimales Aspektverhältnis h/l bereitstellt, um eine ausreichende fluidische Trennung zwischen benachbarten gefüllten Wells gewährleisten zu können, wohingegen die Welllänge l' des Wells 32' ein Aspektverhältnis h/l' von 1,0 erfüllt und die Welllänge l'' des Wells 32" ein Aspektverhältnis h/l'' von 0,25 erfüllt. 4a to 4c show, for comparison purposes, different versions of arrangements of wells provided within the first flow channel surface 31. Here, 4a a honeycomb structure of wells 32 having an elongated hexagonal shape in plan view, with the well vertex 321 on the left side oriented towards the inlet opening 42 and a well edge 322 having the shape of a hexagon, 4b shows a honeycomb structure of Wells 32' with a regular hexagonal shape or an isohexagonal shape in plan view and 4c shows a honeycomb structure of wells 32" having a more elongated hexagonal shape in plan view. On the left side of each figure, at least a portion of the honeycomb structure of the wells is shown, with an enlarged detail being provided on the right side of each figure, particularly showing the shape of a respective representative well in plan view. 5a to 5c show each of the wells 32, 32', 32" from 4a -c in a cross-sectional view along the lines AA, BB and CC in 4a -c, where 5a the elongated hexagonal well 32 from 4a in a cross-sectional view along the line AA in the enlarged detail of 4a shows, 5b the isohexagonal well 32' from 4b in a cross-sectional view along the line BB in the enlarged section of 4b shows and 5c the more extended hexagonal Well 32" from 4c in a cross-sectional view along the line CC in the enlarged detail of 4c shows. In all 5a to 5c the height h of the flow channel 3 remains the same, while the length of the wells 32, 32', 32" varies. In particular, the well length l of the 5a shown wells 32 have an aspect ratio h/l of 0.5, which provides an optimal aspect ratio h/l to ensure sufficient fluidic separation between adjacent filled wells to ensure, whereas the wavelength l' of the well 32' satisfies an aspect ratio h/l' of 1.0 and the wavelength l'' of the well 32" satisfies an aspect ratio h/l'' of 0.25.

Ein Ablauf eines Versiegelungsverfahrens des gefüllten länglichen Wells 32 aus 4a und 5a mittels eines Siegelfluids 7 ist in 6a bis 6d gezeigt, ein Verlauf eines Versiegelungsverfahrens des gefüllten isohexagonalen Wells 32' aus 4b und 5b mittels des Siegelfluids 7 ist in 7a bis 7d gezeigt und ein Ablauf eines Versiegelungsverfahrens des gefüllten, stärker verlängerten Wells 32" aus 4c und 5c mittels des Siegelfluids 7 ist in 8a bis 8d gezeigt. Aus 6a bis 6d ist zu entnehmen, dass das Siegelfluid 7 von der Seite der Einlassöffnung 42 in den Strömungskanal 3 eingetragen wird und in Richtung der Auslassöffnung 43 fließt. Sobald das Siegelfluid 7 das längliche Well 32 erreicht, das das Aspektverhältnis von 0,5 erfüllt, was bedeutet, dass die Welllänge l das Zweifache der Strömungskanalhöhe h ist, wird das Siegelfluid 7 aufgrund von Kapillarkräften, d. h. Oberflächenspannungskräften, und aufgrund der Kontaktwinkelbedingungen in Bezug auf die Wände des Wells 32 in das Well 32 gedrückt und bildet einen Tropfen oder Meniskus in das Well 32, der etwas dPCR-Reaktionsgemisch 5 aus dem Well 32 presst, siehe 6b. Während das Siegelfluid 7 weiter durch den Strömungskanal 3 gepresst wird, verschließt das Siegelfluid 7 das Well 32, wobei ein wesentlicher Teil des dPCR-Reaktionsgemisches 5 am Boden des Wells 32 verbleibt, siehe 6c, während das dPCR-Reaktionsgemisch 5 im Strömungskanal 3 weiter in Richtung der Auslassöffnung 42 gepresst wird, bis der Strömungskanal 3 vollständig mit Siegelfluid 7 gefüllt ist, siehe 6d, mit Ausnahme der ausreichenden Menge an dPCR-Reaktionsgemisch 5, die am Boden des Wells 32 eingeschlossen ist. Somit ist das längliche Well 32 ausreichend mit dPCR-Reaktionsgemisch 5 gefüllt und benachbarte längliche Wells 32 sind mittels des Siegelfluids 7 fluidisch sicher voneinander getrennt.A sequence of a sealing process of the filled elongated well 32 from 4a and 5a by means of a sealing fluid 7 is in 6a to 6d shown a course of a sealing process of the filled isohexagonal well 32' from 4b and 5b by means of the sealing fluid 7 is in 7a to 7d and a sealing procedure of the filled, more extended well 32" from 4c and 5c by means of the sealing fluid 7 is in 8a to 8d shown. From 6a to 6d it can be seen that the sealing fluid 7 is introduced into the flow channel 3 from the side of the inlet opening 42 and flows towards the outlet opening 43. As soon as the sealing fluid 7 reaches the elongated well 32, which satisfies the aspect ratio of 0.5, which means that the well length l is twice the flow channel height h, the sealing fluid 7 is pressed into the well 32 due to capillary forces, i.e. surface tension forces, and due to the contact angle conditions with respect to the walls of the well 32 and forms a drop or meniscus in the well 32, which presses some dPCR reaction mixture 5 out of the well 32, see 6b . While the sealing fluid 7 is further pressed through the flow channel 3, the sealing fluid 7 closes the well 32, whereby a substantial part of the dPCR reaction mixture 5 remains at the bottom of the well 32, see 6c , while the dPCR reaction mixture 5 in the flow channel 3 is further pressed towards the outlet opening 42 until the flow channel 3 is completely filled with sealing fluid 7, see 6d , with the exception of the sufficient amount of dPCR reaction mixture 5 which is enclosed at the bottom of the well 32. Thus, the elongated well 32 is sufficiently filled with dPCR reaction mixture 5 and adjacent elongated wells 32 are fluidically safely separated from one another by means of the sealing fluid 7.

Aus Gründen eines veranschaulichenden Vergleichs zeigen 7a bis 7d ein ähnliches Versiegelungsverfahren, mit der Ausnahme, dass das isohexagonale Well 32' ein Aspektverhältnis von 1,0 erfüllt, d. h., die Höhe h des Strömungskanals 3 ist identisch mit der Welllänge l'. Hier ist zu entnehmen, dass das Siegelfluid 7 erneut von der Seite der Einlassöffnung 42 in den Strömungskanal 3 eingetragen wird und in Richtung der Auslassöffnung 43 fließt. Sobald das Siegelfluid 7 das isohexagonale Well 32' erreicht, wird das Siegelfluid 7 aufgrund von Kapillarkräften, d. h. Oberflächenspannungskräften, und aufgrund der Kontaktwinkelbedingungen in Bezug auf die Wände des Wells 32' in das Well 32' gedrückt und bildet einen vergleichsweise kleinen Meniskus in das Well 32', der eine geringe Menge des dPCR-Reaktionsgemisches 5 aus dem Well 32' presst, siehe 7b, wobei diese Menge deutlich geringer ist als die Menge, die in 6b aus dem Well 32' gepresst wird. Während das Siegelfluid 7 weiter durch den Strömungskanal 3 gepresst wird, verschließt das Siegelfluid 7 das Well 32', wobei ein erheblicher Teil des dPCR-Reaktionsgemisches 5 innerhalb des Wells 32' verbleibt, siehe 7c, während das dPCR-Reaktionsgemisch 5 im Strömungskanal 3 weiter in Richtung der Auslassöffnung 42 gepresst wird, bis der Strömungskanal 3 vollständig mit Siegelfluid 7 gefüllt ist, siehe 7d, mit Ausnahme der großen Menge an dPCR-Reaktionsgemisch 5, die innerhalb des Wells 32' eingeschlossen ist. Dementsprechend ist das Well 32' größtenteils mit dPCR-Reaktionsgemisch 5 gefüllt.For the sake of illustrative comparison, 7a to 7d a similar sealing process, with the exception that the isohexagonal well 32' satisfies an aspect ratio of 1.0, i.e., the height h of the flow channel 3 is identical to the well length l'. Here it can be seen that the sealing fluid 7 is again introduced into the flow channel 3 from the side of the inlet opening 42 and flows towards the outlet opening 43. As soon as the sealing fluid 7 reaches the isohexagonal well 32', the sealing fluid 7 is pressed into the well 32' due to capillary forces, i.e., surface tension forces, and due to the contact angle conditions with respect to the walls of the well 32' and forms a comparatively small meniscus in the well 32', which presses a small amount of the dPCR reaction mixture 5 out of the well 32', see 7b , although this amount is significantly lower than the amount contained in 6b is pressed out of the well 32'. While the sealing fluid 7 is further pressed through the flow channel 3, the sealing fluid 7 closes the well 32', whereby a significant part of the dPCR reaction mixture 5 remains within the well 32', see 7c , while the dPCR reaction mixture 5 in the flow channel 3 is further pressed towards the outlet opening 42 until the flow channel 3 is completely filled with sealing fluid 7, see 7d , except for the large amount of dPCR reaction mixture 5 enclosed within well 32'. Accordingly, well 32' is mostly filled with dPCR reaction mixture 5.

Erneut aus Gründen eines veranschaulichenden Vergleichs zeigen 8a bis 8d ein ähnliches Versiegelungsverfahren, mit der Ausnahme, dass das stärker verlängerte hexagonale Well 32" ein Aspektverhältnis von 0,25 erfüllt, d. h., die Höhe h des Strömungskanals 3 beträgt ein Viertel der Welllänge l''. Hier ist zu entnehmen, dass das Siegelfluid 7 erneut von der Seite der Einlassöffnung 42 in den Strömungskanal 3 eingetragen wird und in Richtung der Auslassöffnung 43 fließt. Sobald das Siegelfluid 7 das stärker verlängerte hexagonale Well 32" erreicht, wird das Siegelfluid 7 aufgrund von Kapillarkräften, d. h. Oberflächenspannungskräften, und aufgrund der Kontaktwinkelbedingungen in Bezug auf die Wände des Wells 32" in das Well 32" gedrückt und bildet einen großen Meniskus in das Well 32", der das dPCR-Reaktionsgemisches 5 aus dem Well 32" zu pressen beginnt, siehe 8b. Während das Siegelfluid 7 weiter durch den Strömungskanal 3 gepresst wird, füllt der Meniskus des Siegelfluids 7 das Well 32" fast vollständig aus, wobei nur ein sehr kleiner Teil des dPCR-Reaktionsgemisches 5 am äußeren Rand des Bodens des Wells 32' verbleibt, siehe 8c'. Während das Siegelfluid 7 zur Auslassöffnung 43 fließt, verschließt das Siegelfluid 7 das Well 32", wobei der kleine Teil des dPCR-Reaktionsgemisches 5 in dem Well 32" verbleibt, siehe 8d, bis der Strömungskanal 3 vollständig mit Siegelfluid 7 gefüllt ist. Wie aus 8d ersichtlich ist, ist das Well 32" dementsprechend nahezu vollständig mit Siegelfluid 7 gefüllt, während lediglich eine unbedeutende Menge des dPCR-Reaktionsgemisches 5 in dem Well 32" verbleibt. Bei einer derartigen Verringerung des tatsächlich verwendbaren dPCR-Reaktionsgemisches in der mikrofluidische dPCR-Vorrichtung verschlechtert sich nicht nur die analytische Leistung der Vorrichtung erheblich, sondern die tatsächliche Gesamtmenge des in der mikrofluidischen Vorrichtung verbleibenden dPCR-Reaktionsgemisches kann auch nicht eindeutig bestimmt werden, was jedes analytische Ergebnis ungenau und unbrauchbar macht.Again, for the sake of illustrative comparison, 8a to 8d a similar sealing process, with the exception that the more elongated hexagonal well 32" satisfies an aspect ratio of 0.25, i.e., the height h of the flow channel 3 is a quarter of the well length l''. Here it can be seen that the sealing fluid 7 is again introduced into the flow channel 3 from the side of the inlet opening 42 and flows towards the outlet opening 43. As soon as the sealing fluid 7 reaches the more elongated hexagonal well 32", the sealing fluid 7 is pressed into the well 32" due to capillary forces, i.e., surface tension forces, and due to the contact angle conditions with respect to the walls of the well 32", forming a large meniscus in the well 32", which begins to press the dPCR reaction mixture 5 out of the well 32", see 8b . As the sealing fluid 7 continues to be pressed through the flow channel 3, the meniscus of the sealing fluid 7 almost completely fills the well 32", with only a very small portion of the dPCR reaction mixture 5 remaining at the outer edge of the bottom of the well 32', see 8c '. While the sealing fluid 7 flows to the outlet opening 43, the sealing fluid 7 closes the well 32", whereby the small part of the dPCR reaction mixture 5 remains in the well 32", see 8d until the flow channel 3 is completely filled with sealing fluid 7. As can be seen from 8d As can be seen, the well 32" is accordingly almost completely filled with sealing fluid 7, while only an insignificant amount of the dPCR reaction mixture 5 remains in the well 32". With such a reduction of the actually usable dPCR reaction mixture in the microfluidic dPCR device, not only does the analytical performance of the device deteriorate considerably, but the actual total amount of the dPCR reaction mixture remaining in the microfluidic device cannot be clearly determined, which makes any analytical result inaccurate and unusable.

Die vorliegende Erfindung ist zwar im Hinblick auf ihre spezifischen Ausführungsformen beschrieben, es versteht sich jedoch, dass diese Beschreibung nur zu Veranschaulichung dient. Dementsprechend soll die Erfindung nur durch den Umfang der hier anhängenden Ansprüche eingeschränkt werden.While the present invention has been described with respect to specific embodiments thereof, it is to be understood that such description is for purposes of illustration only. Accordingly, the invention is to be limited only by the scope of the claims appended hereto.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDED IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of documents listed by the applicant was generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA accepts no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

US 6143496 A [0004]
US 6027695 A [0004]

Claims

Microfluidic device (1) for thermocycling a reaction mixture (5), comprising: an inlet opening (42); an outlet opening (43); a flow channel (3) connecting the inlet opening (42) and the outlet opening (43) and defining a flow direction from the inlet opening (42) through the flow channel (3) to the outlet opening (43), and an array of wells (32; 32'; 32") provided in the first flow channel surface (31) for fluid communication with the inlet opening (42) and the outlet opening (43), wherein the microfluidic device (1) is used for digital PCR or biochemical assays of a sample provided in the form of the reaction mixture (5) by means of the flow channel (3) in each of the wells (32), wherein the microfluidic device (1) is adapted to fill the wells (32; 32'; 32") with an aqueous dPCR reaction mixture in a passive manner, and to fill the wells (32; 32'; 32") with an aqueous dPCR reaction mixture in a passive manner, and to fill the wells (32; 32'; 32") with an aqueous dPCR reaction mixture in a passive manner, and to fill the wells (32; 32'; 32") with an aqueous dPCR reaction mixture in a passive manner, dPCR reaction mixture filled wells (32; 32'; 32") are fluidically separated from one another by applying an active filling pressure with a sealing or separating fluid, so that a fluidic separation between adjacent filled wells (32; 32'; 32") can be ensured, and wherein the microfluidic device (1) is adapted to avoid entrapping gas bubbles in the wells (32; 32'; 32") and to achieve complete filling of the wells (32; 32'; 32") with the aqueous dPCR reaction mixture.

Microfluidic device (1) according to Claim 1 , wherein the flow channel (3) comprises a first flow channel surface (31) and a second flow channel surface (41) opposite the first flow channel surface (31), wherein the first flow channel surface (31) provides a first hydrophilicity and at least a portion of the second flow channel surface (41) provides a second hydrophilicity, and wherein the first hydrophilicity is greater than the second hydrophilicity.

Microfluidic device (1) according to Claim 2 , wherein the first hydrophilicity and/or the second hydrophilicity are provided by material properties, by surface treatment such as a plasma hydrophilization treatment, or by a hydrophilic coating such as a SiO ₂ coating.

Microfluidic device (1) according to Claim 2 or 3 , wherein at least a portion of the array of wells (32; 32';32") has a corrugation in the first flow channel surface (31) in the form of a hexagon, wherein all of the wells (32; 32';32") preferably have a corrugation in the first flow channel surface (31) in the form of a hexagon.

Microfluidic device (1) according to Claim 4 , wherein a vertex (321) of each hexagonal well (32) is aligned in the flow direction and faces the side of the inlet opening (42), wherein preferably two oppositely arranged vertices of each hexagonal well (32) are aligned parallel to the flow direction.

Microfluidic device (1) according to Claim 4 or 5 wherein each hexagonal well (32) has an elongated hexagonal shape which is extended in the flow direction.

Microfluidic device (1) according to one of the preceding claims, wherein each well (32; 32'; 32") has a well length in the flow direction in a range of 50 µm to 300 µm and/or a well width perpendicular to the well length in a range of 25 µm to 150 µm and/or a well depth in a range of 25 µm to 200 µm.

A microfluidic device (1) according to any one of the preceding claims, wherein an edge (322) of each well (32) in the first flow channel surface (31) facing the side of the inlet opening (42) is a rounded edge.

Microfluidic device (1) according to Claim 8 , wherein the rounded corrugated edge (322) is rounded with a radius of < 10 µm.

Microfluidic device (1) according to one of the preceding claims, wherein an edge (33) is provided between adjacent wells (32) for fluidic separation of the adjacent wells (32), each edge (33) having a width of > 10 µm.

Microfluidic device (1) according to one of the preceding claims, wherein an aspect ratio between a height of the flow channel (3) and a length of each well (32) is in a range between 0.3 and 0.7, preferably about 0.5.

Microfluidic device (1) according to one of the preceding claims, wherein a height of the flow channel (3) is in the range of 25 µm to 200 µm.

Microfluidic device (1) according to one of the preceding claims, wherein the microfluidic The microfluidic device (1) consists of two parts (2, 4) which can be fastened to one another, the microfluidic device (1) preferably being divided into the two parts (2, 4) along its longitudinal axis.

Microfluidic device (1) according to Claim 13 , wherein the flow channel (3) with the arrangement of wells (32) as well as the inlet opening (42) and the outlet opening (43) is provided in a part (2) of the microfluidic device (1) which provides the first flow channel surface (31), and wherein the other part (4) of the microfluidic device (1) represents a cover part which provides the second flow channel surface (41), preferably provided in the form of a cover plate or cover film.

Microfluidic device (1) according to one of the preceding claims, wherein the microfluidic device (1) is a consumable material and preferably consists of a transparent material, more preferably of cyclic olefin copolymer, COC, or cyclic olefin polymer, COP.