DE202017102836U1

DE202017102836U1 - Laser scanning microscope

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Publication number: DE202017102836U1
Application number: DE202017102836.4U
Authority: DE
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2017-06-19
Anticipated expiration: 2027-05-12

Abstract

Laser-Raster-Mikroskop mit einen teilweise als Beleuchtungskanal genutzten Detektionskanal, eine Fokusebene (BE) in der eine Probe (2) angeordnet ist und eine optische Achse (A) aufweisend, im Wesentlichen enthaltend ein Mikroskopobjektiv (1), ein Scanobjektiv (3), einen Scanspiegel (4), der in einer schnellen Scanrichtung (x) und einer langsamen Scanrichtung (y) auslenkbar ist, einen ersten Strahlteiler (5) und eine Detektoreinheit (6), mit einem Detektor (6.1) und wenigstens einer Optik (6.2), die entlang der optischen Achse (A) angeordnet sind, wobei über den ersten Strahlteiler (5), der für einen von einer ersten Beleuchtungseinheit (7) kommenden Beleuchtungsstrahl (BL) reflektierend und für einen von der Probe (2) kommenden Detektionsstrahl (DL) transmittierend ist, der Beleuchtungsstrahl (BL) in Richtung der optischen Achse (A) in den Detektionskanal eingekoppelt wird, sodass eine Beleuchtungsstrahlachse (ABL) koaxial zur optischen Achse (A) verläuft und der Beleuchtungsstrahl (BL) in einem ersten Fokus (F1) auf ein erstes Pixel (P1) (auch Detektionsspot) der Probe (2) fokussiert wird, von dem ausgehend der Detektionsstrahl (DL), auf den Detektor (6.1) gelangt und ein zweiter Strahlteiler (8) zwischen dem ersten Strahlteiler (5) und dem Scanspiegel (4) angeordnet ist, dem eine zweite Beleuchtungseinheit (9) zugeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Beleuchtungseinheit (9) so zum zweiten Strahlteiler (8) angeordnet ist, dass ein von der zweiten Beleuchtungseinheit (9) ausgehender Manipulationsstrahl (ML) direkt oder indirekt, über ein zusätzliches Umlenkelement (10), so auf den zweiten Strahlteiler (8) gerichtet und an diesem reflektiert in den Detektionskanal eingekoppelt wird, dass seine Manipulationsstrahlachse (AML) um einen Winkel (α) in einer Ebene (E), die die optische Achse (A) schneidet, gegenüber der optischen Achse (A) verkippt ist, sodass der Manipulationsstrahl (ML) in einem zweiten Fokus (F2) auf ein zweites Pixel (P2) (auch Manipulationsspot) der Probe 2 fokussiert wird und wobei der zweite Strahlteiler (8) für den Beleuchtungsstrahl (BL) und den Detektionsstrahl (DL) wenigstens teilweise durchlässig und für den Manipulationsstrahl (ML) wenigstens teilweise reflektierend ist.Laser raster microscope with a detection channel partly used as a illumination channel, a focal plane (BE) in which a sample (2) is arranged and having an optical axis (A), essentially comprising a microscope objective (1), a scanning objective (3) a scanning mirror (4) which is deflectable in a fast scanning direction (x) and a slow scanning direction (y), a first beam splitter (5) and a detector unit (6), with a detector (6.1) and at least one optical system (6.2 ) which are arranged along the optical axis (A), wherein the first beam splitter (5), which is reflective for an illumination beam (BL) coming from a first illumination unit (7) and for a detection beam coming from the sample (2). DL) is transmitted, the illumination beam (BL) is coupled into the detection channel in the direction of the optical axis (A), so that an illumination beam axis (ABL) runs coaxially to the optical axis (A) and the illumination beam L (BL) is focused in a first focus (F1) on a first pixel (P1) (also detection spot) of the sample (2), starting from the detection beam (DL), the detector (6.1) passes and a second beam splitter (8) is arranged between the first beam splitter (5) and the scanning mirror (4), to which a second illumination unit (9) is assigned, characterized in that the second illumination unit (9) is arranged to the second beam splitter (8) a manipulation beam (ML) emanating from the second illumination unit (9) directly or indirectly, via an additional deflecting element (10), directed onto the second beam splitter (8) and coupled to the detection channel at its reflection, that its manipulation beam axis (AML) is tilted relative to the optical axis (A) by an angle (α) in a plane (E) which intersects the optical axis (A), so that the manipulation beam (ML) is focused on a second pixel (F2) in a second focus (F2). P2) (also Manipulation spot) of the sample 2 is focused and wherein the second beam splitter (8) for the illumination beam (BL) and the detection beam (DL) is at least partially transmissive and at least partially reflective for the manipulation beam (ML).

Description

Die Erfindung betrifft ein Laser-Raster-Mikroskop (Laser-Scanning-Mikroskop) mit dem eine Probe mit einem Beleuchtungsstrahl und einem Manipulationsstrahl räumlich zueinander versetzt, zeitgleich abgerastert wird. The invention relates to a laser scanning microscope (laser scanning microscope) with a sample with an illumination beam and a manipulation beam spatially offset from each other, is scanned at the same time.

In der Laser-Scanning-Mikroskopie wird eine Probe mit einem fokussierten Laserstrahl eines schmalen Emissionsbandes (nachfolgend Beleuchtungsstrahl, vereinfacht betrachtet mit nur einer Wellenlänge) pixelweise, in der Regel Zeile für Zeile, abgerastert (abgescannt). Der Beleuchtungsstrahl wird zum einen von der Probe reflektiert und kann zum anderen ein Fluoreszenzlicht generieren, mit einem typischerweise breiten Emissionsband auf der langwelligen Seite der Wellenlänge des Beleuchtungsstrahles. In laser scanning microscopy, a sample with a focused laser beam of a narrow emission band (in the following, illumination beam, in simplified terms with only one wavelength) is scanned pixel by pixel, usually line by line (scanned). The illumination beam is reflected on the one hand by the sample and on the other hand can generate a fluorescent light, with a typically broad emission band on the long-wavelength side of the wavelength of the illumination beam.

Zur Erzeugung eines Bildes der Probe wird entweder der an der Probe reflektierte Anteil des Beleuchtungsstrahls oder das generierte Fluoreszenzlicht pixelweise von einem Detektor detektiert. To generate an image of the sample, either the portion of the illumination beam reflected at the sample or the generated fluorescent light is detected pixel by pixel by a detector.

Im Falle der Abbildung des Fluoreszenzlichtes wird der Beleuchtungsstrahl in den Strahlengang des Laser-Raster-Mikroskops typischerweise über einen Farbteiler (dichroitischen Spiegel, Filter) eingekoppelt, der für die Wellenlänge des Beleuchtungsstrahls reflektierend und für das Emissionsband des Fluoreszenzlichtes transmittierend ist, so dass bei einem koaxialen Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang nur das vom Objekt kommende Fluoreszenzlicht den Farbteiler passiert und zu einem Detektor gelangt. In the case of the imaging of the fluorescent light, the illumination beam is coupled into the beam path of the laser scanning microscope typically via a color splitter (dichroic mirror, filter), which is reflective for the wavelength of the illumination beam and transmits for the emission band of the fluorescent light, so that at coaxial illumination and imaging beam path only the fluorescent light coming from the object passes the color splitter and passes to a detector.

Um eine Probe alternativ mit einem Beleuchtungsstrahl unterschiedlicher Wellenlänge beleuchten zu können, ist es bekannt, anstelle eines einzelnen Farbteilers ein Filterrad zu verwenden, mittels dem wahlweise unterschiedliche Farbteiler in den Strahlgang eingebracht werden können, die dann nur die für den Beleuchtungsstrahl gewünschte Wellenlänge in den Strahlengang reflektieren. In order to be able to illuminate a sample alternatively with an illumination beam of different wavelengths, it is known to use a filter wheel instead of a single color divider, by means of which optionally different color splitters can be introduced into the beam path, which then only the desired wavelength for the illumination beam in the beam path reflect.

Aus der DE 10 2009 006 729 A1 ist ein Laser-Raster-Mikroskop bekannt mit zwei hintereinander im Strahlengang angeordneten Filterrädern, über die zwei sich koaxial im Strahlengang überlagernde Beleuchtungsstrahlen eingekoppelt werden können, die als kombinierter Beleuchtungsstrahl mit zwei Wellenlängen eine Probe pixelweise beleuchten. Um die beiden Beleuchtungsstrahlen unabhängig von einer toleranzbehafteten Relativlage der Filterräder im koaxialen Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang auf die optischen Achse einzukoppeln, wird vorgeschlagen, den beiden Filterrädern jeweils ein Winkelstellglied mit zwei Stellgliedern vorzuordnen, mit denen der vom Filterrad reflektierte Beleuchtungsstrahl auf die optische Achse justiert wird. Diese Stellglieder weisen jeweils einen zum Toleranzbereich der Relativlage der Filterräder korrespondierenden Stellbereich auf. From the DE 10 2009 006 729 A1 a laser scanning microscope is known with two successively arranged in the beam path filter wheels, can be coupled via the two coaxial in the beam path superimposed illumination beams that illuminate a sample as a combined illumination beam with two wavelengths pixel by pixel. In order to couple the two illumination beams independently of a tolerance-related relative position of the filter wheels in the coaxial illumination and imaging beam path on the optical axis, it is proposed to pre-assign the two filter wheels each an angle actuator with two actuators with which the reflected from the filter wheel illumination beam is adjusted to the optical axis , These actuators each have an adjustment range corresponding to the tolerance range of the relative position of the filter wheels.

Mit einem Laser-Raster-Mikroskop der vorgenannten DE 10 2009 006 729 A1 wird ein Laser-Raster-Mikroskop zur Verfügung gestellt, mit dem durch die freie Kombinierbarkeiten der einzelnen Farbteiler der beiden Filterräder ein kombinierter Beleuchtungsstrahl mit zwei kombinierten Wellenlängen über die Probe geführt werden kann. Der Detektor detektiert somit pixelweise Fluoreszenzlicht, was mit der Beaufschlagung eines Pixels der Probe durch den kombinierten Beleuchtungsstrahl generiert wird. Aus der zeitlichen Abfolge der durch den Detektor generierten Signale wird eine pixelaufgelöste Abbildung der Probe generiert. With a laser scanning microscope of the aforementioned DE 10 2009 006 729 A1 a laser scanning microscope is provided, with the free combinabilities of the individual color splitters of the two filter wheels, a combined illumination beam with two combined wavelengths can be performed on the sample. The detector thus detects pixel-wise fluorescent light, which is generated when a pixel of the sample is exposed to the combined illumination beam. The temporal sequence of the signals generated by the detector generates a pixel-resolved image of the sample.

In der Laser-Scanning-Mikroskopie ist man häufig interessiert, eine Probe zusätzlich mit einem zweiten Lichtstrahl (nachfolgend Manipulationsstrahl) zu beleuchten, um beispielsweise die Probe vollständig oder stellenweise vor der Erzeugung einer Abbildung zu bleichen oder auf andere Weise zu manipulieren, während die Probe gleichzeitig mit einem Beleuchtungsstrahl abgerastert wird, um ein Bild von der Probe zu gewinnen. Der Beleuchtungsstrahl und der Manipulationsstrahl müssen sich nicht durch ihre Wellenlänge oder Intensität unterscheiden und können eine gleiche Wirkung auf die Probe haben. Der Manipulationsstrahl muss lediglich zeitlich vor dem Beleuchtungsstrahl auf ein jeweiliges Pixel gerichtet werden. In laser scanning microscopy, it is often desirable to additionally illuminate a sample with a second light beam (for example, manipulation beam), for example, to bleach or otherwise bleach the sample completely or in places prior to generating an image while the sample is scanned simultaneously with an illumination beam to obtain an image of the sample. The illumination beam and the manipulation beam need not differ by their wavelength or intensity and may have an equal effect on the sample. The manipulation beam only has to be directed to a respective pixel in time before the illumination beam.

Aus der DE 100 39 520 A1 ist ein Laser-Raster-Mikroskop mit zwei voneinander unabhängig arbeitenden Strahlablenkeinrichtungen bekannt, die bevorzugt nicht in einem gleichen Strahlengang angeordnet sind. Mit einer in einem Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang (hier Detektionsstrahlengang) angeordneten ersten Strahlablenkeinrichtungen wird ein Beleuchtungsstrahl über eine Probe gescannt und das von der Probe kommende Reflexions- oder Fluoreszenzlicht (nachfolgend Detektionslicht) wird auf einen Detektor geführt, um aus den gewonnenen Detektorsignalen ein Bild der Probe zu generieren. Mit einer in einem Manipulationsstrahlengang angeordneten zweiten Strahlablenkeinrichtung wird ein Manipulationsstrahl abgelenkt. Durch die weitgehend getrennte Strahlführung des Beleuchtungs- und des Manipulationsstrahles können sie jeweils über eine unterschiedliche Optik in die Probe und damit auch in unterschiedliche Ebenen der Probe fokussiert werden. Der zeitlichen Nachlauf des Detektionsstrahles gegenüber dem Manipulationsstrahl ist aufgrund der Auslenkung über jeweils eine andere Strahlablenkeinrichtung immer toleranzbehaftet. From the DE 100 39 520 A1 is a laser scanning microscope with two independently operating beam deflection known, which are preferably not arranged in a same beam path. With a in a illumination and imaging beam path (here detection beam) arranged first beam deflecting an illumination beam is scanned over a sample and the coming of the sample reflection or fluorescent light (hereinafter detection light) is passed to a detector in order to obtain an image of the obtained detector signals To generate a sample. With a arranged in a manipulation beam path second beam deflecting a manipulation beam is deflected. As a result of the largely separate beam guidance of the illumination and the manipulation beam, they can each be focused via a different optical system into the sample and thus also into different planes of the sample. The time lag of the detection beam with respect to the manipulation beam is always subject to tolerances because of the deflection via a respective other beam deflection device.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Laser-Raster-Mikroskop zu finden, bei dem ein vorgegebener zeitlicher Versatz des Beaufschlagens jeweils eines Pixels einer Probe durch einen Manipulationsstrahl und einen Detektionsstrahl gesichert stabil ist. The object of the invention is to find a laser scanning microscope in which a predetermined time offset of each time a pixel of a sample is reliably secured by a manipulation beam and a detection beam.

Diese Aufgabe wird für ein Laser-Raster-Mikroskop gemäß Anspruch 1 gelöst. This object is achieved for a laser scanning microscope according to claim 1.

Vorteilhafte Ausführungen sind in den Unteransprüchen 2 bis 10 angegeben. Advantageous embodiments are specified in the subclaims 2 to 10.

Nachfolgend soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und Zeichnungen näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail with reference to embodiments and drawings.

Hierzu zeigen: Show:

1 Optikschema für ein erfindungsgemäßes Laser-Raster-Mikroskop, 1 Optical scheme for a laser scanning microscope according to the invention,

2a–2c drei Beispiele für den Versatz zwischen dem Manipulationsspot und dem Beleuchtungsspot und 2a - 2c three examples of the offset between the manipulation spot and the illumination spot and

3 eine Ausführung des zweiten Strahlteilers. 3 an embodiment of the second beam splitter.

Ein erfindungsgemäßes Laser-Raster-Mikroskop, wie in 1 gezeigt, enthält gleich einem aus dem Stand der Technik bekannten Laser-Raster-Mikroskop einen teilweise als Beleuchtungskanal genutzten Detektionskanal mit einer Fokusebene BE in der eine zu untersuchende Probe 2 angeordnet wird und einer optischen Achse A. Der Detektionskanal enthält im Wesentlichen entlang der optischen Achse A angeordnet ein Mikroskopobjektiv 1, ein Scanobjektiv 3, einen Scanspiegel 4, der um eine schnelle Scanrichtung x und eine langsame Scanrichtung y auslenkbar ist, einen ersten Strahlteiler 5 und eine Detektoreinheit 6, mit einem Detektor 6.1 und wenigstens einer Optik 6.2, die entlang einer optischen Achse A angeordnet sind. Die Optik 6.2 bildet den Detektionsstrahl über ein Pinhole auf dem Detektor ab, wobei zusätzliche optische Mittel vorhanden sein können, die den Detektionsstrahl z.B. filtern oder spektral auftrennen. A laser scanning microscope according to the invention, as in 1 shown, similar to a known from the prior art laser scanning microscope partially used as a lighting channel detection channel with a focal plane BE in a sample to be examined 2 is arranged and an optical axis A. The detection channel includes substantially along the optical axis A arranged a microscope objective 1 , a scan lens 3 , a scanning mirror 4 , which is deflectable by a fast scan direction x and a slow scan direction y, a first beam splitter 5 and a detector unit 6 , with a detector 6.1 and at least one optic 6.2 which are arranged along an optical axis A. The optics 6.2 forms the detection beam via a pinhole on the detector, wherein additional optical means may be present, for example, filter the detection beam or spectrally separate.

Über den ersten Strahlteiler 5, der für einen von einer ersten Beleuchtungseinheit 7 kommenden Beleuchtungsstrahl BL reflektierend und für von der Probe kommendes Detektionslicht transmittierend ist, wird der Beleuchtungsstrahl BL in Richtung der optischen Achse A in den Detektionskanal eingekoppelt, sodass seine Strahlachse (nachfolgend Beleuchtungsstrahlachse A_BL) koaxial zur optischen Achse A verläuft und auf die Probe 2 fokussiert wird, während das von einem jeweils beleuchteten Pixel kommende Detektionslicht (nachfolgend Detektionsstrahl DL), auf den Detektor 6.1 gelangt. Der Beleuchtungsstrahl BL und der Detektionsstahl DL weisen somit einen gemeinsamen Fokus (nachfolgend erster Fokus F₁) auf, mit dem eine in der Fokusebene BE angeordnete Probe 2 pixelweise abgescannt wird. About the first beam splitter 5 for one of a first lighting unit 7 Reflecting light beam BL and is reflective of coming from the sample detection light, the illumination beam BL is coupled in the direction of the optical axis A in the detection channel, so that its beam axis (hereinafter illumination beam axis A _BL ) is coaxial with the optical axis A and the sample 2 is focused, while the coming of each illuminated pixel detection light (hereinafter detection beam DL), on the detector 6.1 arrives. The illumination beam BL and the detection beam DL thus have a common focus (hereinafter first focus F ₁ ), with which a sample arranged in the focal plane BE 2 scanned pixel by pixel.

Zusätzlich und ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt, weist ein erfindungsgemäßes Laser-Raster-Mikroskop einen zweiten Strahlteiler 8 auf, der zwischen dem ersten Strahlteiler 5 und dem Scanspiegel 4 angeordnet ist und über den ein zweiter Beleuchtungsstrahl in den Detektionskanal eingekoppelt werden kann. In addition, and also known from the prior art, a laser scanning microscope according to the invention has a second beam splitter 8th on that between the first beam splitter 5 and the scanning mirror 4 is arranged and via which a second illumination beam can be coupled into the detection channel.

Ein erfindungsgemäßes Laser-Raster-Mikroskop unterscheidet sich von einem solchen bekannten Laser-Raster-Mikroskop dadurch, dass es dazu ausgelegt ist den zusätzlichen zweiten Beleuchtungsstrahl (nachfolgend Manipulationsstrahl ML), der ebenso über den Scanspiegel 4, das Scanobjektiv 3 und das Mikroskopobjektiv 1 auf die Probe 2 gerichtet wird, so auf der Probe 2 in einem zweiten Fokus F₂ zu fokussieren, dass die beiden Foki F₁, F₂ en geometrischen vorgegebenen Versatzein zueinander aufweisen, der zu einem gezielten zeitlichen Versatz zwischen Manipulation und Detektion führt. Der Beleuchtungsstrahl BL bildet in der Fokusebene BE einen Beleuchtungsspot und der Manipulationsstrahl bildet einen Manipulationsspot. A laser scanning microscope according to the invention differs from such a known laser scanning microscope in that it is designed for the additional second illumination beam (hereinafter manipulation beam ML), which also passes over the scanning mirror 4 , the scan lens 3 and the microscope objective 1 to the test 2 is judged so on trial 2 to focus in a second focus F ₂ , that the two foci F ₁ , F ₂ en have geometrically predetermined Versatzein each other, which leads to a specific time offset between manipulation and detection. The illumination beam BL forms an illumination spot in the focal plane BE and the manipulation beam forms a manipulation spot.

Der von einer zweiten Beleuchtungseinheit 9 ausgehende Manipulationsstrahl ML ist entweder direkt oder indirekt, über ein zusätzliches Umlenkelement 10, so auf den zweiten Strahlteiler 8 gerichtet und wird an diesem reflektiert und in den Detektionskanal eingekoppelt, dass seine Manipulationsstrahlachse A_ML um einen Winkel α in einer Ebene E, die die optische Achse A schneidet, gegenüber der optischen Achse A verkippt ist. Folglich wird der Manipulationsstrahl ML in einem zweiten Fokus F₂ auf ein zweites Pixel P₂ der Probe 2 fokussiert. Der zweite Strahlteiler 8 ist für den Beleuchtungsstrahl BL und den Detektionsstrahl DL wenigstens teilweise durchlässig und für den Manipulationsstrahl ML wenigstens teilweise reflektierend. The one from a second lighting unit 9 Outgoing manipulation jet ML is either directly or indirectly, via an additional deflecting element 10 , so on the second beam splitter 8th is directed and is reflected at this and coupled into the detection channel, that its manipulation beam axis A _ML is tilted by an angle α in a plane E, which intersects the optical axis A, with respect to the optical axis A. Consequently, the manipulation beam ML becomes in a second focus F ₂ on a second pixel P _{2 of} the sample 2 focused. The second beam splitter 8th is at least partially transparent to the illumination beam BL and the detection beam DL and at least partially reflective to the manipulation beam ML.

Im Falle, dass ein Umlenkelement 10 vorhanden ist, ist dieses vorteilhaft um eine zur langsamen Scanrichtung y parallelen ersten Achse und eine zur schnellen Scanrichtung x parallelen zweite Achse verstellbar. Damit kann der Nachlauf eines ersten Pixels P₁ gegenüber dem zweiten Pixel P₂ und damit bei gegebener Scangeschwindigkeit des Scanspiegels 4 der zeitlichen Abstand zwischen der Manipulation und der Detektion eingestellt werden. Die 2a bis 2c zeigen hierfür drei Beispiele. In the case of a deflecting element 10 is present, this is advantageously adjustable by a first axis parallel to the slow scan direction y and a second axis parallel to the fast scan direction x. Thus, the wake of a first pixel P ₁ with respect to the second pixel P ₂ and thus at a given scanning speed of the scanning mirror 4 the time interval between the manipulation and the detection can be set. The 2a to 2c show three examples for this.

Gemäß 2a läuft der Manipulationsspot dem Belichtungsspot um die fünffache Belichtungszeit pro Pixel voraus. Dazu ist die Manipulationsstrahlachse A_ML um einen Winkel α in einer Ebene E verkippt, in der in diesem Fall die schnelle Scanrichtung x liegt. According to 2a The manipulation spot precedes the exposure spot by five times the exposure time per pixel. This is the Manipulation beam axis A _ML tilted by an angle α in a plane E, in which case the fast scan direction x is located.

Gemäß 2b entspricht die Vorlaufzeit des Manipulationsspots zum Belichtungsspot die Abtastzeit einer Zeile, die sich aus den Belichtungszeiten aller Pixel einer Zeile ergibt. Dazu ist die Manipulationsstrahlachse A_ML um einen Winkel α in einer Ebene E verkippt, in der in diesem Fall die langsame Scanrichtung y liegt. According to 2 B The lead time of the manipulation spot for the exposure spot corresponds to the scanning time of one line, which results from the exposure times of all pixels of a line. For this purpose, the manipulation beam axis A _ML is tilted by an angle α in a plane E, in which case the slow scan direction y lies in this case.

Gemäß 2c entspricht die Vorlaufzeit des Manipulationsspots zum Belichtungsspot der zweifachen Abtastzeit einer Zeile zuzüglich der fünffachen Belichtungszeit pro Pixel. According to 2c corresponds to the lead time of the manipulation spot to the exposure spot twice the scan time of one line plus five times the exposure time per pixel.

Vorteilhaft ist der Manipulationsstrahl ML so in den Detektionsstrahlengang eingekoppelt, dass er die optische Achse A auf dem Scanspiegel 4 schneidet, wodurch sich eine optimale Einkopplung des Manipulationsstrahls ML über das gesamte Scanfeld ergibt. Advantageously, the manipulation beam ML is coupled into the detection beam path in such a way that it blocks the optical axis A on the scanning mirror 4 cuts, resulting in an optimal coupling of the manipulation beam ML over the entire scan field.

Indem der Manipulationsstrahl ML vorteilhaft so auf den zweiten Strahlteiler 8 gerichtet ist, dass er auf diesen mit einem radialen Abstand a zur optischen Achse A auftrifft, werden unterschiedliche Bereiche des zweiten Stahlteilers mit dem Beleuchtungsstrahl BL bzw. dem Detektionsstrahl DL einerseits und dem Manipulationsstrahl ML andererseits beaufschlagt. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, die betreffenden Bereiche jeweils maximal durchlässig bzw. maximal reflektierend auszuführen. By the manipulation beam ML advantageously so on the second beam splitter 8th is directed that it impinges on this with a radial distance a to the optical axis A, different areas of the second steel divider with the illumination beam BL and the detection beam DL on the one hand and the manipulation beam ML on the other hand acted upon. This results in the possibility of carrying out the respective areas in a maximally permeable or maximally reflective manner.

Der zweite Strahlteiler 8 ist dann vorteilhaft, wie in 3 dargestellt, nur in einem zentralen Bereich Z mit einem Radius kleiner dem Abstand a um die optische Achse A für den Beleuchtungsstrahl BL und den Detektionsstrahl DL durchlässig und darüber hinaus nur für den Manipulationsstrahl ML reflektierend, wodurch kein Energieverlust für den Manipulationsstrahl ML aufgrund des zweiten Strahlteilers 8 entsteht. The second beam splitter 8th is then beneficial, as in 3 shown only in a central region Z with a radius smaller than the distance a around the optical axis A for the illumination beam BL and the detection beam DL transmissive and beyond only for the manipulation beam ML reflecting, whereby no energy loss for the manipulation beam ML due to the second beam splitter 8th arises.

Indem der zentrale Bereich Z als Loch gebildet wird, entsteht kein Energieverlust für den Beleuchtungsstrahl BL und den Detektionsstrahl DL aufgrund des zweiten Strahlteilers 8. Darüber hinaus ist die Herstellung eines solchen zweiten Strahlteilers 8 einfacher, der dann keine differenzierte Beschichtung erfordert. Der Beleuchtungsstrahl BL und der Manipulationsstrahl ML können in diesem Fall auch durch Licht gleicher Wellenlänge gebildet sein. By forming the central region Z as a hole, there is no loss of energy for the illumination beam BL and the detection beam DL due to the second beam splitter 8th , In addition, the production of such a second beam splitter 8th easier, which then requires no differentiated coating. The illumination beam BL and the manipulation beam ML can in this case also be formed by light of the same wavelength.

Grundsätzlich ist die Größe des Manipulationsspots und des Beleuchtungsspots gleich, da der Beleuchtungsstrahl BL und der Manipulationsstrahl ML über die gleichen optischen Elemente zur Probe 2 geführt werden. Indem dem zweiten Strahlteiler 8 bezogen auf den Manipulationsstrahl ML nicht nur eine strahlumlenkende Funktion sondern auch eine strahlformende Funktion zugeordnet wird, kann der Manipulationsspot auch größer ausgeführt werden. Basically, the size of the manipulation spot and the illumination spot is the same since the illumination beam BL and the manipulation beam ML are the same as the sample through the same optical elements 2 be guided. By the second beam splitter 8th is related to the manipulation beam ML not only a beam deflecting function but also a beam-forming function is assigned, the manipulation spot can also be made larger.

Um Bereiche in der Probe 2 festlegen zu können, die nicht manipuliert werden, sind die erste und die zweite Beleuchtungseinheit 7, 9 vorteilhaft voneinander unabhängig ansteuerbar. To areas in the sample 2 To be able to determine which are not manipulated, are the first and the second illumination unit 7 . 9 advantageous independently controllable.

Für eine sehr genaue Einstellung des Winkels α ist das Umlenkelement 10 z.B. durch ein Festkörpergelenkspiegel gebildet. For a very accurate adjustment of the angle α is the deflecting element 10 eg formed by a solid-state joint mirror.

Wie aus dem Stand der Technik bekannt, können auch bei einem erfindungsgemäßen Laser-Raser-Mikroskop der erste und / oder der zweite Strahlteiler 5, 8 einen Farbfilter von mehreren verschiedenen Farbfiltern eines Filterrades darstellen, womit der Beleuchtungsstrahl BL und der Manipulationstrahl wahlweise aus verschiedenen Wellenlängenanteilen eines Beleuchtungslichtes bzw. eines Manipulationslichtes gebildet werden können. As known from the prior art, the first and / or the second beam splitter can also be used in a laser-laser microscope according to the invention 5 . 8th represent a color filter of a plurality of different color filters of a filter wheel, with which the illumination beam BL and the manipulation beam can optionally be formed from different wavelength components of an illumination light or a manipulation light.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

1 1: Mikroskopobjektiv microscope objective
2 2: Probe sample
3 3: Scanobjektiv scanning objective
4 4: Scanspiegel scanning mirror
5 5: erster Strahlteiler first beam splitter
6 6: Detektoreinheit detector unit
6.1 6.1: Detektor detector
6.2 6.2: Optik optics
7 7: erste Beleuchtungseinheit first lighting unit
8 8th: zweiter Strahlteiler second beam splitter
9 9: zweite Beleuchtungseinheit second lighting unit
10 10: Umlenkelement deflecting
BE BE: Fokusebene focal plane
A A: optische Achse optical axis
BL BL: Beleuchtungsstrahl illumination beam
A_BL A _BL: Beleuchtungsstrahlachse Lighting beam axis
DL DL: Detektionsstrahl detection beam
A_DL A _DL: Detektionsstrahlachse Detection beam axis
ML ML: Manipulationsstrahl manipulation beam
A_ML A _ML: Manipulationsstrahlachse Manipulation beam axis
F₁ F ₁: erster Fokus first focus
F₂ F ₂: zweiter Fokus second focus
α α: Winkel angle
E e: Ebene level
P₁ P ₁: erstes Pixel first pixel
P₂ P ₂: zweites Pixel second pixel
a a: Abstand distance
Z Z: zentraler Bereich central area
x x: schnelle Scanrichtung fast scan direction
y y: langsame Scanrichtung slow scan direction

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturCited patent literature

DE 102009006729 A1 [0006, 0007]
DE 10039520 A1 [0009]

Claims

Laser scanning microscope with a detection channel partly used as illumination channel, a focal plane (BE) in which a sample ( 2 ) and having an optical axis (A), essentially containing a microscope objective ( 1 ), a scan lens ( 3 ), a scanning mirror ( 4 ), which is deflectable in a fast scan direction (x) and a slow scan direction (y), a first beam splitter ( 5 ) and a detector unit ( 6 ), with a detector ( 6.1 ) and at least one optic ( 6.2 ), which are arranged along the optical axis (A), wherein via the first beam splitter ( 5 ) suitable for one of a first lighting unit ( 7 ) reflected illumination beam (BL) and for one of the sample ( 2 ) is coupled, the illumination beam (BL) in the direction of the optical axis (A) is coupled into the detection channel, so that an illumination beam axis (A _BL ) coaxial to the optical axis (A) and the illumination beam (BL) in a first focus (F ₁ ) on a first pixel (P ₁ ) (also detection _spot ) of the sample ( 2 ), starting from which the detection beam (DL), on the detector ( 6.1 ) and a second beam splitter ( 8th ) between the first beam splitter ( 5 ) and the scanning mirror ( 4 ), to which a second lighting unit ( 9 ), characterized in that the second illumination unit ( 9 ) so to the second beam splitter ( 8th ) is arranged, that one of the second illumination unit ( 9 ) outgoing manipulation jet (ML) directly or indirectly, via an additional deflecting element ( 10 ), so on the second beam splitter ( 8th ) and is coupled to the latter in the detection channel in such a way that its manipulation beam axis (A _ML ) is tilted by an angle (α) in a plane (E) which intersects the optical axis (A) with respect to the optical axis (A) such that the manipulation beam (ML) in a second focus (F ₂ ) on a second pixel (P ₂ ) (also manipulation spot) of the sample 2 is focused and wherein the second beam splitter ( 8th ) for the illumination beam (BL) and the detection beam (DL) is at least partially transmissive and at least partially reflective for the manipulation beam (ML).

Laser scanning microscope according to claim 1, characterized in that the deflecting element ( 10 ) is adjustable by a first axis parallel to the slow scan direction (y) and a second axis parallel to the fast scan direction (x), to follow the first pixel (P ₁ ) with respect to the second pixel (P ₂ ) and thus at a given scanning speed of the first pixel Scan mirror ( 4 ) to be able to set the time interval between the manipulation and the detection.

Laser scanning microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the manipulation beam (ML) on the second beam splitter ( 8th ) is directed to impinge on the latter at a radial distance (a) from the optical axis (A).

Laser scanning microscope according to claim 1 or 2, characterized in that the manipulation beam (ML) on the scanning mirror ( 4 ) intersects the optical axis (A).

Laser scanning microscope according to claim 3, characterized in that the second beam splitter ( 8th ) only in a central region (Z) with a radius smaller than the distance (a) around the optical axis (A) for the illumination beam (BL) and the detection beam (DL) is transparent and beyond only for the manipulation beam (ML) is reflective , whereby no energy loss for the manipulation beam (ML) due to the second beam splitter ( 8th ) arises.

Laser scanning microscope according to claim 5, characterized in that the central region (Z) is formed by a hole, whereby no loss of energy for the illumination beam (BL) and the detection beam (DL) due to the second beam splitter ( 8th ) arises.

Laser scanning microscope according to claim 6, characterized in that the illumination beam (BL) and the manipulation beam (ML) are formed by light of the same wavelength.

Laser scanning microscope according to one of claims 1 to 7, characterized in that there da the first and the second illumination unit ( 7 ) 9 ) are independently controllable to detect areas in the sample ( 2 ), which are not manipulated.

Laser scanning microscope according to one of claims 2 to 7, characterized in that the deflecting element ( 10 ) is a solid-state joint mirror.

Laser scanning microscope according to one of claims 1 to 7, characterized in that the first and / or the second beam splitter ( 5 ) 8th ) represent a color filter of several different color filters of a filter wheel.