DE20121970U1

DE20121970U1 - Nukleinsäuren für die Diagnose von mit der Genregulation assoziierten Krankheiten

Info

Publication number: DE20121970U1
Application number: DE20121970U
Authority: DE
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-04-06
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2011-04-07

Abstract

Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von Seq. IDNo. 1 bis Seq. IDNo. 224 und dazu komplementärer Sequenzen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder der Therapie von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang stehen.
Stand der Technik
Die Vervollständigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms hat den Bedarf hervorgehoben, die Regulation und Kontrolle von Genen weiter zu verstehen. Die Zelle übt viele Niveaus an Kontrolle auf die Gene aus, jedoch ist für die Hauptzahl von Genen der wichtigste regulatorische Mechanismus die transkriptionelle Kontrolle.
Es gibt viele Mechanismen der Genregulation, die verschiedene Familien von Proteinen, Genen und regulatorischen Sequenzen einschließen. Die Transkription von eukaryontischen Genen durch Polymerasen erfordert die vorangehende Zusammensetzung von Transkriptionsfaktoren an der Promotorregion des Gens. Dieser Faktoren binden in einer spezifischen Reihenfolge, beginnend mit der Bindung von TFIID an die TATA-Box. Dieses stellt mehrere Phasen zur Verfügung, an denen eine Genregulation stattfinden kann und von vielen eukaryontischen Gen-Regulationsmechanismen wird geglaubt, daß sie durch Ausüben von positiver oder negativer Kontrolle auf diese Prozesse funktionieren.
Gen-regulatorische Proteine erkennen kurze Abschnitte von doppelsträngiger DNA. Hunderte solcher Sequenzen wurden über das Genom hinweg identifiziert, zum Beispiel Sp1, das die Sequenz GGGCGG (in doppelsträngiger Form) erkennt, GATA-1 das die Sequenz TGATAG (in doppelsträngiger Form) erkennt und Oct-1 das ATGCAAAT (in doppelsträngiger Form) erkennt. Gen-regulatorische Proteine enthalten strukturelle Motive, die in der Lage sind, die regulatorischen Sequenzen zu erkennen, unter der Verwendung der einmaligen Muster von Wasserstoffbrücken Donoren, Wasserstoffbrücken Akzeptoren und hydrophoben Bereichen in der großen und kleinen Grube der DNA. Mehrere Familien von strukturellen Motiven sind bekannt, einschließlich des Helix-Turn-Helix-Motivs, das aus Aminosäuren zusammengesetzt ist, das Zinkfingermotiv, das eine oder mehrere Moleküle von Zink als die strukturelle Komponente verwendet, den Leucin "Zipper" und das Helix-Loop-Helix-Motiv.
Andere Mechanismen der Genregulation schließen die Chromatin-Verpackung ein. Chromatin, das stark kompaktiert ist, ist nicht zur Transkription in der Lage und in einer weniger kompensierten Form ist die DNA immer noch auf Nucleosomen gepackt. Nucleosomen, die am Standpunkt der Transkriptionsstelle positioniert sind, blockieren die Zusammensetzung von Transkriptionsfaktoren, und diese müssen entfernt werden. Zusätzlich erfordert die Gen-Transkription eine extensive Windung und Entwindung der supercoiled DNA. Obwohl die genauen Mechanismen der DNA Verpackung nicht vollständig verstanden sind schließen Sie die Verwendung einer Vielzahl von Helikasen, Gyrasen und Topoisomerasen ein. Eine weitere Diskussion der Genregulation kann in Standard-molekularbiologischen Lehrbüchern, zum Beispiel Alberts et. al. 'Molecular Biology of the cell' Garland Publishing gefunden werden.
Unterbrechungen von Gen-Regulationswegen wurden mit einer großen Vielzahl von Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf:

Schwere kombinierte Immundefizienz-Erkrankung: Misaki et. al. 'Gene-Transferred Oligoclonal T Cells Predominantly Persist in Peripheral Blood from an Adenosine Deaminase-Deficient Patient during Gene Therapy.' Mol Ther 2001 Jan;3(1):24-27.
Cardiale Beschädigung: Pieper et. al. 'Myocardial postischemic injury is reduced by polyADPripose polymerase-1 gene disruption.' Mol Med 2000 Apr;6(4):271-82
Entzündungsantwort: Lekstrom-Himes J, Xanthopoulos KG 'CCAAT/enhancer binding protein epsilon is critical for effective neutrophil-mediated response to inflammatory challenge.' Blood 1999 May 1;93(9):3096-105.
Hämophilie B: Crossley M, Brownlee GG 'Disruption of a C/EBP binding site in the factor IX promoter is associated with haemophilia B.' Nature 1990 May 31;345(6274):444-6.
Werner Syndrom: Li B, Comai L 'Requirements for the nucleoytic processing of DNA ends by the Werner syndrome protein:Ku70/80 complex.' J Biol Chem 2001 Jan 4.
Asthma: Nakamura et. al. 'Gene expression of the GATA-3 transcription factor is increased in atopic asthma.' J Allergy Clin Immunol 1999 Feb;103(2 Pt 1):215-22.
HDR Syndrom: Van Esch et. al. 'GATA3 haplo-insufficiency causes human HDR syndrome.' Nature 2000 Jul 27;406(6794):419-22.
Congenitale Herzdefekte: Srivastava D 'HAND proteins: molecular mediators of cardiac development and congenital heart disease.' Trends Cardiovasc Med 1999 Jan-Feb;9(1-2):11-8.
Saethre-Chotzen Syndrom: El Ghouzzi et. al. 'Mutations within or upstream of the basic helix-loop-helix domain of the TWIST gene are specific to Saethre-Chotzen syndrome.' Eur J Hum Genet 1999 Jan;7(1):27-33.
Nierenerkrankung: Morello et. al. 'Regulation of glomerular basement membrane collagen expression by LMX1B contributes to renal disease in nail patella syndrome.' Nat Genet. 2001 Feb;27(2):205-208.
Präeklampsie: Rajakumar et. al. 'Selective Overexpression of the Hypoxia-Inducible Transcription Factor, HIF-2alpha, in Placentas from Women with Preeclampsia.' Biol Reprod. 2001 Feb;64(2):499-506.
Ogata et. al. 'Inducible expression of basic transcription factor-binding protein 2 (BTEB2), a member of zinc finger family of transcription factors, in cardiac allograft vascular disease.' Transplantation. 2000 Dec 15;70(11):1653-6.
Colorectaler Krebs: Rask et. al. 'Increased expression of the transcription factors CCAAT-enhancer binding protein-beta (C/EBBeta) and C/EBzeta (CHOP)correlate with invasiveness of human colorectal cancer.' Int J Cancer. 2000 May 1;86(3):337-43.
Schilddrüsenkrebs: Kebebew et. al. 'The helix-loop-helix transcription factor, Id-1, is overexpressed in medullary thyroid cancer' Surgery. 2000 Dec;128(6):952-7.
Speiseröhrenkrebs: Saeki et. al. 'Expression of ets-1 transcription factor is correlated with penetrating tumor progression in patients with squamous cell carcinoma of the esophagus' Cancer. 2000 Oct 15;89(8):1670-6.

Die Vielfalt von Mechanismen, die an der Regulation von Genen beteiligt sind, stellt ein alternatives Niveau zur Verfügung, auf das Therapien und Diagnosen für Erkrankungen abzielen sollte. Insbesondere kann dies für Erkrankungen relevant sein, bei denen augenblickliche Therapien unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen können oder dabei versagen, eine effektive Behandlung zur Verfügung zu stellen. Für Krebspatienten stellen solche Verfahren einen beträchtlichen Vorteil über herkömmliche Verfahren dar, wie zum Beispiel Chemotherapie mit ihrem massiven Nebenwirkungen, die manchmal zu nicht akzeptabler Morbidität führen oder zum Tode des Patienten führen. In der Praxis begrenzen diese unerwünschten Nebenwirkungen, die mit Krebstherapien assoziiert sind, häufig die Behandlung, die einem Patienten helfen könnte.
Eine globale Analyse des Status der Gen-regulatorischen Mechanismen würde eine Basis für die Entwicklung von geeigneten und spezifischen Therapien für die vielen Erkrankungen zur Verfügung stellen, die mit der Genregulation assoziiert sind. Solche Analyse kann auf eine Gen-spezifische Weise durchgeführt werden, basierend auf den Ergebnissen von Geneexpression, zum Beispiel der DNA Microarray Analyse von mRNA Expression oder proteomischer Analyse. Der nächste Schritt wäre es dann, auf die kausalen Faktoren zu schauen, die an früheren Phasen in den regulatorischen Mechanismen beteiligt sind. Die DNA Methylierung stellt ein neues Niveau an Information zur Verfügung, auf dem das Genom analysiert werden kann.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, voll-ständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrizes, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8):1367-73). Die Kopplung eines „charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Aufgabe der Erfindung
Im Hinblick auf das oben Gesagte ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von Genen zur Verfügung zu stellen, die mit der Genregulation assoziiert sind, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen sowie ein Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass genetische und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, zur Diagnose und/oder der Therapie von mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das zur Verfügung stellen einer Nukleinsäure, die einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene enthält, gelöst. In der Tabelle sind nach den aufgelisteten Gen-Bezeichnungen die jeweiligen Datenbanknummern (Zugangsnummern) angegeben, die die dazugehörigen Gensequenzen als einmalig definieren. GenBank am National Institute of Health wurde als die zu Grunde liegende Datenbank unter der Internet Adresse www.ncbi.nlm.nih.gov verwendet.
Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen und epigenetische Parametern gebracht werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und epigenetischen Parameter von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. – 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, daß das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. – 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers ist.
Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene mindestens ein Oligomer umfaßt.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte „Primer-Oligonukleotide" zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, daß eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene), Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfaßt:
In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, daß an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter „chemischer Vorbehandlung" verstanden.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder Kombinationen davon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse angewendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primer-Oligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 – 2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfaßt der Satz von Primer-Oligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen und/oder der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primer-Oligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie kein CpG Dinukleotid enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der Amplifikation mindestens ein Primer-Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, daß die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, daß an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.
Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Ver fahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose und/oder Therapie einer mit der Genregulation assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, verwendet werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose und/oder der Therapie von HIV-Infektion, neurodegenerativer Erkrankungen, Graft-versus-host Erkrankung, Alterung, Glomerularen Erkrankungen, Lewis-Körper Erkrankung, Arthritis, Arteriosklerose, festen Tumoren und Krebsarten.
Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementäre Sequenzen und/oder die chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Sequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten Gene können für die Diagnose und/oder der Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder Therapeutikums zur Diagnose und/oder der Therapie von Krankheiten, die mit der Genregulation assoziiert sind durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, wobei das Diagnostikum und/oder das Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikum für Krankheiten, die mit der Genregulation assoziiert sind, durch Analyse von Methylierungsmustern von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikum dadurch gekennzeichnet ist, das es mindestens eine Nu kleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen enthält.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.
"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Invertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele unter Bezug auf die beigefügte Figur weiter verdeutlicht werden, ohne hierauf eingeschränkt zu werden.
1
1 zeigte die Hybridisierung von Fluoreszenz-markierten Amplifikaten an ein Oberflächengebundenes Oligonukleotid. Probe I stammt von pilocytischem Astrocytom (Hirntumor)-Gewebe und Probe II stammt von Grad II Astrocytom (Hirntumor)-Gewebe. Die Fluoreszenz an einem Punkt zeigt die Hybridisierung des Amplifikats an. Die Hybridisierung an ein CG Oligonukleotid zeigt an, daß die Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird, die Hybridisierung an ein TG Oligonukleotid zeigt an, daß keine Methylierung an der Cytosin-Position analysiert wird.
Sequenz ID No. 1 bis Sequenz ID No. 224
Die Sequenz ID Nos. 1 bis 224 zeigen Sequenzen von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, gemäß der Erfindung. Sequenzen, die ungerade Sequenznummern haben (z.B., Seq. ID No. 1, 3, 5,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind. Sequenzen, die gerade Sequenznummern aufweisen (z.B., Seq. ID No. 2, 4, 6,...) zeigen in jedem Fall Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von verschiedenen Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, die komplementär zu den voranstehenden Sequenzen sind (z.B., die komplementäre Sequenz zu Seq. ID No. 1 ist Seq. ID No. 2, die komplementäre Sequenz zu Seq. ID No. 3 ist Seq. ID No. 4, usw.)
Sequence ID Nos. 225 to 228
Seq. ID No. 225 bis Seq. ID No. 228 zeigen spezifische Oligonukleotid-Sequenzen, wie in Beispiel 1 verwendet.
Beispiel 1: Methylierungsanalyse in dem mit der Genregulation assoziierten Gen p53
Das folgende Beispiel betrifft ein Fragment eines Gens, das mit der Genregulation assoziiert ist, in diesem Fall p53, worin eine spezifische CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin analysiert wird.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, daß alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, daß eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben.
Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Die chemisch umgewandelte DNA (Seq ID No. 221) dient dann dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min, 90-100 °C) bei alkalischem pH-Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens p53 analysiert. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden GTGATAAGGGTTGTGAAGGA (Seq. ID No. 225) und CAAAAACTTACCCAATCCAA (Seq. ID No. 226) ein definiertes Fragment der Länge 595 by amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise AACCCCTACGAAACTCCT (Seq. ID No. 227), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 401 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primer-Oligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit kann der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt abgeleitet werden.
Um den Methylierungsstatus der Position zu überprüfen, wird eine Probe des Amplifikats weiterhin an ein anderes Oligonukleotid hybridisiert, das vorher an eine feste Phase gebunden wurde. Dieses Oligonukleotid ist identisch zu dem Oligonukleotid, das vorher benutzt wurde, um den Methylierungsstatus der Probe zu analysieren, mit der Ausnahme der fraglichen Position. An der zu analysierenden Position umfaßt das Oligonukleotid eine Thymin-Base, im Gegensatz zu einer Cytosin-Base d.h. die Sequenz AACCCCTACAAAACTCCT (Seq. ID No. 228). Daher findet die Hybridisierungsreaktion nur statt, falls ein nicht-methyliertes Cytosin an der zu analysierenden Positionen vorhanden ist.
Die Analyse wurde an zwei Gewebeproben durchgeführt, Probe 1 aus pilocytischem Astrocytom (Hirntumor) Gewebe und Probe 2 aus Grad II Astrocytom (Hirntumor) Gewebe. Aus den Ergebnissen (1) kann gesehen werden, daß Probe eines an Position 401 des Amplifikat methyliert war, wohingegen Probe 2 ein Gemisch von sowohl methylierten als auch nicht methylierten Zellen an derselben Position aufwies.
Beispiel 2: Diagnose von mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen
Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit der Genregulation assoziierten Erkrankungen herzustellen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Personen. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine Methylierungs-sensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und die Muster können z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.
Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten gezielt mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
Beispiel 2 kann zum Beispiel für die folgenden Erkrankungen durchgeführt werden: Schwere kombinierte Immundefizienz-Erkrankung, kardiale Erkrankungen, Entzündungsantwort, Hämophilie, Werner Syndrom, Asthma, HDR Syndrom, Saethre-Chotzen Syndrom, renale Erkrankung, Präeclampsie, Graft-versus-Host Erkrankung, solide Tumore und Krebsarten.
Tabelle 1
Auflistung von besonders bevorzugten Genen der vorliegenden Erfindung, die mit der Genregulation assoziiert sind.

Claims

Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementärer Sequenzen.
Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind, gemäß einer der Sequenzen gemäß den Genen CBFB (L20298), ELF1 (M82882), ETV3 (L16464), ETV4 (D12765), LYL1 (M22637), RENBP (U52112), TAF2C2 (Y09321), TCF3 (M31222), H4FI (NM_003544), ADA (NM_000022), ATF3 (NM_001674), CEBPD (NM_005195), CHD1L (NM_004284), CTPS (NM_001905), DCTD (NM_001921), EIF2B1 (NM_001414), ELF3 (NM_004433), ELK4 (NM_021795), ETV5 (NM_004454), FOXOlA (NM_002015), HIVEP1 (NM_002114), HMG2 (NM_002129), ID1 (NM_002165), ID3 (NM_002167), ID4 (NM_001546), LAF4 (NM_0022859), MAFG (NM_002359), MHC2TA (NM_000246), ODC1 (NM_002539), PBX3 (NM_006195), PCNA (NM_002592), POU2AF1 (NM_006235), PRPS1 (NM_002764), RARG (NM_000966), RECQL (NM_002907), RXRA (NM_002957), TIAL1 (NM_003252), ZNF173 (NM_003449), ATBF1 (NM_006885), FLI1 (NM_002017), NUMA1 (NM_006185), POU2F2 (NM_002698), SP100 (NM_003113) und dazu komplementärer Sequenzen.
Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer, wobei das Oligomer in jedem Fall mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden umfaßt, die an eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen, die mit der Genregulation assoziiert sind gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 nach Anspruch 1 oder eine chemisch vorbehandelte DNA von Genen nach Anspruch 2 und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert oder dazu identisch ist.
Oligomer nach Anspruch 3, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfaßt.
Oligomer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.
Satz von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomere nach einem der Ansprüche 3 bis 5.
Satz von Oligomeren nach Anspruch 6, umfassend Oligomere zur Detektion des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide von einer der Sequenzen gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 nach Anspruch 1 oder einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2 und dazu komplementärer Sequenzen.
Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden nach Anspruch 3, die als Primer-Oligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementären Sequenzen oder einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2 und dazu komplementären Sequenzen oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
Auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 224 und dazu komplementärer Sequenzen und/oder einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2 stehenden Erkrankungen, wobei dem mindestens ein Oligomer nach einem der Ansprüche 3 bis 5 an eine feste Phase gekoppelt vorliegt.
Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Array nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure nach einem der voranstehenden Ansprüche umfaßt.
Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 3 bis 5.