DE20121966U1

DE20121966U1 - Nukleinsäuren für die Diagnose von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten

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Publication number: DE20121966U1
Application number: DE20121966U
Authority: DE
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2011-07-03

Description

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E30047/A
Epigenomics AG

Nukleinsäuren für die Diagnose von mit dem Immunsvstem assoziierten Krankheiten Gebiet der Erfindung

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen, die mit den genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen und insbesondere deren Methylierungsstatus in Zusammenhang stehen.

Stand der Technik

Sehr viele menschliche Erkrankungen stehen in Zusammenhang mit dem Immunsystem. Das Immunsystem erkennt in den Körper eingerungene Mikroorganismen (Bakterien, Viren, Pilze) und macht diese unschädlich. Man unterscheidet dabei zwei Systeme, die eng zusammenwirken. Das sogenannte unspezifische, humorale Abwehrsystem richtet sich ganz allgemein gegen eingedrungene Krankheitserreger und versucht - unabhängig von der Art der Erreger und der auslösenden Erkrankung - sie abzutöten. Das zweite System ist das spezifische, zelluläre Abwehrsystem. Es geht viel gezielter gegen Krankheitserreger vor, indem es, entsprechend dem Aufbau des jeweiligen Erregers, Antikörper bildet, mit deren Hilfe die Krankheit überwunden wird. Bestimmte Erreger werden bei erneutem Auftreten wiedererkannt und rascher beseitigt; in manchen Fällen ist der Organismus lebenslang immun. Immunerkrankungen beziehen sich jedoch nicht nur auf Krankheitsbilder, die von Erregern hervorgerufen werden und die ein gesundes Immunsystem in der Regel erfolgreich bekämpfen kann. Bei vielen chronischen Erkrankungen wie Rheuma oder Asthma ist ein sogenannter Immundefekt wesentlich am Krankheitsgeschehen beteiligt. Nicht zuletzt haben Streß und andere psychische Belastungen einen negativen Einfluß auf das Immunsystem.

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Krankheiten, die durch Fehl- oder Überreaktionen eines an sich intakten Immunsystems verursacht werden, werden unter den Überbegriffen Allergien, wie z. B. Asthma (Kuo ML, Huang JL, Yeh KW, Li PS, Hsieh KH. Evaluation of Thl/Th2 ratio and cytokine production profile during acute exacerbation and convalescence in asthmatic children. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001 Mar;86(3):272-6) und Autoimmunkrankheiten wie &zgr;. B. Artheriosklerose (Gordon PA, George J, Khamashta MA, Harats D, Hughes G, Shoenfeld Y. Atherosclerosis and autoimmunity. Lupus. 2001;10(4):249-52), systemic lupus erythematosus (Lorenz HM, Herrmann M, Winkler T, Gaipl U, Kalden JR. Role of apoptosis in autoimmunity. Apoptosis. 2000 Nov;5(5):443-9) oder Typ I Diabetes mellitus (Not T, Tommasini A, Tonini G, Buratti E, Pocecco M, Tortul C, Valussi M, Crichiutti G, Berti I, Trevisiol C, Azzoni E, Neri E, Torre G, Martelossi S, Soban M, Lenhardt A, Cattin L, Ventura A. Undiagnosed coeliac disease and risk of autoimmune disorders in subjects with Type I diabetes mellitus. Diabetologia. 2001 Feb;44(2):151-5) zusammengefasst. Auch zwischen dem Immunsystem und Krebserkrankungen wie Anämie (Bron D, Meuleman N, Mascaux C. Biological basis of anemia. Semin Oncol. 2001 Apr;28(2 Suppl 8): 1-6), Pankreaskarzinom (Shimura T, Tsutsumi S, Hosouchi Y, Kojima T, Kon Y, Yonezu M, Kuwano H. Clinical significance of soluble form of HLA class I molecule in Japanese patients with pancreatic cancer. Hum Immunol. 2001 Jun;62(6):615-9), chronische myeloische Leukämie (Jahagirdar BN, Miller JS, Shet A, Verfaillie CM. Novel therapies for chronic myelogenous leukemia. Exp Hematol. 2001 May;29(5):543-56), akute lymphoblastische Leukämie (Velders MP, ter Horst SA, Kast WM. Prospect for immunotherapy of acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2001 May;15(5):701-6) oder akute myeloische Leukämie (Harrison BD, Adams JA, Briggs M, Brereton ML, Yin JA. Stimulation of autologous proliferative and cytotoxic T-cell responses by "leukemic dendritic cells" derived from blast cells in acute myeloid leukemia. Blood. 2001 May 1;97(9):2764-71) bestehen zahlreiche Zusammenhänge. Die Zellen des menschlichen Immunsystems erkennen viele Tumorzellen als fremdartig und versuchen, sie anzugreifen. Dennoch ist bei Krebskranken die Körperabwehr nicht in der Lage, den Tumor zu zerstören. Krebszellen zeigen gegenüber normalen Körperzellen veränderte Eigenschaften und bilden häufig auch andere Eiweiße, die bei der Erkennung von 'Selbst' und 'Fremd' im Immunsystem eine entscheidende Rolle spielen. Sie werden im Körper den T-Killerzellen, gebunden an MHC-Moleküle an der Außenseite von Zellen, präsentiert. Die T-Killerzellen kontrollieren, ob die Peptide von normalen Eiweißen stammen. Ist ein Peptid nicht aus einem normalen,

körpereigenen Eiweiß herausgeschnitten, leiten die T-Zellen die Vernichtung der Zelle ein, die das veränderte oder fremde Peptid zur Schau stellt.

Weitere Erkrankungen, die mit dem Immunsystem in Zusammenhang stehen sind die Alzheimer Erkrankung (Smits HA, van Beelen AJ, de Vos NM, Rijsmus A, van der Bruggen T, Verhoef J, van Muiswinkel FL, Nottet HS. Activation of human macrophages by amyloidbeta is attenuated by astrocytes J Immunol. 2001 Jun l;166(ll):6869-76), acquired immune deficiency syndrome (Aids) (McGrath KM, Hoffman NG, Resch W, Nelson JA, Swanstrom R. Using HIV-I sequence variability to explore virus biology. Virus Res. 2001 Aug;76(2): 137-60.), progressive fokale Epilpsy (Ponomareva EN, Khmara ME, Nedz'ved¹ MK, Drakina SA, Kolomiets AG, Protas II [The clinical characteristics of progressive focal epilepsy with a herpetic etiology]. Lik Sprava. 2000 Jul-Aug;(5):106-10), primär sklerosierende Cholangitis 1: Bo X, Broome U, Remberger M, Sumitran-Holgersson S. Tumour necrosis factor alpha impairs function of liver derived T lymphocytes and natural killer cells in patients with primary sclerosing cholangitis. Gut. 2001 Jul;49(l):131-41) oder Neurofibromatose (Gerosa PL, Spinelli M, Giussani G, Vai C, Fontana A, Canepari C. Neurofibromatosis (NFl) and neuroleprosy: immunoreaction against pathologic Schwann-cells. Physiopathogenetic observations. Minerva Med. 2001 Apr;92(2):89-97).

Behandlungsmethoden bei Immunerkrankungen konzentrieren sich vor allem auf Allergien, Autoimmunerkrankungen sowie die Entwicklung von Vaccinen, um stärkere Immunantworten gegen pathogene Organismen und Krebs (Fahrer AM, Bazan JF, Papathanasiou P, Nelms KA, Goodnow CC. A genomic view of immunology. Nature. 2001 Feb 15;409(6822):836-8) zu stimulieren.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

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Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch &ldquor;normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr;5(2):94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation

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ontogeny of the Hl 9 methylation imprint. Nat Genet. 1997 Nov;17(3):275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine &ldquor;Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31, WO 95/00669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum MoI Genet. 1997 Mar;6(3):387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(l-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine

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sehr leistungsfähige Entwicklung fur die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25;23(8): 1367-73). Die Kopplung eines &ldquor;charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von &ldquor;charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genonische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch

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und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Aufgabenstellung

Die vorliegende Erfindung soll Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen und ein Verfahren bereitstellen, welches sich zur Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich insbesondere Cytosin-Methylierungsmuster zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen besonders eignen.

Beschreibung

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen, sowie ein Verfahren bereit zu stellen, welches sich zur Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen besonders eignet. Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter und insbesondere das Cytosin-Methylierungsmuster von mit dem Immunsystem assoziierten Genen zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen besonders eignen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 gelöst. In der Tabelle werden hinter den aufgeführten Genbezeichnungen jeweils die Datenbank-Nummern (Accession-Nummern) aufgeführt, welche die zugehörigen Gensequenzen als einzigartig definieren. Als zugrunde liegende Datenbank wurde GenBank verwendet, deren Internet-Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov lautet.

Die chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen und epigenetische Parametern gebracht werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder

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Oligomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomeren gemäß Tabelle 1 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomersonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und epigenetischen Parameter von mit dem Immunsystem assoziierten Genen erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. - 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers ist, im Falle von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. - 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers ist.

Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No. 1 bis Seq ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 mindestens ein Oligomer umfasst.

Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 &eegr;

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(Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA von mit dem Immunsystem assoziierten Genen gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 verwendet werden.

Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfugung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dieses Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzugterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.

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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfasst:

In einem ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.

Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien, Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder Kombinationen davon.

Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.

Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer

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bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.

Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.

Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz

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von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Sonden, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5¹-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.

Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann.

Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem

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-13-Immunsystem
assoziierten Genen verwendet.

Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustem von mit dem Immunsystem assoziierten Genen verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose und/oder Therapie bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb von mit dem Immunsystem assoziierten Genen.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose und/oder Therapie von Augenerkrankungen, prolieferativer Retinopathie, neovascularem Glaukom, soliden Tumoren, Gewebsentzündungen, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinopathie, macularer Degeneration aufgrund von Neovascularisation, Psoriasis, Artheriosklerose, entzündliche Darmerkrankungen, ulcerativem Darmkatarrh, Morbus Crohn und Krebserkrankungen.

Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No.2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomere gemäß Tabelle 1 können für die Diagnose und/oder Therapie von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von mit dem Immunsystem assoziierten Genen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums und/oder Therapeutikums zur Diagnose und/oder Therapie von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustem von mit dem Immunsystem assoziierten Gene, wobei das Diagnostikum und/oder Therapeutikums dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum und/oder Therapeutikums zur von mit dem Immunsystem assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustem von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, bei dem die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb von mit dem Immunsystem assoziierten Genen mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.

Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60⁰C in 2,5 &khgr; SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.

Mit dem Begriff "funktioneile Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Polypeptid ähnliche Aktivität aufweisen.

"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von mit dem Immunsystem assoziierten Genen und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen. Polymorphismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.

"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen von mit dem Immunsystem assoziierten Genen und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann,

ΦΦ· &phgr;&phgr;&phgr;

-15-sondern
wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.

Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.

Seq ID No. 1 bis Seq ID No. 2420

Sequenzen mit ungeraden Sequenznummern (z.B Seq. ID No. 1, 3, 5, ...) zeigen jeweils unterschiedliche Sequenzen der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit dem Immunsystem assoziierten Genen. Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z.B Seq. ID No. 2, 4, 6, ...) zeigen jeweils die zu den unterschiedlichen Sequenzen, komplementären Sequenzen (z.B ist die zu Seq. ID No. 1 komplementäre Sequenz Seq. ID No.2, zu Seq. ID No.3 die komplementäre Sequenz Seq. ID No.4 usw.) der chemisch vorbehandelten genomischen DNAs von mit dem Immunsystem assoziierten Genen.

Seq ID No. 2421 bis Seq ID No. 2424

Seq ID No. 2421 bis Seq ID No. 2424 zeigen Sequenzen von Oligonukleotiden, die in den Beispielen verwendet wurden.

Beispiel 1: Durchführung der Methylierungsanalyse in dem mit dem Immunsystem assoziierten Gen ESRl (Estrogen Receptor)

Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens ESRl, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung zu untersuchen ist.

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, daß alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, daß eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt

-16-

man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschließend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens ESRl untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden AGGGGGAATTAAATAGAAAGAG (SEQ ID NO: 2421) und

CAATAAAACCATCCCAAATACT (SEQ ID NO: 2422) ein definiertes Fragment der Länge 662 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TTTAATTTCGGGTTGTGT (SEQ ID NO: 2423) zum Nachweis für einen methylierten Zustand und TTTAATTTTGGGTTGTGT (SEQ ID NO: 2424) zum Nachweis für einen nicht-methylierten Zustand, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 527 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt. Im vorliegenden Fall (Figur 1) werden für die Oligomere in Abbildung A ein nicht methylierter Status und für die Oligomere in Abbildung B ein teilweise methylierter Status nachgewiesen.

Beispiel 2: Diagnose von mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankungen

Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit dem Immunsystem assoziierten Erkrankung durchzuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Patienten. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind, durch z. B. markierte Sonden identifiziert. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und die Muster können z.B. mittels Clustering-Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.

Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe

-17-zuzuordnen
und diese Patienten gezielt zu mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.

Das Beispiel 2 lässt sich zum Beispiel für die folgenden Erkrankungen ausführen: Asthm, Artheriosklerose, Anämie, Pankreaskarzinom, akute myeloische Leukämie, Alzheimer Erkrankung, Aids, Epilepsie, Neurofibromatose.

Tabelle 1

Liste der bevorzugten Gene, die mit dem Immunsystem assoziiert sind in bezug auf die Erfindung

Gen	Genbank Eintrag Nr. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
AlBG	T80683
C4A	K02403
C4BPAL2	X81360
CDlA	M27735
CD20	L23418
CDR2	M63256
CENPB	X05299
COLl 1A2	U32169
CRlL	M31230
CYP2A	X06401
EBF	AA504812
ERCC2	L47234
ESD	M13450
ETV4	D12765
FCGR2C	M90737
FLG	M24355
FNl	M10905
ITGAl	X68742
ITGAD	Ü40274
KRT4	X07695
KSR	U43586
LY9	L42621
MEKKl	U29671
MFAP4	P8486
MMP18	Y08622
MYCLl	M19720
NOTCHl	M73980
PDE7A	L12052
PIK3R1	M61906
SLC9A1	M81768
TCF3	M31222
TCRA	M12959
TCRB	K02779

-18-

TCRG	M27331
TLR5	U08888
TNFSFIl	AF013171
UBC	AB009010
ZNF121	M99593
ZRK	L08961
ALPPL2	NM 031313
AHSG	NM 001622
FCGR3A	NM 000569
FUT3	NM 000149
IL1R2	NM 004633
IL2RB	HM 000878
LHB	NM 000894
MDH2	NM 005918
SLCl 1&Agr;2	NM 000617
OMG	NM 002544
PIK3CA	NM 006218
TPMl	NM 000366
TUB	NM 003320
ABAT	NM 000663
ACADL	NM 001608
ACOl	NM 002197
ADAMlO	NM 001110
ADDl	NM 014189
ADH4	NM 000670
ADRA2C	NM 000683
AGA	NM 000027
AGTR2	NM 000686
AKTl	NM 005163
ALDH6	NM 000693
AMPH	NM 001635
&Agr;&Ngr;&KHgr;&Agr;4	NM 001153
&Agr;&Rgr;&Bgr;&Agr;2	NM 005503
APC	NM 000038
&Agr;&Rgr;&Ogr;&Agr;2	NM 001643
ARHGAPl	NM 004308
ATOXl	NM 004045
&Agr;&Tgr;&Rgr;2&Bgr;2	NM 001683
&Agr;&Tgr;&Rgr;4&Bgr;	NM 000705
ATR	NM 001184
AUH	NM 001698
AXL	NM 001699
BCL2	NM 000633
BENE	NM 005434
BID	NM 001196
BMIl	NM 005180
&Bgr;&Ngr;51&Tgr;	NM 001722
BUBI	NM 004336

-19-

ClR	NM 001733
C4BPB	NM 000716
C5R1	NM 001736
CASP3	NM 004346
CASP7	NM 001227
CBFB	NM 001755
CCR4	NM 005508
CD151	NM 004357
CD36L1	NM 005505
CD4	NM 000616
CD81	NM 004356
CDH12	NM 004061
CDW52	NM 001803
CEL	NM 001807
CESl	NM 001266
CGA	NM 000735
CHSl	NM 000081
CLDN3	NM 001306
CNK	NM 004073
CSF2RA	NM 006140
CTSK	NM 000396
CX3CR1	NM 001337
CYBB	NM 000397
CYPIlA	NM 000781
DCC	NM 005215
DFFB	NM 004402
DOCKl	NM 001380
DPYD	NM 000110
ELA VL2	NM 004432
ELA VL4	NM 021952
&Egr;&Rgr;&Bgr;41	NM 004437
&Egr;&Rgr;&EEgr;&Agr;3	NM 005233
&Egr;&Rgr;&EEgr;&KHgr;2	NM 001979
EPS 15	NM 001981
ETV6	NM 001987
F2	NM 000506
F8A	NM 012151
FABP6	NM 001445
FADD	NM 003824
FANCE	NM 021922
FCAR	NM 002000
FGA	NM 021871
FGB	NM 005141
FGFR3	NM 000142
FGG	NM 000509
HFL3	NM 005666
FOXOlA	NM 002015
ADAM2	NM 001464

FUCAl	NM 000147
FUT2	NM 000511
FY	NM 002036
GABRA5	NM 000810
GABRA6	NM 000811
GAS	NM 000805
GAS6	NM 000820
GBA	NM 000157
GFIl	NM 005263
GH2	NM 002059
GHR	NM 000163
GIF	NM 005142
GNAQ J	NM 002072
GP9	NM 000174
GPRl 5	NM 005290
GPR30	NM 001505
GRB14	NM 004490
GRIKl	NM 000830
GUCY2D	NM 000180
HADHA	NM 000182
NRGl	NM 013964
HIVEPl	NM 002114
HLALS	NM 001531
HLCS	NM 000411
HMXl	NM 018942
HNRPD	NM 002138
HSA277165	NM 018411
HRG	NM 000412
HSPG2	NM 005529
HTN3	NM 000200
HTR2A	NM 000621
HTR7	NM 000872
IFNAl	NM 024013
ILlORA	NM 001558
ILIA	NM 000575
ILlB	NM 000576
ILlRl	NM 000877
IL3RA	NM 002183
IL9	NM 000590
ILFl	NM 004514
ILF2	NM 004515
SCYBlO	NM 001565
INPP5D	NM 005541
ITGAX	NM 000887
ITGBl	NM 002211
ITGB3	NM 000212
ITGB5	NM 002213
ITGB7	NM 000889

JM 005546

:CNJ3

JM 002239

³NAl

JM 002264

.ECT2

JM 002302

.EPR

JM 002303

JM 005577

:CNH2

KM 000238

,SPl

NM 002339

,TF

NM 002343

MAB21L1

NM 005584

MAL

NM 002371

MASPl

NM 001879

1CF2

NM 005369

d»3K3

002401

IMP 16

NM 022564

IMP 17

NM 016155

MMP23A

NM 004659

MMP7

NM 002423

MYC

NM 002467

NAGA

000262

NAT2

JM 000015

NDUFS2

JM 004550

NEB

NM 004543

NEUl

NM 000434

NFATC4

NM 004554

NFE2L2

NM 006164

NFRKB

NM 006165

NGFB

NM 002506

NTF3

NM 002527

NUMAl

NM 006185

TNRCIl

NM 005120

SLC22A1L

NM 002555

DUSP2

NM 004418

PAF AH2

NM 000437

PAPPA

JM 002581

PCMl

JM 006197

PCTKl

NM 006201

PDE4A

NM 006202

PDE4B

NM 002600

PEXlO

NM 002617

SERPINB9

JM 004155

PIGA

JM 002641

PLAGLl

JM 002656

POU2AF1

NM 006235

PRKGl

NM 006258

MAPKlO

NM 002753

MAPK9

JM 002752

PROPl

JM 006261

PSD	NM 002779
PTK2B	NM 004103
PTN	NM 002825
PTPN13	NM 006264
PTPN6	NM 002831
PTPRD	NM 002839
PTPRG	NM 002841
QDPR	NM 000320
RAC3	NM 005052
RELA	NM 021975
REQ	NM 006268
RMSAl	NM 002932
RSN	NM 002956
S100A7	NM 002963
S100A8	NM 002964
IQGAPl	NM 003870
SCNlB	NM 001037
SCN5A	NM 000335
SCNNlG	NM 001039
SCYA14	NM 004166
SCYA7	NM 006273
SDHC	NM 003001
SELPLG	NM 003006
SFTP A2	NM 006926
SGSH	NM 000199
SHMT2	NM 005412
MYHIl	NM 002474
SNRPN	NM 003097
SOATl	NM 003101
SORLl	NM 003105
SPPl	NM 000582
SSTRl	NM 001049
STATI2	NM 003877
STXlB	NM 003163
TCF8	NM 030751
TCPl	NM 030752
TF	NM 001063
TGFBI	NM 000358
TGFBR3	NM 003243
TGM2	NM 004613
TLRl	NM 003263
TM4SF7	NM 003271
TNFAIP6	NM 007115
TNFRSFlA	NM 001065
TNFSF12	NM 003809
TPH	NM 004179
TPIl	NM 000365
TRAF2	NM 021138

TRAF5	NM 004619
TSTA3	NM 003313
TTR	NM 000371
UBEl	NM 003334
UBE2V2	NM 003350
UMPK	NM 012474
UP	NM 003364
UPKlB	NM 006952
USP7	NM 003470
VASP	NM 003370
VDR	NM 000376
NSEPl	NM 004559
ZFP161	NM 003409
AQPl	NM 000385
BDKRBl	NM 000710
F13A1	NM 000129

Claims

1. Nukleinsäure von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 2420 und dazu komplementären Sequenzen.

2. Nukleinsäure von mit dem Immunsystem assoziierten Genen, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA gemäß einer der Sequenzen der Gene A1BG (T80683), C4A (K02403), C4BPAL2 (X81360), CD1A (M27735), CD20 (L23418), CDR2 (M63256), CENPB (X05299), COL11A2 (U32169), CR1L (M31230), CYP2A (X06401), EBF (AA504812), ERCC2 (L47234), ESD (M13450), ETV4 (D12765), FCGR2C (M90737), FLG (M24355), FN1 (M10905), ITGA1 (X68742), ITGAD (U40274), KRT4 (X07695), KSR (U43586), LY9 (L42621), MEKK1 (U29671), MFAP4 (L38486), MMP18 (Y08622), MYCL1 (M19720), NOTCH1 (M73980), PDE7A (L12052), PIK3R1 (M61906), SLC9A1 (M81768), TCF3 (M31222), TCRA (M12959), TCRB (K02779), TCRG (M27331), TLR5 (U08888), TNFSF11 (AF013171), UBC (AB009010), ZNF121 (M99593), ZRK (L08961), ALPPL2 (NM_031313), AHSG (NM_001622), FCGR3A (NM_000569), FUT3 (NM_000149), IL1R2 (NM_004633), IL2RB (NM_000878), LHB (NM_000894), MDH2 (NM_005918), SLC11A2 (NM_000617), OMG (NM_002544), PIK3CA (NM_006218), TPM1 (NM_000366), TUB (NM_003320), ABAT (NM_000663), ACADL (NM_001608), ACO1 (NM_002197), ADAM10 (NM_001110), ADD1 (NM_014189), ADH4 (NM_000670), ADRA2C (NM_000683), AGA (NM_000027), AGTR2 (NM_000686), AKT1 (NM_005163), ALDH6 (NM_000693), AMPH (NM_001635), ANXA4 (NM_001153), APBA2 (NM_005503), APC (NM_000038), APOA2 (NM_001643), ARHGAP1 (NM_004308), ATOX1 (NM_004045), ATP2B2 (NM_001683), ATP4B (NM_000705), ATR (NM_001184), AUH (NM_001698), AXL (NM_001699), BCL2 (NM_000633), BENE (NM_005434), BID (NM_001196), BMI1 (NM_005180), BN51T (NM_001722), BUB 1 (NM_004336), C1R (NM_001733), C4BPB (NM_000716), C5R1 (NM_001736), CASP3 (NM_004346), CASP7 (NM_001227), CBFB (NM_001755), CCR4 (NM_005508), CD151 (NM_004357), CD36L1 (NM_005505), CD4 (NM_000616), CD81 (NM_004356), CDH12 (NM_004061), CDW52 (NM_001803), CEL (NM_001807), CES1 (NM_001266), CGA (NM_000735), CHS1 (NM_000081), CLDN3 (NM_001306), CNK (NM_004073), CSF2RA (NM_006140), CTSK (NM_000396), CX3CR1 (NM_001337), CYBB (NM_000397), CYP11A (NM_000781), DCC (NM_005215), DFFB (NM_004402), DOCK1 (NM_001380), DPYD (NM_000110), ELAVL2 (NM_004432), ELAVL4 (NM_021952), EPB41 (NM_004437), EPHA3 (NM_005233), EPHX2 (NM_001979), EPS15 (NM_001981), ETV6 (NM_001987), F2 (NM_000506), F8A (NM_012151), FABP6 (NM_001445), FADD (NM_003824), FANCE (NM_021922), FCAR (NM_002000), FGA (NM_021871), FGB (NM_005141), FGFR3 (NM_000142), FGG (NM_000509), HFL3 (NM_005666), FOXO1A (NM_002015), ADAM2 (NM_001464), FUCA1 (NM_000147), FUT2 (NM_000511), FY (NM_002036), GABRAS (NM_000810), GABRA6 (NM_000811), GAS (NM_000805), GAS6 (NM_000820), GBA (NM_000157), GFI1 (NM_005263), GH2 (NM_002059), GHR (NM_000163), GIF (NM_005142), GNAQ (NM_002072), GP9 (NM_000174), GPR15 (NM_005290), GPR30 (NM_001505), GRB14 (NM_004490), GRIK1 (NM_000830), GUCY2D (NM_000180), HADHA (NM_000182), NRG1 (NM_013964), HIVEP1 (NM_002114), HLALS (NM_001531), HLCS (NM_000411), HMX1 (NM_018942), HNRPD (NM_002138), HSA277165 (NM_018411), HRG (NM_000412), HSPG2 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TGFBR3 (NM_003243), TGM2 (NM_004613), TLR1 (NM_003263), TM4SF7 (NM_003271), TNFAIP6 (NM_007115), TNFRSFIA (NM_001065), TNFSF12 (NM_003809), TPH (NM_004179), TPI1 (NM_000365), TRAF2 (NM_021138), TRAFS (NM_004619), TSTA3 (NM_003313), TTR (NM_000371), UBE1 (NM_003334), UBE2V2 (NM_003350), UMPK (NM_012474), UP (NM_003364), UPK1B (NM_006952), USP7 (NM_003470), VASP (NM_003370), VDR (NM_000376), NSEP1 (NM_004559), ZFP161 (NM_003409), AQP1 (NM_000385), BDKRB1 (NM_000710), F13A1 (NM_000129), und dazu komplementären Sequenzen.

3. Oligomer (Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid(PNA)-Oligomer) zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch vorbehandelte DNA gemäß einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 2420 nach Anspruch 1 oder zu einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen hybridisiert.

4. Oligomer nach Anspruch 3, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfaßt.

5. Oligomer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.

6. Ein Satz von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomeren nach einem der Ansprüche 3 bis 5.

7. Satz von Oligomeren nach Anspruch 6, umfassend Oligomere zur Detektion des Methylierungszustandes aller CpG Dinukleotide aus einer der Sequenzen der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 2420 nach Anspruch 1 oder einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen.

8. Satz von mindestens zwei Oligonukleotiden nach Anspruch 3, die als Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Sequenzen einer chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2 und zu deren komplementären Sequenzen oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.

9. Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.

10. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand der CpG Dinukleotide einer der Seq. ID 1 bis Seq. ID 2420 und zu deren komplementären Sequenzen und/oder Oligonukleotid- und/oder chemisch vorbehandelten DNA von Genen nach Anspruch 2, bei dem mindestens ein Olignomer nach einem der Ansprüche 3 bis 5 an eine feste Phase gekoppelt vorliegt.

11. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

12. Array nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

13. DNA- und/oder PNA-Array zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustand von Genen stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure nach einem der voranstehenden Ansprüche umfaßt.

14. Kit, umfassend ein Bisulfit (= Disulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 3 bis 5.