DE20023863U1

DE20023863U1 - Microarray erhältlich durch Gesamt-Chromosomanalyse von Protein-DNA-Wechselwirkung

Info

Publication number: DE20023863U1
Application number: DE20023863U
Authority: DE
Original assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Current assignee: Whitehead Institute for Biomedical Research
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2010-09-02

Abstract

Microarray erhältlich durch das Verfahren, welches die Schritte umfasst:
a) Quervernetzen von DNA-bindendem Protein in der Zelle mit genomischer DNA der Zelle, wobei mit genomischer DNA quervernetztes DNA-bindendes Protein hergestellt wird;
b) Erzeugen von DNA-Fragmenten der mit DNA-bindendem Protein quervernetzten genomischen DNA in a), wobei ein Gemisch enthaltend DNA-Fragmente, an die DNA-bindendes Protein gebunden ist, erzeugt wird;
c) Entfernen eines DNA-Fragmentes, an das ein Protein von Interesse gebunden ist, aus dem in b) hergestellten Gemisch;
d) Abtrennen des in c) identifizierten DNA-Fragmentes von dem Protein von Interesse;
e) Amplifizieren des DNA-Fragmentes von d); und
f) In-Kontakt-bringen des DNA-Fragmentes von d) mit DNA, welche eine zu genomischer DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, bei denen Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich, der zu genomischer DNA komplementären Sequenz stattfindet, wobei die DNA, die eine zu genomischer DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, auf...

Description

Hintergrund der Erfindung
Viele Proteine, die bei der Regulation der Genomexpression, der Chromosomen-Replikation und zellulären Proliferation beteiligt sind, wirken durch ihre Fähigkeit, an spezifische Orte in dem Genom zu binden. Transkriptionsaktivatoren, beispielsweise, binden an spezifische Promotorsequenzen und rekrutieren Chromatin-modifizierende Komplexe und den Transkriptionsapparat zur Initiation der RNA Synthese. Das Remodellieren der Genexpression, das stattfindet während die Zellen durch den Zellzyklus hindurchgehen, oder wenn die Zellen Veränderungen in ihrer Umgebung erfühlen, wird teilweise durch Änderungen in dem DNA-Bindungsstatus der Transkriptionsaktivatoren bewirkt. Bestimmte DNA-Bindungsproteine sind auch mit Zentromeren, Telomeren und ursprünglich der DNA-Replikation verbunden, wo sie die Chromosomen-Replikation und – Erhaltung regulieren. Obwohl beträchtliches Wissen zahlreicher fundamentaler Aspekte der Gen-Expression und DNA-Replikation erhalten wurde aus Studien mit DNA-bindenden Proteinen, ist das Verständnis dieser Proteine und ihrer Funktionen beschränkt durch unsere Kenntnis ihrer Bindungsstellen in dem Genom.
Proteine, die an einen bestimmten DNA-Bereich binden, können unter Verwendung bekannter Verfahren nachgewiesen werden. Jedoch besteht ein Bedarf an einer Vorrichtung, die die Untersuchung der Bindung von Proteinen an die DNA über das gesamte Genom eines Organismus erlaubt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Identifizierung eines Bereichs (eines oder mehrerer) eines Genoms einer Zelle, an den ein Protein von Interesse bindet. In den hierin beschriebenen Verfahren wird ein DNA-bindendes Protein verbunden (z.B. kovalent quervernetzt) an genomische DNA einer Zelle. Die genomische DNA, an die das DNA-bindende Protein gebunden ist, wird identifiziert und kombiniert oder In-Kontakt gebracht mit DNA, die eine zu genomische DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist (z.B. die gesamte oder einen Teil der genomischen DNA einer Zelle wie eines oder mehrerer Chromosomen oder chromomaler Bereiche) unter Bedingungen, bei denen die Hybridisierung zwischen der identifizierten genomischen DNA und der zur genomischen DNA komplementären Sequenz stattfindet. Bereiche) der Hybridisierung sind Bereiche) des Genoms der Zelle, an die das Protein von Interesse bindet. Der Microarray wird vorzugsweise hergestellt unter Verwendung von lebenden Zellen.
In einer Ausführungsform werden Proteine, die an DNA in einer Zelle binden, mit zellulärer DNA quervernetzt. Das entstehende Gemisch, das DNA umfasst, die durch Protein gebunden wird, und DNA, die nicht durch Protein gebunden wird, wird Scherbedingungen unterworfen. Als Ergebnis werden DNA-Fragmente des Genoms, die mit DNA-bindendem Protein quervernetzt sind, erzeugt, und das DNA-Fragment (eines oder mehrere) an die das Protein von Interesse gebunden ist, werden aus dem Gemisch entfernt. Das entstehende DNA-Fragment wird sodann von dem Protein von Interesse abgetrennt und unter Verwendung bekannter Verfahren amplifiziert. Das DNA-Fragment wird kombiniert mit DNA, welche eine Sequenz aufweist, die mit genomischer DNA der Zelle komplementär ist, unter Bedingungen, in denen eine Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich der zu der genomischer DNA komplementären Sequenz stattfindet; und der Bereich der Sequenz, der komplementär zu der genomischen DNA ist, an den das DNA-Fragment hybridisiert, wird identifiziert. Der identifizierte Bereich (einer oder mehrere) ist ein Bereich des Genoms der Zelle, wie ein aus gewähltes Chromosom oder Chromosomen, an den das Protein von Interesse bindet.
In einer bestimmten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Identifizierung eines Bereichs eines Genoms (wie eines Bereichs eines Chromosoms) einer Zelle, an den ein Protein von Interesse bindet, wobei das DNA-bindende Protein der Zelle mit der genomischen DNA der Zelle unter Verwendung von Formaldehyd quervernetzt wird. DNA-Fragmente des quervernetzten Genoms werden erzeugt, und das DNA-Fragment, an das das Protein von Interesse gebunden ist, wird entfernt oder aus dem Gemisch abgetrennt wie durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch das Protein von Interesse bindet. Dies führt zur Abtrennung des DNA-Proteinkomplexes. Das DNA-Fragment in dem Komplex wird von dem Protein von Interesse abgetrennt, beispielsweise, durch Unterwerfen des Komplexes unter Bedingungen, die die Querverbindungen umkehren. Das abgetrennte DNA-Fragment wird amplifiziert unter Verwendung von Legationsvermittelter Polymerasekettenreaktion (LM-PCR), und sodann Fluoreszenz markiert. Das markierte DNA-Fragment wird In-Kontakt gebracht mit einem DNA-Microarray, welcher eine zur genomischen DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, in denen Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich der Sequenz, welcher zur genomischen DNA komplementär ist, stattfindet. Der Bereich der Sequenz, welcher zur genomischen DNA komplementär ist, an die das DNA-Fragment hybridisiert, wird identifiziert durch Messen der Fluoreszenzintensität, und die Fluoreszenzintensität des Bereiches der zu genomischer DNA komplementären Sequenz, an den das DNA-Fragment hybridisiert, wird mit der Fluoreszenzintensität einer Kontrolle verglichen.
Die Fluoreszenzintensität in einem Bereich der zur genomischen DNA komplementären Sequenz, welche größer ist als die Fluoreszenzintensität der Kontrolle in dem Bereich der Sequenz, welche zur genomischen DNA komplementär ist, zeigt den Bereich des Genoms in der Zelle, an den das Protein von Interesse bindet.
Ferner ist erfindungsgemäß umfasst ein Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Bestimmung einer Funktion eines Proteins von Interesse, das an die genomische DNA einer Zelle bindet. In diesem Verfahren wird das DNA-bindende Protein der Zelle mit der genomischen DNA der Zelle quervernetzt. DNA-Fragmente des Genoms, die mit dem DNA-bindenden Protein quervernetzt sind, werden sodann erzeugt, wie vorstehend beschrieben, und das DNA-Fragment (eines oder mehrere), an die das Protein von Interesse gebunden ist, werden aus dem Gemisch entfernt. Das entstandene DNA-Fragment wird dann von dem Protein von Interesse abgetrennt und amplifiziert. Das DNA-Fragment wird kombiniert mit DNA, welche eine Sequenz aufweist, die komplementär ist zu genomischer DNA der Zelle, unter Bedingungen, bei denen Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich der zu genomischer DNA komplementären Sequenz stattfindet; und der Bereich der zu genomischer DNA komplementären Sequenz, an den das DNA-Fragment hybridisiert, wird identifiziert. Dieser identifizierte Bereich ist ein Bereich des Genoms der Zelle, an den das Protein von Interesse bindet. Der identifizierte Bereich wird charakterisiert und die Eigenschaft des identifizierten Bereiches zeigt die Funktion des Proteins von Interesse an (z.B. ein regulatorisches Protein wie ein Transkriptionsfaktor; ein Onkoprotein).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Bestimmung, ob ein Protein von Interesse, das an genomische DNA einer Zelle bindet, als ein Transkriptionsfaktor wirkt. In einer Ausführungsform wird das DNA-bindende Protein der Zelle mit der genomischen DNA der Zelle quervernetzt. DNA-Fragmente des quervernetzten Genoms werden erzeugt und das DNA-Fragment, an das das Protein von Interesse gebunden ist, wird aus dem Gemisch entfernt. Das entstandene DNA-Fragment wird von dem Protein von Interesse abgetrennt und amplifiziert. Das DNA-Fragment wird mit DNA kombiniert, welche eine zur genomischen DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, bei denen die Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich der zur genomischen DNA komplementären Sequenz stattfindet. Der Bereich der zur genomischen DNA komplementären Sequenz, an der die DNA-Fragmente hybridisieren, wird identifiziert; wobei, falls der Bereich des Genoms ein regulatorischer Bereich ist, das Protein von Interesse ein Transkriptionsfaktor ist.
Der hierin beschriebenen Microarray erleichtern die Zergliederung des regulatorischen Netzwerkes der Genexpression der Zellen über das gesamte Genom und helfen bei der Identifizierung der Genfunktion.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Akte des Patentes enthält wenigstens eine Zeichnung, die in Farbe ausgeführt ist. Kopien dieses Patentes mit Farbzeichnung(en) werden vom Patent- und Markenamt auf Antrag und gegen Zahlung der notwendigen Gebühr bereitgestellt.
1 ist eine Veranschaulichung der Gesamtgenomanalyse von Protein-DNA Interaktionen, die hierin beschrieben sind.
2 zeigt wie die relative Bindung des Proteins von Interesse an jede auf einem Array dargestellte Sequenz berechnet wurde unter Verwendung einer gewichteten Mittelwertsanalyse.
3 ist ein Graph der chromosomalen Position gegen die in Einheit dargestellten Veränderung der Gesamtgenom-Analyse von Proteinen-DNA Interaktionen.
4 ist ein Graph der Chromosomenposition gegen das Verhältnis von getaggter zu ungetaggter auf die Bindung von ORC1 and das Hefechromosom III.
5A ist ein Beispiel eines eingescannten Bildes. Die nicht angereicherte und IP-angereicherte DNA erzeugt grüne Fluoreszenz beziehungsweise rote Fluoreszenz. Das Bild in vergrößerter Darstellung zeigt Beispiele von Spots, an denen die rote Intensität überrepräsentiert ist, welches auf die Bindung des gesuchten Proteins an diese DNA-Sequenzen hinweist.
5B zeigt, dass kleine Mengen von DNA quantitativ amplifiziert und mit Cy3 und Cy5-Flurophoren markiert werden können. Cy3- und Cy5-markierte DNA aus 1 ng Hefe genomischer DNA wurde hergestellt unter Verwendung des in dem Text beschriebenen LM-PCR-Verfahrens. Die entstandenen DNA-Proben wurden gemischt und mit einem Hefeintragenischen DNA-Microarray hybridisiert. Spots mit niedriger Intensität weisen größere Variationen auf als solche Spots mit hoher Intensität, wahrscheinlich aufgrund des Hintergrundrauschens.
6A zeigt den Satz von 24 Genen, deren Promotorbereiche am wahrscheinlichsten von Gal4 gebunden werden aufgrund der Analyse-Kriterien, die hierin beschrieben sind.
6B ist eine schematische Darstellung der Gal4 bindenden intergenischen Regionen.
6C zeigt die Ergebnisse der konventionellen ChIP-Analyse.
6D zeigt die Ergebnisse des AlignAce-Programms, das zur Identifizierung einer Konsensusbindungstelle für den Gal4-Aktivator verwendet wurde.
6E ist ein Balkendiagam, welches die relative Expression von PLC10 und MTH1 zeigt.
6F ist eine schematische Darstellung, die veranschaulicht wie die Identifikation von MTH1 und MTH, PCL10 und FUR4 als Gal4-regulierte Gene zeigt, wie mehrere unterschiedliche Stoffwechselwege verbunden sind.
7 listet den Satz der Gene auf, deren Promotorregionen am wahrscheinlichsten von Ste12 gebunden werden aufgrund der hierin beschriebenen Analysekriterien.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das Verständnis, wie DNA-bindende Proteine die gesamte Gen-Expression, chromosomale Replikation und zelluläre Proliferation steuern, würde vereinfacht werden durch Identifikation der chromosomalen Orte, an denen diese Proteine in vivo wirken. Hierin beschrieben wird ein Microarray erhältlich durch Gesamtgenom Ortsbestimmungsverfahren für DNA-gebundene Proteine, das zur Überwachung der dynamischen Bindung von Gen-spezifischen Transkriptionsfaktoren und Komponenten des allgemeinen Transkriptionsapparates in Hefe-Zellen verwendet wurde. Das Gesamtgenom-Lokalisierungsverfahren identifizierte korrekt bekannte Wirkungsorte für die Transkriptionsaktivatoren Gal4 und Ste12 und offenbarte unerwartete Wirkungen dieser Aktivatoren. Die Kombination von Expressions- und Lokalisierungsprofilen identifizierte den gesamten Satz von Genen, deren Expression unter der direkten Steuerung der spezifischen Aktivatoren und Komponenten des Transkriptionsapparates ist, da die Zellen auf Anderung in ihrer extrazellulären Umgebung antworteten. Die Gesamtgenom-Lokalisierungsanalyse stellt ein kraftvolles Werkzeug zur weiteren Zergliederung von Gen-regulatorischen Netzwerken dar, dem Zuordnen von Genfunktionen und dem Erforschen wie die Genome repliziert werden.
Daher stellt die vorliegende Erfindung Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Untersuchung der Bindung von Proteinen an DNA über das Genom hinweg bereit (z.B. das Gesamtgenom oder einen Teil davon wie ein oder mehrere Chromosomen oder Chromosomenbereiche) eines Organismus. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Identifizierung eines Bereiches (eines oder mehrerer) von genomischer DNA einer Zelle, an den ein Protein von Interesse bindet. In einer Ausführungsform werden Proteine, die DNA in einer Zelle binden, mit der zellulären DNA quervernetzt. Das entstandene Gemisch, das DNA, die von Protein gebunden wird und DNA, die nicht von Protein gebunden wird, umfasst, wird Scherbedingungen unterworfen. Als Ergebnis werden DNA-Fragmente des Genoms erzeugt, die mit DNA-bindendem Protein quervernetzt sind, und das DNA-Fragment (eines oder mehrere), an das das Protein von Interesse gebunden ist, wird aus dem Gemisch entfernt. Die entstandenen DNA-Fragmente werden dann von dem Protein von Interesse getrennt und unter Verwendung von bekannten Verfahren amplifiziert. Das DNA-Fragment wird dann mit DNA kombiniert, die eine Sequenz aufweist, die zu der genomischen DNA der Zelle komplementär ist, unter Bedingungen, bei denen eine Hybridisierung zwischen DNA-Fragmenten und der Sequenz stattfindet, die komplementär zu der genomischen DNA ist; und der Bereich der zu der genomischen DNA komplementären Sequenz, an den das DNA-Fragment hybridisiert, wird identifiziert. Der identifizierte Bereich ist ein Bereich des Genoms der Zelle, an den das Protein von Interesse bindet.
Ferner ist von der vorliegenden Erfindung umfasst einen Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Bestimmung einer Funktion eines Proteins von Interesse, welches an die genomische DNA einer Zelle bindet. In diesem Verfahren wird DNA-bindendes Protein der Zelle mit der genomischen DNA der Zelle quervernetzt. DNA-Fragmente des Genoms, welche mit DNA-bindendem Protein quervernetzt sind, werden dann erzeugt, wie vorstehend, und das DNA-Fragment (eines oder mehrere), an das das Protein von Interesse gebunden ist, wird entfernt. Das entstandene DNA-Fragment wird dann von dem Protein von Interesse abgetrennt und amplifiziert. Das DNA-Fragment wird dann kombiniert mit DNA, welche eine zur genomischen DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, bei denen die Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich der zu der genomischen DNA komplementären Sequenz stattfindet; und der Bereich der zu der genomischen DNA komplementären Sequenz, an den das DNA-Fragment hybridisiert, wird identifiziert, und ist ein Bereich des Genoms der Zelle, an den das Protein von Interesse bindet. Der identifizierte Bereich wird charakterisiert (z.B. eine regulatorische Region) und die Eigenschaft des identifizierten Bereiches zeigt eine Funktion des Proteins von Interesse an (z.B. Transkriptionsfaktor; ein Oncoprotein).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Microarray erhältlich durch das Verfahren zur Bestimmung, ob ein Protein von Interesse, welches an genomische DNA einer Zelle bindet, als ein Transkriptionsfaktor wirkt. In einer Ausführungsform wird das DNA-bindende Protein der Zelle mit genomischer DNA der Zelle quervernetzt und DNA-Fragmente des quervernetzten Genoms werden erzeugt. Das DNA-Fragment, an das das Protein von Interesse gebunden ist, werden entfernt. Das entstandene DNA-Fragment wird von dem Protein von Interesse abgetrennt und amplifiziert. Das DNA-Fragment wird mit DNA kombiniert, welche eine zur genomischen DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, bei denen Hybridisierung zwischen DNA-Fragmenten und der zur genomischen DNA komplementären Sequenz stattfindet. Der Bereich der zur genomischen DNA komplementären Sequenz, an den die DNA-Fragmente hybridisieren, wird identifiziert, wobei, falls der Bereich des Genoms ein regulatorischer Bereich ist, ist das Protein von Interesse ein Transkriptionsfaktor.
Die Microarrays der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Untersuchung und/oder Identifizierung von DNA-Bindung von Proteinen über das gesamte Genom eines eukaryotischen Organismus hinweg. Beispielsweise können DNA-bindende Proteine über das gesamte Genom von eukaryotischen Organismen wie Hefe, Drosophila und Mensch untersucht werden. Alternativ können sie verwendet werden zur Untersuchung und/oder Identifizierung von DNA-Bindung von Proteinen an ein gesamtes Chromosom oder Satz von Chromosomen von Interesse.
Eine Vielzahl von Proteinen, die an DNA binden, kann untersucht werden. Beispielsweise kann jedes Protein, das an der DNA-Replikation beteiligt ist, wie ein Transkriptionsfactor, oder ein Onkoprotein mit dem Microarray der vorliegenden Erfindung untersucht werden.
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die verwendet werden können zum Verbinden von DNA-bindendem Protein der Zelle an das Genom der Zelle. Beispielsweise kann UV-Licht verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform wird Formaldehyd verwendet zur Quervernetzung von DNA-bindenden Proteinen an die genomische DNA einer Zelle.
In der Herstellung des Microarray der vorliegenden Erfindung kann die Identifikation von DNA-Fragmenten, die an das Protein von Interesse gebunden sind, aus dem Gemisch entfernt werden, welches das DNA-Fragment(e), welche an das Protein von Interesse gebunden sind, und DNA-Fragmente, welche nicht an das Protein von Interesse gebunden sind, unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren. Beispielsweise kann die Immunpräzipitation unter Verwendung eines Antikörpers (z.B. polyklonal, monoklonal) oder Antigen-bindendem Fragment davon verwendet werden, welches (spezifisch) an das Protein von Interesse bindet. Zusätzlich kann das Protein von Interesse markiert oder getaggt werden unter Verwendung, beispielsweise, eines Antikörper-Epitops (z.B. Hämagglutinin (HA)).
Die DNA-Fragmente in den hierin beschriebenen Microarray können amplifiziert werden unter Verwendung, beispielsweise, der Ligations-vermittelten Polymerase-Kettenreaktion (z.B. siehe Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al., Herausgeber 1991, die Offenbarung wird hiermit durch Referenz aufgenommen).
Die DNA, die die Komplement-Sequenz des Genoms der Zelle aufweist, kann mit dem isolierten DNA-Fragment kombiniert werden, an das das Protein von Interesse bindet unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren. Beispielsweise kann die Komplement-Seguenz auf einem Glassträger immobilisiert werden (z.B. Corning Microarray Technology (CMT^TM) GAPS^TM) oder auf einem Mikrochip. Bedingungen zur Hybridisierung, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, umfassen, beispielsweise, Bedingungen von hoher Stringenz und/oder gemäßigt stringente Bedingungen; vgl. z.B. Seiten 2.10.1-2.10.16 (vgl. insbesondere 2.10.3-11) und Seiten 6.3.1-6 in Current Protocols in Molecular Biology). Faktoren wie die Sondenlänge, Basenzusammensetzung, Prozentfehlpaarung zwischen den hybridisierenden Sequenzen, Temperatur und Ionenstärke beeinflussen die Stabilität der Hybridisierung. Daher können Bedingungen hoher oder moderater Stringenz empirisch bestimmt werden, und hängen teilweise von Eigenschaften der bekannten Nukleinsäuren (DNA, RNA) und weiteren Nukleinsäuren ab, die für die Hybridisierung daran untersucht werden.
Die erfindungsgemäßen hergestellte Microarrays können weiterhin das Vergleichen der Ergebnisse mit einer Kontrolle umfassen. Beispielsweise können in einer Ausführungsform die Microarrays der vorliegenden Erfindung hergestellt werden unter Verwendung eines Kontrollproteins, welches kein DNA-bindendes Protein ist. In einer Ausführungsform wird Immunpräzipitation durchgeführt unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein HA oder MYC Epitop Tag. Die Ergebnisse des Immunpräzipitierens des Proteins von Interesse enthaltend das Tag, und des Proteins von Interesse ohne das Tag werden verglichen. Das ungetaggte Protein sollte nicht immunpräzipitiert werden, und dient daher als Negativkontrolle.
Wie in den Beispielen beschrieben umfasst eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die kombinierte Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und Gesamtgenom Expressions-Analysen-Microarrays. Chromatin-Immunpräzipitation erlaubt den Nachweis von Proteinen, die an einen bestimmten Bereich der DNA gebunden sind. Es umfasst vier Schrit te. (1) Das Formaldehyd-Quervernetzungen von Proteinen mit DNA in lebenden Zellen, (2) das Zerstören und nachfolgende Behandeln mit Ultraschall der Zellen unter Erhalt von kleinen Fragmenten quervernetzter DNA, (3) das Immunpräzipitieren der Protein-DNA-Quervernetzungen unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch das Protein von Interesse bindet, und (4) das Umkehren der Quervernetzungen und das Amplifizieren des DNA-Bereichs unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Unetrsuchung der Ausbeute an PCR-Produkt um Vergleich zu einer nicht-immunpräzpitierten Kontrolle bestimmt, ob das Protein von Interesse an den untersuchten DNA-Bereich bindet. Jedoch muss jeder DNA-Bereich einzeln durch PCR untersucht werden. Daher ist das ChIP-Verfahren auf einen kleinen Satz von DNA-Regionen beschränkt, die für die Untersuchung ausgewählt werden.
Im Gegensatz hierzu ist die Herstellung des vorliegenden Microarray nicht auf das Amplifizieren von einzelnen DNA-Bereichen durch Durchführen der PCR-Reaktion mit spezifischen Primern beschränkt. Vielmehr wird das gesamte Genom amplifiziert unter Verwendung von einer Legations-vermittelten PCR (LMPCR) Strategie. Die amplifizierte DNA wurde Fluoreszenz markiert durch das Einschließen von Fluoreszenz-getaggten Nukleotiten in der LM-PCR Reaktion. Letztlich wurde die markierte DNA mit einem DNA-Microarray hybridisiert, welcher Spots enthält, die alle oder eine Untergruppe (z.B. ein Chromosom oder Chromosomen) des Genoms darstellen. Die Fluoreszenzsintensität jedes Spots auf dem Microarray relativ zu einer nicht-immunpräzipitierten Kontrolle zeigte, ob das Protein von Interesse an den DNA-Bereich gebunden ist, der an dem bestimmten Spot gelegen ist. Daher erlauben der hierin beschriebenen Microarray den Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen über das gesamte Genom.
Insbesondere wurden DNA-Microarrays bestehend aus dem größten Teil des Hefechromosoms III und zusätzlich ungefähr 15 Modell Genen, deren Expression gut untersucht ist, hergestellt. Diese Arrays wurden verwendet in Zusammenhang mit dem ChIP-Verfahren zur Untersuchung der DNA-bindenden Eigenschaften von Transkriptionsfaktoren und des Gesamt-Genom-Transkriptionsapparates. Die hierin beschriebenen Microarrays stellen Einsichten in den Mechanismus und die Regulation der Genexpression in eukaryotischen Zellen bereit.
Der durch das Genomweite Lokalisierungs-Untersuchungsverfahren erhältliche Microarray, der hierin beschrieben ist, erlaubt die Untersuchung von Protein-DNA-Wechselwirkungen über das gesamte Hefegenom und ist in 1 dargestellt. Der Microarray erhältlich durch das Verfahren, welches ein modifiziertes Chromatin Immunpräzipitations-(ChIP)-Verfahren, das zuvor verwendet wurde zur Untersuchung in vivo von Protein-DNA-Wechselwirkungen an einer oder einer ganzen Anzahl von bestimmten DNA-Stellen, mit DNA-Microarray-Analyse kombiniert. Kurz gesagt werden Zellen mit Formaldehyd fixiert, durch Ultraschall geerntet, und DNA-Fragmente, die mit einem Protein von Interesse quervernetzt sind, durch Immunpräzipitation mit einem spezifischen Antikörper angereichert. Nach Umkehrung der Quervernetzung wird die angereicherte DNA amplifiziert und mit Fluoreszenzfarbstoff unter Verwendung der Legations-vermittelten PCR (LM-PCR) markiert. Eine DNA-Probe, die nicht durch Immunopräzipitation angereichert worden ist, wird LM-PCR unterworfen in Gegenwart eines unterschiedlichen Fluorophors, und sowohl IP-angereicherte als auch nicht angereicherte Pools von markierter DNA werden mit einem Einzel-DNA-Microarray hybridisiert, der sämtliche Hefe-intergenischen Sequenzen enthält. Das Fluoreszenzintensitätsverhältnis von IP-angereicherten/nichtangereicherten Proben, das aus drei voneinander unabhängigen Experimenten erhalten wird, kann verwendet werden mit einer gewichteten Mittelwerts-Analysen-Methode zur Berechnung der relativen Bindung des Proteins von Interesse an jede Sequenz, die auf dem Array dargestellt ist (vgl. 2).
Vier Eigenschaften des globalen Lokalisierungs-Profilierungs-Verfahren wurden als kritisch für konsistente, qualitativ hochwertige Ergebnisse gefunden. Erstens spielen DNA-Microarrays mit konsistenter Spot-Qualität und gleichem Signal-Hintergrund eine offensichtliche Rolle. Ein Beispiel eines durch die hierhin beschriebene Technik erzeugten Bildes ist in 5A gezeigt. Zweitens wurde das LM-PCR-Verfahren, das hierin beschrieben ist, entwickelt, um reproduzierbare Amplifikation von sehr geringen Mengen von DNA zu ermöglichen; Signale für mehr als 99,9% der Gene waren im Wesentlichen identisch mit dem Fehlerbereich, wenn unabhängige Proben von 1 ng genomischer DNA mit dem LM-PCR-Verfahren amplifiziert wurden (5B).
Drittens wurde jedes Experiment dreifach durchgeführt, welches eine Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Bindungsdaten erlaubt. Und viertens wurde ein Einzelarray Fehlermodel, das von Hughs et al, (2000) beschrieben wurde, angewandt, um das Rauschen zu handhaben, das mit Spots niedriger Intensität verbunden ist, und um Wiederholungsexperimente mit geeigneter Gewichtung zu ermitteln.
Die quantitative Amplifikation geringer Mengen von DNA erzeugt einige Unsicherheit für Spots niedriger Intensität. Um dieser Unsicherheit auf den Grund zu gehen und um in der Lage zu sein, Wiederholungsexperimente mit geeigneten Bezugsgewichtungen zu ermitteln, haben wir ein Einzelarray-Fehlermodel angewandt, das erstmals von Hughs er al, (2000) beschrieben wurde. Gemäß diesem Fehlermodel ist die Bedeutung eines gemessenen Verhältnisses an einem Spot definiert durch ein statistisches X, welches die Form annimmt X = (a2 – a1)/[σ2 + σ2 2 + f2(a1 2 + a2 2)]½ (1)wobei a_1,2 die Intensitäten sind, die in beiden Kanälen für jeden Spot gemessen wurden, σ_1,2 sind die Unsicherheiten aufgrund des Abzugs des Hintergrundes, und f ist ein fraktionaler multiplikativer Fehler, der aus Hybridisierungsuneinheitlichkeiten kommen würde, Schwankungen in der Farbstoffeinbau-Effizienz, Scanner-Ausbeuten-Schwankungen, etc. X ist ungefähr normal. Die Parameter σ und f wurden ausgewählt, sodass X eine Einheiten-Varianz aufweist. Die Bedeutung eines Wechsels der Größe |x| wird dann berechnet als p = 2 × (1 – Erf(|X|)) (2).
Während diese Erfindung besonders gezeigt und beschrieben wurde mit Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen, ist es für den Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Veränderungen in Form und Einzelheiten hierbei durchgeführt werden können ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, der von den beigefügten Ansprüchen umfasst wird.
Beispiele
Beispiel 1
Design des Hefe-Chromosom III und ausgewählte Modell-Genen-Arrays für die Charakterisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen
Der Array enthält sämtliche nicht-überlappenden offenen Leseraster (ORF) auf Chromosom III (vgl. Tabelle). Wenn eine Sequenz teilweise oder sämtliche der beiden potenziellen Leseraster enthält, wurde die längere Sequenz ausgewählt als solche, die den ORF darstellt. Jede verbleibende Sequenz wurde in intergenischen Fragmenten eingeschlossen.
Sämtliche intergenischen Regionen, die größer sind als 100 bp, werden durch Fragmente mit einem Mittel von 500 bp dargestellt. Im Falle von Bereichen, die größer sind als 700 bp, so werden diese in mehrere Fragmente von 300 bis 600 bp aufgeteilt. PCR-Primer jedes Bereiches wurden ausgewählt unter Verwendung des Saccharomyces genomischen Datenbank (SGD) „Design Primers" Programms von der Stanford-Universität. Die Gesamtzahl von intergenischen Fragmenten beträgt 241 für Chromosom III.
Die Lokalisierung und Größe der offenen Leseraster wurde aus der Saccharomyces genomischen Datenbank (SGD) funktionalen Chromosomen Karte bestimmt.
Zusätzlich wurden 17 Modellgene (vgl. Tabelle) ausgewählt auf der Grundlage ihrer hohen Frequenz der Zitate in der Transkriptionsliteratur. Jedes Gen wurde amplifiziert ebenso wie 1-2kb Stromaufwärts und 500 bp Stromabwärts des kodierenden Bereiches.
ChIP – Microarray-Protokolle

PCR-Erzeugung von nicht-modifizierter Hefe OFR DNA
100 μl Reaktion ergibt allgemein ungefähr 5–6 μg DNA

RXN Gemisch:

10,0 μl 10X PCR-Puffer (Perkin Elmer, AmpliTaq)
8,0 μl 25 mM MgCl2 (Perkin Elmer, AmpliTaq)
10,0 μl 10X dNTPs (2 mM jeweils, Pharmacia 100 mM Stammlösungen)
1,0-2,0 μl ORF DNA (Research Genetics, ungefähr 10 ng)
2,5 μl jedes Universals-Primers (Research Genetics, 20 μM Lösung)
1,6 μl verdünnte Pfu DNA-Polymerase (1:100 verdünnt in Wasser, Stratagene, 0,02U)
1,0 μl AmpliTaq DNA-Polymerase (5U, Perkin Elmer)
63,4 μl ddH₂O

PCR-Erzeugung von Hefe-intergenischen Bereichen

100 μl Reaktion ergibt allgemein ungefähr 5-6 μg DNA

RXN Gemisch:

10,0 μl 10X PCR-Puffer (Perkin Elmer, AmpliTaq)
8,0 μl 25 mM MgCl2 (Perkin Elmer, AmpliTaq)
10,0 μl 10X dNTPs ( 2 mM jeweils, Pharmacia 100 mM Stammlösungen)
1,0 μl Hefe genomische DNA (Research Genetics, ungefähr 100 ng)
5,0 μl jedes Primers (Research Genetics, 20 μM Lösung)
1,6 μl verdünnte Pfu DNA Polymerase (1:100 verdünnt im Wasser, Stratagene 0,02U)
1,0 μl AmpliTaq DNA Polymerase (SU, Perkin Elmer)
58,4 μl ddH₂O

Zyklen für ORF und intergenische DNA

95°C 3 min
30 Zyklen von:
94°C 30 sec
60°C 30 sec
72°C 2 min

PCR-Aufreinigung:
Die Reaktionen wurden aufgereinigt durch Qiagen QIAquick 96 PCR-Aufreinigungskits gemäß Herstellerangaben mit der folgenden Ausnahme. DNA wurde eluiert mit 120 μl T.E. 8.0 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). T.E. 8.0 wurde auf die Qiagen Membran aufgetragen und sedimentieren gelassen über 5 Minuten vor der Elution. Die DNA wurde in einer Corning Polypropylen 96 Napfplatte gesammelt.
Die Reaktionen wurden quantifiziert durch optische Darstellung von 1 μl der aufgereinigten DNA auf einem Agarosegel im Vergleich zu einer bekannten Menge Lambda DNA geschnitten mit HindIII (Promega).
Die DNA wurde bei –20 bis kurz vor dem Drucken gelagert. Die DNA wurde sodann durch Zentrifugation im Vakuum eingetrocknet in Corning Microtiter-Platten of weniger als 5 μl.
Drucken
Die PCR-Reaktionen wurden resuspendiert zu ungefähr 0,5 mg/ml in 3X SSC. SSC wurde hergestellt als eine 20X-Stammlösung (3 M NaCl, 0,3 M Na₃-Zitrat·2H₂O, der pH-Wert wurde eingestellt auf 7,0 mit HCl) und auf die gewünschte Konzentration mit H₂O verdünnt.
10-15 μl der DNA wurden in eine Corning 96 oder 384 Napfplatte eingebracht und GAPS-beschichtete Objektträger wurden gedruckt unter Verwendung des kartesianischen Roboters. PCR-Produkte sollten größer sein als 250 bp.
Objektträgerbearbeitung

1. Rehydratisierung der Arrays durch Halten der Objektträger über einen Teller mit heißem ddH₂O (~10 Sekunden).
2. Schnelltrocknen von jedem Array (DNA-Seite oben) auf einer 100°C heißen Platte über ~3 Sekunden.
3. UV-Quervernetzen der DNA an Glas unter Verwendung eines Stratalinker-Sets bei 60 mJoule.
4. Auflösen vom 5 g Bernsteinsäure-Anhydrid (Aldrich) in 315 mL n-Methylpyrrilidinon.
5. Hierzu wurden 35 mL 0,2 M Na-Borat pH 8,0 hinzugefügt und bis zur Auflösung gerührt (Borsäure pH-eingestellt mit NaOH).
6. Tränken der Arrays in dieser Lösung über 15 Minuten unter Rühren.
7. Übertragen der Arrays in 95°C Wasserbad über 2 Minuten.
8. Rasches Übertragen der Arrays in 95% EtOH über 1 Minute.
9. Lufttrocknen der Objektträger, mit der Arrayseite oben mit einem kleinen Winkel (annähernd vertikal).

Prä-Hybridisierung der Objektträger

1. Inkubieren des Objektträgers in 3,5 X SSC, 0,1% SDS, 10 mg/ml BSA (Sigma) in einem Coplin-Kolben über 20 Minuten bei 50°C (Einbringen des Coplin-Kolbens in ein Wasserbad)
2. Waschen des Objektträgers durch Eintauchen in Wasser und nachfolgend Isopropanol.
3. Lufttrocknen des Arrays mit Seite nach oben bei kleinem Winkel (annähernd vertikal)

Sonden-Herstellung

1. Das Sonden-Volumen sollte 20-30 μl für ein kleines Deckglas (25 mm²) und 40-60 μl für ein großes Deckglas (24 x 60 mm) betragen.
2. Einstellen der Sonde (cDNA oder PCP-basiert) zu finalem Hybridisierungsvolumen in 3X SSC, 0,1% SDS mit 10 μg E. coli tRNA (Boehringer-Mannheim).
3. Aufheizen in Heizblock über 3-5 Minuten.
4. Schockabkühlen auf Eis. und abzentrifugieren.

Hybridisierung

1. Übertragen der Sonde auf den Objektträger. Aufbringen des Deckglases auf die Flüssigkeit unter Vermeidung von Blasen.
2. Zusammenfügen über 50°C Wasserbad in Hybridisierungskammer. Mit Klammern verschließen.
3. Eintauchen in 50°C Wasserbad über Nacht.

Scannen

1. Zerlegen der Hybridisierungskammer, wobei die richtige Seite oben ist. 2. Entfernen des Deckglases mit Fingern oder Pinzetten.
3. Einstellen in 0,1 X SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur 5-10 Minuten.
4. Übertragen der Objektträger in 0,1 X SSC über 2,5 Minuten und nochmals über 2,5 Minuten.
5. Trockenblasen und Abscannen des Objektträgers.

Datenanalyse
Die aus dem Scannen erhaltenen Daten wurden unter Verwendung der ImaGene Software analysiert.
Die Tabelle
Beispiel 2
Gesamtgenom-Lokalisierung und Funktion von DNA-bindenden Proteinen
Gesamtanalyse von Gal4-Bindungsstellen
Zur Untersuchung der Genauigkeit des Gesamtgenom-Lokalisierungs-Untersuchungsverfahrens wurde die Untersuchung verwendet zur Identifizierung von Stellen, die von dem Transkriptionsaktivator Gal4 im Hefegenom gebunden werden. Gal4 wurde ausgewählt, da er zu den bestcharakterisierten Transkriptionsaktivatoren gehört, er ist bekannt dafür, für die Induktion von 10 Genen verantwortlich zu sein, die für den Galaktose-Stoffwechsel verantwortlich sind, und eine Konsensus-DNA Bindungssequenz (das UAS_G) ist für Gal4 in den Promotoren der GAL Gene identifiziert worden. Sehr wenig Gal4 ist an UAS_G der GAL1 und GAL10 Promotoren gebunden, wenn die Zellen in Glukose (reprimierter Zustand) kultiviert werden, wohingegen relativ hohe Mengen von Gal4 in Galaktose gebunden werden (aktivierter Zustand).
Die Gesamtgenom-Lokalisierung von Epitop-getaggtem Gal4p sowohl in Glukose- als auch Galaktose-Medien wurde in drei unabhängigen Experimenten untersucht, wie vorstehend im Detail beschrieben. Das Lokalisierungsanalyse-Experiment identifizierte sieben Gene, die zuvor bereits berichtet wurden, als durch Gal4 reguliert und drei weitere Gene, die Aktivitäten kodieren, die physiologisch relevant für Zellen sind, die Galaktose als einzige Kohlenstoffquelle verwenden, die jedoch nicht zuvor bekannt waren als durch diesen Aktivator reguliert (6A).
Der Satz von 24 Genen, deren Promotorbereiche am wahrscheinlichsten von Gal4 gebunden werden aufgrund der hierhin beschriebenen Analysenkriterien (p-Wert < 0,00001) ist in 6A dargestellt. Gal4 aktiviert nichtfunktionell sämtliche dieser Gene, da nur eine Untergruppe der Gene, die intergenische Regionen teilen, die von Gal4 gebunden werden, durch diesen Aktivator reguliert werden (6B). Zur Identifizierung dieser Gene, die von Gal4 gebunden werden und von Galaktose aktiviert werden, wurde Gesamtgenom-Expressionsanalyse durchgeführt. Der obere Teil von 6A zeigt Gene, deren Expression in Galaktose induziert ist, wohingegen der untere Teil Gene zeigt, deren Expression Galaktoseunabhängig ist. Sieben Gene, die zuvor als durch Gal4 (GAL1, GAL2, GAL3, GAL7, GAL10, GAL80 und GCY1) als reguliert berichtet wurden, haben an Gal4 gebunden und wurden in Galaktose aktiviert. Drei Gene, deren Expression nicht zuvor mit dem Gal4-Aktivator in Verbindung stand, MTH, PCL10 und FUR4, wurden auch gefunden, dass diese Gal4 binden und in Galaktose aktiviert werden. Deutlich weniger Gal4 war erwartungsgemäß assoziiert mit jedem dieser Promotoren in Zellen, die in Glukose kultiviert wurden. Gal4p hat nicht an Promotoren von GAL4 und PGM2 gebunden, Gene, von denen man zuvor annahm, dass sie durch Gal4 reguliert werden, obwohl direkter Beweis für die Gal4-Bindung an diese Promotoren nicht gezeigt worden war. Jedes dieser Ergebnisse wurde bestätigt durch konventionelle ChIP-Analyse (6C), was zeigt, dass die Microarray-Ergebnisse genau Ergebnisse widerspiegeln, die durch den konventionellen Ansatz erhalten wurden, der bis jetzt verwendet wurde zur Untersuchung von einzelnen Bindungsstellen.
Die zehn Gene, die sowohl gebunden als auch von Gal4 reguliert werden, wurden ausgewählt und das AlignAce-Programm wurde verwendet zur Identifizierung einer Konsensus-Bindungsstelle für diesen Aktivator (6D). Diese Bindungsstellen-Sequenz ist ähnlich zu, verfeinert jedoch, die Sequenz, die zuvor für Gal4 bestimmt wurde. Die Gal4-Bindungssequenz liegt an ungefähr 50 Stellen innerhalb des Hefegenoms vor, von denen die Gal4-Bindung nicht nachgewiesen worden ist, welches zeigt, dass das einfache Vorhandensein dieser Sequenz nicht für die Gal4-Bindung ausreicht.
Drei Gene, deren Expression nicht zuvor in Zusammenhang mit dem Gal4-Aktivator, MTH, PCL10 und FUR4 stand, wurden gefunden, dass diese von Gal4 gebunden werden und in Galaktose aktiviert werden. Es ist wahrscheinlich, dass diese drei Gene echte Gal4p Ziele sind, da sie die folgenden drei Merkmale teilen mit den etablierten Gal4- abhängigen GAL-Genen. MTH, PCL10 und FUR4 sind Galaktose-induziert (6A). Die Galaktose-Induktion hängt von Gal4 (6C) ab. MTH, PCL10 und FUR4-Promotoren werden von Gal4 gebunden, wenn die Zellen in Galaktose kultiviert werden, jedoch nicht in Glukose (6A). Die Bindung von Gal4p an die MTH, PCL10 und FUR4-Promotoren wurde bestätigt durch konventionelle ChIP-Analyse (6C).
Die Identifikation von MTH1 und MTH, PCL10 und FUR4 als Gal4- regulierte Gene zeigt wie die Regulation mehrerer unterschiedlicher Stoffwechselwege miteinander verbunden ist (6F). MTH1 kodiert einen Transkriptionsrepressor zahlreicher Gene, die in Stoffwechselwegen beteiligt sind, die unnötig wären, wenn die Zellen Galaktose als eine Ziel-Kohlenstoffquelle verwenden. Unter den interessantesten dieser Ziele ist eine Untergruppe der HTX Gene, die am Hexose-Transport beteiligt sind. Die hierin beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die Zelle auf Galaktose durch Verändern der Konzentration ihrer Hexose-Transporter an der Membran in einer Gal4-abhängigen Weise reagiert; Gal4 aktiviert das Galaktose-Transport-Gen GAL2 und bewirkt durch Aktivierung des MTH1-Repressors verminderte Spiegel der Glukosetransporter-Expression. Das Pc110 Cyclin verbindet sich mit Pho85p und scheint die Bildung von Glykogen zu unterdrücken. Die Beobachtung, dass PCL10 Gal4-aktiviert ist, zeigt an, dass verminderte Glykogenese stattfindet zur Maximierung der Energie, die aus dem Galaktose-Metabolismus erhalten wird. FUR4 kodiert eine Uracil-Pennease und deren Induktion durch Gal4 kann einen Bedarf widerspiegeln zur Erhöhung der interzellulären Pools von Uracil, um das wirksame Hinzufügen von UDP an Galaktose zu ermöglichen, das durch Gal7 katalysiert wird.
Vorherige Studien haben gezeigt, dass Gal4 wenigstens an einige GAL Genpromotoren bindet, wenn die Zellen auf Kohlenstoffquellen unterschiedlich von Galaktose kultiviert werden, solange Glukose abwesend ist. Die Gesamtgenom- Lokalisierungsanalyse für Gal4 in Zellen, die auf Raffinose kultiviert wurden, wurde wiederholt, und es wurde gefunden, dass die Ergebnisse im wesentlichen identisch sind mit jenen, die erhalten wurden, wenn die Zellen auf Galaktose kultiviert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Gal4 das gleiche Bindungsverhalten an sämtlichen seiner genomischen Bindungsstellen aufweist und zeigt, dass die Gesamtgenom-Lokalisierungsmethode hoch reproduzierbar ist.
Gesamtanalyse von Ste12-Bindungsstellen
Das Gesamtgenom-Bindungsprofil des DNA-bindenden Transkriptionsaktivators Ste12 wurde auch untersucht. Ste12 ist von Interesse, da er eine definierte zelluläre Rolle hat – er ist der Schlüsselfaktor zu der Antwort von haploider Hefe auf Paarungspheromone – jedoch sind nur einige wenige Gene, die von Ste12 reguliert werden, identifiziert worden. Die Aktivierung des Pheromon-Antwort-Weges bewirkt die Arretierung des Zellzyklus und die Transkriptionsaktivierung von mehr als 100 Genen. Die Expressionsanalyse unter Verwendung von Ste12 Mutantenzellen hat gezeigt, dass Ste12 erforderlich ist für die Pheromoninduktion sämtlicher dieser Gene. Jedoch ist der Mechanismus, durch den Ste12 die Transkription dieser Gene in Antwort auf das Pheromon aktiviert, nicht aufgeklärt.
Die Gesamtgenom-Lokalisierung von Epitop-getaggtem Ste12p vor und nach der Pheromonbehandlung wurde in drei unabhängigen Experimenten untersucht. Der Satz von Genen, deren Promotor-Regionen am wahrscheinlichsten von Ste12 gebunden werden aufgrund der Analysenkriterien (p-Wert < 0,005) wie hierin beschrieben ist in 7 aufgelistet; der obere Teil zeigt Gene, deren Expression durch Alpha-Faktor induziert wird, wohingegen die untere Hälfte Gene zeigt, deren Expression nicht wesentlich durch Alpha-Faktor induziert wird. Von den 36 Genen, die durch Alpha-Faktor induziert werden und von Ste12 gebunden werden, ist bei 12 von ihnen bekannt, dass sie an verschiedenen Schritten des Paarungsprozesses teilnehmen (FIG2, AFR1, GIC2, STE12, CHS1, KARS, FUS1, AGA1, FUS3, CIK1, FAR1, FIG1).
Ste12 bindet an einige Promotoren in Abwesenheit des Pheromonsignals, jedoch ist dessen Bindung an die meisten Gene durch Alpha-Faktor erhöht. Interessanterweise wird Ste12p an seinen eigenen Promotor gebunden sowohl vor als auch nach der Pheromonbehandlung. Zusammen sprechen die Bindungs- und Expressionsdaten dafür, dass die Regulation des STE12 Gens eine positive Feedback-Schleife umfasst. STE12 Expression ist direkt nach der Pheromonbehandlung erhöht, was zeigt, dass der gebundene, jedoch inaktive STE12-Aktivator rasch in eine aktive Form umgewandelt wird. Die erhöhte Expression des STE12 Gens würde erlauben, dass mehr STE12p hergestellt wird und dies würde umgekehrt dessen Gene aktivieren.
Vierundzwanzig Gene, deren Expression nicht zuvor mit STE12 und dem Paarungsprozess assoziiert wurde, wurden gefunden von STE12 gebunden zu werden und durch den Alpha-Faktor aktiviert zu werden. Unter Berücksichtigung, dass ihre Pheromoninduktion in STE12 Mutantenzellen eliminiert wird, ist wahrscheinlich, dass diese 24 Gene auch echte STE12-Ziele sind. Die Identitäten dieser Gene zeigen interessante Details über verschiedene Schritte des Paarungsprozesses. Beispielsweise kodiert ein STE12-Zielgen, PCL2, ein G1 Zyklin, das Komplexe mit der Zyklin-abhängigen Kinase (cdk) Pho85 bildet. Die Pc12-Pho85 und PC11-Pho85 Komplexe wirken zusammen mit Cln1-Cdc28 und Cln-2-Cdc28 Zyklin-abhängigen Kinase-Komplexen zur Förderung der G1 Zellzyklus-Progression (Measday et al., 1994). Der Pc12-Pho85 Kinase-Komplex weist eine Substratspezifität auf, die überlappend, jedoch unterschiedlich ist von derjenigen von Cln1-Cdc28 und Cln-2-Cdc28. Während des Paarungsprozesses werden haploide Hefe-Zellen am Beginn der späten G1-Phase arretiert aufgrund der Hemmung der Cln1-Cdc28 und Cln-2-Cdc28 Aktivitäten durch Far1, welches kodiert wird von einem anderen STE12 Zielgen. Die Aktivierung von PCL2 durch Ste12 nach Pheromonbehandlung zeigt an, dass erhöhte Pho85 Komplexaktivitäten wahrscheinlich notwendig sind zur Kompensation des Verlustes von Cdc28 Aktivitäten.
Die meisten Ste12 Zielgene, die durch die Analyse der Genomorte von Ste12 und Expressionsprofile während der Pheromoninduktion identifiziert wurden, kodieren Proteine, die an verschiedenen Schritten der Paarungsantwort beteiligt sind. Unter ihnen sind 11 zuvor nicht charakterisierte. Die zellulären Rollen dieser Gene, umfassen YNL279W, YOR129C, YOR343C, YPL192C, YER019W, YIL083C, YIL037C, YIL169C, YNL105W, YOL155C und YNR064C stehen daher am wahrscheinlichsten in Zusammenhang zur Paarung.
Ste12 wurde auch angenommen, bei weiteren zellulären Prozessen beteiligt zu sein. Zusammen mit Tec1 reguliert Ste12 die Filamentation von diploiden Zellen und das invasive Wachstum in Haploiden. Zwei Gene, TEC1 und FLO11, sind als Ste12-Ziele im filamentösen Wachstumspfad identifiziert worden. Ste12-Bindung an diese Gene entweder bei Vorhandensein oder Abwesenheit von Alpha-Faktor wurde nicht nachgewiesen. Es ist wahrscheinlich, dass die Bindung von Ste12p an diese Promotoren durch verschiedene physiologische Bedingungen reguliert wird.

Claims

Microarray erhältlich durch das Verfahren, welches die Schritte umfasst: a) Quervernetzen von DNA-bindendem Protein in der Zelle mit genomischer DNA der Zelle, wobei mit genomischer DNA quervernetztes DNA-bindendes Protein hergestellt wird; b) Erzeugen von DNA-Fragmenten der mit DNA-bindendem Protein quervernetzten genomischen DNA in a), wobei ein Gemisch enthaltend DNA-Fragmente, an die DNA-bindendes Protein gebunden ist, erzeugt wird; c) Entfernen eines DNA-Fragmentes, an das ein Protein von Interesse gebunden ist, aus dem in b) hergestellten Gemisch; d) Abtrennen des in c) identifizierten DNA-Fragmentes von dem Protein von Interesse; e) Amplifizieren des DNA-Fragmentes von d); und f) In-Kontakt-bringen des DNA-Fragmentes von d) mit DNA, welche eine zu genomischer DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, bei denen Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich, der zu genomischer DNA komplementären Sequenz stattfindet, wobei die DNA, die eine zu genomischer DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, auf einem Microarray angeordnet ist.
Microarray gemäß Anspruch 1, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
Microarray gemäß Anspruch 1, wobei das Protein von Interesse ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus einem Transkriptionsfaktor und einem Onkogen.
Microarray gemäß Anspruch 1, wobei das DNA-bindende Protein der Zelle mit dem Genom der Zelle unter Verwendung von Formaldehyd quervernetzt ist.
Microarray gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Fragmente von d) durch Ultraschallbehandlung erzeugt werden.
Microarray gemäß Anspruch 1, wobei das DNA-Fragment von c), an das das Protein von Interesse gebunden ist, unter Verwendung eines Antikörpers identifiziert wird, der an das Protein von Interesse bindet.
Microarray gemäß Anspruch 1, wobei das DNA-Fragment von e) unter Verwendung von Ligations-vermittelter Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.
Microarray erhältlich durch das Verfahren, welches die Schritte umfasst: a) Quervernetzen von DNA-bindendem Protein in der Zelle mit genomischer DNA der Zelle mit Formaldehyd, wobei mit genomischer DNA quervernetztes DNA-bindendes Protein hergestellt wird, b) Erzeugen von DNA-Fragmenten der mit DNA-bindendem Protein quervernetzten genomischen DNA in a), wobei DNA-Fragmente, an die DNA-bindendes Protein gebunden ist, erzeugt werden; c) Immunpräziptieren des in b) hergestellten DNA-Fragmentes, an das das Protein von Interesse gebunden ist, unter Verwendung eines Antikörpers, der das Protein von Interesse spezifisch bindet; d) Abtrennen des in c) identifizierten DNA-Fragmentes von dem Protein von Interesse; e) Amplifizieren des DNA-Fragmentes von d) unter Verwendung von Ligations-vermittelter Polymerasekettenreaktion; f) Markieren des DNA-Fragmentes von e) mit Fluoreszenz; und g) In-Kontakt-bringen des markierten DNA-Fragmentes von e) mit einem DNA-Microarray, welcher eine zu genomische DNA der Zelle komplementäre Sequenz aufweist, unter Bedingungen, bei denen Hybridisierung zwischen dem DNA-Fragment und einem Bereich, der zu genomischer DNA komplementären Sequenz stattfindet.
Microarray gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei der Amplifikationsschritt (e) das Glätten (blunting) des DNA-Fragmentes von Schritt (d) zur Bildung von geglätteter DNA und das Ligieren der Enden der geglätteten DNA an unidirektionale Linker umfasst.
Modifizierter Microarray umfassend: a) einen Microarray; b) markierte DNA-Fragmente, wobei die DNA-Fragmente, welche zur Markierung verwendet werden, durch Chromatin-Immunpräzipitation erhalten werden; und c) komplementäre Nukleotid Sequenz, die auf dem Microarray immobilisiert ist.