DE2051715C3

DE2051715C3 -

Info

Publication number: DE2051715C3
Application number: DE19702051715
Authority: DE
Filing date: 1970-10-21
Publication date: 1976-09-02

Description

Die Erfindung betrifft eine Trennkammer für die kontinuierliche Ablenkungs^lektrophorese im trägerfreien Elektrolytstrom, mit Elektroden, mit einer Trennkammer und Zu- und Ableitungen für den Elektrodenpuffer, den Kammerpuffer und die zu trennende Substanz.The invention relates to a separation chamber for continuous deflection ^ lektrophoresis in a carrier-free electrolyte stream, with electrodes, with a Separation chamber and supply and discharge lines for the electrode buffer, the chamber buffer and the one to be separated Substance.

Für die kontinuierliche elektrophoretische Trennung im freien Pufferstrom sind eine Reihe von Trennkammern entwickelt worden, die fast ausnahmslos auf folgendem Prinzip beruhen: Zwischen zwei planparallelenFor the continuous electrophoretic separation in the free buffer stream, a number of separation chambers have been developed, which are almost without exception based on the following principle: Between two plane-parallel ones Platten wird ein Puffervorhang mit der Dicke der Kammer gleichmäßig in Fallrichtung bewegt In den Pufferstrom wird an einer Stelle kontinuierlich das zu trennende Substanzgemisch injiziert, das als Streifen lot-Plates, a buffer curtain with the thickness of the chamber is moved evenly in the direction of fall.

recht zwischen den planparallelen Platten herunterwandert Unter dem Einfluß eines elektrischen Gleichstromfelds, dessen Feldlinien horizontal verlaufen, werden die Substanzpartikeln je nach ihrer Ladung abgelenkt Ihre Wanderungswege bilden mit der Flußrich-moves right down between the plane-parallel plates Under the influence of an electric direct current field, the field lines of which run horizontally, the substance particles are deflected depending on their charge.

tung des Pufferstroms Winkel, deren Größe von den spezifischen Eigenschaften der Partikeln, die Feldstärke und der Pufferflußgeschwindigkeit abhängt Die Bandbreite ist durch den Querschnitt der Kammer und durch das Verhältnis aus Dosiergeschwindigkeit desdirection of the buffer flow angle, the size of which depends on the The specific properties of the particles, the field strength and the buffer flow rate depend on the Bandwidth is determined by the cross section of the chamber and by the ratio of the dosing speed Substanzgemisches und der Pufferflußgeschwindigkeit (Dosierverhältnis) gegeben. Sie vergrößert sich während der Trennung durch Diffusion, Turbulenz, Elektroosmose und Thermokonvektion. Die Bedingung für die vollständige Trennung zweier Substanzen ist erfüllt,Mixture of substances and the buffer flow rate (dosing ratio) given. It increases during separation through diffusion, turbulence, electro-osmosis and thermal convection. The condition for the complete separation of two substances is fulfilled,

wenn sich zum Zeitpunkt der Entnahme die Streifen nicht überlappen und wenn die wirksame Breite b einer einzelnen Entnahmevorrichtung kleiner ist als der Abstand zwischen den einzelnen Bändern an der Entnahmestelle. Die Abmessungen der Trennkammern be-if the strips do not overlap at the time of removal and if the effective width b of an individual removal device is smaller than the distance between the individual strips at the removal point. The dimensions of the separation chambers kannter Geräte sind beispielsweise LxBxd = 50x 50 χ 0,05 cm oder 50 χ 10 χ 0,5 cm liegen.known devices are, for example, LxWxd = 50x 50 χ 0.05 cm or 50 χ 10 χ 0.5 cm.

Bei den bekannten Geräten kann wegen der in der Nähe der Elektroden auftretenden Inhomogenitäten des elektrischen Felds nicht die gesamte TrennIn the known devices, because of the inhomogeneities occurring in the vicinity of the electrodes of the electric field does not cover the entire separation kammerbreite ausgenutzt werden, so daß das Gerät breiter ausgeführt werden muß, als dies bei maximaler Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Trennkammerbreite eigentlich notwendig wäre. Ferner ist das Problem, Kammerplattenpaare dieser Größe, dieChamber width are used, so that the device must be made wider than would actually be necessary with maximum utilization of the available separation chamber width. Furthermore is the problem, pairs of chamber plates of this size, the

zudem noch von allen vier Seiten aus durch die Elektroden- und Pufferzuführungs- bzw. Absaugvorrichtung unter recht hohe mechanische Spannung gesetzt werden, präzis im richtigen Abstand zu halten und gegen Pufferdruckschwankungen zu stabilisieren, technischalso from all four sides through the electrode and buffer feed or suction device be placed under quite high mechanical tension, precisely to be kept at the correct distance and against To stabilize buffer pressure fluctuations, technically

nur sehr aufwendig zu lösen und daher Ursache erhöhter Störanfälligkeit Auch ist das große Eigenvolumen der Trennkammer bei Arbeiten mit kleinen Probenmengen sehr nachteilig. So ist es kaum möglich, die Verweilzeit der Substanz in der Kammer kürzer alsCan only be solved with great effort and is therefore the cause of increased susceptibility to failure the separation chamber is very disadvantageous when working with small sample quantities. So it is hardly possible that Residence time of the substance in the chamber is shorter than etwa 30 Minuten zu halten, wodurch insbesondere Arbeiten mit empfindlichen Substanzen behindert werden. Aus der US-PS 35 09 035 ist ferner eine Trennkammer bekannt, bei der die Elektrodenräume im Winkel zu einer ebenen Trennkammer angeordnet sind. DieHold for about 30 minutes, which hinders work with sensitive substances in particular. From US-PS 35 09 035 a separation chamber is also known in which the electrode spaces at an angle are arranged to form a planar separation chamber. the Verbindung von den Elektrodenräumen zur Trennkammer erfolgt über enge Schlitze, die nur zur Stromleitung dienen, in denen aber keine Strömung des Elektrolyts auftritt Eine Strömung in den Schlitzen muß bei dieser bekannten Trennkammer unbedingt vermiedenThe connection from the electrode spaces to the separating chamber takes place via narrow slots which are only used to conduct electricity, but in which there is no flow of the electrolyte. A flow in the slots must occur this known separation chamber absolutely avoided werden, weil sich die Schlitze nur über einen Teil der Trennkammer erstrecken, so daß durch ein Ein- bzw. Austreten von Elektrolyt vom Trennraum in bzw. aus einem Schlitz die Strömung im Trennraum unzulässig gestört würde.because the slots are only over part of the Extending separation chamber so that electrolyte enters or exits from the separation chamber a slot, the flow in the separation space would be inadmissibly disturbed.

In der DT-OS 19 23 613 ist schließlich noch eine Trennvorrichtung beschrieben, bei der ein horizontaler Trennraum oben und unten durch Wände begrenzt wird die gleichförmig gerippt sind. In den Rinnen zwischen den Rippen, deren Anzahl etwa 100 bis 200 be-In DT-OS 19 23 613, a separating device is finally described in which a horizontal Separation space is limited at the top and bottom by walls that are uniformly ribbed. In the grooves between the ribs, the number of which is about 100 to 200

trägt, sollen die bereits getrennten Fraktionen geführt werden, so daß eine Wiedervermischung durch Diffusion vermieden wird. Diese bekannte Trennkammer kann also nur in horizontaler Lage verwendet werdenthe fractions that have already been separated should be carried out so that remixing by diffusion is avoided. This known separation chamber can therefore only be used in a horizontal position

und ist für Partikeltrennung praktisch nicht brauchbar. Sie ist für chargenweisen Betrieb gedacht und eignet sich bei kontinuierlichem Betrieb nur für eine grobe Vortrennung.and is practically useless for particle separation. It is intended and suitable for batch operation only for a rough pre-separation in continuous operation.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe s zugrunde, eine Trennkammer zu schaffen, die mechanisch so stabU ist. daß z. R Änderungen des Pufferdrucks und ungleiches Anpressen der Dichtungen keinen Einfluß auf die Form der Kammer haben. Zudem sollen bei kleinem Eigen volumen hohe Feldstärken, in- ι ο tensive Kühlung und große Pufferflußgeschwindigkeiten erreichbar sein. Außerdem soll die Kamme·· mit wenigen Handgriffen montierbar und in ihren Hauptabmessungen variabel sein.The present invention is therefore based on the object of creating a separation chamber which is mechanically stable. that z. R Changes in the buffer pressure and uneven compression of the seals have no influence on the shape of the chamber. In addition high field strengths, intensive cooling and high buffer flow velocities should be achievable with a small intrinsic volume. In addition, the comb should be able to be assembled in a few simple steps and its main dimensions should be variable.

Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß die Trennkammer zwischen den Elektroden einen nicht ebenen, einfach oder mehrfach gewinkelten oder gewölbten Querschnitt besitzt.This object is achieved according to the invention in that the separation chamber between the electrodes has a non-flat, single or multiple angled or arched cross-section.

Zweckmäßig ist es hierbei, die Elektroden in einem gemeinsamen Block zusammenzufassen, so daß die Elektroden praktisch eine Einheit bilden.It is useful here to have the electrodes in one to summarize common block, so that the electrodes practically form a unit.

Die Innenfläche der Trennkammer kann durch einen Innenblock und ihre Außenfläche durch die Innenfläche eines Außenblocks gebildet werden. Dabei sind Innenblock, und gewünschtenfalls auch Außenblock und Elektrodenblock zur Aufnahme von Kühlvorrichtungen vorgesehen. Besitzt die Trennkammer beispielsweise einen U-förmigen Querschnitt, so kann der Außenblock aus einem Frontblock und zwei Seitenblöcken, und der Innenblock aus einem Kühlblock bestehen.The inner surface of the separation chamber can be through an inner block and its outer surface through the inner surface an outer block can be formed. Thereby are inner block, and if desired also outer block and Electrode block provided for holding cooling devices. Has the separation chamber, for example a U-shaped cross-section, so the outer block consist of a front block and two side blocks, and the inner block consists of a cooling block.

Außen- und Innenblock werden zweckmäßigerweise über zwischengelegte Dichtungen und Elektrodenmembranen a if den Elektrodenblock gepreßt, wobei die elektrodenseitigen Kammerenden über den Schlitzen der Elektrodenräume liegen.Outer and inner block are expediently pressed over interposed seals and electrode membranes a if the electrode block, whereby the chamber ends on the electrode side lie over the slots in the electrode spaces.

Um eine genaue Einstellung der Plattenstärke zu ermöglichen, ist es zweckmäßig, die einzelnen Blöcke so auszubilden, daß Außenblock und Innenblock getrennt auf den Elektrodenblock gepreßt werden können. Dabei kann im Fall einer U-förmigen: Kammer ein durch den Elektrodenblock in den Kühlblock führender Spannbolzen H vorgesehen werden, der die Blöcke C und E zusammenspannt, so daß die Dicke der Trennkammer konstant bleibtIn order to enable the plate thickness to be set precisely, it is advisable to design the individual blocks in such a way that the outer block and inner block can be pressed separately onto the electrode block. In the case of a U-shaped chamber, a clamping bolt H leading through the electrode block into the cooling block can be provided, which clamps the blocks C and E together so that the thickness of the separating chamber remains constant

Außen- und Innenblock können aus jeweils einem oder mehreren Teilen bestehen, durch deren gegenseitige Verschiebung Trennkammern variabler Dicke und Form hergestellt werden können.Outer and inner block can each consist of one or more parts, through their mutual displacement separating chambers of variable thickness and Shape can be made.

Sind die Elektroden in einem gemeinsamen Block untergebracht, dann können sie, um eine Auswechslung so oder Reinigung zu erleichtern, einsteckbar ausgebildet sein. Dabei bewirken die Steckverbindungen die Abdichtung des Elektrodenkanals und die Justierung der Elektroden in den Elektrodenräumen. Der sonst zur Reinigung der Kammer, zum Austausch der Elektrodcnmembranen usw. erforderliche Arbeits- und Zeitaufwand entfällt hierdurch zu einem großen Teil. Darüber hinaus wird mit Hilfe des Entlastungsbolzens der Aufbau einer Trennkammer ermöglicht, die nahezu frei von Zug- und Druckkräften ist Vorteilhaft ist ferner die leichte Zugänglichkeit der Elektroden.If the electrodes are housed in a common block, they can be replaced like this or to facilitate cleaning, be designed to be pluggable. The plug connections seal the electrode channel and adjust the Electrodes in the electrode compartments. The expenditure of time and effort otherwise required for cleaning the chamber, replacing the electrode membranes, etc., is thereby largely eliminated. In addition, with the help of the relief bolt, the Construction of a separation chamber that is almost free of tensile and compressive forces is also advantageous the easy accessibility of the electrodes.

Die erfindungsgemäße Trennkammer läßt sich einfach und schnell zusammenbauen und mittels weniger Einzelteile in ihren Hauptabmessungen einfach und schnell verändern. Auf Grund ihres Aufbaus ist die Trennkammer mechanisch so stabil, daß Änderungen des Pufferdrucks und ungleiches Auspressen der Dichtungen keinen Einfluß auf die Form der Kammer haThe separation chamber according to the invention can be assembled easily and quickly and by means of less Change individual parts in their main dimensions quickly and easily. Due to its structure, the Separation chamber so mechanically stable that changes in the buffer pressure and uneven compression of the seals have no effect on the shape of the chamber

Die besondere Konstruktion des Elektrodenblocks und die nicht planare Anordnung der Trennkammer erlaubt es aber auch. Kammern verschiedenster Formen aufzubauen. So kann beispielsweise bei vorgegebenem Abstand der Elektrodenkanäle das Seitenverhältnis der Kammer durch Variation der Seitenblöcke verändert und damit die Kammerbreite variiert werden. Um eine möglichst schmale Kammer herzustellen, kann der Kühlblock z. B. durch eine mechanisch genügend stabile Glasplatte ersetzt und der Raum zwischen Elektrodenblock, Dichtungsleisten und Glasplatte als Kanal für die Kühlflüssigkeit benutzt werden. Die Kunststofftechnologie erlaubt es ferner, mit einfachen Mitteln Kammern auch mit nicht ebenen Begrenzungsflächen herzustellen. Wenn Gieß- oder Spritzverfahren angewendet werden und der Kühlblock als negative Form benutzt wird, ist die Konstanz der Kammerdicke bei beliebigen Kammerformen in hohem Maße gewährleistetThe special construction of the electrode block and the non-planar arrangement of the separation chamber also allow it. Chambers of various shapes build up. For example, with a predetermined spacing between the electrode channels, the aspect ratio of the Chamber can be changed by varying the side blocks and thus the chamber width can be varied. To a To produce the narrowest possible chamber, the cooling block can, for. B. replaced by a mechanically stable enough glass plate and the space between the electrode block, sealing strips and glass plate as a channel for the coolant can be used. The plastics technology also makes it possible to manufacture chambers with uneven boundary surfaces using simple means. When pouring or spraying processes are used and the cooling block is used as a negative shape, the constancy of the chamber thickness is arbitrary Chamber shapes guaranteed to a high degree

Das Volumen des gesamten Geräts kann durch den unebenen Aufbau der Trennkammer auf das unbedingt notwendige Minimum verringert werden und es sind zudem hohe Feldstärken, intensive Kühlung und große Pufferflußgeschwindigkeiten möglich.The volume of the entire device can be increased by the uneven structure of the separation chamber necessary minimum are reduced and there are also high field strengths, intensive cooling and large Buffer flow rates possible.

Insbesondere ist bei U-förmigem Querschnitt der Trennkammer eine sehr einfache Bauweise derselben möglich, die eine große Präzision der Kammerform zuläßt und eine große mechanische Stabilität bieteL Hierdurch brauchen Kammerpufferzu- und -abfluß nicht synchronisiert zu werden und es können Niveaugefäße gleichen Querschnitts für die Pufferzuführung verwendet werden. Die Befürchtung, daß die Ablenkung der Substanzstreifen bei dieser Kammerform in ungünstiger Weise beeinflußt würde, hat sich als unbegründet erwiesen. An Hand von Versuchen konnte festgestellt werden, daß die um die Ecke herum wandernden Substanzstreifen in ihrer Form und ihrem Ablenkungswinkel unbeeinflußt bleiben.In particular, if the separating chamber has a U-shaped cross section, it has a very simple construction possible, which allows a great precision of the chamber shape and offers great mechanical stability. This means that chamber buffer inflow and outflow do not need to be synchronized and level vessels of the same cross-section can be used for the buffer supply. Fear that the distraction of the Substance strips would be adversely affected in this chamber shape has been found to be unfounded proven. Experiments have shown that the shape and angle of deflection of the substance strips wandering around the corner remain unaffected.

Die Größe der erfindungsgemäßen Trennkammer ist konstruktiv nicht eingeschränkt. Sie kann in weiten Grenzen variiert werden.The size of the separation chamber according to the invention is not structurally restricted. You can in wide Limits can be varied.

Die Ablenkung einer gegebenen Substanz kann in sehr weiten Grenzen durch die Wahl von Pufferflußgeschwindigkeit und Feldstärken variiert werden. So sind beispielsweise bei der erfindungsgemäßen Trennkammer unter Verwendung üblicher Puffersysteme Trennungen bei Feldstärken von 80 bis 120 V/cm im Dauerbetrieb möglich. Um Turbulenz der Strömung zu vermeiden und möglichst kreisrunde, von Wandeffekten unbeeinflußte Substanzstreifen zu erzielen, haben sich Kammerdicken von 0,5 bis 1 mm als optimal herausgestellt.The deflection of a given substance can be varied within very wide limits by choosing the buffer flow rate and field strengths. So are For example, in the case of the separating chamber according to the invention using conventional buffer systems, separations at field strengths of 80 to 120 V / cm in continuous operation are possible. To avoid turbulence in the flow and as circular as possible, from wall effects To achieve unaffected strips of substance, chamber thicknesses of 0.5 to 1 mm have proven to be optimal.

Da in der Mehrzahl der Trennprobleme geringe Verweilzeilen in der Kammer und hohe Durchsatzraten wünschenswert sind, kann für die Absaugvorrichtung ein Antriebsmotor vorgesehen v/erden, der Durchflußgeschwindigkeiten von 3 bis 20 ml/Minute erlaubt. Dies entspricht Verweilzeiten von 7 bis 1 Minute in der Kammer. Für besondere Trennungen, z. B. in Ampholytgradienten sind geringe Flußgeschwindigkeiten erwünscht. Sie werden durch einen zweiten, leicht austauschbaren Antriebsmotor mit geringen Laufgeschwindigkeiten erzielt. Das kleine Kammervolumen ist für derartige Trennungen gleichzeitig ein erheblicher wirtschaftlicher Vorteil.Because in the majority of separation problems, low dwell times in the chamber and high throughput rates are desirable, a drive motor can be provided for the suction device, which allows flow rates of 3 to 20 ml / minute. this corresponds to residence times of 7 to 1 minute in the chamber. For special separations, e.g. B. in ampholyte gradients low flow velocities are desirable. They are achieved by a second, easily replaceable drive motor with low running speeds. The small chamber volume is at the same time a considerable economic advantage for such separations.

An Hand der in der Zeichnung dargestellten beispielsweisen Ausführungsform wird die Erfindung im folgenden näher erläutert. Es zeigtUsing the exemplary embodiment shown in the drawing, the invention is illustrated in FIG explained in more detail below. It shows

F i g. 1 einen Horizontalschnitt durch eine erfindungsgemäß ausgebildete Trennkammer, undF i g. 1 shows a horizontal section through a separating chamber designed according to the invention, and

F i g. 2 einen Vertikalschnitt durch die in F i g. 2 gezeigte Trennkammer.F i g. 2 shows a vertical section through the in FIG. 2 separation chamber shown.

In den F i g. 1 und 2 ist eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Trennkammer gezeigt. Die Trennkammer wird einerseits von einem Frontblock A, und zwei Seitenblöcken B begrenzt. Innerhalb dieser Blöcke liegt ein Kühlblock C mit einem Kühlflüssigkeitskanal D₁ so daß sich insgesamt ein U-förmiger Querschnitt der Trennkammer ergibt. Den Seitenblökken B und dem Kühlblock C gegenüberliegend angeordnet ist ein Elektrodcnblock E, der, gegenüberliegend den Enden der U-förmigen Trennkammer, Elektrodenkanäle F mit Elektroden enthält. Zwischen dem Elektrodenblock und der Trennkammer sind kompressible Dichtungsleisten K (z. B. aus Silicon), Elektrodenmembranen L und Ausgleichsleisten M angeordnet. Die Blöcke sind durch Spannbolzen G miteinander verspannt, wobei die durch die Seitenblöcke B führenden Löcher als Langlöcher ausgeführt sind, so daß die Dikke der Trennkammer einstellbar ist Ein durch den Elektrodenblock E hindurchgeführter Spannbolzen H dient zur Aufnahme der Kräfte, die eine Verringerung der Kammerdicke bewirken wurden. Die Kammerpufferlösung wird durch Kammerpufferzuführungen E zu- bzw. abgeleitet Das zu trennende Substanzgemisch wird durch eine Zuführung P eingeleitet. Der Elektrodenpuffer wird durch Anschlüsse N zu- bzw. abgeführt. Die Elektroden selbst sind mittels eingeschliffener Steckverbindungen in die Elektrodenkanäle eingesetzt, so daß sie einfach und schnell ausgewechselt werden können.In the F i g. 1 and 2 show a preferred embodiment of the separation chamber according to the invention. The separation chamber is bounded on the one hand by a front block A and two side blocks B. Within these blocks there is a cooling block C with a cooling liquid channel D ₁ so that overall a U-shaped cross section of the separating chamber results. Arranged opposite the side blocks B and the cooling block C is an electrode block E which, opposite the ends of the U-shaped separating chamber, contains electrode channels F with electrodes. Compressible sealing strips K (e.g. made of silicone), electrode membranes L and compensating strips M are arranged between the electrode block and the separating chamber. The blocks are clamped together by clamping bolts G , the holes leading through the side blocks B being designed as elongated holes so that the thickness of the separating chamber can be adjusted.A clamping bolt H passed through the electrode block E is used to absorb the forces that cause a reduction in the chamber thickness became. The chamber buffer solution is supplied or discharged through chamber buffer feed lines E. The substance mixture to be separated is fed in through a feed line P. The electrode buffer is supplied and discharged through connections N. The electrodes themselves are inserted into the electrode channels by means of ground-in plug connections so that they can be exchanged quickly and easily.

Die oben beschriebene Vorrichtung erlaubt eine Isolierung von Trennkammer und Elektrodenraum sowie hohe Feldstärken und lange Verweilzeiten in der Trennkammer. Dadurch kann die Vorrichtung so betrieben werden, daß man den Trennraum kontinuierlich mit einer Lösung eines geeigneten Trägerampholyten mit der Lösung des zu trennenden Substanzgemisches beschickt ein zur Ausbildung eines pH-Gradienten genügend hohes Feld anlegt und die im pH-Gradienten aufgetrennten Fraktionen aus den Entnahmeöffnungen der Trennkammer entnimmtThe device described above allows isolation separation chamber and electrode space as well as high field strengths and long dwell times in the Separation chamber. As a result, the device can be operated in such a way that the separation space is continuously with a solution of a suitable carrier ampholyte with the solution of the substance mixture to be separated loads a field that is high enough to form a pH gradient and that in the pH gradient removed fractions from the removal openings of the separation chamber

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung füllt man in die von der Trennkammer durch geeignete Membranen abgetrennten Elektrodenräume geeignete Flüssigkeiten ein, deren Acidität (Anodenraum) bzw. Basizität (Kathodenraum) den gewünschten Bereich des pH-Gradienten begrenzt; z. B. pH-Bereich 4 bis 8, Anodenraum einprozentige Phosphorsäure, Kathodenraum, l,5prozentig wäßrige Äthanolamin-Lösung. According to a preferred embodiment of the invention, the separation chamber is filled with suitable ones Membranes separated electrode chambers suitable liquids whose acidity (anode chamber) or basicity (cathode compartment) limits the desired range of the pH gradient; z. B. pH range 4 to 8, anode compartment one percent phosphoric acid, cathode compartment, 1.5 percent aqueous ethanolamine solution.

Zweckmäßig gibt man das zu trennende Substanzgemisch in die Trägerampholyt-Lösung, bevor diese in den Trennraum eintrittThe substance mixture to be separated is expediently added to the carrier ampholyte solution before it enters the separation space

Vorzugsweise führt man das zu trennende Substanzgemisch vermittels einer Dosierpumpe in den Trennraum ein. The substance mixture to be separated is preferably introduced into the separation space by means of a metering pump.

example

' Man durchströmt den Anodenraum mit einprozentiger Phosphorsäure, den Kathodenraum mit l,5prozentiger Äthanoaminlösung. Trennkammer und Elektrodenräume sind durch eine Dialysiermembran voneinander getrennt Die große mechanische Stabilität der Kammer gestattet es, die Ampholie-Lösung durch sechs Niveaugefäße der Trennkammer zuzuführen. Bei den handelsüblichen Trennkammersystemen werden hierzu die üblichen Kammerpufferzuführungen benutzt. Man kann die Einstellungsgeschwindigkeit des pH-Gradienten in Abhängigkeit von der Verweilzeit des Trägerampholyten in der Trennkammer bei Feldstärken von 90 bis 100 V/cm bestimmen. Hierbei strömt die einprozentige Ampholine- Lösung aus den Niveaugefäßen als 11 cm breiter und 0,05 cm dicker Pufferfilm durch die Kammer und wird nach einer LaufstreckeOne percent phosphoric acid flows through the anode compartment and 1.5 percent ethanoamine solution in the cathode compartment. Separation chamber and electrode chambers are separated from one another by a dialysis membrane . The high mechanical stability of the chamber allows the ampholia solution to be fed into the separation chamber through six level vessels. In the case of the commercially available separating chamber systems, the usual chamber buffer feeds are used for this purpose. The speed at which the pH gradient is set can be determined as a function of the retention time of the carrier ampholyte in the separation chamber at field strengths of 90 to 100 V / cm. Here, the one percent ampholine solution flows from the level vessels as a buffer film 11 cm wide and 0.05 cm thick through the chamber and is after a walk

ίο von 36 cm durch ein 48fache Schlauchpumpe am unteren Ende der Kammer entnommen. Man beobachtet, daß die Leitfähigkeit, die bei Ampholytgradienten ein Maß für die Einstellung des pH-Gradienten ist, innerhalb von etwa 10 Minuten, abhängig von der Puffer-ίο of 36 cm through a 48-fold peristaltic pump on the lower Taken from the end of the chamber. It is observed that the conductivity, which is an ampholyte gradient The measure for setting the pH gradient is within about 10 minutes, depending on the buffer

• 5 flußgeschwindigkeit, auf 40 bis 60% des Ausgangswerts zurückgeht. Die Bestimmung des pH in den 48 Fraktionen ergab im Rahmen der methodischen Genauigkeit übereinstimmende pH-Gradienten bei Verweilzeiten von 25, 50 und 100 Minuten. Sie zeigten den erwarteten Verlauf.• 5 flow rate, to 40 to 60% of the initial value going back. The determination of the pH in the 48 fractions was within the scope of the methodical accuracy matching pH gradients with residence times of 25, 50 and 100 minutes. They showed the expected Course.

Die unerwartet rasche Einstellung des pH-Gradienten in der Trennkammer läßt vermuten, daß die Herstellung des Gradienten und eine weitgehende isoelektrische Fokussierung in einem einzigen Durchlauf erreicht werden kann, wenn die Verweilzeit in der Trennkammer genügend groß ist. Diese Möglichkeit wurde an Hand der Trennungen von vier Proteinen, Serum-Albumin (Rind) (Behringwerke A.G„ Marburg, elektrophoretischer Reinheitsgrad 100%), Gamma-Globulin (Rind) (Behringwerke A.G, Marburg, reinst) (elektrophoretisch einheitlich [/']), Hämiglobin (Rind) (Serva Entwicklungslabor, Heidelberg, zweimal kristallisiert, reinst) und Myoglobin (Pferd) (Serve Entwicklungslabor, Heidelberg, reinst) geprüftThe unexpectedly rapid adjustment of the pH gradient in the separation chamber suggests that the production of the gradient and an extensive isoelectric focusing achieved in a single pass can be if the residence time in the separation chamber is sufficiently long. That possibility was on the basis of the separations of four proteins, serum albumin (cattle) (Behringwerke A.G "Marburg, electrophoretic Purity 100%), gamma globulin (beef) (Behringwerke A.G, Marburg, pure) (electrophoretic uniform [/ ']), hemiglobin (cattle) (Serva development laboratory, Heidelberg, crystallized twice, pure) and myoglobin (horse) (Serve Development Laboratory, Heidelberg, pure) tested

Es wurden zwei Arten der Substanzzuführung in der Kammer angewendet:Two types of substance delivery were used in the chamber:

a) Auflösen des Proteins in der Ampholine-Lösung eines der sechs Niveaugefäße. Bei einer Konzentration des Proteins von 1 mg/ml Ampholine-Lsg., 100 Min. Verweilzeit und einem Kammervolumen von 20 ml werden pro Stunde 2 mg Protein durchgesetzt. a) Dissolving the protein in the ampholine solution one of the six level vessels. At a protein concentration of 1 mg / ml Ampholine solution, 100 min. Residence time and a chamber volume of 20 ml, 2 mg of protein per hour are enforced.

b) Zupumpen der Proteinlösung durch die Dosiereinrichtung. Bei einer Substanzkonzentration von 10 mg/ml Ampholine-Lsg, einem Dosierverhältnis von Substanzlösung/Kammerpuffer = 1 :50, einer Verweilzeit von 100 Min. werden ebenfalls etwa 2 mg Protein/Std. getrenntb) pumping in the protein solution through the metering device. At a substance concentration of 10 mg / ml ampholine solution, a dosage ratio of substance solution / chamber buffer = 1:50, a residence time of 100 min. are also about 2 mg protein / hour separated

Ergebnisseresults

In F i g. 4 ist die Trennung des Gamma-Globulins im pH-Gradienten von 3 bis 10 dargestellt Die punktierte Kurve stellt den Extinktionsverlauf bei 280 nm in den verschiedenen Fraktionen nach einer Verweilzeit von 50 Min. dar. Injiziert wurde eine Globulinlösung von 5 mg/ml in einprozentige Ampholine-Lösung im Dosierverhältnis 1 :50. Die ausgezogene Kurve zeigt die Trennung nach doppelter Verweilzeit (100 Min.) und doppelter Proteinkonzentration. Das Trennergebnis war im letzteren Fall unabhängig davon, an welcher Einlaßstelle die Globulinprobe injiziert wurde. Dies zeigt daß die erreichte Trennung zum mindesten eine sehr weitgehende Fokussierung der Globulinanteile mit unterschiedlichen IP in ihnen zukommenden pH-Bereich darstellt Die gestrichelte Kurve gibt den in den Fraktionen ermittelten pH-Wert wieder. In Fig. 4 shows the separation of the gamma globulin in the pH gradient from 3 to 10. The dotted curve shows the course of the extinction at 280 nm in the various fractions after a residence time of 50 minutes. A globulin solution of 5 mg / ml was injected into one percent Ampholine solution in a dosage ratio of 1:50. The solid curve shows the separation after double the residence time (100 min.) And double the protein concentration. In the latter case, the separation result was independent of the inlet point at which the globulin sample was injected . This shows that the separation achieved represents at least a very extensive focusing of the globulin fractions with different IPs in their associated pH range. The dashed curve shows the pH value determined in the fractions.

Die Trennung des »elektrophoretisch einheitlichen« Serum-Albumins unter der Bedingungen der Globulin- The separation of the "electrophoretically uniform" serum albumin under the conditions of globulin

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trennung mit 100 Min. Verweilzeit ist in F i g. 5 dargestellt. In flacheren pH-Gradienten (Ampholine pH 6 bis 8) wurden Myoglobin- und Hämoglobinlösungen (2,5 mg/ml) mit einer Verweilzeit von 100 Min. und einem Dosierverhältnis von 1 :50 getrennt. Die punktierten Linien in Fig.6 stellen die bei 415 nm, die durchgezogenen die bei 280 nm gemessenen Extinktionen dar. Aus F i g. 6 ist auch die ausgezeichnete Reproduzierbarkeit der pH-Gradienten zu entnehmen, die durch die gestrichelten Linien repräsentiert werden.separation with 100 min. residence time is shown in FIG. 5 shown. In shallower pH gradients (Ampholine pH 6 to 8) were myoglobin and hemoglobin solutions (2.5 mg / ml) with a residence time of 100 min. and a dosage ratio of 1:50 separately. The dotted lines in Figure 6 represent those at 415 nm, the The solid line represents the absorbance measured at 280 nm. From FIG. 6 is also the excellent reproducibility the pH gradients represented by the dashed lines.

Da die Trennung und Fraktionierung kontinuierlich erfolgt, können zu jedem Zeitpunkt Proben für Kontrollmessungen entnommen und so z. B. die Güte der Trennung laufend verfolgt werden. Wird bei so geringer Substanzkonzentration gearbeitet, daß keine Veränderung des Gradienten durch die Pufferwirkung der Substanz zu befürchten ist, so können die IP nacheinander getrennter Substanzen unmittelbar miteinander verglichen werden. Höhere Substanzkonzentrationen verursachen allerdings Störungen der Linearität des Gradienten (vgl. F i g. 4), so daß in diesem Fall der Verlauf des pH-Giradienten jeweils gesondert bestimm) werden muß.Since the separation and fractionation take place continuously, samples can be used for control measurements at any time removed and so z. B. the quality of the separation can be continuously monitored. Will be lower at so Substance concentration worked that no change in the gradient due to the buffer effect of the Substance is to be feared, so the IP of successively separated substances can be directly related to one another be compared. However, higher substance concentrations cause disturbances in the linearity of the Gradients (see Fig. 4), so that in this case the course of the pH gradient is determined separately in each case) must become.

Da im kontinuierlichen Verfahren weder ein Dichtegradient aufzubauen ist, noch nach erfolgter Trennung in einem besonderen Arbeitsgang fraktioniert werder muß, ist der Arbeits- und Zeitaufwand im Vergleich zum diskontinuierlichen Verfahren sehr gering; zumal die Trennung auf Grund der hohen anwendbaren Feldstärken rascher erfolgt als in der Trennsäule.Since in the continuous process there is no need to build up a density gradient, even after separation must be fractionated in a special operation is the labor and time required in comparison very low compared to the discontinuous process; especially the separation due to the high applicable field strengths occurs faster than in the separation column.

Die Trennungen wurden bisher ausschließlich in einprozentig wäßrigen Ampholine-Lösungen in der von uns entwickelten Trennkammer (8) ausgeführt. Wegen der geringen Dichte der Ampholine-Lösungen wurden nur wenig kon2:entrierte Proteinlösungen getrennt. Es besteht jedoch die Möglichkeit eines Dichteausgleichs z. B. durch Rohrzucker, Ficoll usw., bzw. durch apparative Veränderungen.The separations have so far only been carried out in one percent aqueous ampholine solutions in the von the separation chamber (8) developed by us. Because of the low density of the ampholine solutions were only a little con2: entrapped protein solutions separated. However, there is the possibility of density compensation z. B. by cane sugar, Ficoll, etc., or by apparatus Changes.

Hierzu 2 Blatt ZeichnungenFor this purpose 2 sheets of drawings

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Claims

Patent claims:

1. Trennkammer für die kontinuierliche Ablenkungselektrophorese eines trägerfreien Elektrolytstroms, mit parallel zur Elektrolytströmung angeordneten Elektroden, Zu- und Ableitungen für den Elektrodenpuffer, den Kammerpuffer und die zu trennende Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände der Trennkammer (TK) durch gegeneinander verschiebbare äußere Blöcke (A, Bi, Bi) und einen inneren, mit je einer Wand diesen Blöcken (A, Bi, Bi) gegenüberliegenden Kühlblock (C) gebildet sind, die gegeneinander abgedichtet sind, wobei infolge entsprechender Formgebung der Außenseite des Kühlblocks (C) sowie der gegenüberliegenden Innenseiten der Btöcke (A, Bu Bi) eine einfach oder mehrfach gewinkelte oder gewölbte Trennkammer (TK) mit längs der Rußrichtung konstantem Querschnitt gebildet wird.1. Separation chamber for the continuous deflection electrophoresis of a carrier-free electrolyte flow, with electrodes arranged parallel to the electrolyte flow, supply and discharge lines for the electrode buffer, the chamber buffer and the substance to be separated, characterized in that the walls of the separation chamber (TK) are made by mutually displaceable outer blocks (A, Bi, Bi) and an inner cooling block (C) , each with a wall , opposite these blocks (A, Bi, Bi) , which are sealed against one another, with the outer side of the cooling block (C) and the opposite inner sides of the blocks (A, Bu Bi) a single or multiple angled or arched separating chamber (TK) is formed with a constant cross section along the soot direction.

2. Trennkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden in einem gemeinsamen, mit einer Seite an die Blöcke (Bi, Bi, C) angrenzenden Block f£J zusammengefaßt sind.2. Separation chamber according to claim 1, characterized in that the electrodes are combined in a common block f £ J adjoining the blocks (Bi, Bi, C) on one side.

3 Trennkammer nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektroden in die Elektrodenräume einsteckbar und justierbar sind.3 separation chamber according to claims 1 and 2, characterized in that the electrodes in the Electrode spaces are insertable and adjustable.

4. Trennkammer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in einem oder mehreren der äußeren Blöcke (A, B\, Bi) sowie die Elektrodenblocks (E) zusätzlich Kühlvorrichtungen vorgesehen sind.4. Separation chamber according to claim 1 or 2, characterized in that cooling devices are additionally provided in one or more of the outer blocks (A, B \, Bi) and the electrode blocks (E).

5. Trennkammer nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Außenblöcke und Innenblock über Dichtungen (K) und Elektrodenmembranen (L) gemeinsam auf den Elektrodenblock (E) gepreßt sind, wobei die eiektrodenseitigen Kammerenden über den Schlitzen der Elektrodenräume liegen.5. Separation chamber according to claim 1 to 3, characterized in that outer blocks and inner block are pressed together on the electrode block (E) via seals (K) and electrode membranes (L) , the electrode-side chamber ends being above the slots in the electrode spaces.

6. Trennkammer nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Außenblock und Innenblock getrennt auf den Elektrodenblock preßbar sind.6. separation chamber according to claim 1 to 3, characterized characterized in that the outer block and inner block can be pressed separately onto the electrode block.

7: Trennkammer nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennkammer einen U-förmigen Querschnitt aufweist.7: Separation chamber according to Claims 1 to 5, characterized in that the separation chamber has a U-shaped cross section.

8. Trennkammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch den Elektrodcnblock ^durchgreifender Spannbolzen (H) die Blöcke (C) und (E) zusammenspannt8. Separation chamber according to one of the preceding claims, characterized in that a through the Elektrodcnblock ^ clamping bolt (H) clamps the blocks (C) and (E) together

9. Trennkammer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Außenblöcke (A, ft. 02^ und der Kühlblock (C) jeweils aus einem oder mehreren Teilen bestehen, durch deren gegenseitige Verschiebung Trennkammern variabler Dicke und Form herstellbar sind.9. Separation chamber according to one of the preceding claims, characterized in that the outer blocks (A, ft. 02 ^ and the cooling block (C) each consist of one or more parts, through the mutual displacement of which separating chambers of variable thickness and shape can be produced.