DE1918661A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Feststellung von lebenden Bakterien - Google Patents

Description

Dr. rer. nat. Horst Schuler 6Frankfurt/Main ι, den n.n. 1969

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PATENTANWALT 1918 661 ^Τβ'^θί°^{Π (0611) 23722}°

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Vorrichtung und Verfahren zur Feststellung von lebenden Bakterien

Die Erfindung "betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur nahezu augenblicklichen Feststellung der Anwesenheit von lebenden Bakterien in einer Flüssigkeit in einem sehr kleinen Probenvolumen. Insbesondere betrifft sie einen elektronischen Zähler für lebende Bakterien.

Es ist bereite bekannt, daß, wenn man eine elektrisch leitende Flüssigkeit zur Strömung durch eine kleine Öffnung in einer nicht leitenden Trennwand veranlaßt, während man gleichzeitig einen elektrischen Strom durch die gleiche öffnung schickt, Teilchen, Bakterien, usw., die eine andere elektrische Leitfähigkeit als die Flüssigkeit haben, die elektrische Leitfähigkeit in der Öffnung beeinflussen und eine momentane Widerstandsänderung verursache.n. Indem man diese Widerstandsänderungen elektronisch zählt, und sie mit der Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung durch die Öffnung in Zusammenhang bringt„ kann man die Konzentration solcher Partikel, Bakterien usw. in der Flüssigkeit bestimmen.

Offensichtlich wird die Größe und der Unterschied in der Leit-

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fähigkeit der Teilchen, Bakterien usw. im Vergleich mit der Flüssigkeit, in der sie enthalten sind, das Ausmaß und die Art der Widerstandsänderung beeinflussen, welche sie verursachen,, Es ist beispielsweise beobachtet worden, daß lebende Bakterien in solchen Systemen eigenartig reagieren, und daß insbesondere sich diese Reaktion mit der Größe des Stroms in der Meßapparatur zu ändern scheint. Curby, Swanton und Lind bezeichnen in "Journal of General Microbiology" (1963), Bd. 32, S. 33-41 "dieses Phänomen als Empfindlichkeit gegenüber der elektromotorischen Kraft (emf.)." Von Swanton, Curby und Lind wurde in einem anderen Artikel, veröffentlicht in Band 10, Nr. 5 (September 1962),Seite 480 der Zeitschrift "Applied Microbiology"» angedeutet, daß diese stromabhängige Reaktion der lebensfähigen Bakterien verwendet werden kann, um die Lebensfähigkeit einer Bakterienkultur abzuschätzen.

Trotz dieser früheren Beobachtungen und Andeutungen hat es bisher keinen elektronischen Zähler gegeben, der fähig ist, zwischen lebenden und toten Bakterien zu unterscheiden. In der Tat gibt es kein bekanntes Verfahren, um in einer kleinen Probe die Anwesenheit oder in einer großen Probe die Konzentration lebender Bakterien zu bestimmen, welches nicht relativ langwierige und komplizierte Laboratoriumsverfahren erfordert.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Gerät zu liefern, das lebende Bakterien elektronisch feststellen kann.

Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, einen elektronischen Zähler zu liefern, der lebende Bakterien einerseits und tote Bakterien, inerte Teilchen usw. im gleichen Größenbereich andererseits voneinander unterscheiden kann.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, eine vereinfachte und rasche Methode zur Bestimmung des Gehaltes von Flüssigkeiten an lebenden Bakterien zu geben.

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Diese und andere Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch einen Meßfühler, der ein Paar Elektroden zur Erzeugung eines Stromweges durch ein sieh nicht bewegendes Flüssigkeitsvolumen, eine Vorrichtung zurElnengung der Querschnittsfläche des Stromweges oder eines Abschnittes davon, Mittel zur Erhöhung des elektrischen Potentials längs des" eingeengten Stromweges oder Abschnittes und eine Vorrichtung zur Messung momentaner Widerstandsänderungen längs des Stromweges bei der Erhöhung des elete trischen Potentials besitzt. In seiner typischen Form enthält dieser Meßfühler ein !Flüssigkeitsgefäß mit einer Vorrichtung zur abwechselnden Füllung und Leerung des Gefäßes mit Flüssigkeit. In dem Gefäß sind ein Paar Elektroden zur Einstellung eines Stromweges in der Flüssigkeit vorgesehen. Eine außerhalb des G-efäßes befindliche Vorrichtung liefert ein ansteigendes elektrisches Potential in einem kritischen Volumen in oder in der Nähe des eingeengten Stromweges. Zwischen den Elektroden ist eine elektrisch nicht-leitende G-renzwand angeordnet mit einer Öffnung, deren Durchmesser im allgemeinen weniger als das 5Ofache des Durchmessers der zu messenden Bakterien beträgt. Der Stromweg verläuft notwendigerweise durch die Öffnung und an diesem Punkt wird seine Querschnittsfläche eingeengt. Das kritische Volumen liegt in oder in der Nähe dieser Öffnung.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse einer Flüssigkeit auf lebende Bakterien umfaßt die Erzeugung eines elektrischen Stromflusses durch einen sich nicht bewegenden Teil der auf lebende Bakterien zu untersuchenden Flüssigkeit, während die Querschnittsfläche" des elektrischen Stromweges oder eines Abschnittes davon eingeengt wird. Das elektrische Potential über der Einengung des Stromweges wird dann vergrößert, um jegliche lebende Bakterien in dem Stromweg in oder in der Nähe der Einengung durch Messung der momentanen 7/iderstandsänderung, die in dem Stromv.eg im Ergebnis der Widerstandsänderangen der darin enthaltenen lebenden Bakterien auftritt » festzukeilen.

Wenn die Anzahl dieser durchgeführten Messungen statistisch

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bedeutungsvoll ist, dann kann man die Konzentration der lebenden Bakterien in der Flüssigkeit abschätzen. Dies erfordert eine Vorrichtung zum periodischen Austausch der Probenflüssigkeit in dem eingeengten Teil des Stromweges und das Ansteigen der darüberliegenden Spannung, nachdem die neue Probenflüssigkeit eingebracht worden ist und ihre Bewegung aufgehört hat. Zu diesem Zweck enthält die vorzugsweise Form der vorliegenden Erfindung einen Sägezahngenerator zur periodischen Erhöhung der Spannung längs des eingeengten Stromweges und zu ihrer anschließenden Verringerung und eine Kolbenpumpe zum periodischen Einpumpen und Auspumpen von Flüssigkeit. Die Rückhub- oder Nichtpumpphase der Kolbenpumpe wird so gesteuert, daß sie mit der Phase des Spannungsanstieges des Sägezahngenerators zusammenfällt.

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht eines Gerätes, welches die vorzugsweise Ausführung der Erfindung umfaßt.

Fig. 2 ist eine Ansicht eines Teilschnittes des Gerätes der Fig. 1.

Fig. 3 ist ein vergrößerter Teilschnitt einer alternativen Form des in Fig. 2 gezeigten Meßfühlers.

Fig. 1 zeigt einen später noch näher zu beschreibenden Meßfühler 10 / eine Kolbenpumpe 12, welche die auf lebende Bakterien zu untersuchende Flüssigkeit aus einem Einlaß 14 durch den Meßfühler 10 zu einem Auslaß 16 fördert. Beim normalen Betrieb der Kolbenpumpe 12 erfolgt die Zufuhr der Meßflüssigkeit zu dem Fühler 10 periodisch, d.h. sie erfolgt in periodischen Intervallen, zwischen denen die Meßflüssigkeit in dem System sich in Ruhe befindet. Während dieser zwischengeschalteten Ruheperioden befindet sich der Kolben der Pumpe 12 auf seinem Rückhub und der Meßfühler 10 wird, wie ebenfalls in weiteren Einzelheiten untenstehaad beschrieben, zur Messung der lebenden Bakterien in Tätigkeit gesetzt.

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Andere Teile des in Fig. 1 gezeigten Gerätes schließen einen Sägezahnspannungserzeuger 18 zur periodischen Erhöhung des elektrischen Potentials im Meßfühler 10 über einen vor"bestimmten Bereich ein. Der Programmier- und Steuerteil 20 koordiniert die Arbeitsweise des Sägezahnspannungserzeugers 18 mit der Arbeitsweise der Kolbenpumpe 12, so daß die Periode der ansteigenden Spannung im Meßfühler 10 zusammenfällt mit dem Rückhub des Kolbens der Pumpe 12 und daher mit der Periode, in der die Flüssigkeit im Meßfühler 10 sich in Ruhe befindet. Ein Widerstand 22 in Reihe mit dem Meßfühler 10 und dem Sägezahngenerator 18 wird zusammen mit einem Potentiometer 24 über dem Widerstand 22 verwendet, um die momentanen Widerstandsänderungen in dem Meßfühler 10 zu messen. Der Differentiator 26 gibt

ab

ein Signalf wenn die Anderungsgeschwindigkeit der Spannung über dem Widerstand 22 eine plötzliche Änderung erfährt, wolchos der Zähler 28 registriert. Zu diesem Zwecke werden die Änderungen, welche das unmittelbare Ergebnis der sich periodisch ändernden Ausgangsspannung der Sägezahnspannung des Spannungsgenerators 18 sind, in dem Differentiator-Zählersystem unterdrückt .

Das in der Figur 1 gezeigte Gerät mit dem zugehörigen Meßfühler 10 ist eine vorzugsweise Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und ist geeignet für die wiederholten Messungen, die für eine verläßliche statistische Abschätzung des Gehaltes an lebenden Bakterien in einer Flüssigkeit erforderlich sind. Es ist jedoch offensichtlich, daß andere Vorrichtungen für die Ausübung der Funktionen gewisser Teile des Gerätes gleich gut geeignet sein können. Z.B. kann anstelle der Kolbenpumpe 12 ein automatisch gesteuertes Ventil benutzt werden, um die wechselnde Zulieferung von Flüssigkeit zu dem Meßfühler 10 in Phase mit dem Sägezahnspannungsgenerator 18 zu bewirken. Ebenso können zahlreiche parallel angeordnete Meßfühler verwendet werden, um die Zahl der Einzelmessungen zu erhöhen, welche in einem vorgegebenen Zeitraum durchgeführt werden können.

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Pig. 2 zeigt einen vergrößerten Teilschnitt des Meßfühlers 10 der Pig. 1. Insbesondere zeigt sie eine Kammer 30 für die Meßflüssigkeit, die als Gehäuse für ein Elektrodenpaar 32 und 34 mit den Zuleitungen 36 und 38 zum Sägezahnspannungsgenerator dient. Zwischen den Elektroden 32 und 34 ist eine elektrisch nicht-leitende Grenzwand 40 eingefügt mit einer öffnung 42, die einen Durchmesser von weniger als dem 50fachen des Durchmessers einer zu erfassenden BakterJe 44 hat. Die Kurven 46 deuten allgemein den Verlauf des Stromweges zwischen den Elektroden 32 und 34 und in der durch die Grenzwand 40 verursachten Einengung des Stromweges an.

Typischerweise liegt der Abstand zwischen den Elektroden 32 und 34 in dem Meßfühler 10 in der Größenordnung von einigen Zoll oder weniger. IHir die meisten Bakterien ist eine Öffnung 42 mit einem Durchmesser von etwa 25 Mikron und im allgemeinen kreisförmiger Gestalt geeignet. Die auf lebende Bakterien zu untersuchende Flüssigkeit hat eine Leitfähigkeit von etwa 0,01 Siemens/cm. Normalerweise besteht die Probeflüssigkeit aus Wasser, dem zur Erhöhung der Leitfähigkeit auf das gewünschte Maß ein Elektrolyt, beispielsweise Natriumchlori'd, zugefügt wird. Das elektrische Potential zwischen den Elektroden 32 und 34 wird periodisch von etwa 0 Volt an "bis auf etwa 30 Volt variiert, während die Meßflüssigkeit in der Kammer 30 in Rahe ist. Bei irgendeinem elektrischen Potential innerhalb dieses Bereiches erleiden lebende Bakterien in der näheren Umgebung der Öffnung 42 augenscheinlich ein Zusammenbrechen ihrer Fähigkeit, dem Ionenstrom durch ihre äußere Zellwand hindurch zu widerstehen und der Widerstand des Stromweges zwischen den Elektroden 32 und 34 wird im Ergebnis momentan geändert. Anstelle der Grenzwand 40 mit der Öffnung 42 in dem Meßfühler 10 kann eine Elektrode mit einer sehr kleinen Spitze als Abschluß des Stromweges verwendet werden. Beim Sammeln des Stromes an einer solchen Elektrode wird die Querschnittsfläche des Stromweges eingeengt. In seiner Punktion wird dieser eingeengte Stromweg in der gleichen Weise verwendet, wie der durch die öffnung 42 und die Grenzwand 40 gegebene eingeengte Stromweg.

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Eine andere Alternative zu der in der Figur 2 gezeigten Form des Meßfühlers 10 wird in Fig. 3 gezeigt. In dieser Ausführungsform der Erfindung umfaßt der Meßfühler 48 die Elektroden 50 und 52 mit den Zuleitungen 54 und 56. Die Elektroden 50 und sind an den beiden Enden eines Flüssigkeitsgefäßes 58 mit eingeengtem Durchmesser angeordnet, so daß der Querschnitt des Stromweges zwischen den Elektroden auf seiner ganzen Länge eingeengt ist. Der Meßfühler 48 wird durch den Flüssigkeitseinlaß 60 und den Auslaß 62 vervollständigt und ist in seiner äußeren Schaltung und den äußeren Bauteilen sonst ähnlich den im Zusammenhang mit dem Meßfühler 10 in den Fig. 1 und 2 "beschriebenen Teilen.

Obwohl der Mechanismus des Zusammenbrechens von lebenden Bakterien infolge des Anlegens einer Spannung, die augenscheinlich die Spannung überschreitet, welche die Bakterien aushalten können, nicht klar ist, it-.t es bekannt, daß die äußeren Zellwände einer lebenden Bakterie eine Differenz der Ionenkonzentration zwischen der Innenweite und der Außenseite der Bakterie aufrechterhalten. Dies befähigt die Bakterie, eine Anzahl von für ihre Lebensfähigkeit notwendigen Ionenbestandteilen zurückzuhalten und schließt die Abwanderung dieser Bentandteile in die Bereiche der.Flüssigkeit mit niedrigerer Ionenkonzentration aus. Diese Fähigkeit der Bakterienmembran versagt augenscheinlich, wenn das elektrische Fotential über der Bakterie einen gewissen Pegel übersteint. Daher beginnen die Ionen in der Bakterie durch Ionenwanderung durch die Zellwand der Bakterie einen Strom hindurchzuleiten und bewirken eine Änderung der Leitfähigkeit oder des Widerstandes in dem kleinen, von der Bakterie eingenommenen und sie unmittelbar umgebenden Volumen. Es itst dieser angenommene Effekt, welcher in dem G-erät und in dem Verfahren der Erfindung zur Feststellung der Anwesenheit lebender Bakterien ausgenutzt wird.

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Claims (8)

— ο — Ansprüche

1) Meßvorrichtung zur Peststellung der Anwesenheit lebender Bakterien in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Torrichtung (32, 34, 50, 52) zur Herstellung eines Stromweges in einem ruhenden Teil der Flüssigkeit, von dem mindestens ein Abschnitt (42) auf einen Durchmesser von weniger als dem 50fachen des Durchmessers der zu bestimmenden Bakterien eingeengt ist, eine Vorrichtung (.18) zur Erhöhung des elektrischen Potentials längs des eingeengten Stromweges (42) zur Erzeugung einer Widerstandsänderung in dem Stromweg (42) infolge der Anwesenheit lebender Bakterien in der Umgebung des eingeengten Stromweges (42) und eine Vorrichtung (22, 24, 26, 28) zur Messung plötzlicher Widerstandsänderungen in dem Stromweg (42) bei dem Ansteigen des elektric' sehen Potentials über diesem Abschnitt aufweist.

2) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Vorrichtung zur Herstellung eines Stromweges ein Elektrodenpaar (32, 34 bzw. 50, 52) in dem ruhenden Teil der Flüssigkeit umfaßt mit einem dazwischen angelegten elektrischen Potential und der Meßfühler (10) weiterhin als Mittel zur Einengung des Strömweges eine Grenzwand (40) für den Strom in dem ruhenden Teil der Flüssigkeit zwischen den Elektroden (32, 34, bzw. 50, 52) enthält, wobei diese Grenzwand (40) eine Öffnung (42) aufweist, die. einen Durchmesser von weniger als dem 50fachen des Durchmessers der zu bestimmenden Bakterien (44) hat.

3) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Messung von Widerstandsänderungen einen mit dem Stromweg in Reihe geschalteten Widerstand ( 22) und ein Potentiometer (24) über diesem Widerstand (22) zur Spannungsmessung umfaßt.

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4) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zu Messung von Widerstandsänderungen eine Differentiatorvorrichtung (26) zur Bestimmung des Zeitpunktes umfaßt, an dem die Geschwindigkeit der Widerstandsänderung sich plötzlich ändert und einen Zä hler (28) zur automatischen Zählung jeder dieser Änderungen enthält.

5) Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Erhöhung des Potentials einen Sägezahnspannungsgenerator (18) zur periodischen Erhöhung des Potentials von einem niedrigeren vorgewählten Wert zu einem höheren vorgewählten Wert und zur Rückführung auf den niedrigeren Wert enthält.

6) Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Vorrichtung (12) zur Steuerung der Flüssigkeitsströmung enthält, die abwechselnd eine Strömung der Flüssigkeit durch den eingeengten Stromweg auslöst und unterbricht, wobei die Zeiträume, während denen die Flüssigkeitsströmung unterbrochen wird, mit den Zeiträumen des Ansteigens des elektrischen Potentials in der Periode der Ausgangs spannung des Sägezahngenerators (18) zusammenfallen.

7) Vorrichtung nach Anspruch 6,dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Steuerung der Flüssigkeitsströmung eine Kolbenpumpe (12) umfaßt.

8) Verfahren zur Untersuchung einer Flüssigkeit auf den Gehalt an lebenden Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß ein elektrischer Stromweg durch einen in Huhe befindlichen Teil der Flüssigkeit eingestellt wird und mindestens ein Abschnitt dieses Weges auf einen Durchmesser von weniger als dem 50fachen des Durchmessers der zu bestimmenden Bakterien eingeengt wird, und daß das elektrische Potential längs dieses Weges erhöht wird, um eine augenblickliche Widerstandsänderung in diesem eingeengten Stromweg infolge der Anwesenheit von

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lebenden Bakterien zu bewirken, worauf die infolge der Anwesenheit von lebenden Bakterien in diesem eingeengten Strömwert auftretenden Widerstandsänderungen gemessen werden,,ein anderer Teil der Flüssigkeit in den Stromweg gebracht wirdj und die vorhergehenden Verfahrens.=chritte solange wiederholt werden, bis eine statistisch bedeutungsvolle Anzahl von Flüssigkeitsproben untersucht worden ist und die Ergebnisse dieser wiederholten Messungen extrapoliert werden, um die wahrscheinliche Konzentration von lebenden Bakterien in der Flüssigkeit 2U best inmien.

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