DE19959045A1 - MCP-1 exprimierende AAV-Expressionsvektoren und deren therapeutische Verwendung - Google Patents

Abstract

Beschrieben werden adenoassoziierte Virus-Expressionsvektoren (AAV-Expressionsvektoren), die das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) exprimieren, vorzugsweise unter Kontrolle des CMV- oder Cytokeratin K14-Promotors. Beschrieben werden ferner die Verwendung dieser AAV-Expressionsvektoren bzw. diese Vektoren enthaltender AAV-Partikel zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren, zur Förderung oder Induktion der Angiogese oder zur Behandlung von Entzündungsprozessen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen adenoassoziierten Virus-Expressionsvektor (AAV-Expressionsvektor), der das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) exprimiert, vorzugsweise unter Kontrolle des CMV- oder Cytokeratin K14- Promotors. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieser AAV-Expressionsvektoren bzw. diese Vektoren enthaltender AAV- Partikel zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren, zur Förderung oder Induktion der Angiogenese oder zur Behandlung von Entzündungsprozessen.

Lange bestehende Infektionen mit den menschlichen "Hoch- Risiko"-Papillomavirus-Typen (HPV), beispielsweise HPV-Typ 16 oder 18, werden als der wichtigste Risikofaktor bei der Entwicklung des Zervixkarzinoms angesehen. Dabei sind annähernd 100% der Zervixkarzinome mit einer HPV16- oder HPV18-Infektion assoziiert. Die onkogene Funktion dieser beiden HPV-Typen wurde hauptsächlich mit der Expression der zwei frühen Gene E6 und E7 in Zusammenhang gebracht. Diese induzieren durch das Herbeiführen einer Labilität von p53 und Sequestrieren von Retinoblastom-Protein eine verminderte Kontrolle des Zellzyclus, zelluläre Immortalität und Chromosomen-Abberationen. Es gibt inzwischen einige Beweise dafür, daß die Expression dieser transformierenden Gene zur Aufrechterhaltung des Tumor-erzeugenden Phänotyps bei verschiedenen Zervixkarzinom-Zellen, die mit "Hoch-Risiko"- HPV-Typen infiziert sind, kontinuierlich erfolgen muß. Die Hemmung der E6 und E7 codierenden Gene durch komplementäre antisense-Transkripte führte bei Zervixkarzinom- und Mundkarzinom-Zellinien zu reduzierten Wachstumsraten und zum Verlust des transformierten Phänotyps und zu einer Hemmung der Tumorbildung im Tiermodell. Darüber hinaus gibt es gute Hinweise darauf, daß an der Kontrolle der Papillomavirus- Infektion sowohl bei der primären Manifestation als auch bei dem Fortschreiten zur Bösartigkeit das Immunsystem beteiligt ist. Somit ergaben sich verschiedene Ansatzpunkte für eine Therapie.

Allerdings konnten mit den bisherigen Therapieansätzen, die auf den vorstehend diskutierten Strategien basieren, noch keine befriedigenden therapeutischen Erfolge erzielt werden. Dies liegt bezüglich der Unterdrückung der Expression von E6 und/oder E7 mittels antisense- bzw. Ribozym-Strategien daran, daß bei dieser Vorgehensweise ein hoher Prozentsatz der Zielzellen transduziert werden muß, da es hier keinen "Bystander"-Effekt gibt, der dazu führt, daß letztendlich das therapeutische Ziel in allen Zellen verwirklicht wird. Eine solch hohe Transduktionseffizienz ist jedoch in der Praxis nicht erreichbar. Außerdem stellt sich noch das kaum lösbare Problem, daß die Expression der antisense-RNA bzw. der Ribozyme stabil sein muß, da die Tumorzellen durch eine Behandlung mit einem proliferationshemmenden antisense- Konstrukt nicht eliminiert werden.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem war somit die Bereitstellung von Mitteln, die eine wirksame Therapie von HPV-induzierten Tumoren, vorzugsweise die Therapie des Zervixkarzinoms, erlauben.

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die Verabreichung von AAV-Expressionsvektoren, die MCP-1 exprimieren, das HPV-induzierte Tumorwachstum gehemmt werden kann, diese somit ein wirksames Mittel zur Behandlung von solchen Tumoren, vorzugsweise des Zervixkarzinoms, darstellen.

In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß zwar die Expression von antisense-E6 bzw. E7 oder entsprechender Ribozyme mittels AAV-Expressionsvektoren keinen Antitumor- Effekt aufweist, jedoch die von AAV-Expressionsvektoren vermittelte Expression von MCP-1. Dazu wurde deshalb das AAV- 2-Vektorsystem gewählt, da davon ausgegangen wurde, daß mit diesem System Zellen, beispielsweise HeLa-Zellen sehr effizient transduziert werden können und dieser Vektor nicht nur in das Genom integrieren sondern auch eine langandauernde Expression des gewünschten Gens gewährleisten kann. Anzumerken ist auch noch, daß von AAV, beispielsweise AAV-2, stammende Vektoren eine immer größerer Akzeptanz für die Gentherapie gewinnen, beispielsweise zur Behandlung von Erbkrankheiten, da sie eine geringe Immunogenität aufweisen, zu einer langdauernden Expression des gewünschten Gens führen und gemäß derzeitigem Wissensstand für den Empfänger nicht pathogen sind. Das MCP-1 codierende JE-Gen wurde deshalb gewählt, weil es Befunde dafür gibt, daß das MCP-1 Protein in tumorigenen HPV-positiven Zervixkarzinomzellinien grundsätzlich fehlt, obwohl das endogene Gen vorhanden und nicht strukturell rearrangiert ist. MCP-1 wurde unter der Kontrolle zweier verschiedener Promotoren, dem CMV-Promotor und dem Cytokeratin K14-Promotor exprimiert. Die Transduktion des MCP-1 codierenden JE-Gens unter der Kontrolle dieser Promotoren mittels AAV-Vektoren in SiHa-Zellen bzw. HeLa-Zellen erlaubte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums. Diese Reduktion war für die MCP-1-Expression spezifisch, da die Transduktion des lacZ-Gens oder von antisense-MCP-1 keinen signifikanten Effekt hinsichtlich des Tumorwachstums hatte. Die Analyse des zeitlichen Verlaufs des Tumorwachstums bei Tumoren, die von implantierten SiHa-Zellen stammten, zeigt, daß das Tumorwachstum etwa 40 bis 45 Tage nach Implantation des Tumors praktisch vollständig gehemmt wird. Es konnte somit in der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß die Transduktion des JE-Gens mit rAAV-Vektoren in eine begrenzte Anzahl von Zellen bereits zu therapeutisch ausreichenden Konzentrationen des MCP-1-Gens führt, was in Nacktmäusen zu einem signifikant reduzierten Wachstum von Tumoren führt, die von HeLa- oder SiHa-Zellen stammen - vermutlich durch die MCP- 1-vermittelte indirekte Hemmung der E6/E7-Expression. Somit bietet der AAV-Vektor-vermittelte Transfer des JE-Gens in Zielzellen, der einen systemischen Effekt vermittelt, eine erfolgversprechende Basis für die Therapie von HPV-induzierten Tumoren, insbesondere des Zervixkarzinoms.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein adenoassozierter Virus-Expressionsvektor (AAV- Expressionsvektor), der eine das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierende DNA-Sequenz enthält.

Der hier verwendete Ausdruck "AAV-Expressionsvektor" betrifft jegliches AAV, d. h. Virus-Partikel, und dessen DNA. Der AAV-Expressionsvektor kann in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Ferner kann er ein System aus mehreren Komponenten sein, die einzelne oder alle Funktionen von AAV und/oder seiner DNA bereitstellen. Ein solches System umfaßt z. B. einen rep-negativen AAV-Expressionsvektor und ein ein AAV-Rep-Protein bereitstellendes Mittel. Der AAV-Expressionsvektor kann in Zellen eingebracht werden und dort in das Genom integrieren oder in episomaler Form verbleiben.

AAVs sind einzelsträngige, zur Familie der Parvoviren gehörende DNA-Viren. Für ihre Replikation benötigen AAVs Helferviren, insbesondere Herpesviren oder Adenoviren. In Abwesenheit von Helferviren integrieren AAVs in das Wirtszellgenom, insbesondere an einer spezifischen Stelle von Chromosom 19. Das Genom von AAVs ist linear und weist eine Länge von ca. 4680 Nukleotiden auf. Dieses umfaßt zwei Leserahmen, die für ein strukturelles und ein nichtstrukturelles Gen codieren. Das strukturelle Gen wird als cap-Gen bezeichnet. Dieses steht unter der Kontrolle des P40-Promotors und kodiert für drei Capsid-Proteine. Das nicht­ strukturelle Gen wird mit rep-Gen bezeichnet und kodiert für die Rep-Proteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Die beiden ersteren werden unter der Kontrolle des P5 Promotors exprimiert, während die Expression von Rep 52 und Rep 40 unter der Kontrolle des P19-Promotors steht. Die Funktionen der Rep-Proteine liegen u. a. in der Regulation der Replikation und Transkription des AAV-Genoms.

Zur Herstellung eines vorstehenden AAV-Expressionsvektors können übliche Verfahren durchgeführt werden. Soll z. B. der AAV-Expressionsvektor in Form eines Virus-Partikels erhalten werden, bietet sich ein Verfahren an, bei dem ein für MCP-1 codierender AAV-Expressionsvektor, der nicht für AAV-Rep- und -Cap-Proteine codiert, zusammen mit einem AAV-Plasmid verwendet wird, das für die beiden AAV-Proteine kodiert und daneben für die Ausbildung von AAV-Virus-Partikeln notwendige Helfervirus-Sequenzen aufweist. Der AAV-Expressionsvektor und das AAV-Plasmid werden in 293-Zellen mittels Cotransfektion eingeführt und nach etwa 48 h werden Virus-Partikel des erfindungsgemäßen AAV-Vektors erhalten. Diese Virus-Partikel sind frei von Helferviren. Es wird auf die nachstehenden Beispiele und das deutsche Patent 196 44 500 des Aasmelders verwiesen.

Mit einem vorstehenden AAV-Expressionsvektor kann eine Therapie von Tumoren durchgeführt werden, deren Entstehung ursächlich mit einer HPV-Infektion in Zusammenhang steht. Hierzu bietet es sich an, einem einen solchen Tumor tragenden Individuum den AAV-Expressionsvektor systemisch zu verabreichen. Auch kann der AAV-Expressionsvektor lokal verabreicht werden. In beiden Fällen kann der AAV- Expressionsvektor als DNA oder als Virus-Partikel vorliegen, wobei letzteres bevorzugt ist.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorstehende Erfindung einen AAV-Expressionsvektor, der mindestens folgende DNA-Sequenzen umfaßt: (a) die 5'ITR und 3'ITR eines adenoassoziierten Virus (AAV), (b) einen in Säugern aktiven konstitutiven oder induzierbaren Promotor; (c) eine mit dem Promotor von (b) funktionell verknüpfte, das Monocyten­ chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierende DNA-Sequenz, und (d) ein Polycodenylierungssignal.

Der Fachmann kann mittels üblicher Verfahren die vorstehend genannten Komponenten der AAV-Expressionsvektoren isolieren und so miteinander verknüpfen, daß ein AAV-Expressionsvektor mit den gewünschten Eigenschaften erhalten wird. Dabei umfaßt der Begriff "5'ITR" bzw. "3'ITR" alle "5'ITR"- bzw. "3'ITR"- Sequenzen, die dem Vektor die Integration in das Wirtsgenom erlauben. Diese können beispielsweise von den AAV Typen 1-6. Vorzugsweise stammen diese 5'ITR und/oder 3'ITR von einem AAV Typ 2 (AAV-2).

Der hier verwendete Ausdruck "ein in Säugern aktiver konstitutiver oder induzierbarer Promotor" umfaßt alle Promotoren, die in Säugern die Transkription der MCP-1 codierenden DNA-Sequenz erlauben, vor allem solche, die zu einer starken Expression führen, vorzugsweise heterologe Promotoren. Geeignete Promotoren sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise konstitutive Promotoren, wie RSV (Rous Sarcoma Virus "late terminal repeat")-Promotor, SV40 (SV40 "early promoter/enhancer")-Promotor, und β-Actin Promotor, oder induzierbare Promotoren, wie Tet induzierbare Promotoren, Ecdyson induzierbare Promotoren, Lac Switch System und MMTV- Promotor. Zu solchen Promotoren zählen auch die in den nachstehenden Beispielen näher beschriebenen CMV- und Cytokeratin K14-Promotoren. Vorzugsweise erfolgt die Expression der MCP-1 codierenden DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, wie Cytokeratin 14 Promotor oder p4NS1p38 Kassette des autonomen Parvovirus H1.

Der hier verwendete Ausdruck "MCP-1 codierende DNA-Sequenz" betrifft sowohl die DNA-Sequenz, die das native, im Stand der Technik beschriebene Protein codiert, sowie jede DNA-Sequenz, die eine MCP-1-Variante codiert, die gegenüber der nativen Form Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäuren) aufweist oder veränderte Oligosaccharid­ seitenketten, jedoch noch biologisch aktiv ist, d. h. beispielsweise die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Eigenschaften aufweist. Diese Varianten betreffen auch MCP-1-Varianten, die im Vergleich zu der ursprünglichen Form eine ähnliche oder bessere biologische Aktivität aufweisen. Diese biologische Aktivität kann mittels der in den nachstehenden Beispielen 2 bis 5 beschriebenen Verfahren untersucht werden.

Der hier verwendete Ausdruck "MCP-1 codierende DNA-Sequenz" betrifft schließlich auch DNA-Sequenzen, die nur ein Fragment von MCP-1 codieren, wobei dieses Fragment noch die vorstehend diskutierten biologischen Eigenschaften aufweist.

Die in dem erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektor funktionell mit dem in Säugern aktiven Promotor verknüpfte, MCP-1 codierende DNA-Sequenz kann hinter dem Promotor in "sense"- oder "antisense"-Orientierung vorliegen. Im ersteren Fall führt die Transkription zu einer mRNA, die in das biologisch aktive Protein translatiert werden kann, das dann die vorstehend und in den nachstehenden Beispielen näher beschriebene biologische Wirkung hinsichtlich der Tumorhemmung besitzt. Im letzteren Fall führt die Transkription nicht zu einer mRNA, deren Translation zu einem funktionellen Protein führt. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, daß diese "antisense"-ENA, die auch nur einen Teil der zu der MCP-1 codierenden DNA-Sequenz komplementären RNA umfassen kann, in den Zellen zur Hemmung der Expression von MCP-1 führt, da sie an die MCP-1-mRNA bindet und auf verschiedene Weise die Expression des MCP-1 Proteins, z. B. durch Inhibition der Translation der MCP-1-mRNA, hemmt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektoren um pAV-CMV- MCP-1, pAV-K14-MCP-1, bzw. pAV-CMV-antiMCP-1. Diese AAV- Expressionsvektoren wurden bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellen) hinterlegt, pAV-CMV-MCP-1 am 9. August 1999 unter DSM 12990, pAV-K14-MCP-1 am 16. August 1999 unter DSM 13015 und pAV-CMV-antiMCP-1 am 9. August 1999 unter DSM 12991.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein AAV- Partikel, das den erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektor enthält.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Arzneimittel, das den erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektor oder das AAV-Partikel enthält. Das Arzneimittel kann ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Art des Trägers hängt davon ab, wie der erfindungsgemäße AAV-Expressionsvektor bzw. das erfindungsgemäße AAV-Partikel verabreicht werden soll. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Schweregrad der Erkrankung, der Art der Verabreichung, etc.

Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen AAV- Expressionsvektoren auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Der erfindungsgemäße AAV- Expressionsvektor kann ferner ein Gen enthalten, das für einen nachweisbaren phänotypischen Marker codiert, wodurch das erfolgreiche Einschleusen des AAV-Expressionsvektors in die Zielzelle nachgewiesen werden kann. Geeignete Markergene sind z. B. das Luciferase- oder das "green-fluorescent-protein" (GFP) kodierende Gen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine den vorstehend beschriebenen AAV-Expressionsvektor enthaltende Wirtszelle, die beispielsweise zur Vermehrung des AAV-Vektors dienen kann. Beispiele solcher Wirtszellen sind Säugerzellen, vorzugsweise 293 oder Hela-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten etc. sind dem Fachmann bekannt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektors oder des erfindungsgemäßen AAV-Partikels zur Tumortherapie, vorzugsweise zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Therapie des Zervixkarzinoms. Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße AAV- Expressionsvektor oder das erfindungsgemäße AAV-Partikel auch zur Förderung oder Induktion der Angiogenese verwendet werden. Bezüglich des Wirkens von MCP-1 auf angiogenetische Vorgänge wird z. B. auf Arras et al., J. clin. Investigations 101, 1998, 40-50 verwiesen.

Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen AAV-Expressionsvektoren bzw. AAV- Partikel, bei denen die MCP-1 codierende DNA-Sequenz in "antisense"-Orientierung inseriert ist, zur Behandlung von Entzündungsprozessen. Bezüglich der Wirkung von "antisense" MCP-1 codierenden DNA-Sequenzen auf Entzündungsprozesse wird z. B. auf New England Journal of Medicine 338, 1998, 436-445 verwiesen.

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1 Konstruktion von AAV-vektorplasmiden zur Expression von Fremd-DNA

Die "Shuttle"-Plasmide pAV-CMV und pAV-K14 enthalten das Plasmidrückgrat und die beiden invertierten terminalen Wiederholungseinheiten (ITR) von AAV aus dem Plasmid psub201(+). Die beiden poly(A)-Signale und die Mehrfachclonierungsstelle stammen von pGL-2 (Promega) und diese wurden zwischen die beiden ITR von AAV-2 wie in Beispiel 1 beschrieben inseriert. Danach wurden entweder der menschliche CMV-IE-Promotor (HincII/AvaII-Fragment; 877 bp) zusammen mit einem FspI/EcoRI-Fragment der menschlichen poly(ADP-Ribose)-Polymerase als "Spacer"-Fragment oder das AvaI-Fragment (1946 bp) des Cytokeratin K14-Promotors zwischen die beiden poly(A)-Signale in die KpnI-Stelle cloniert; die KpnI-Stelle wird beibehalten. So wurden die Plasmide pAV-CMV bzw. pAV-K14 erhalten. Bei beiden Plasmiden ist die Mehrfachclonierungsstelle mit Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme eingerahmt dargestellt.

Fig. 2 MCP-1 exprimierende AAV-2-Vektor-Plasmide

Struktur der Vektorplasmide pAV-CMV-MCP-1 und pAV-K14-MCP-1, die das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) exprimieren. Die von psub201(+) stammenden terminalen Wiederholungseinheiten (TR), das poly(A)-Signal (pA1) von pGL- 2, das "Spacer"-Fragment von poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP), der "immediate early"-Promotor CMV (PCMV), der Cytokeratin K14-Promotor (PK14) und das Polyadenylierungssignal von SV40 (pA2) sind angegeben. Die für das menschliche Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1/JE) codierende cDNA wurde in ein ThoI-Fragment (740 bp) hinter den CMV-Promotor bzw. den Cytokeratin 14-Promotor cloniert.

Die Expression des JE-Gens wurde über eine transiente Transfektion der Vektorkonstrukte in HeLa-Zellen und anschließende Northern-Blot-Analyse getestet. Die Expression von MCP-1 in den benignen HeLa-Fibroblasten-Hybriden 444 diente als positive Kontrolle. Es wurden zwei unterschiedliche pAV-CMV-MCP-1-Clone getestet (9-CMV, 4-CMV). Von den AAV- Expressionskonstrukten stammende MCP-1-mRNA wanderte wegen eines längeren poly(A)-Signals im Vergleich zu der mRNA der Kontrollkonstrukte langsamer im Gel.

MCP-1 wurde in einem ELISA nachgewiesen. Dazu wurden Überstände von HeLa-Zellen verwendet, die mit pAV-CMV-MCP-1- Konstrukten (9-CMV, 4-CMV) oder pAV-K14-MCP-1-Konstrukten (14- K14) transient transfiziert waren. Als Kontrolle wurden Überstände von 444-Zellen und HeLa-Zellen untersucht. Die Konzentration des MCP-1-Proteins in den Überständen ist als ng/ml angegeben.

Fig. 3 Expression des lacZ-Gens nach rAAV-vermitteltem Gentransfer in SiHa-Zellen

5 × 10³ SiHa-Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und 18 Stunden bei 37°C entweder mit Medium (A) als Kontrolle oder mit rAAV-lacZ bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1 (B) oder 10 (C) in D-MEM inkubiert, das mit 2% FCS supplementiert worden war. Die Platten wurden gewaschen und die Zellen mittels 0,25% Glutaraldehyd 10 min. auf Eis fixiert und mit X-Gal gefärbt.

Fig. 4 Produktion von MCP-1 in mit MCP-1 exprimierenden rAAV infizierten SiHa-Zellen

SiHa-Zellen wurden mit rekombinanten AAV-2-Partikeln infiziert, die MCP-1 unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimieren. Die gewählten Infektionsmultiplizitäten (MOI) sind in der Figur angegeben. Das Inokulum wurde 16 Stunden später entfernt und gegen frisches D-MEM-Medium ausgetauscht, das mit 2% FCS supplementiert worden war. Die Überstände wurden nach 2, 2 oder 5 Tagen gesammelt und die MCP-1- Konzentration wurde mittels eines MCP-1-ELISA (A) oder des Chemotaxis-Assays (B) wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Die Chemotaxis-Aktivität ist als % der Standard-Chemotaxis- Aktivität in 1% menschlichem Serum angegeben.

Fig. 5 Auswirkung der Vorbehandlung von HeLa-Zellen und SiLa-Zellen mit rekombinanten AAV-2 auf die Induktion der Tumorbildung in Nacktmäusen

Induktion der Tumorbildung von mit rAAV ex vivo behandelten HeLa-Zellen. HeLa-Zellen wurden 8 Stunden mit gereinigten rekombinanten AAV-Partikeln, die MCP-1 oder β-Galactosidase exprimierten, in D-MEM (supplementiert mit 2% FCS) mit einer MOI von 2 infiziert. Danach wurde das Medium gegen frisches D- MEM (supplementiert mit 10% FCS) ausgetauscht und die Zellen über Nacht inkubiert. Unbehandelte und rAAV-infizierte Zellen wurden Mäusen injiziert (2 × 10⁶ Zellen/Maus). Das Tumorvolumen wurde bis zu 25 Tage nach der Injektion bestimmt. Die Kurven stellen von 5 Tieren stammende Mittelwerte dar.

(B, C) Induktion der Tumorbildung von mit rAAV ex vivo behandelten SiHa-Zellen. SiHa-Zellen wurden in Schalen (Durchmesser: 10 cm) mit gereinigten rekombinanten AAV- Partikeln in D-MEM (supplementiert mit 2% FCS) 8 Stunden infiziert, die β-Galactosidase, antisense-E6/E7, eine Kombination aus antisense-E6/E7 und MCP-1 oder antinsense-MCP- 1 exprimierten. Die MOI-Werte sind in den Figuren angegeben. Danach wurde das Medium gegen frisches D-MEM (supplementiert mit 10% FCS) ausgetauscht und die Zellen über Nacht inkubiert. Schein-infizierte und behandelte Zellen wurden in die Lende von Nacktmäusen mit einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/Maus injiziert. Das Tumorvolumen wurde bis zu 61 Tage (B) oder 60 Tage (C) nach Injektion bestimmt. Die Kurven stellen Mittelwerte der Tumorvolumina von 5 (B), 10 (β-Galactosidase und MCP-1) oder 5 Tieren (antisense-MCP-1) dar.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren

ZELLINIEN UND ZUCHTBEDINGUNGEN: Die menschliche Zervixkarzinom-Zellinien, SiHa, und HeLa wurden in "Dulbecco's Modified Eagle's" Medium (D-MEM) (BRL) gehalten, dem 10% fötales Kälberserum (FCS), 1% Penicillin und 1% Streptomycin zugesetzt waren.

REKOMBINANTE AAV-2 PLASMIDE: Die Vektorplasmide pAV-CMV und pAV-K14, die die zwei invertierten terminalen Wiederholungseinheiten (ITR) des adonassoziierten Virus Typ 2 (AAV-2) und den menschlichen CMV-Promotor bzw. Cytokeratin K14 Promotor enthielten, stammten von psub201(+) (Samulski et al., J. Virol. 61, 1987, 3096-3101. Zur Konstruktion dieser Plasmide wurden zum Erhalt des Plasmids pAV zuerst ein DraIII/BamHI-Fragment mit einem poly(A)-Signal sowie das SV40- poly(A)-Signal und die Spleißstelle von pGL-2 (Promega, Mannheim, Deutschland) mit glatten Enden versehen und in psub201(+) inseriert, das mit XbaI geschnitten und danach mit glatten Enden versehen worden war. Vorher war das auf pGL-2 vorhandene Luciferase-Gen durch Spaltung von pGL-2 mit HindIII und EcoRI und anschließender Religation des verbleibenden Plasmidfragments mit glatten Enden entfernt worden. Danach wurden ein HincII/AvaII-Fragment (877 bp), das den menschlichen CMV-IE-Promotor (Lehner et al., J. clin. Microbiol. 29, 1991, 2494-2502) enthält, und ein FspI/EcoRI- Fragment (1460 bp) von dem menschlichen poly(ADP-Ribose)- Polymerase Gen mit glatten Enden versehen und in die nur einmal vorhandene, zwischen den beiden poly(A)-Signalen von pAV gelegene KpnI-Stelle (die mit glatten Enden versehen worden war) cloniert, wodurch das Plasmid pAV-CMV erhalten wurde (Fig. 1). Zur Konstruktion von pAV-K14 wurde der Cytokeratin K14-Promotor (Leask et al., Genes Dev. 4, 1990, 1985-1998) als ein AvaI-Fragment (1964 bp) in die KpnI-Stelle von pAV inseriert (wobei beide DNA-Fragmente mit glatten Enden versehen worden waren). Sowohl pAV-CMV als auch pAV-K14 enthalten die Mehrfachclonierungsstelle von pGL-2, was die einfache Insertion von gewünschten Genen erlaubt (Fig. 1).

NORTHERN-BLOT ANALYSEN: Zelluläre Gesamt-RNA von 5 × 10⁶ Zellen wurde mittels der üblichen Guanidin/Isothiocyanat-Lysemethode (Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 1987, 156-159) extrahiert. Gleiche RNA-Mengen, die mittels der Messung der optischen Dichte bei 260 nm bestimmt worden waren, wurden auf einem 1% Agarose/Formaldehyd-Gel (50 mM HEPES, pH-Wert 7,8, 1 mM EDTA) aufgetrennt und über Nacht in 25 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 6,8, ("Kapillar-Blotting") auf eine Nylonmembran übertragen (GeneScreen Plus, Du Pont NEN). Zum Nachweis von MCP-1 Transkripten wurden die Nylonfilter 2 Stunden bei 42°C vorhybridisiert und danach mit einer für MCP-1 spezifischen Sonde (Xhol-Fragment von pGEM-hJE34 mit 740 bp, markiert mit ³²p über Zufalls-Priming) bei 42°C über Nacht in Hybridisierungslösung (7% SDS, 0,125 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,2, 0,25 M NaCl, 1 mM EDTA, 45% Formamid) hybridisiert. Der Filter wurde bei 42°C viermal jeweils 5 min. in 2xSSC (1xSSC = 0, 15 mM NaCl, 15 mM Natriumzitrat)/0,1% SDS und danach zweimal bei 68°C jeweils 30 min. mit 0,2xSSC/0,1% SDS gewaschen. Der Filter wurde an der Luft getrocknet und dann mit Kodak X-Omat XAR-5 Film eine Autoradiographie erstellt.

HERSTELLUNG VON rAAV-PARTIKELN: AAV-2 Partikel wurden über Cotransfektion von 293-Zellen mit einem der Vektorkonstrukte und dem "Verpackungsplasmid" pDG, wie kürzlich beschrieben hergestellt (Grimm et al., Hum. Gene Ther. 9, 1998, 2745-2760). Die Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet, mehrmals eingefroren und aufgetaut und danach zur Entfernung von Zelldebris 10 min. bei 5000 × g zentrifugiert. Typische rAAV-Titer in dem geklärten Überstand waren 106 bis 10⁷ infektiöse Einheiten/ml, was über Replikationsassays (Grimm et al., supra) bestimmt wurde.

KONZENTRIERUNG DER VEKTORPARTIKEL: Die Konzentrierung der rAAV Partikel erfolgte über Säulenchromatographie mit sulfonierter Zellulose (Cellufinsulfat) als Matrix (Tamayose et al., Hum. Gene Ther. 7, 1996, 507-513). Der geklärte Überstand von insgesamt 10 Schalen (Durchmesser: 14 cm) wurde über Nacht langsam auf die Säule aufgetragen (2 ml Säulenvolumen; Amicon, Witten, Deutschland). Nach Waschen mit PBS wurden die AAV-2 Vektorpartikel mit 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2, der 1 M NaCl enthielt, eluiert. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt, wobei die meisten Partikel in den beiden ersten Fraktionen enthalten waren. Zur weiteren Aufreinigung und Konzentrierung wurden alle Vektorpartikel enthaltenden Fraktionen vereinigt und durch ein Saccharosekissen zentrifugiert. Dieses Saccharosekissen wurde durch Unterschichtung von 450 µl 30% Saccharose in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,6) mit 500 µl 50% Saccharose in TE hergestellt. Die vereinigten Fraktionen mit den eluierten Partikeln (in 1 M NaCl, etwa 3 ml) wurden auf das Saccharosekissen aufgetragen und 2,5 Stunden bei 4°C unter Verwendung eines SW 60-Rotors (Kontron, Neufahrn, Deutschland) bei 45.000 UpM (273.000 × g) zentrifugiert. Die pelletierten Partikel würden in 0,5 ml OPTI-MEM (BRL, Karlsruhe, Deutschland) resuspendiert, das mit 1% Penicillin und 1% Streptomycin supplementiert worden war.

ASSAY BEZÜGLICH TUMORERZEUGUNG: SiHa- oder HeLa-Zellen wurden mit gereinigten rekombinanten Viren bei einer MOI von 2, 10 oder 25 in mit 2% FCS supplementiertem D-MEM infiziert. Acht Stunden nach Infektion wurde das Inokulum entfernt und gegen frisches, mit 10% FCS supplementiertes D-MEM ausgetauscht. Am nächsten Tag wurden die infizierten Zellen mittels Trypsinisierung geerntet, zweimal mit PBS gespült und in "Hank's"-Puffer resuspendiert. Für jede Injektion wurden 2 × 10⁶ HeLa-Zellen oder 5 × 10⁶ SiHa-Zellen in 0,15 ml "Hank's"- Puffer subcutan in eine weibliche Nacktmaus (nu/nu; Alter: 5 bis 6 Wochen) injiziert. Die Tumore wurden über einen Zeitraum von 25 Tagen (für von HeLa-Zellen stammende Tumore) oder über einen Zeitraum von 60 Tagen (für von SiHa-Zellen stammende Tumore) hinsichtlich ihrer Durchmesser zweimal wöchentlich bestimmt. Das Tumorvolumen wurde entsprechend der Formel 1/6π a × b × c bewertet, wobei a, b und c die senkrecht aufeinanderstehenden Durchmesser des Tumors darstellen.

ELISA-TESTS UND CHEMOTAXIS-ASSAYS: SIHA-Zellen (5 × 10³) wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und mit gereinigten rekombinanten AAV-2 MCP-1 Viruspartikeln bei einer MOI von 20, 50, 100 oder 400 in D-MEM, das mit 2% FCS supplementiert war, infiziert. Die Zellüberstände wurden 1,2 oder 5 Tage später gesammelt und hinsichtlich der Gegenwart von MCP-1 getestet, wobei ein kommerziell erhältlicher ELISA verwendet wurde (R, Wiesbaden-Nordenstadt, Deutschland). Die chemotaktische Aktivität von MCP-1 wurde mittels des Chemotaxis-Assays gemessen. Menschliche Monocyten wurden mittels Elution in einem JE-6 Rotor (Beckmann) wie in Sanderson et al., J. Immunol. 118, 1977, 1409-1414) beschrieben isoliert. Die Monocyten wurden zu einer Dichte von 1 × 10⁶ pro ml resuspendiert und der Chemotaxis-Assay wurde unter Verwendung einer Migrationskammer (48 Vertiefungen) mit einer 5 µm Membran durchgeführt (Nucleopore). Die Chemotaxis- Kammer wurde 90 min. in einem Zellinkubator mit befeuchteter Luft inkubiert. Gewanderte Zellen wurden mittels eines "Hematocolor"-Sets (Merck, Darmstadt, Deutschland) angefärbt und bei einer 320fachen Vergrößerung gezählt. 1% menschliches Serum wurde als Chemotaxis-positive Kontrolle verwendet (Kreuzer et al., J. Artheriosclerosis 90, 1991, 203-209). Pro Experiment wurden mindestens 3 Vertiefungen verwendet. Pro Vertiefungen wurden fünf "Highpower"-Felder ausgezählt. Alle Experimente wurden in dreifacher oder vierfacher Ausfertigung durchgeführt. Die Ergebnisse sind als die durchschnittliche Anzahl von gewanderten Zellen in Prozent der Wanderungsreaktion von Kontrollzellen angegeben.

Beispiel 2 Herstellung von MCP-1 exprimierenden AAV-2 Vektorplasmiden

Die Herstellung der Ausgangsplasmide pAV-CMV und pAV-K14 wurde bereits in Beispiel 1 beschrieben. Bei deren Herstellung wurde zur Erzielung der für die optimale Verpackung der AAV-2 Vektoren erforderlichen Mindestgröße ein 1,46 kb-Fragment der poly(ADP-Ribose)-Polymerase (PARP) vor die Expressionskassette und ein zweites poly(A)-Signal hinter die 5'ITR von AAV-2 cloniert, die die mögliche Expression des PARP-Fragments durch eine mögliche kryptische Promotoraktivität in der 5'ITR verhindern sollte. In die mit XhoI linearisierten Plasmide pAV-CMV und pAV-K14 wurde ein XhoI-Fragment von pGEM-hJE34 mit einer Länge von 740 bp cloniert. Die erhaltenen AAV-2 Vektorkonstrukte erhielten die Bezeichnungen pAV-CMV-MCP-1 und pAV-K14-MCP-1 (Fig. 2A). Die Expression von MCP-1 nach Transfer der Vektorplasmide in HeLa-Zellen wurde mittels Northern Blotting und einem MCP-1 ELISA analysiert (Fig. 2B, 2C). In Northern Blots mit RNA von HeLa-Zellen, die sowohl mit dem CMV-gesteuerten als auch dem K14-gesteuerten Expressionskonstrukt transfiziert waren, wurde ein spezifisches Transkript nachgewiesen, das wegen des längeren 3'-untranslatierten Anteils des JE-Gens in den Vektorkonstrukten im Vergleich zu dem Transkript des endogenen Gens in 444-Zellen eine geringere Mobilität zeigte (Kleine et al., Mol. Carcinog. 14, 1995, 179-189). Wie aus den Northern- Analysen und den ELISA-Daten ersichtlich ist, erzeugten zwei unterschiedliche Clone der CMV-gesteuerten Expressionskonstrukte eine 10 bis 30fach höhere Menge an MCP-1 im Vergleich zu dem K14-gesteuerten Konstrukt.

Beispiel 3 Infektion von Zervixkarzinom-Zellen mit rekombinantem AAV-2 und Expression von MCP-1

Zur Etablierung von definierten Infektionsbedingungen für Zervixkarzinom-Zellen mit rekombinantem AAV-2 wurden HeLa- und SiHa-Zellen mit einem rAAV infiziert, das das lacZ-Gen unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert (Grimm et al., supra) und die transduzierten Gene wurden mittels histochemischer Anfärbung untersucht. Bereits bei einer MOI von 1 wurden einige SiHa-Zellen transduziert, bei einer MOI von 5 etwa 35% der Zellen und bei einer MOI von 10 50% (Fig. 3). Nach Infektion von HeLa-Zellen wurden ähnliche Werte erhalten. Nach Infektion von SiHa-Zellen mit ansteigenden MOIs an AAV-2, die MCP-1 unter der Kontrolle des CMV-Promotors exprimierten, wurde eine MCP-1 Expression induziert, die Werte bis zu 4 µg/ml Medium erreichte. Die Expression hielt über 5 Tage an (Fig. 4A). Die Analyse der chemotaktischen Aktivität des sezernierten MCP-1 zeigte ebenfalls ein MOI-abhängiges Ansteigen und ein verlängertes Fortbestehen der chemotaktischen Aktivität. Mit dem Überstand von Zellen, die mit niedrigeren MOIs infiziert worden waren, wurde allerdings eine hohe Variabilität der Ergebnisse auf Grund der geringeren Empfindlichkeit dieses Assays beobachtet (Fig. 4B).

Beispiel 4 Auswirkungen von MCP-1 exprimierenden rAAV auf das Tumorwachstum in Nacktmäusen

Während AAV-2 Konstrukte, bei denen die Expression der beiden frühen Gene E6 und E7 des menschlichen Papillomavirus (HPV) durch die Expression von antisense-E6/E7-RNA bzw. entsprechenden Ribozymen unterdrückt wurde, zu keiner signifikanten Hemmung der Tumorbildung von implantierten SiHa- Zellen führten, konnte nach Transfer und Expression der in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen, MCP-1 exprimierenden Konstrukte eine deutliche Hemmung des Tumorwachstums beobachtet werden. Für die Experimente hinsichtlich des Einflusses des MCP-1 Gens auf das Tumorwachstum in Nacktmäusen wurde der Vektor gewählt, bei dem die Expression unter der Kontrolle des CMV-Promotors steht. Die Experimente wurden zuerst durch ex vivo-Infektion von HeLa-Zellen 8 Stunden mit einer MOI von 2 bzw. SiHa-Zellen mit einer MOI von 10 oder 25 und die Implantation der Tumorzellen in Nacktmäuse durchgeführt. Das Tumorvolumen wurde für von HeLa-Zellen stammende Tumore bis zum 25. Tag und für von SiHa-Zellen stammende Tumore bis zum 60. Tag gemessen. Kontrolltieren wurden HeLa-Zellen bzw. SiHa-Zellen implantiert, die mit rAAV infiziert waren, die das lacZ-Gen oder antisense-MCP-1 exprimierten. Ein signifikanter Effekt auf das Tumorwachstum konnte jedoch nur bei den Tieren beobachtet werden, denen HeLa-Zellen bzw. SiHa-Zellen implantiert worden waren, die mit MCP-1 exprimierenden rAAV infiziert worden waren: Das Tumorvolumen von implantierten HeLa-Zellen wurde signifikant verringert (Fig. 5A) und bei von SiHa-Zellen stammenden Tumoren wurden sowohl das Wachstum der Tumore als auch das Tumorvolumen verringert (Fig. 5B, 5C). Die Injektion von 5 × 10⁶ infektiösen Einheiten von MCP-1 exprimierenden rekombinanten AAV-2 in etablierte Tumore in zwei Serien mit jeweils 8 Tieren führte zu einer Verringerung der Geschwindigkeit des Tumorwachstums. Die histochemische Analyse der Verteilung der Makrophagen im Tumor, in der Tumorzellenkapsel und im an das nekrotische Gebiet angrenzenden Bereich mittels Mac-3 Antikörpern ergab allgemein eine geringe oder mäßige Anhäufung von Makrophagen im Tumor und im an das nekrotische Gebiet angrenzenden Bereich. Allerdings konnte in der Kapsel in mit rAAV-MCP-1 behandelten Tumoren innerhalb der ersten beiden Wochen eine erhöhte Makrophagenkonzentration nachgewiesen werden, die dann während der folgenden 12 Wochen abnahm. Die direkte Injektion der rAAV-MCP-1-Konstrukte in den Tumor führte zu einer mäßigen Anhäufung von Makrophagen im Tumor bzw. einer hohen Anhäufung im an das nekrotische Gebiet angrenzenden Bereich.

Claims (19)

1. AAV-Expressionsvektor, mit einer das Monocyten­ chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierenden DNA-Sequenz.

2. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 1, umfassend folgende DNA-Sequenzen:

• a) die 5'ITR und 3'ITR eines adenoassoziierten Virus (AAV)
• b) einen in Säugern aktiven konstitutiven oder induzierbaren Promotor;
• c) eine mit dem Promotor von (b) funktionell verknüpfte, das Monocyten-chemotaktische Protein 1 (MCP-1) codierende DNA-Sequenz; und
• d) ein Polyadenylierungssignal.

3. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die 5'ITR und/oder 3'ITR von AAV-2 stammen.

4. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ein Gewebe- und/oder Tumor­ spezifischer Promotor ist.

5. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ein CMV-Promotor oder ein Cytokeratin K14-Promotor ist.

6. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die MCP-1 codierende DNA-Sequenz gegenüber dem Promotor in "sense"-Orientierung vorliegt.

7. AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die MCP-1 codierende DNA-Sequenz gegenüber dem Promotor in "antisense"-Orientierung vorliegt.

8. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 6, der pAV-CMV-MCP-1 (DSM 12920 oder pAV-K14-MCP-1 (DSM 13015).

9. AAV-Expressionsvektor nach Anspruch 7, der pAV-CMV-anti MCP-1 (DSM 12991) ist.

10. AAV-Partikel, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8.

11. AAV-Partikel, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 9.

12. Arzneimittel, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das AAV-Partikel nach Anspruch 10 oder 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

13. Zelle, enthaltend den AAV-Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder das AAV-Partikel nach Anspruch 10 oder 11.

14. Zelle nach Anspruch 13, die eine Säugerzelle ist.

15. Zelle nach Anspruch 14, die eine 293-Zelle ist.

16. Verwendung des AAV-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8 oder des AAV-Partikels nach Anspruch 10 zur Therapie von HPV-induzierten Tumoren.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Tumortherapie die Therapie des Zervixkarzinoms ist.

18. Verwendung des AAV-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8 oder des AAV-Partikels nach Anspruch 10 zur Förderung oder Induktion der Angiogenese.

19. Verwendung des AAV-Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 5, 7 oder 9 oder des AAV-Partikels nach Anspruch 11 zur Behandlung von Entzündungsprozessen.