DE19956763A1 - Rekombinante Adenoviren mit reduzierter Affinität zu humanen Erythrozyten zur Anwendung in der Gentherapie - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reduzieren der Toxizität von rekombinanten Adenoviren in der Gentherapie. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Maßnahmen zur Modifikation rekombinanter Adenoviren für die Gentherapie zur Verfügung mit dem Ziel, die Affinität rekombinanter Adenoviren zur Oberfläche humaner Erythrozyten zu reduzieren. Hierdurch sollen unerwünschte Nebenwirkungen verringert und gleichzeitig die Verfügbarkeit der Adenoviren für die Zielzellen erhöht werden. Erreicht wird dies durch das Einführen von wenigstens einer gezielten Mutation in Basensequenzen des Fiber-Gens von Adenoviren abgeleiteten Vektoren humanen oder nicht-humanen Ursprungs oder in virale nicht-virale Helferkonstrukte zur Herstellung solcher Vektoren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reduzieren der Toxizität von rekombinan­ ten Adenoviren in der Gentherapie. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Maßnahmen zur Modifikation rekombinanter Adenoviren für die Gentherapie zur Verfügung mit dem Ziel, die Affinität rekombinanter Adenoviren zur Oberfläche hu­ maner Erythrozyten zu reduzieren. Hierdurch sollen unerwünschte Nebenwirkungen verringert und gleichzeitig die Verfügbarkeit der Adenoviren für die Zielzellen erhöht werden.

Rekombinante Adenoviren gewinnen bei der Entwicklung neuer medizinischer The­ rapieverfahren zunehmend an Bedeutung. Ihre Aufgabe ist es, therapeutische Gene in die Zellen des Zielgewebe einzuschleusen und dort zur Expression zu bringen. Die in der Gentherapie verwendeten rekombinanten Viren leiten sich überwiegend von Adenoviren des Serotyp 5 ab. Schwerpunkt ihres Einsatzes sind zur Zeit erste klinische Studien zur Behandlung bösartiger Tumore und zur Therapie schwerer angeborener Stoffwechseldefekte [1-7].

Bei der Arbeit mit rekombinanten Adenoviren wurde auf eine Eigenschaft der ver­ wendeten Viren gestoßen, die eine potentielle Gefahr bei der Anwendung am Men­ schen birgt. Eine Beschreibung der im Tiermodell und bei in vitro Untersuchungen erhobenen Befunde ist bereits publiziert worden [9]. Es handelt sich dabei dem We­ sen nach um eine nicht erwünschte Wechselwirkung zwischen den Oberflächen­ strukturen der Viren und der von roten Blutkörperchen. Im Zuge dieser Wechselwir­ kung entfalten die Viren eine erhöhte Affinität zur Oberfläche von roten Blutkörper­ chen (Erythrozyten), die zu einer Reaktion führt, die in der Medizin als Hämaggluti­ nation bezeichnet wird. Diese Erscheinung kann zu einer Verklumpung der Erythro­ zyten (Hämagglutination) und anderer zellulärer Bestandteile des Blutes führen, in deren Folge geringfügige bis hin zu schwersten Störungen der Blutzirkulation auftre­ ten können. Besondere Bedeutung kommt dieser Beobachtung zu, da ihre Existenz für den in klinischen Studien verwendeten Typ von adenoviralen Vektoren (Serotyp 5) nicht nur-nicht bekannt war, sondern seine Existenz in der Literatur aktiv bestrit­ ten wird [11-13]. Die in der Literatur gemachten Angaben beziehen sich allerdings auf Wildtypviren und berücksichtigen nicht mögliche Veränderung der Eigenschaf­ ten, die durch Veränderungen am Virusgenom oder durch spezielle Aspekte des Produktionsverfahrens auftreten können. Von anderen als Serotyp 5 Vektoren sind Hämagglutinationsreaktionen (z. B. gegenüber Rattenerythrozyten) in der Literatur beschrieben und gut untersucht worden [14, 15]. Die viralen Strukturproteine, die für eine Bindung an Oberflächenstrukturen von Säugerzellen, bzw. für Hämagglutinati­ onsreaktionen verantwortlich sind, sind bekannt [14-17].

Am 17. September 1999 ist der erste Patient an den direkten Folgen einer adenovi­ ralen Gentherapie verstorben [8]. Im Mittelpunkt des Krankheitsgeschehens standen akute und schwere Veränderungen des Blutbildes. Die genauen Ursachen für den Tod des jungen Mannes sind zur Zeit Gegenstand intensiver Untersuchungen durch die U.S. Food and Drug Administration (FDA).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Struktur des Fiberproteins a­ denoviraler Vektoren in einer Weise zu verändern, die zu einer Verringerung der Wechselwirkung rekombinanter Adenoviren mit zellulären Bestandteilen des huma­ nen Blutes - insbesondere der Erythrozyten - führen und dadurch das Risiko uner­ wünschter Nebenwirkungen einer adenoviralen Gentherapie zu senken vermag.

Ferner soll die Struktur des Fiberproteins adenoviraler Vektoren in einer Weise ver­ ändern werden, die zu einer Verringerung der Wechselwirkung rekombinanter Adenoviren mit Nicht-Zielzellen, zugunsten eines verbesserten Gentransfer in Zielzellen einer Gentherapie führen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale. Durch diese erfindungsgemäßen Maßnahmen werden Veränderungen am Fiber- Gen derart verändert, dass die Hämagglutinationseigenschaften rekombinanter A­ denoviren - bevorzugt des Seroytyp 5 [Subgenus C] - gegenüber humanen Erythro­ zyten in einer Weise verändert werden, dass es zu keiner Hämagglutination mehr kommt.

Eine derartige Modifikation mit diesem vorgenannten Ergebnis ist bislang noch nie versucht worden, da diese Eigenschaft rekombinanter Adenoviren des Serotyp 5 bislang auch nicht bekannt war.

Es ist möglich, gezielt Veränderungen (Mutationen) in den verantwortlichen Genen zu setzen, die die Antigenen- und Bindungs-Eigenschaften der daraus synthetisier­ ten Proteine verändern [17]. Zum Zweck eines veränderten Tropismus der Vektoren, sind Veränderungen des Fiberproteins von Adenovirusvektoren für die Gentherapie zwar bereits beschrieben worden [18-21, 10]. Aus der großen Gruppe humaner A­ denoviren (über 42 Serotypen) jedoch ist eine Hämagglutination menschlicher E­ rythrozyten bislang nur vom Serotyp 9 (Subgenus D) bekannt [11-12]. Da die zur Diskussion stehenden Fiber-Gene zwischen den verschiedenen Serotypen teilweise austauschbar sind, existiert neben der Möglichkeit gezielte Mutationen in diesen Genen zu setzen, auch die Alternative, Gene aus nicht-hämagglutinierenden Viren teilweise oder komplett auszutauschen.

Im folgenden werden zum besseren Verständnis der Erfindung einige Begriffe Im Sinne der vorliegenden Erfindung erläutert:

Zielzellen und Nicht-Zielzellen einer Gentherapie: In Abhängigkeit von der medizini­ schen Fragestellung gehören zu Zielgeweben eines therapeutischen Ansatzes z. B. die Zellen eines bösartigen Tumors oder Leber-, Herzmuskel- und oder andere Or­ ganzellen. Unabhängig davon, ob der Adenovirusvektor über die Blutbahn oder lokal direkt in das Zielgewebe appliziert wird, kommt es zu einem Kontakt des Virus' mit körpereigenen Strukturen, die nicht zum Zielgewebe gehören, wie z. B. zellulären Bestandteilen des Blutes oder Gefäßwänden. Besitzt der Vektor eine erhöhte Affini­ tät zu diesen Strukturen des Nicht-Zielgewebes führt dies zum einen zu einem quantitativ verringerten Gentransfer ins Zielgewebe und die unspezifischen Wech­ selwirkungen bergen ein erhöhte Gefahr für Nebenwirkungen.

Fiber-Gen: Das Fiber-Gen adenoviraler Vektoren codiert für ein Kapsid- bzw. ein kapsidassozüertes Protein, das wesentlich für Bindung an zelluläre Rezeptoren und andere zelluläre Oberflächenstrukturen verantwortlich ist. Das Fiberprotein ist maß­ geblich an der Induktion sog. Hämagglutinationsreaktionen beteiligt [14, 17]. Die La­ ge des Gens im Adenovirusgenom ist genau bekannt [26]. Es ist mit Hilfe moleku­ larbiologischer Techniken möglich, gezielte Veränderungen an einzelnen Sequenz­ abschnitten vorzunehmen oder komplette Gene verschiedener Seroytpen miteinan­ der zu tauschen [19, 20, 21, 27].

Verpackungszelllinie: Wildtypadenoviren können sich in fast allen Körpergeweben und einer sehr großen Zahl von etablierten Zelllinien replizieren. Den in der Genthe­ rapie verwendeten Adenoviren ist durch eine Deletion in der sog. E1-Region die Fähigkeit sich auf jeder Zelle zu replizieren genommen worden. Auf dieses Weise wird verhindert, dass die Viren sich nach Gentherapie im Körper aktiv vermehren und die Gesundheit des Empfängers bedrohen. Allerdings ist zur Herstellung dieser replikationsdefekten Viren die Gegenwart der sog. E1-Region notwendig. Dieses Problem wird gelöst, indem die Gene der E1-Region stabil in das Genom einer Zell­ linie eingebaut werden. Infiziert man nun einen an sich replikationsdefekten Virus auf diese Zelllinie kann er sich dort replizieren, nicht jedoch auf Zellen die das fragli­ che Gen nicht tragen. Zelllinien die Gene tragen, die für die Replikation eines partiell deletierten Virus notwendig sind, werden als sogenannte Verpackungszellen be­ zeichnet.

Hämagglutination: Die Klassifikation humaner Adenoviren - z. Z. sind etwa 45 ver­ schiedene Serotypen bekannt - werden anhand ihres Hämagglutinationsverhalten in 6 verschiedene Subgeni (A-F) unterteilt [10-12]. Nur von Subgenus-D ist bekannt, dass sie humane Erythrozyten zu agglutinieren vermögen, nicht jedoch von Subge­ nus-C-Viren, zu denen auch der Serotyp 5 gehört. Aus Untersuchungen über die Fähigkeit von Subgenus D Adenoviren Ratten-, Affen- und Humane-Erythrozyten zu hämagglutinieren ist bekannt, dass ein relativ kurzer Sequenzabschnitt im Bereich der sog. Gamma (y)-Domäne des Fiberproteins hauptverantwortlich für die Hä­ magglutinationsneigung dieser Serotypen ist [14, 16, 17]. Der Austausch der Gam­ ma-Domäne aus Viren mit anderen Hämagglutinationsspezifitäten führt zu einer Übertragung der entsprechenden Hämagglutinationseigenschaften [17].

Dies ist auch bei der Herstellung rekombinanter Adenoviren möglich und führt zu einer Veränderung der antigenen Struktur und zu einem veränderten Neutralisati­ onsneigung gegenüber neutralisierender Antikörper und einem verändertem Zelltro­ pismus [19, 20, 21].

Vorteilhaft im Sinne der Erfindung ist die Tatsache, dass Erythrozyten prinzipiell keine Zielzellen einer Adenovirusinfektion sind, da sie nicht zur Virusvermehrung geeignet sind. Die Modifikation der Bindungseigenschaften gegenüber Erythrozyten dient daher hier auch nicht dem Ziel der Veränderung des Virustropimus.

Aus diesen Gründen ist es möglich, virale Vektoren zu konstruieren, die eine ver­ minderte unspezifische Affinität zu Nicht-Zielzellen haben und dadurch unerwünsch­ te Wechselwirkungen und in der Folge das Risiko ernster Nebenwirkungen verrin­ gern helfen.

Bevorzugt ist die Ausführung gemäß Anspruch 2 und 3. Über den Austausch von einzelnen Strukturgenen hinaus ist es möglich, ein Vektorsystem auf der Basis an­ derer Serotypen humanen und auch nicht-humanen Ursprungs aufzubauen. Dazu müssen, analog zum Vorgehen bei Seroytyp 5 Vektoren, essentielle Steuerungs­ elemente analog der E1-Region bei Ad5 aus dem Virus entfernt und stabil auf eine Zelllinie übertragen werden. In dieser Weise veränderte Viren können auf ihren normalen Wirtszellen nicht mehr replizieren. Ihre Vermehrung ist an Zelllinien ge­ bunden, die die ausgelagerten Sequenzen stabil in ihrem Genom tragen und da­ durch zur Verpackungszelle werden. Im Falle von E1-deletierten Adenoviren der ersten und folgender Generationen sind dies überwiegend von 293 Zellen abgeleite­ te Linien.

In den durch die Entfernung von Steuerungselementen aus dem Virus entstandenen Raum können therapeutische Transgene eingesetzt werden. Diese Vorgehensweise ist ein grundlegendes Prinzip und gilt für die Nutzung rekombinanter Adenoviren als Gentransfervektor allgemein.

Die Produktion rekombinanter Adenoviren erfolgt auf sog. Verpackungszellen. Eini­ ge der Gene, die für Bausteine codieren, die für den Aufbau von funktionsfähigen Viren notwendig sind, können auch stabil in das Genom der Verpackungszelle integ­ riert sein, oder dort als sogenanntes Episom angesiedelt sein. Sie müssen nicht Bestandteil des Genoms des therapeutischen Virus oder eines viralen oder nicht­ viralen Helferkontsruktes sein. Am Beispiel der Supplementierung des Fiberproteins ist dies bereits gezeigt worden [25].

Die genaue Lage des Fiber-Gens ist bekannt. Es ist möglich Fiber-Gene aus einem anderen, nicht-agglutinierenden Adenoviren (Subgenus A, B, C außer Serotyp 5, E, F) mit Hilfe einer PCR-Reaktion oder eines Restriktionsverdaus des Virusgenoms zu isolieren. Über direkte Klonierungen oder über homologe Rekombinationen kann das ursprüngliche Fiber-Gen (des Serotyp-5-Vektors) oder Teile davon aus dem Vektor entfernt und durch Teile oder komplette Fiber-Gene anderer Serotypen er­ setzt werden. Aus dem in dieser Weise veränderten Virusgenom können Viren pro­ duziert werden, deren veränderte Hämagglutinationsneigung menschlichen Erythro­ zyten gegenüber anschließend in in vitro Untersuchungen bestimmt wird.

Ein derart erfindungsgemäß behandeltes Virus, das eine verringerte bzw. keine Hä­ amagglutinatiosnneigung mehr zeigt, dessen Gentransferleistung aber durch die vorgenommen Veränderungen weitgehend unbeeinflusst gut ist, trägt ein geringeres medizinisches Risisko in sich, schwere hämatologische Veränderungen beim Men­ schen auszulösen. Der erfindungsgemäße Vorteil ist daher immens.

Über den Austausch von einzelnen Strukturgenen hinaus ist es möglich, ein Vektor­ system auf der Basis anderer Serotypen humanen und auch nicht-humanen Ur­ sprungs aufzubauen. Dazu müssen, analog zum Vorgehen bei Seroytyp 5 Vektoren, essentielle Steuerungselemente analog der E1-Region bei Ad5 aus dem Virus ent­ fernt und stabil auf eine Zelllinie übertragen werden. In dieser Weise veränderte Viren können auf ihren normalen Wirtszellen nicht mehr replizieren. Ihre Vermeh­ rung ist an Zelllinien gebunden, die die ausgelagerten Sequenzen stabil in ihrem Genom tragen und dadurch zur Verpackungszelle werden. Im Falle von E1-dele­ tierten Adenoviren der ersten und folgender Generationen sind dies überwiegend von 293 Zellen abgeleitete Linien.

Der mit der vorliegenden Erfindung erzielte Vorteil stellt mithin ein überraschendes Ergebnis dar, welches aufgrund der einschlägigen Literatur nicht zu erwarten war. Der Vorteil der Nutzung derart erfindungsgemäß behandelter rekombinanter Adeno­ viren zu gentherapeutischen Zwecken liegt daher auf der Hand. Dabei spielt es grundsätzlich keine Rolle, ob es sich aus Serotyp-5 oder aus anderen als Serotyp 5 abgeleiteten Viren handelt.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung ist in den anliegenden Zeichnungen dargestellt und wird nachfolgend näher beschrieben. Es zeigt

Fig. 1 einen beispielhaften erfindungsgemäßen Ver­ fahrensablauf, nämlich den Austausch der Fiber- Gene zwischen Adenovirus Serotyp 2 und 5.

Die Plasmide, die zur Herstellung rekombinanter (E1-deletierter) Adenoviren der ersten und folgender Generationen verwendet werden, sind zu einem wesentlichen Teil von Graham an der McMaster Universität in Toronto in den achtziger und neun­ ziger Jahren entwickelt worden und sind weltweit verbreitet [22, 23, 24]. Die rekombi­ nanten Viren leiten sich nahezu ausschließlich von Serotyp 5 ab.

Die genaue Lage des Fiber-Gens ist bekannt. Es ist möglich Fiber-Gene, aus ande­ ren, nicht-agglutinierenden Adenoviren [Subgenus A,B,C außer Serotyp 5, E, F] mit Hilfe einer PCR-Reaktion oder eines Restriktionsverdau des Virusgenoms zu isolie­ ren. Über direkte Klonierungen oder über homologe Rekombinationen kann das ursprüngliche Fiber-Gen (des Serotyp 5 Vektors) oder Teile davon aus dem Vektor entfernt und durch Teile oder komplette Fiber-Gene anderer Serotypen ersetzt wer­ den. Aus dem in dieser Weise veränderten Virusgenom können Viren produziert werden, deren veränderte Hämagglutinationsneigung menschlichen Erythrozyten gegenüber anschließend in in vitro Untersuchungen bestimmt wird.

Ein Virus, das eine verringerte bzw. keine Häamagglutinatiosnneigung mehr zeigt, dessen Gentransferleistung aber durch die vorgenommen Veränderungen weitge­ hend unbeeinflusst gut ist, würde ein geringeres medizinisches Risiko in sich tra­ gen schwere hämatologische Veränderungen beim Menschen auszulösen.

Austausch der Fiber-Gene zwischen Adenovirus Serotyp 2 und 5

Fig. 1 zeigt ein Ausgangskonstrukt A, z. B. einen Adenovirus Serotyp 2 (bestehend aus 35937 Basenpaaren). In einem ersten Schritt wird das Fiber-Gen Ad2 (31030 bp - 32778 bp) aus dem Genom eines Spenderadenovirus (A) über eine PCR amplifiziert und anschließend wird findet eine Insertion des PCR-Produktes in ein Hilfsplasmid B statt. Das Hilfsplasmid enthält Sequenzabschnitte aus dem Empfän­ gerplasmid pJM17, die das Ad5 Fiber-Gen (Serotyp 5) flankieren.

In einem zweiten Schritt wird das Ad2 Fiber-Gens über homologe Rekombination des Hilfsplasmides B mit dem pJM17 -Plasmides an den Ort des Ad5-Fiber-Gen insertiert. Das beispielhaft gewählte pJM17 Plasmid trägt das komplette Serotyp 5 Genom und dient als Ausgangskonstrukt zur Herstellung rekombinanter Adenoviren.

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Claims (10)

1. Verfahren zur Verringerung der Wechselwirkung rekombinanter Adenoviren mit zellulären Bestandteilen des humanen Blutes, insbesondere zur Verwen­ dung in der humanen Gentherapie, gekennzeichnet durch das Einführen von wenigstens einer gezielten Mutation in Basensequenzen des Fiber-Gens von Adenoviren abgeleiteten Vektoren humanen oder nicht-humanen Ursprungs oder in virale oder nicht-virale Helferkonstrukte zur Herstellung solcher Vek­ toren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verwendung von Serotyp-5- Adenoviren bevorzugt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch den teilweisen oder kompletten Austausch oder das zusätzliche Einbringen von Fiber- Genen aus Nicht-Serotyp 5 Adenoviren in von Adenovirus Serotyp 5 abgelei­ tete Vektoren humanen oder nicht-humanen Ursprungs oder Helferkonstruk­ te zur Herstellung solcher Vektoren.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Mutationen um Insertio­ nen und/oder Deletionen handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den zellulären Bestandteilen des Blutes um Erythrozyten handelt.

6. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche unter Verwendung von Adenovirus-Vektoren, die von anderen Adenoviren abgelei­ tet werden.

7. Verfahren nach wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in den nach Entfernung von Steuerungselementen aus dem Virus entstande­ nen Raum therapeutische Transgene eingesetzt werden.

8. Verfahren zur Herstellung von spezifischen Verpackungslinien, die Fiber- Gene oder Teile davon komplementieren können und zur Produktion von adenoviralen Vektoren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 verwendet werden.

9. Verwendung von adenoviralen Vektoren nach den Ansprüchen 1 bis 8 in der ex-vivo Gentherapie.

10. Verwendung von adenoviralen Vektoren nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung von pharmazeutisch wirksamen Produkten in der ex-vivo Gen­ therapie.