DE19936412A1

DE19936412A1 - DNA-Konstrukte zur Herstellung transgener Pflanzen

Info

Publication number: DE19936412A1
Application number: DE19936412A
Authority: DE
Inventors: Peter Nick; Diego Breviario
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg; Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg; Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 1999-08-03
Publication date: 2001-02-15
Also published as: WO2001009354A1; EP1200614A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Konstrukte, die eine C-terminal mutierte alpha-Tubulinsequenz umfassen. Weiterhin betrifft die Erfindung Pflanzenzellen und Pflanzen, die diese Konstrukte enthalten sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Konstrukte, die für mutierte Tubuline kodieren, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen, die diese Konstrukte enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Herbizidresistenz und veränderter Kältesensitivität.

Das Auftreten von Schadkräutern, beispielsweise Roter Reis, Leersia, Echinocloa, Heteranthera in Kulturen von Nutzpflanzen wie Reis, Gerste oder Roggen stellt in der Landwirtschaft ein großes Problem mit weitreichenden wirtschaftlichen Konsequenzen dar. Für einige dieser Schadkräuter (besonders für den Befall von Reisfeldern mit Rotem Reis) gibt es bislang keinen Ansatz zur Kontrolle. Bislang wird zum Beispiel für den Roten Reis vor allem versucht, die Erstinfektion von Reisfeldern zu verhindern. Dies ist dadurch erschwert, daß der Rote Reis eine perfekte Mimikry betreibt, so daß es praktisch unmöglich ist, das Saatgut reinzuhalten. Ein anderer Ansatz beruht darauf, daß eine Pseudoaussaat durchgeführt wird, also ein Umpflügen ohne Aussaat, so daß die im Boden überdauernden Samen des Roten Reises zum Keimen gebracht werden. Danach werden die Keime durch Behandlung mit Trichloressigsäure zum Absterben gebracht. Da aber die Samen dieser Schadpflanze bis zu fünf Jahre im Boden überdauern können, ist dieser Ansatz nicht sehr wirksam, abgesehen von der ökologischen Belastung. Im Durchschnitt vergehen drei Jahre von der Erstinfektion eines Reisfelds bis zum völligen Zusammenbruch des Reisanbaus auf diesem Feld. Die Verluste liegen inzwischen bei 30% der Ernte.

Beim Einsatz von Herbiziden zur Bekämpfung von Schadkräutern wäre es wünschenswert, daß das Herbizid selektiv nur die Schadkräuter, nicht jedoch die Nutzpflanzen am Wachstum hindert. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Pflanze bereitzustellen, die unempfindlich gegen bestimmte Herbizide ist, sowie Ausgangsmaterialien und Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen.

Verschiedene Herbizide greifen an Mikrotubuli an. Mikrotubuli sind Polymere, die aus Heterodimeren von alpha- und beta- Tubulin aufgebaut sind. Pflanzliche Mikrotubuli spielen für die Steuerung der pflanzlichen Entwicklung eine bedeutende Rolle, beispielsweise bei der Steuerung des Wachstums, Knollenbildung, Verzweigung, Blatt- und Wurzelbildung, bei der Bildung von Holz, beim Gravitropismus und bei der Reaktion auf Licht, Wind, Pathogene und Kälte. Dennoch wurden sie bislang biotechnologisch nicht genutzt, obwohl zahlreiche Tubulingene mit mannigfaltigen Regulationsmustern bekannt sind. Der Grund liegt im wesentlichen darin, daß bislang keine Möglichkeit bestand, das Verhalten der Tubulinproteine und damit die Funktion zu manipulieren.

Für eine bestimmte Klasse von Substanzen, die sogenannten Dinitro-Aniline, wird vermutet, daß sie an den N-Terminus des Tubulins binden. Es ist gelungen, eine Resistenz gegen diese Herbizide von der Spezies Eleusine indica, wo diese Resistenz spontan aufgetreten war, auf Mais zu übertragen (Nature 393, 1998, 260-262).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine andere Klasse von Herbiziden, die Carbamatherbizide, an den C-Terminus pflanzlicher alpha-Tubuline bindet. Dadurch wird eine Depolymerisierung der Mikrotubuli bewirkt, was zu Wachstumshemmung führt.

Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen, die alpha-Tubuline exprimieren, deren C-Terminus so modifiziert ist, daß bestimmte Herbizide nicht mehr binden können. Das exogene alpha-Tubulin verleiht den Mikrotubuli der transgenen Pflanzen erhöhte Resistenz gegen bestimmte Herbizide.

Im Rahmen dieser Erfindung umfaßt der "C-Terminus eines alpha- Tubulins" denjenigen C-terminalen Aminosäurebereich eines alpha-Tubulins, der deletiert werden kann, ohne daß die Fähigkeit des alpha-Tubulins, in Mikrotubuli eingebaut zu werden, verloren geht.

Ein Aspekt der Erfindung sind DNA-Konstrukte, die zur Expression eines C-terminal modifizierten alpha-Tubulins in Pflanzenzellen geeignet sind. Das alpha-Tubulin, für das die DNA-Sequenz kodiert, besitzt einen N-terminalen Teil, der insoweit unverändert ist, daß das alpha-Tubulin noch in Mikrotubuli eingebaut werden kann. Der C-terminale Teil des kodierten alpha-Tubulins weist eine Mutation gegenüber dem Wildtyp-Tubulin auf, von dem die DNA-Sequenz abgeleitet ist. Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt weist weiterhin wenigstens eine DNA-Sequenz auf, die die Expression der alpha-Tubulin-DNA- Sequenz in Pflanzenzellen kontrolliert.

Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt enthält auch wenigstens eine DNA-Sequenz, die für einen Resistenzfaktor kodiert, der die Selektion transfizierter Pflanzenzellen erlaubt. Oft sind Resistenzfaktoren Proteine mit enzymatischer Aktivität, die bestimmte Verbindungen umwandeln oder abbauen können. Folglich werden als DNA-Sequenzen Gene eingesetzt, die für diese Proteine kodieren. Bevorzugt werden DNA-Sequenzen eingesetzt, die für den Resistenzfaktor Neomycin-Phosphotransferase II kodieren. Dadurch wird Resistenz gegen Kanamycin vermittelt.

Diese für einen Resistenzfaktor kodierende DNA-Sequenz steht ebenfalls unter der Kontrolle einer DNA-Sequenz, die die Expression der Sequenz in Pflanzenzellen reguliert. Vorzugsweise handelt es sich dabei um einen Promotor, der zur Expression von DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen geeignet ist.

Eine Besonderheit der vorliegenden Erfindung ist, daß der Resistenzfaktor das C-terminal modifizierte alpha-Tubulin selbst sein kann. Expression des modifizierten alpha-Tubulins kann Resistenz gegen bestimmte Herbizide vermitteln. Es ist also möglich, transfizierte Zellen durch Kultivieren in Gegenwart der Herbizide zu selektionieren.

Eine Ausführungsform der Erfindung ist also ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein C-terminal modifiziertes alpha-Tubulin kodiert, aber keine zusätzliche DNA-Sequenz, die für einen Resistenzfaktor kodiert. Die für einen Resistenzfaktor kodierende DNA-Sequenz ist in diesem speziellen Fall die alpha-Tubulin-Sequenz selbst.

Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen DNA- Konstrukten um circuläre Plasmide, die ein C-terminal mutiertes alpha-Tubulin unter der Kontrolle eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors kodieren und ein Resistenzgen unter der Kontrolle eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors aufweisen.

Denkbar sind ebenfalls Ti-Plasmide, die von dem Ti-Plasmid von Agrobakterium tumefaciens abgeleitet sind und zur Herstellung transgener Pflanzen geeignet sind. Es kann sich aber auch um "nackte" DNA-Konstrukte oder um Konstrukte mit viralen Komponenten handeln.

Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt ist zumindest teilweise in vitro hergestellt. Das bedeutet, daß zumindest ein Schritt bei der Herstellung des DNA-Konstrukts außerhalb einer Pflanzenzelle stattgefunden hat. Dadurch unterscheiden sich die erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte von natürlich vorkommenden Sequenzen. Die DNA-Sequenz, die für das alpha-Tubulin kodiert, kann entweder aus einer Gen-Bibliothek isoliert worden sein, es kann aber auch durch Polymerase Kettenreaktion (PCR) oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Denkbar ist auch eine Kombination dieser Methoden. In der Regel wird die alpha- Tubulin-Sequenz in die "multiple cloning site" eines Expressionsvektors kloniert, der zur Expression von DNA- Sequenzen in Pflanzenzellen geeignet ist.

Die C-terminale Mutation des alpha-Tubulingens kann auf verschiedene Weisen gewonnen werden. Beispielsweise kann ein Teil eines alpha-Tubulins, das bereits die entsprechende Mutation trägt, in das gewünschte alpha-Tubulingen umkloniert werden. Die mutierte Ausgangssequenz kann beispielsweise aus einer herbizidresistenten Pflanzenlinie stammen, bei der das alpha-Tubulingen isoliert und sequenziert worden ist und eine entsprechende Mutation festgestellt wurde. Bevorzugt wird die Mutation jedoch durch In vitro Mutagenese eingeführt. Dabei werden in die DNA des alpha-Tubulingens gezielt Punktmutationen eingeführt. Hierzu geeignete Verfahren können auf der PCR- Technik basieren. Dabei wird als Matrize die alpha-Tubulin-DNA- Sequenz verwendet, in die die Mutation eingeführt werden soll. Die PCR-Primer tragen einen entsprechenden Basenaustausch gegenüber der Matrizensequenz. Über die Primer wird auch die Mutation amplifiziert.

Vorzugsweise liegt die C-terminale Mutation des alpha-Tubulins an einer Aminosäureposition, die innerhalb des Aminosäurebereichs liegt, der den Aminosäurepositionen 414 bis 451 des alpha-Tubulins TUBA1 aus Reis entspricht. Am bevorzugtesten aber liegt die C-terminale Mutation des alpha- Tubulins an einer Aminosäureposition, die innerhalb der 15 C terminalen Aminosäuren des entsprechende Wildtyp-alpha-Tubulins liegt, von dem die DNA-Sequenz abgeleitet ist.

Die Mutationen können verschiedener Art sein. Auf DNA-Ebene kann es sich um Deletionen, Insertionen oder eine oder mehrere Punktmutationen handeln. Auf Aminosäureebene kann es sich um Punktmutationen handeln, so daß das mutierte alpha-Tubulin an wenigstens einer Aminosäureposition eine andere Aminosäure aufweist als das entsprechende Wildtyp-alpha-Tubulin, von dem die Tubulin-Sequenz abgeleitet ist. Bevorzugt sind jedoch Mutationen, die in dem exprimierten alpha-Tubulin zu einem verkürzten C-Terminus führen. Das wird dadurch erreicht, daß ein Kodon, das im entsprechenden Wildtyp-alpha-Tubulin für eine Aminosäure kodiert, in ein Stopkodon umgewandelt ist. Denkbar sind jedoch auch Mutationen, die zu einer Verschiebung des Leserahmens führen, so daß "fremde Aminosäuren" kodiert werden, die nicht Teil einer Tubulin-Sequenz sind.

Am bevorzugtesten ist ein DNA-Konstrukt, in dem in der mutierten DNA-Sequenz das Kodon, das dem Kodon 414 des alpha- Tubulingens TUBA1 von Reis entspricht, ein Stopkodon ist.

Die DNA-Sequenz, die für das alpha-Tubulin kodiert, ist in der Regel von einem pflanzlichen alpha-Tubulingen abgeleitet. Dies ist jedoch nicht zwingend, da aufgrund des sehr hohen Konservierungsgrades der Tubuline auch alpha-Tubulingene aus nichtpflanzlichen Organismen in Pflanzen funktionell sein könnten. Es sind sogar chimäre Tubulinsequenzen denkbar, die aus Abschnitten verschiedener Tubulingene zusammengesetzt sind. In der Regel handelt es sich bei der alpha-Tubulin-DNA-Sequenz des DNA-Konstrukts um eine DNA-Sequenz, die für ein alpha- Tubulin einer Nutzpflanze kodiert. Vorzugsweise handelt es sich um eine DNA-Sequenz, die für ein alpha-Tubulin von Reis kodiert, am bevorzugtesten um wenigstens einen Teil des Gens TUBA1 von Reis. Ebenfalls bevorzugt sind DNA-Konstrukte, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein alpha-Tubulin der Kartoffel kodiert.

Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt kann neben einer DNA- Sequenz, die für ein C-terminal modifiziertes alpha-Tubulin kodiert, auch eine DNA-Sequenz aufweisen, die für ein beta- Tubulin kodiert. Dies ist vorteilhaft, wenn hohe Expressionsniveaus erreicht werden, da dann durch alleinige Expression des alpha-Tubulins das Verhältnis von alpha- zu beta-Tubulin gestört sein könnte. Das wird durch gleichzeitige Expression eines beta-Tubulins vermieden. Vorzugsweise befinden sich alpha- und beta-Tubulin-Sequenz als "Tandemkonstrukt" hintereinander. Beispielsweise kann das DNA-Konstrukt die vollständige Sequenz des OSTBB16-Gens (für beta-Tubulin kodierend) aus Reis aufweisen.

Die wichtigsten Kontrollsequenzen zur Regulation der Expression der alpha-Tubulinsequenz sind Promotoren. Bevorzugt werden folgende Promotoren eingesetzt: Der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) erlaubt konstitutive Expression in Pflanzenzellen. Durch den Maisubiquitin-Promotor wird sehr starke Expression in Getreidezellen erreicht. Der TUBA1- Promotor aus Reis ist zur Expression von DNA-Sequenzen in wachsenden Zellen geeignet, während der OSTBB16-Promotor aus Reis zur konstitutiven Expression geeignet ist. Schließlich kann durch spezifische Promotoren eine zeitlich und räumlich begrenzte Expression erreicht werden. Ein Beispiel dafür ist der Einsatz des Patatin-Promotors aus Kartoffel. Er sorgt dafür, daß Sequenzen unter seiner Kontrolle nur in den Knollen exprimiert werden. Dadurch werden die Wirkungen der Expression auf bestimmte Pflanzenteile oder Zelltypen begrenzt.

Die genannten Kontrollsequenzen können auch die Expression des Resistenzfaktors kontrollieren.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Pflanzenzellen, die wenigstens einen Teil eines erfindungsgemäßen DNA-Konstruktes enthalten. In der Regel ist dieser Teil fest in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Vorzugsweise handelt es sich um die Zelle einer Nutzpflanze, beispielsweise Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Mais, Tabak, Baumwolle, Reis, Brassicaceen, Kirschen, Pflaumen, Kartoffeln.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, bei dem ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt in eine Pflanzenzelle eingebracht wird, so daß zumindest ein Teil dieses Konstrukts stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert wird. Dazu kann man eine Suspension von Pflanzenzellen transfizieren, wonach eine Selektion der erfolgreich transfizierten Zellen stattfindet. Erfindungsgemäß werden die transfizierten Zellen vermehrt und kultiviert, was zum Auswachsen einer vollständigen Pflanze führt. Dabei wird die exogene Tubulin-Sequenz in den Pflanzenzellen exprimiert.

Es sind verschiedene Transfektionsmethoden anwendbar, um das DNA-Konstrukt in Pflanzenzellen einzubringen. Möglich sind der "silicon carbide"-vermittelte Gentransfer, Infektion durch Agrobakterium tumefaciens und Elektroporation, bevorzugt ist jedoch der Beschuß von Zellen mit DNA-beschichteten Goldkügelchen ("particle-inflow gun").

Nach Transfektion werden die Zellen vermehrt und kultiviert.

Vorzugsweise wird aus reifen Embryonen eine Kalluskultur erzeugt und diese dann auf Agarplatten, die den Selektionsfaktor (z. B. Kanamycin bzw. Carbamatherbizide) enthalten, mit der "particle-inflow gun" mithilfe DNA- beschichteter Goldpartikel transfiziert. Erfindungsgemäß werden die transfizierten Zellen auf den Agarplatten unter Selektionsdruck vermehrt und dann mit Cytokininen behandelt, so daß sich aus dem Kallus Sprosse bilden. Diese werden dann nach einigen Wochen abgeschnitten und auf auxinhaltigem Agarmedium bewurzelt. Die so entstandenen Pflänzchen können dann nach ein bis zwei Monaten auf Erde umgesetzt und zur Blüte gebracht werden. Die entstehenden Samen werden dann ausgesät und auf die Anwesenheit des eingebrachten modifizierten Tubulingens und die dadurch ausgelöste Carbamatresistenz geprüft. Die positiven Linien können dann auf konventionelle Weise weitervermehrt werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Pflanzen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden. Diese Pflanzen exprimieren ein C-terminal modifiziertes Tubulin. Dieses alpha- Tubulin wird in die zellulären Mikrotubuli eingebaut und es entstehen Hybridmikrotubuli, die sowohl natives als auch modifiziertes alpha-Tubulin aufweisen. Es ist auch möglich, daß die Mikrotubuli überwiegend modifiziertes alpha-Tubulin enthalten, da die Expression des nativen alpha-Tubulins herunterreguliert wird. Die Hybridmikrotubuli besitzen veränderte Eigenschaften. Da bestimmte Herbizide an den C- Terminus des alpha-Tubulins binden, können die Mikrotubuli der erfindungsgemäßen Pflanzen nicht mehr von diesen Herbiziden gebunden werden und folglich auch nicht mehr depolymerisiert werden. Somit verleiht das modifizierte alpha-Tubulin der erfindungsgemäßen Pflanze eine erhöhte Resistenz gegenüber bestimmten Herbiziden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Carbamatherbizide, am bevorzugtesten um Ethyl-N-phenylcarbamat, Isopropyl-N-phenylcarbamat (Propham) und 3-Chlorisopropyl-N- phenylcarbamat (Chlorpropham).

Die Hybridmikrotubuli können den Pflanzen auch weitere vorteilhafte Eigenschaften verleihen. Eine Besonderheit von Mikrotubuli ist ihre Kältesensitivität, die zur Depolymerisierung unterhalb bestimmter Temperaturen führt. Dieses Verhalten der Mikrotubuli wird als verantwortlich für die Hemmung des pflanzlichen Wachstums bei Kälte angesehen. Unter Kälte sind Temperaturen von 0-10°C zu verstehen. Kälteresistenz ist in diesem Zusammenhang von Frostresistenz zu trennen. Der Ernteausfall bei kalten Sommern hat weitreichende wirtschaftliche Konsequenzen. Es gibt Hinweise, daß der C- Terminus des alpha-Tubulins für die Kälteempfindlichkeit der Mikrotubuli verantwortlich ist. Somit kann die erfindungsgemäße Pflanze zelluläre Mikrotubuli mit veränderter Kältesensitivität aufweisen. Denkbar sind Nutzpflanzen, die ein alpha-Tubulin exprimieren, dessen C-Terminus derart verändert ist, daß die Mikrotubuli stabiler gegen Kälte sind und somit das Wachstum der Pflanze weniger durch niedrige Temperaturen gehemmt wird.

Es sind auch Pflanzen vorstellbar, die eine erhöhte Kältesensitivität aufweisen. Bei der Lagerung von Kartoffeln ist ein frühzeitiges Auskeimen unerwünscht. Dem wird derzeit durch Einsatz chemischer Keimhemmer wie beispielsweise Propham oder Chlorpropham begegnet. Daneben wird versucht, das Auskeimen durch sehr niedrige Temperaturen unter 4°C zu verhindern. Das führt jedoch zur Umwandlung von Stärke in Zucker und somit zur Geschmacksveränderung. Außerdem treten Verfärbungen auf. Ein Aspekt der Erfindung ist beispielsweise eine Kartoffelpflanze, die ein C-terminal modifiziertes alpha- Tubulin unter der Kontrolle des knollenspezifischen Patatin- Promotors exprimiert. Das alpha-Tubulin ist derart modifiziert, daß die entstehenden Hybridmikrotubuline eine erhöhte Empfindlichkeit gegen niedrige Temperaturen aufweisen, d. h. bereits bei höheren Temperaturen depolymerisieren. Dadurch könnte die Keimung bei Kartoffeln durch Lagerung und Transport bei entsprechender Temperatur verhindert werden, ohne daß die unerwünschten Wirkungen extrem niedriger Temperaturen auftreten. Deshalb könnte auf chemische Keimhemmer verzichtet werden. Vorteilhafterweise wird das modifizierte alpha-Tubulin nicht in Pflanzenteilen außer in den Knollen exprimiert, dadurch werden etwaige Nebeneffekte minimiert.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmittel der erfindungsgemäßen Pflanzen, vor allem ihre Samen. Weitere Vermehrungsmittel sind beispielsweise die Saatknollen von Kartoffeln.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung C-terminal mutierter alpha-Tubuline oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren zur Herstellung der oben genannten erfindungsgemäßen Pflanzen oder ihrer Vermehrungsmittel. Nucleinsäuren umfassen hier insbesondere einzel- oder doppelsträngige DNA und RNA.

Alle Aspekte der vorliegenden Erfindung, insbesondere die, welche Pflanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung betreffen, sind auf viele verschiedene Pflanzen und Pflanzensorten anwendbar. Die vorliegende Erfindung ist damit nicht auf eine bestimmte Pflanzensorte beschränkt. Gegenstand der Erfindung sind daher erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Pflanzen, nicht aber einzelne Pflanzensorten.

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Nukleotidsequenzen des TUBA1- Gens aus Arborio (Arb.; SEQ ID NO: 3), Nihonmasari Wildtyp (Nihmas WT; SEQ ID NO: 5) und Nihonmasari ER31 (Nihmas ER31; SEQ ID NO: 7). Nukleotid 1353 von ER31 weist eine Mutation auf, die zu einem Stopcodon führt. Die entsprechenden Aminosäuresequenzen für Arborio (SEQ ID NO: 4), Nihonmasari Wildtyp (SEQ ID NO: 6) und Nihonmasari ER31 (SEQ ID NO: 8) sind unterhalb der Nukleotidsequenzen angegeben. Die entsprechenden Experimente sind in Beispiel 2 erläutert.

Fig. 2 zeigt die erhöhte Resistenz der Linie ER31, die das C terminal modifizierte TUBA1-Gen exprimiert, gegen das Herbizid Ethyl-N-phenylcarbamat (EPC) im Vergleich mit dem Wildtyp. Es wurden Koleoptil- und Mesokotylwachstum in Abhängigkeit von der EPC-Konzentration ermittelt. Die entsprechenden Experimente sind in Beispiel 3 erläutert.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

Beispiel 1 Bindung von Carbamatherbiziden an den C-Terminus von alpha- Tubulin

Zunächst wurden Carboxy-Derivate der Carbamatherbizide Ethyl-N- phenylcarbamat und Isopropyl-N-phenylcarbamat hergestellt und an Sepharose 4B gekoppelt. Diese Matrix wurde nun mit verschiedenen alpha-Tubulinen und C-terminalen Peptiden verschiedener alpha-Tubuline inkubiert. Im einzelnen wurden eingesetzt: die Genprodukte der Reis-alpha-Tubulingene TUBA1, TUBA2 und TUBA3, ein alpha-Tubulin bestehend aus den Aminosäuren 1 bis 413 des Genprodukts des Reis-alpha- Tubulingens TUBA1, drei Peptide, die jeweils den Aminosäuren 437 bis 451 der Genprodukte der Reis-alpha-Tubulingene TUBA1 bis TUBA3 entsprechen. Die nativen alpha-Tubuline wurden auf folgende Weise gewonnen: Reiskoleoptilen (6 Tage bei 25°C in absoluter Dunkelheit gewachsen) wurden im Sicherheitsgrünlicht geerntet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver gemörsert. Das Pulver wurde mit eiskaltem Mikrotubuli-stabilisierendem Puffer gemischt (1 Gewichtsteil Pulver : 1 Gewichtsteil Puffer) und langsam auf Eis aufgetaut. Der Mikrotubuli-stabilisierende Puffer enthält 25 mM MES, 5 mM EGTA, 1 mM MgSO₄, 1% w/v Glycerin, 1 mM GTP, 1 mM PMSF und jeweils 10 µg/ml pepstatin A, aprotinin und leupeptin, pH 6,9. Das Gemisch wurde dann durch zwei Lagen 80 µm Nylongewebe filtriert, für 10 min bei 4°C mit 300 000 g ultrazentrifugiert, der Niederschlag verworfen und der Überstand durch ein 0,22 µm-Membranfilter filtriert. Dieser Überstand ist stark angereichert an Tubulin und Mikrotubuli assoziierten Proteinen. Zur Gewinnung des mutierten TUBA1- Proteins (Aminosäuren 1 bis 413) wurde als Ausgangsmaterial die Carbamat-resistente Reislinie ER31 verwendet. Die Peptide wurden durch chemische Synthese hergestellt.

Die genannten Peptide und Proteine wurden mit der Matrix inkubiert, so daß sie binden konnten. Anschließend wurden sie mit einem Kaliumchloridgradienten eluiert. Die einzelnen Fraktionen wurden mit Trichloressigsäure gefällt und dann nach Gelelektrophorese durch Western-Blot mit Isotyp-spezifischen Antikörpern gegen Reis-alpha-Tubulin auf die Anwesenheit des jeweiligen Tubulin-Isotyps untersucht. Die Intensität der Banden wurde mit Hilfe eines Gel-Scanning- Quantifizierungsprogramms ermittelt. In folgender Tabelle sind die relativen Intensitäten der Banden in Abhängigkeit von der Kaliumchloridkonzentration angegeben:

Tabelle 1

Natives Reis-TUBA1-Protein bindet deutlich fester an das Matrix-Material als natives Reis-TUBA3-Protein. C-terminal verkürztes Reis-TUBA1-Protein bindet jedoch viel schwächer. Das zeigt, daß der C-Terminus von TUBA1 für die Bindung an Carbamatherbizide notwendig ist. Die C-terminalen 15 Aminosäuren des TUBA1-Proteins binden mit gleicher Stärke an das Matrix-Material wie das Gesamtprotein. Das zeigt, daß der C-Terminus des TUBA1-Proteins auch hinreichend für die Bindung an Carbamatherbizide ist.

Beispiel 2 Klonierung des mutierten Reis-TUBA1-Gens

Es wurden Isotyp-spezifische PCR-Primer hergestellt (siehe Fig. 1). Der 5'-Primer hatte die Sequenz "GAGACTGCAGCGTCGCAGCATCAACCCAAT" (SEQ ID NO: 1), der 3'-Primer hatte die Sequenz "GAGAATTCCCAGACGACGACGACTCCTC" (SEQ ID NO: 2). Es wurden für Wildtyp (Kultivar Nihonmasari) und die carbamatresistente Linie ER31 verschiedene, voneinander unabhängige Schwesterlinien bei völliger Dunkelheit für sechs Tage kultiviert (bei 25°C), davon im Sicherheitsgrünlicht die Koleoptilen geerntet und darauf gemäß der von Ehmann et al. (Planta 183, 416-422, 1991) publizierten Methode die mRNA isoliert. Die mRNA wurde mit reverser Transkriptase (erhältlich von Firma Roche Diagnostics) gemäß Herstellerprotokoll in cDNA umgeschrieben und daraus dann mittels PCR mit den Isotyp spezifischen Primern die cDNA für TUBA1 amplifiziert. An die Primer war eine Erkennungssequenz für die Restriktionsenzyme EcoRI und PstI ansynthetisiert, die PCR wurde mit 35 Zyklen bei einer "Annealingtemperatur" von 55°C mit der besonders fehlerfreien "ExTaq"-Polymerase der Firma TaKaRa durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde nach Standardverfahren auf einem Agarosegel aufgetrennt, die amplifizierte Bande ausgeschnitten und mit Hilfe des "Qiagen Gel Extraction Kit" (erhältlich von der Firma Qiagen) nach Angaben des Herstellers eluiert und aufgereinigt. Nach Verdau mit EcoRI und PstI nach Angaben des Herstellers (Firma Gibco) wurde das TUBA1-cDNA-Fragment in den Vektor pUC19 ligiert und nach dem üblichen Verfahren in E.coli transformiert. Es wurden fünf unabhängige Klonierungen für den Wildtyp und sechs unabhängige Klonierungen für die carbamatresistente Linie ER31 durchgeführt. Schließlich wurden die amplifizierten DNA-Sequenzen ermittelt.

Die erhaltenen Sequenzen wurden mit der für den Reiskultivar Arborio publizierten Sequenz für TUBA1 verglichen. Der Vergleich (siehe Fig. 1) zeigt, daß sich die zwei Kultivare an mehreren Stellen unterscheiden. Zwei Unterschiede wurden sowohl im Wildtyp als auch bei der carbamatresistenten Linie gefunden, sind also Kultivar-spezifisch. Es handelt sich um den Austausch eines Serins (Arborio) in Position 52 gegen ein Phenylalanin (Nihonmasari) und den Austausch eines Serins (Arborio) in Position 437 gegen ein Alanin. Zusätzlich liegt bei den carbamatresistenten Linien an Position 1353 ein Basenaustausch G zu T vor, dadurch wird das Triplett GAG (Gutamat) in das Triplett TAG (Stop) überführt, wodurch das entstehende Protein C-terminal von 451 auf 413 Aminosäuren verkürzt wird.

Beispiel 3 Resistenz der Linie ER31 gegen Ethyl-N-phenylcarbamat

Reiskaryopsen von ER31 und Wildtyp wurden bei völliger Dunkelheit für sechs Tage bei 25°C auf wäßrigen Lösungen von Ethyl-N-phenylcarbamat angezogen. Dazu wurden jeweils 20 Karyopsen äquidistant auf einem feinen Plastiknetz ausgelegt, das mithilfe von Polystyrolblöckchen auf der Lösung flottierte. Die Länge von Koleoptile und Mesokotyl wurde nach Ablauf der Anzucht gemessen und die entsprechenden Mittelwerte gegen den Logarithmus der eingesetzten Konzentration von Ethyl-N- phenylcarbamat aufgetragen. Aus der Verschiebung der Dosis- Wirkungs-Kurve für die Mutante zu höheren Konzentrationen läßt sich der Grad der Resistenz als Faktor bestimmen. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 4 Herstellung einer transgenen Reispflanze

Als Ausgangsmaterial dienen reife Reissamen, aus denen Kallus hergestellt wird. Dieser Schritt ist beschrieben in P. Nick, O. Yatou, M. Furuya, A. M. Lambert (1994) Auxin-dependent microtubule responses and seedling development are affected in a rice mutant resistant to EPC. Plant J. 6, 651-663.

Das Kallusgewebe wird nun eine Woche nach Subkultur auf MS-A Agar (Hartke, S. and Lörz, H. - 1989 Somatic embryogenesis and plant regeneration from various indica rice ("Oryza sativa L.") genotypes. J. Genet. Breeding 43, 205-214) mit Hilfe der "particle inflow gun" transformiert.

Dazu wird das Kallusgewebe auf MS-A Agar, der mit jeweils 0,3 M Mannit und Sorbit komplementiert ist, verteilt und für 3 Stunden bei 25°C inkubiert. Danach werden die Zellen unter sterilen Bedingungen mit jeweils 10 µl DNA-beschichteten Goldpartikeln pro Schuß transformiert und für weitere 12 Stunden bei 25°C auf den Mannit/Sorbit-haltigen Agarplatten belassen. Danach werden sie auf Selektionsmedium umgesetzt (MS- A Agar mit 1 mM Ethyl-N-phenylcarbamat), wobei die beschossene Fläche des Kallus nach oben zeigt. Neugebildetes Kallusgewebe wird nach zwei Wochen im Dunkeln bei 25°C auf frisches Selektionsmedium übertragen, bis sich kompakte und undurchsichtige Kallusknöllchen bilden. Diese werden steril entnommen und auf Vor-Regenerationsmedium (Selektionsmedium, in dem das 2,4 D durch 2 ppm 6-Benzylaminopurin, 1 ppm alpha- Naphthylessigsäure und 5 ppm Abscisinsäure ersetzt ist) umgesetzt. Nach einer weiteren Woche Kultivierung im Dunkeln wird wiederum kompakter und undurchsichtiger Kallus entnommen und auf Regenerationsmedium überführt (Selektionsmedium, in dem das 2,4 D durch 3 ppm 6-Benzylaminopurin und 0,5 ppm alpha- Naphthylessigsäure ersetzt ist) und bei Tageslicht weiterkultiviert, bis Sprosse regenerieren. Die Sprosse werden nach mehreren Wochen auf Selektionsmedium ohne Hormone umgesetzt und bei 10 000 Lx/m² weiterkultiviert, bis sich Wurzeln gebildet haben. Die Reispflänzchen werden dann auf Erde weitergezogen und davon Samen erzeugt wie in Nick et al. (1994) (siehe oben) beschrieben.

Claims

1. DNA-Konstrukt, das geeignet ist, um eine DNA-Sequenz in Pflanzenzellen zu exprimieren und zumindest teilweise in vitro hergestellt wird, umfassend folgende Bestandteile:

a) eine DNA-Sequenz, die für ein mutiertes alpha-Tubulin kodiert, wobei
- a) der N-terminale Teil des alpha-Tubulins so erhalten ist, daß das alpha-Tubulin in Mikrotubuli eingebaut werden kann;
- b) der C-terminale Teil des alpha-Tubulins eine Mutation gegenüber dem Wildtyp-Tubulin aufweist, von dem die DNA-Sequenz abgeleitet ist;
b) wenigstens eine DNA-Sequenz, die die Expression der alpha- Tubulin-DNA-Sequenz in Pflanzenzellen kontrolliert;
c) wenigstens eine DNA-Sequenz, die für einen Resistenzfaktor kodiert, der die Selektion erfolgreich transfizierter Pflanzenzellen erlaubt, wobei diese DNA-Sequenz unter der Kontrolle einer DNA-Sequenz nach b) steht.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation des alpha-Tubulins im C-terminalen Drittel des alpha-Tubulins ist.

3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation des alpha-Tubulins an einer Aminosäurepostion ist, die innerhalb des Aminosäurebereichs liegt, der den Aminosäurepositionen 414-451 des alpha-Tubulins TUBA1 aus Reis entspricht.

4. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutation des alpha-Tubulins an einer Aminosäureposition ist, die innerhalb der 15 C-terminalen Aminosäuren des entsprechenden Wildtyp-alpha-Tubulins liegt.

5. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte alpha-Tubulin an wenigstens einer Aminosäureposition eine andere Aminosäure als das entsprechende Wildtyp-alpha-Tubulin aufweist.

6. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das mutierte alpha-Tubulin im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-alpha-Tubulin C-terminal verkürzt ist.

7. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß in der mutierten DNA-Sequenz das Kodon, das dem Kodon 414 im alpha-Tubulin-Gen TUBA1 von Reis entspricht, ein Stopkodon ist.

8. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das alpha-Tubulin ein alpha-Tubulin einer Nutzpflanze ist.

9. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das alpha-Tubulin ein alpha-Tubulin von Reis ist.

10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz wenigstens einen Teil des Gens TUBA1 von Reis umfaßt.

11. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein alpha-Tubulin der Kartoffel kodiert.

12. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es als eine Kontrollsequenz den Promotor des TUBA1-Gens aus Reis aufweist.

13. DNA-Konstrukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es als eine Kontrollsequenz den knollenspezifischen Patatin-Promotor der Kartoffel aufweist.

14. Pflanzenzelle, enthaltend wenigstens einen Teil eines DNA- Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 13.

15. Pflanzenzelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die Zelle einer Nutzpflanze ist.

16. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, das folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellung eines DNA-Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
b) Einbringen dieses DNA-Konstrukts in eine Pflanzenzelle, so daß zumindest ein Teil des Konstrukts stabil in das Genom der Pflanzenzelle integriert wird,
c) Vermehrung und Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen, wobei die exogene Tubulinsequenz exprimiert wird.

17. Pflanze, herstellbar durch ein Verfahren nach Anspruch 16, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.

18. Pflanze nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze Resistenz gegenüber wenigstens einem Herbizid aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.

19. Pflanze nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze Resistenz gegenüber wenigstens einem Carbamatherbizid aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.

20. Pflanze nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze Resistenz gegenüber wenigstens einem der Herbizide Ethyl-N-Phenylcarbamat, Isopropyl-N-Phenylcarbamat (Propham) und 3-Chlorisopropyl-N-phenylcarbamat (Chlorpropham) aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.

21. Pflanze nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze erhöhte Kälteresistenz gegenüber der entsprechenden wildtyppflanze aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.

22. Pflanze nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze erhöhte Kälteempfindlichkeit gegenüber der entsprechenden wildtyppflanze aufweist, sowie Vermehrungsmittel dieser Pflanze.

23. Verwendung von C-terminal mutierten alpha-Tubulinen oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren, zur Herstellung von herbizidresistenten Pflanzen oder deren Vermehrungsmittel.

24. Verwendung von C-terminal mutierten alpha-Tubulinen oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren, zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Kälteresistenz oder deren Vermehrungsmittel.

25. Verwendung von C-terminal mutierten alpha-Tubulinen oder von Nucleinsäuren, die diese kodieren, zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Kälteempfindlichkeit oder deren Vermehrungsmittel.