DE19933506A1 - Zelluläre Aufnahme von DNA - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues System zur zellulären Aufnahme von Nukleinsäuren, Stoffen, die eine Nukleinsäurekomponente enthalten, oder genetischer Information. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleotidsequenz mit mindestens einer Signalsequenz, welche die Aufnahme der Nukleinsäure in eine Zelle bewirkt, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Verfahren zur Identifizierung derartiger Nukleotidsequenzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues System zur zellulären Aufnahme von Nukleinsäuren, Stoffen, die eine Nukleinsäurekomponente enthalten, oder geneti­ scher Information. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure, enthal­ tend eine Nukleotidsequenz mit mindestens einer Signalsequenz, welche die Aufnahme der Nukleinsäure in eine Zelle bewirkt, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Verfahren zur Identifizierung derartiger Nukleotidsequenzen.

In der biomedizinischen Forschung ist ein gesamtes Fachgebiet, die Vektoren­ entwicklung, mit der Einschleusung rekombinanter DNA in Zellen von Interesse befaßt. Bis heute hat sich kein Vektorsystem auf breiter Basis durchgesetzt. Darüber hinaus sind die bekannten Verfahren zur Herstellung anwendbarer Vektoren vergleichsweise komplex und teuer.

Die Anwendung viraler und nicht-viraler Vektoren zur Einschleusung rekombinan­ ter genetischer Information (z. B. DNA) in Zielzellen wird in der Molekularbiologie, molekularen Medizin und Gentherapie vor allem durch die Komplexität der Systeme extrem aufwendig, kostenintensiv und biologisch nur äußerst schwer kontrollierbar. Die Übertragung von Nukleinsäure-Transportfunktionen, ins­ besondere DNA-Transportfunktionen, auf die einzuschleusende Nukleinsäure, z. B. eine DNA, selbst würde den konzeptionell einfachsten und in methodischer Hinsicht am besten umsetzbaren Weg darstellen. Jedoch sind artifizielle DNA- Elemente (DNA-cis-Elemente), welche die zelluläre Aufnahme von DNA ver­ mitteln, bisher unbekannt.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein in biologischer und technischer Hinsicht möglichst einfach ausführbares System zur Einschleu­ sung genetischer Information, wie beispielsweise DNA, in Zellen bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfüh­ rungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Die vorstehend definierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird insbesondere dadurch gelöst, daß Transportsignale zur Einschleusung "nackter" Nukleinsäu­ ren, wie beispielsweise rekombinanter DNA, in Zellen von cis-Elementen, wie beispielsweise DNA-cis-Elementen, übernommen werden, die sich auf der ein­ zuschleusenden Nukleinsäure selbst befinden. Daher wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure, enthaltend eine Nukleotidsequenz mit mindestens einer Signalse­ quenz, welche die Aufnahme der Nukleinsäure in eine Zelle bewirkt, bereit­ gestellt.

Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleotidsequenz" umfassen endogen ex­ primierte, halbsynthetische, synthetische oder chemisch modifizierte Nukleinsäu­ remoleküle, die vorzugsweise im wesentlichen aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden bestehen. Die "Signalsequenz" der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist mindestens ein Teil der Nukleotidsequenz und ist somit ein cis-Element der erfindungsgemäßen Nu­ kleinsäure und bewirkt deren Aufnahme in eine Zelle. Beispielsweise handelt es sich bei der Signalsequenz einer erfindungsgemäßen DNA somit um ein DNA-cis- Element.

Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Nukleinsäure weiter mindestens eine zu transportierende zweite Nukleotidsequenz und/oder eine oder mehrere mit der ersten und/oder zweiten Nukleotidsequenz kovalent verknüpfte und/oder komplexierte Komponenten, die biologisch aktiv und keine Nukleinsäuren sind.

Der Ausdruck "eine zu transportierende zweite Nukleotidsequenz" bedeutet eine heterologe oder homologe, rekombinante Nukleotidsequenz, die beispielsweise einen für mindestens ein Polypeptid und/oder ein RNA-Transkript von Interesse, z. B. für mindestens eine Antisense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereich und/oder einen oder mehrere Kontrollbereiche und/oder eine partiell oder vollständig doppelsträngige RNA (z. B. eine RNA_i beim sog. "post translational gene silencing", PTGS) umfassen kann.

Der Ausdruck "für mindestens ein Polypeptid kodierender Bereich" bedeutet, daß der entsprechende Nukleotidsequenzbereich mindestens einen offenen Leserah­ men (ORF) bzw. ein oder mehrere Exons, zwischen denen gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-translatierte Bereiche (z. B. Introns) eingefügt sind, enthält, der bzw. die für die Aminosäuresequenz, d. h. die Primärstruktur, eines Polypep­ tids kodiert bzw. kodieren. Der mindestens für ein Polypeptid kodierende Bereich kann dabei in Bezug auf die Zelle heterolog oder homolog sein. Der Ausdruck "für mindestens eine Antisense-Nukleinsäure kodierender Bereich" bedeutet, daß der entsprechende Nukleotidsequenzbereich mindestens für eine Nukleinsäure kodiert, die zur Bindung an eine Ziel-RNA befähigt ist und so deren biologische Funktion, z. B. die Translation einer mRNA inhibiert. Der Ausdruck "für minde­ stens ein Ribozym kodierender Bereich" bedeutet, daß der entsprechende Nu­ kleotidsequenzbereich mindestens für eine Nukleinsäure, kodiert, die zur Spal­ tung einer Ziel-mRNA befähigt ist und so deren Translation inhibiert. Vorzugs­ weise handelt es sich bei einem solchen Ribozym um ein Hammerhead-Ribozym.

Der Begriff "Kontrollbereich" umfaßt sämtliche bei der Genregulation, d. h. insbesondere bei der Regulation der Expression von Genen, mitwirkende Nukleo­ tidsequzenzen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancer, Operatoren, Trans­ kriptionsstartsignale und Polyadenylierungssignale.

Der Begriff "Promotor" bezeichnet einen Nukleotidsequenzabschnitt, durch den der Initiationspunkt und die Initiationshäufigkeit der Transkription (mRNA-Syn­ these) eines Gens festgelegt werden.

Der Begriff "Enhancer" bezeichnet Nukleotidsequenzabschnitte, wie sie beispiels­ weise im 5'- oder 3'-flankierenden Bereich von Genen, insbesondere solcher eukaryotischer und viraler Herkunft zu finden sind, welche die Effizienz der Transkription erhöhen. Die cis-aktiven Enhancer-Elemente können selbst über Distanzen von einigen Kilobasen ihre Wirkung entfalten. Sie funktionieren in beiden Orientierungen und sind positionsunabhängig, d. h., sie können z. B. im 5'- Bereich eines durch sie kontrollierten Gens liegen oder können auch z. B. im 3'- Bereich oder sogar beispielsweise in einem Intron lokalisiert sein.

Der Begriff "Operator" bezeichnet in der vorliegenden Erfindung einen Nukleotid­ sequenzabschnitt, an dem regulatorisch wirkende Proteine (beispielsweise Repressoren oder Aktivatoren) binden, um dadurch die Aktivitäten von beispiels­ weise angrenzenden Strukturgenen, wie z. B. des für ein Polypeptid kodierenden Bereichs, zu blockieren (negative Regulation) oder zu aktivieren (positive Regula­ tion).

Der Begriff "Transkriptions/Translationsstartsignal" umfaßt insbesondere Kon­ trollbereiche im 5'-flankierenden Bereich von für Polypeptide kodierenden Nukleo­ tidsequenzabschnitten, wie beispielsweise TATA- und CCAT-Boxen, sowie die unmittelbar im 5'-flankierenden Bereich eines Transkriptionsstarts befindlichen sog. "Kozak"-Sequenzen (M. Kozack (1991) "An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control", J. Cell Biol. 115 (4), 887-903) sowie Ribosomenbindungsstellen und IRES-Elemente (engl. "internal ribosomal entry sites").

Ein "Polyadenylierungssignal" bezeichnet Nukleotidsquenzen, die für die Addition eines Poly(A)-Schwanzes an eine mRNA und zur Prozessierung des 3'-Endes der mRNA benötigt werden. Die Polyadenylierungssignale für die Addition eines poly(A)-Schwanzes an mRNA-Moleküle von Säugern enthalten beispielsweise zwei Elemente: Die AAUAAA-Sequenz 20 bis 30 Nukleiotide vor und einen diffusen GU-reichen Abschnitt direkt nach dem 3'-Ende des für die mRNA kodierenden Nukleotidsequenzabschnitts.

Der Begriff "biologisch aktive Komponente" umfaßt alle biologisch aktiven Strukturen, die aus einzelnen oder mehreren Molekülen sämtlicher Substanz­ klassen mit biologischer Funktion außer den Nukleinsäuren, beispielsweise Peptide, z. B. Polypeptide, wie Proteine, Lipide, z. B. Phospholipide, Saccharide, z. B. einzelne Zucker, Oligo- und Polysaccharide aufgebaut sind. Des weiteren können solche biologisch aktiven Komponenten selbstverständlich auch Cofakto­ ren, prosthetische Gruppen, Ionen usw. enthalten.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist (sind) der (die) Kontrollbereich(e) zur Regulation der Expression des minde­ stens einen für mindestens ein Polypeptid und/oder für mindestens eine Anti­ sense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereichs befähigt. Der Ausdruck "zur Regulation der Expression befähigt" bedeutet, daß der bzw. die Kontrollbereiche die Transkription und/oder Translation des minde­ stens einen für mindestens ein Polypeptid und/oder für mindestens eine Anti­ sense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereichs in positiver und/oder negativer Weise beeinflußt bzw. beeinflussen.

Der Begriff "Zelle" umfaßt sowohl prokaryotische Zellen, wie beispiesweise Protozoen und Bakterien, z. B. E. coli, Bacillus spec. und Agrobacteriurne fa­ ciens, als auch eukaryotische Zellen, wie beispielsweise Pilze, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, Schistosaccharomyces pombe und Pichia pastoris, Pflanzenzellen, z. B. Tomatenzellen, Kartoffelzellen und Arabidopsis spec., Nematodenzellen, z. B. C. elegans, Insektenzellen, z. B. D. melanogaster und Sf9- Zellen, sowie Säugerzellen, wie beispielsweise Kulturzellen wie Zellen von Endothel-, Leber-, Muskel- und Hirnzellinien, z. B. humane Kulturzellen (z. B. HeLa, ECV 304, MCF-7, A431) oder Kulturzellen anderer Säuger (z. B. BHK, CHO, PV-1) sowie Zellen, die einem an einer krankhaften Störung leidenden Patienten, beispielsweise einem Menschen oder einem Tier, beispielsweise zur Gentherapie, entnommen wurden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der mindestens die wie vorstehend definierte Nukleinsäure enthält. Der Begriff "Vektor" bedeutet dabei ein DNA- und/oder RNA-Replikon, das zur Amplifikation und/oder Expression der Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet werden kann. Der Vektor kann jegliche wie vorstehend definierte Kontrollbereiche und/oder andere Nukeotidsequenzabschnitte im 5'- und/oder 3'- Bereich der Nukleotidsequenz, die zur Kontrolle ihrer Expression befähigt sind, enthalten. Der Vektor kann zusätzlich weitere Nukleotidsequenzen, die für Aminosäuresequenzen kodieren, die zur Detektion und/oder Reinigung von Proteinen, beipielsweise eines Polypeptids, das von der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz kodiert wird, geeignet sind, im 5'- und/oder 3'-Bereich der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz enthalten. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Vektor weitere Elemente, welche die stabile Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die wie vorstehend definiert beispielsweise für mindestens ein Polypeptid und/oder mindestens eine Antisense-Nukleinsäure und/oder mindestens ein Ribozym kodieren kann, in das Genom eines Wirts­ organismus und/oder die transiente Expression der erfindungsgemäßen Nukleo­ tidsequenz ermöglichen. Ferner enthält der erfindungsgemäße Vektor vorzugs­ weise Selektionsgene, wie beispielsweise ein oder mehrere Antibiotikaresi­ stenzgene, welche die einfache Selektion mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformierter Zeilen ermöglichen. Die hierfür notwendigen Arbeitsschritte sind einem Fachmann bekannt.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen Wirts­ organismus, der mindestens die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor enthält. Der Begriff "Wirtsorganismus" umfaßt sowohl Pilze, Pflanzen, Tiere und Menschen, als auch Teile dieser, insbesondere deren Zellen, wie beispielsweise die vorstehend angebenen eukaryotischen und prokaryotischen Zellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des erfindungsgemäßen Vektors, umfassend die Schritte:

• a) Züchten des erfindungsgemäßen Wirtsorganismus in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen und
• b) Isolieren des gewünschten Produkts aus dem Medium und/oder dem Wirtsorganismus.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine die Aufnahme einer Nukleinsäure in eine Zelle bewirkende Signalsequenz enthält, umfassend die Schritte:

• a) Isolieren einer Nukleinsäure, die von Zellen selektiv aus einer Vielzahl von Nukleinsäuren aufgenommen wird, wobei die Vielzahl der Nukleinsäuren Nukleotidsequenzen aufweisen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden, und
• b) Bestimmen der Nukleotidsequenz der in Schritt (a) isolierten Nukleinsäure.

Der Begriff "Vielzahl von Nukleinsäuren" umfaßt endogen exprimierte, halbsyn­ thetische, synthetische oder chemische modifizierte Nukleinsäuremoleküle, die Nukleotidsequenzen aufweisen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden. Beispielsweise können die Nukleotidsequenzen der Vielzahl von Nukleinsäuren einen variablen Teil, der sich von den variablen Teilen der Nukleo­ tidsequenzen der anderen Nukleinsäuren unterscheidet und einen invariablen Teil, der in jeder Vielzahl von Nukleinsäuren im wesentlichen identisch ist und bei­ spielsweise als Bindungsstelle von PCR-Primern dienen kann, umfassen. Wie vorstehend definiert, ist die Herkunft der Nukleotidsequenzen der Vielzahl der Nukleinsäuren in keiner Weise begrenzt. Die Nukleotidsequenzen der Vielzahl von Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch synthetisiert sein, und/oder von dem Genom jeglicher biologischer Systeme, die genetische Information enthal­ ten, stammen. Der Ausdruck "biologische System, die genetische Information enthalten" umfaßt dabei sowohl prokaryotische und eukaryotische Zellen als auch biologische Systeme, die sich nicht selbständig replizieren können, wie Bakteriophagen, Viren und Viroide. So kann die Vielzahl der Nukleinsäuren beispielsweise von einer representativen Bibliothek, wie beispielsweise einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek, des Genoms eines solchen biologischen Systems stammen.

Ein Beispiel einer Vielzahl von Nukleinsäuren umfaßt einen DNA-Pool mit DNA- Spezies, die beispielsweise eine Länge von 15 bis mehreren tausend Basenpaa­ ren aufweisen, wobei der randomisierte Anteil, d. h. der variable Teil der Nukleo­ tidsequenzen der DNA-Spezies, beispielsweise 5 bis 150 Basenpaare umfaßt und beidseitig terminale Primersequenzen, beispielsweise von 5 bis 40 Basenpaare Länge, angefügt sind.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Zellen können, wie vorstehend definiert, sämtliche eukaryotische und prokaryotische Zellen sein. Bevorzugte Zellen sind Säugerzellinien, wie beispielsweise BHK, Hela und ECV 304.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des vorstehend definierten Verfah­ rens umfaßt das Isolieren der Nukleinsäure

• a) das Inkontaktbringen der Zellen für einen geeigneten Zeitraum, beispiels­ weise von 1 min bis 48 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, mit der Vielzahl von Nukleinsäuren, beispielsweise einem DNA-Pool mit einer ausreichenden Komplexität und in einer ausreichenden Menge, beispiels­ weise 1 ng bis 10 µg pro 10⁷ Zellen, wobei die Zellen selektiv Nukleinsäu­ ren aus der Vielzahl von Nukleinsäuren aufnehmen,
• b) das Isolieren der Nukleinsäure-haltigen Bestandteile der Zellen, (iii) das Detektieren der von den Zellen selektiv aus der Vielzahl der Nuklein­ säuren aufgenommenen Nukleinsäuren in den Nukleinsäure-haltigen Be­ standteilen der Zellen von (ii), und
• c) das Isolieren der im Schritt (iii) detektierten, selektiv von den Zellen aufge­ nommenen Nukleinsäuren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das vorstehend definierte Verfahren weiter

• a) das Wiederholen der Schritte (i) bis (iv), bis sich der Anteil der aus der Vielzahl von Nukleinsäuren selektiv aufgenommenen Nukleinsäuren an den Nukleinsäure-haltigen Bestandteilen der Zellen nicht mehr ändert, wobei jeweils im Schritt (i) die im Schritt (iv) isolierten Nukleinsäuren mit den Zellen in Kontakt gebracht werden.

Vorzugsweise umfaßt das Detektieren der von den Zellen selektiv aufgenomme­ nen Nukleinsäuren im Schritt (iii) gleichzeitig die Amplifikation dieser Nukleinsäu­ ren, beispielsweise mittels Amplifikation in lebenden Zellen, z. B. E. coli, oder mittels einer PCR, vorzugsweise einer präparativen PCR. Dabei werden bei der PCR Primer eingesetzt, die beispielsweise an die terminalen Primersequenzen der wie vorstehend definierten DNA-Spezies im DNA-Pool binden. Ferner umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform weiter ein oder mehrere Waschschritte, beispielsweise nach dem Schritt des Inkontakt­ bringens der Zellen mit der Vielzahl von Nukleinsäuren im Schritt (i).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Ein­ schleusung von Nukleinsäuren in Zellen, umfassend die wie vorstehend definierte Nukleinsäure und/oder den wie vorstehend definierten Vektor und/oder den wie vorstehend definierten Wirtsorganismus.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel, enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder den erfindungsgemäßen Vektor und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff und/oder ein Verdünnungsmittel.

Die vorliegende Erfindung beschreibt somit ein neuartiges System zur Einschleu­ sung von Nukleinsäuren, beispielsweise rekombinanter DNA oder einzelsträngiger Nukleinsäuren, in Zellen, wie beispielsweise menschliche Zellen, über neuartige cis-Elemente, beispielsweise DNA-cis-Elemente, welche die Transportfunktion von bisher benutzten viralen Komponenten oder nicht-viralen Vektoren ersetzen können. Solche DNA-cis-Elemente können beispielsweise "nackte", doppel­ strängige oder partiell oder vollständig einzelsträngige DNA in Säugerzellen einschleusen und stellen daher konzeptionell den einfachsten denkbaren Nu­ kleinsäure- bzw. DNA-Transfer in Zellen dar. Damit kann die aufwendige Kom­ plexierung rekombinanter DNA über virale oder nicht-virale Vektorkomponenten in der Biomedizin substantiell unterstützt oder ersetzt werden. Es ist ebenfalls möglich, daß rekombinante Gene von Interesse in der molekularen Medizin, wie beispielsweise solcher in der Gentherapie, mit zusätzlichen erfindungsgemäßen DNA-Transportelementen versehen werden und so direkt einsetzbar sind, was eine drastische Vereinfachung von Protokollen in der somatischen Gentherapie zur Folgen hat.

Daher betrifft eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder des erfindungsgemäßen Vektors oder des erfindungsgemäßen Wirtsorganismus zur Herstellung eines gentherapeutischen Arzneimittels. Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder der erfindungsgemäße Vektor oder der erfindungsgemäße Wirtsorganismus zur gentherapeutischen Behandlung von Patienten, die an Krankheiten bzw. krankhaften Störungen leiden, die mit Hilfe der Gentherapie behandelt werden können, verwendet werden.

Die zelluläre Aufnahme rekombinanter Nukleinsäuren über die erfindungsgemä­ ßen Nukleotidsequenzen, die Teil der einzuschleusenden Nukleinsäuren selbst sind, bedeutet sowohl in technischer als auch in biologischer Sicht eine massive Vereinfachung gegenüber gegenwärtigen Verfahren. Auch in der biomedizi­ nischen und molekularbiologischen Forschung bedeutet daher die zelluläre Aufnahmer "nackter" Plasmid-DNA eine deutliche und nachhaltige Verbesserung des gegenwärtigen Standes der Technik.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Selek­ tionsprotokolls zur Identifizierung von zellulären DNA-Importsigna­ len.

Das folgende Beispiel erläutert die vorliegende Erfindung näher, ohne sie ein­ zuschränken.

BEISPIEL Selektionsverfahren zur Identifizierung von DNA-Transportsignalsequenzen

In der Fig. 1 ist das Selektionsprotokoll zur Identifizierung von DNA-Signalse­ quenzen, welche die Aufnahme von DNA in Kulturzellen bewirken, gezeigt. Es wurden 10 µg eines DNA-Pools mit Zellen der Säugerzellinie BHK in Kontakt gebracht. Die Länge der DNA-Spezies betrug 146 Basenpaare, umfassend einen randomisierten Anteil mit 100 Basenpaaren und terminale Primersequenzen mit je 23 Basenpaaren. Die Komplexität des DNA-Pools betrug 10¹³ unterschiedliche DNA-Moleküle bzw. Spezies. Die BHK-Zellen (ca. 10⁷ Zellen) wurden mit dem DNA-Pool für 24 Stunden inkubiert. Nach dem ausgiebigen Waschen folgte die Isolierung der Nukleinsäure-haltigen Bestandteile der Zellen (intrazelluläre Frak­ tion). Dieses Isolat diente sodann als Matrize für eine präparative PCR mit Hilfe von Primern, die an die terminalen Primersequenzen der eingesetzen DNA-Spe­ zies bindeten. Im nächsten Selektionsschritt wurden die mit Hilfe der präparati­ ven PCR erhaltenen und danach isolierten Amplifikate wieder mit BHK-Zellen inkubiert. Nach fünf solcher Selektionstypen mit den BHK-Zellen wurde die Aufnahme von DNA-Spezies aus dem DNA-Pool bereits um einen Faktor von 10 bis 100 gesteigert. Wird nach diesem Selektionsschema der Punkt erreicht, an dem auch nach weiteren Selektionsrunden keine weitere Verbesserung der zellulären DNA-Aufnahme erfolgt, werden die selektierten DNA-Spezies kloniert und strukturell sowie funktionell charakterisiert.

Claims (18)

1. Nukleinsäure, enthaltend eine erste Nukleotidsequenz mit mindestens einer Signalsequenz, welche die Aufnahme der Nukleinsäure in eine Zelle be­ wirkt.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleotidsequenz weiter minde­ stens eine zu transportierende zweite Nukleotidsequenz und/oder eine oder mehrere mit der ersten und/oder zweiten Nukleotidsequenz kovalent verknüpfte und/oder komplexierte Komponenten enthält, die biologisch aktiv und keine Nukleinsäuren sind.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei die zu transportierende zweite Nukleotidsequenz einen für mindestens ein Polypeptid und/oder für minde­ stens eine Antisense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereich und/oder einen oder mehrere Kontrollbereiche umfaßt.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 3, wobei der (die) Kontrollbereich(e) einen Promotor und/oder einen Enhancer und/oder einen Operator und/oder ein Transkriptions/Translationsstartsignal und/oder ein Polyadenylierungssignal umfaßt (umfassen).

5. Nukleinsäure nach Anspruch 3 oder 4, wobei der (die) Kontrollbereich(e) zur Regulation der Expression des mindestens eine für mindestens ein Polypeptid und/oder für mindestens eine Antisense-Nukleinsäure und/oder für mindestens ein Ribozym kodierenden Bereichs befähigt ist (sind).

6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.

7. Vektor, der mindestens die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

8. Wirtsorganismus, der mindestens die Nukleinsäure nach einem der An­ sprüche 1 bis 6 oder den Vektor nach Anspruch 7 enthält.

9. Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Vektors nach Anspruch 7, umfassend die Schritte:

• a) Züchten des Wirtsorganismus nach Anspruch 8 in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen und
• b) Isolieren des gewünschten Produkts aus dem Medium und/oder dem Wirtsorganismus.

10. Verfahren zur Identifizierung einer Nukleotidsequenz, die mindestens eine die Aufnahme einer Nukleinsäure in eine Zelle bewirkende Signalsequenz enthält, umfassend die Schritte:

• a) Isolieren einer Nukleinsäure, die von Zellen selektiv aus einer Vielzahl von Nukleinsäuren aufgenommen wird, wobei die Vielzahl der Nu­ kleinsäuren Nukleotidsequenzen aufweisen, die sich mindestens teilweise voneinander unterscheiden, und
• b) Bestimmen der Nukleotidsequenz der in Schritt (a) isolierten Nu­ kleinsäure.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das isolieren der Nukleinsäure

• a) das Inkontaktbringen der Zellen für einen geeigneten Zeitraum mit der Vielzahl von Nukleinsäuren, wobei die Zellen selektiv Nukleinsäu­ ren aus der Vielzahl von Nukleinsäuren aufnehmen,
• b) das Isolieren der Nukleinsäure-haltigen Bestandteile der Zellen,
• c) das Detektieren der von den Zellen selektiv aus der Vielzahl der Nukleinsäuren aufgenommenen Nukleinsäuren in den Nukleinsäure­ haltigen Bestandteilen der Zellen von (ii), und
• d) das Isolieren der im Schritt (iii) detektierten, selektiv von den Zellen aufgenommenen Nukleinsäuren umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das weiter

• a) das Wiederholen der Schritte (i) bis (iv), bis sich der Anteil der aus der Vielzahl von Nukleinsäuren selektiv aufgenommenen Nukleinsäu­ ren an den Nukleinsäure-haltigen Bestandteilen der Zellen nicht mehr ändert, wobei jeweils im Schritt (i) die im Schritt (iv) isolierten Nu­ kleinsäuren mit den Zellen in Kontakt gebracht werden, umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Detektieren gleichzeitig die Amplifikation der Nukleinsäuren umfaßt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Detektieren eine PCR umfaßt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das weiter ein oder mehrere Waschschritte umfaßt.

16. Kit zur Einschleusung von Nukleinsäuren in Zeilen, umfassend die Nu­ kleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und/oder den Vektor nach Anspruch 7 und/oder den Wirtsorganismus nach Anspruch 8.

17. Arzneimittel, enthaltend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder den Vektor nach Anspruch 7 und gegebenenfalls einen pharmazeu­ tisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff und/oder ein Verdünnungs­ mittel.

18. Verwendung der Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Vektors nach Anspruch 7 oder des Wirtsorganismus nach Anspruch 8 zur Herstellung eines gentherapeutischen Arzneimittels.