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DE19929365A1 - Teilsequenzen der Gene des Primär- und Sekundärmetabolismus aus Corynebacterium glutamicum und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Primär- und Sekundärmetaboliten - Google Patents

Teilsequenzen der Gene des Primär- und Sekundärmetabolismus aus Corynebacterium glutamicum und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Primär- und Sekundärmetaboliten

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DE19929365A1
DE19929365A1 DE1999129365 DE19929365A DE19929365A1 DE 19929365 A1 DE19929365 A1 DE 19929365A1 DE 1999129365 DE1999129365 DE 1999129365 DE 19929365 A DE19929365 A DE 19929365A DE 19929365 A1 DE19929365 A1 DE 19929365A1
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DE
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seq
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amino
corynebacterium glutamicum
production
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DE1999129365
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Matthias Mack
Karin Herbster
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Sygnis Pharma AG
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BASF Lynx Bioscience AG
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Publication date
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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Abstract

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit Herstellungsverfahren für Primär- und Sekundärmetabolite mit Hilfe gentechnisch veränderter Organismen.

Description

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit den Herstellungsverfah­ ren für Primär- und Sekundärmetabolite mit Hilfe eines gentech­ nisch veränderten Organismus. Diese Erfindung besteht in Teil­ sequenzen von Genen, die anabolische und katabolische Enzyme aus Corynebacterium glutamicum kodieren, und aus ihrem Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Metaboliten.
Die Konzentrationen der Metabolite sind in lebenden Zellen ge­ wöhnlich gut ausbalanciert und überschreiten nicht eine gewisse Grenze. Unter manchen Wachstumsbedingungen oder als Folge einer gentechnischen Veränderung können sie allerdings im Überschuß gebildet und in das Kulturmedium ausgeschieden werden. Für das Zellwachstum kann man relativ billige Stoffe als Kohlenstoff­ quelle verwenden. Mit Hilfe des biochemischen Potentials der Zellen (in den meisten Fällen mikrobiellen Ursprungs) oder der Enzyme lassen sich diese preiswerten Stoffe in ein breites Spektrum wertvollerer Substanzen umwandeln. Zur fermentativen Herstellung von Metaboliten zu Verkaufszwecken setzt man ins­ besondere Mikroorganismen ein. Mikroorganismen lassen sich durch gentechnische Veränderung der Biosynthesewege in ihrer Biosynthe­ seleistung auf bestimmte Metabolite hin optimieren, und man erzielt dadurch höhere Syntheseleistungen. Gentechnische Verände­ rung meint hier, daß die Anzahl der Kopien oder die Geschwindig­ keit der Transkription bestimmter Gene für bestimmte Synthesewege erhöht ist. Allerdings muß man die geeigneten Zielgene für diese Verbesserung zuerst identifizieren. Wir beschreiben nun im fol­ genden die Zielgene und Teilsequenzen davon, die durch Klonen der DNA und anschließende Sequenzierung mit dem Ziel der Stammverbes­ serung identifiziert wurden.
Ein Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 1 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 1 durch Substitution, Inser­ tion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 2 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 2 durch Substitution, In­ sertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 3 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 3 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 4 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 4 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 5 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 5 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 6 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 6 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 7 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 7 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 8 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 8 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 9 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 9 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 10 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 10 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in einem Genfragment mit einer Nucleotidsequenz, die in der SEQ ID NR. 11 beschrieben ist oder sich von dieser Sequenz SEQ ID NR. 11 durch Substitution, Insertion oder Deletion von bis zu 20% der Nucleotide ableitet.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht im Einsatz der Nucleotid­ sequenz SEQ ID NR. 1 oder SEQ ID NR. 2 oder SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 5 oder SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 7 oder SEQ ID NR. 8 oder SEQ ID NR. 9 oder SEQ ID NR. 10 oder SEQ ID NR. 11 zur Konstruktion genetisch modifizierter Mikroorga­ nismen.
Die vollständigen Gene lassen sich mit Hilfe konventioneller Techniken wie Hybridisierung herstellen, wobei man von den oben offenbarten Genfragmenten ausgeht. Diese Gene lassen sich einset­ zen zur Konstruktion rekombinater Wirtsorganismen, die die Bio­ synthese wertvoller Bioprodukte, wie Aminosäuren, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Vitamine und Kofaktoren ermöglichen. Die biologi­ sche Aktivität dieser Gene wird im experimentellen Teil dieser Beschreibung offenbart. Mit Hilfe dieser Gene wird es möglich, Engpässe bei der Biosynthese von Bioprodukten zu umgehen und so die Syntheseleistung mikrobieller Systeme zu steigern.
Ein weiterer Gesichtspunkt dieser Erfindung besteht in einem Expressions-Vektor mit zumindest einem der oben erwähnten Poly­ nucleotide. Der Expressions-Vektor verbindet funktionell eines oder mehrere dieser Polynucleotide mit regulatorischen Einheiten wie Promotoren, Terminatoren, ribosomale Bindungsstellen und der­ gleichen. Gewöhnlich gehören zu einem Expressions-Vektor weitere Einheiten wie Genmarker und Replikationsabschnitte.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung besteht in der mit einem Expressions-Vektor transformierten Wirtszelle.
Zur gentechnischen Veränderung kann man jeden beliebigen proka­ ryontischen Mikroorganismus verwenden, vorzugsweise Corynebacte­ rium- und Bacillus-Arten, aber auch jeden beliebigen eukaryonti­ schen Mikroorganismus, vorzugsweise Hefestämme der Gattung Ashbya, Candida, Pichia, Saccharomyces und Hansenula.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung besteht in einer Methode zur Herstellung und Reinigung eines Polypeptids, die in folgenden Schritten besteht:
  • a) Kultivierung der Wirtszelle aus Anspruch 3 unter Bedingungen, die für die Expression des Peptids geeignet sind; und
  • b) Gewinnung des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung detaillierter be­ schrieben.
Beispiel 1 Herstellung einer Genombibliothek von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Die DNA aus dem Genom von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 läßt sich nach Standardmethoden gewinnen, die z. B. von Altenbuch­ ner, J. und Cullum, J. (1984, Mol. Gen. Genet. 195 : 134-138) be­ schrieben sind. Die Genom-Bibliothek läßt sich daraus mit jedem beliebigen Klonierungsvektor, z. B. pBluescript II KS-(Strata­ gene) oder ZAP ExpressTM (Stratagene), nach Standardvorschriften gewinnen (z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Jede beliebige Fragmentgröße kann man dabei verwenden, vorzugsweise Sau3AI-Fragmente mit einer Länge von 1 kb, die sich in Klonie­ rungsvektoren mit verdautem BamHI einbinden lassen.
Beispiel 2 Analyse der Nucleinsäuresequenzen der Genombibliothek
Aus der im Beispiel 1 hergestellten Genombibliothek kann man ein­ zelne E, coli-Klone auswählen. E. coli-Zellen werden nach Standardmethoden in geeigneten Medien kultiviert (z. B. LB ergänzt mit 100 mg/l Ampicillin), und danach läßt sich dann die Plasmid- DNA isolieren. Klont man Genomfragmente aus der DNA von Coryne­ bacterium glutamicum in pBluescript II KS- (siehe Beispiel 1), läßt sich die DNA mit Hilfe der Oligonucleotide 5'- AATTAAC- CCTCACTAAAGGG-3' und 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' sequenzieren.
Beispiel 3 Computeranalyse der isolierten Nucleinsäuresequenzen
Die Nucleotidsequenzen lassen sich z. B. mit Hilfe des BLASTX-A1- gorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-410) aneinanderfügen. Auf diesem Weg kann man neuartige Sequenzen ent­ decken und die Funktion dieser neuartigen Gene aufklären.
Beispiel 4 Identifizierung eines E, coli-Klons mit einem Genfragment für die Fettsäuresynthase (2.3.1.85)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 1 beschrieben ist. Bei der Anwen­ dung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Sequenz Ähnlichkeit mit Fettsäuresynthasen aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit einem Fragment mit 519 Basenpaaren für die Fettsäuresynthase aus Corynebacterium ammo­ niagenes gegeben (NRDB Q04846; 68% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 5 Identifizierung eines E. coli-Klons mit dem Gen für die Phytoen- Dehydrogenase (EC 1.3.-.-)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 2 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Phytoen-Dehydrogenasen aus verschiedenen Organis­ men. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit der Phytoen-Dehydro­ genase aus Methanobacterium thermoautotrophicum (NRDB 027835; 37% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 6 Identifizierung eines E. coli-Klons mit dem Gen für die Alkohol- Dehydrogenase (EC 1.1.1.1)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 3 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Alkohol-Dehydrogenasen aus verschiedenen Organis­ men. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit der Alkohol-Dehydroge­ nase aus Bacillus stearothermophilus (NRDB P42327; 50% überein­ stimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 7 Identifizierung eines E. coli-Klons mit einem Genfragment für ein Homologes der Adenosylmethionin-8-Amino-7-oxononanoat-Aminotrans­ ferase (EC 2.6.1.62)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 4 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Adenosylmethionin-8-Amino-7-oxononanoat-Amino­ transferasen aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 342 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Adenosylmethionin-8-amino-7-oxononanoat-Aminotransferase aus Erwinia herbicola (NRDB P53656; 40% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 8 Identifizierung eines E. coli-Klons mit einem Genfragment für ein Homologes der Phosphoglycerat-Mutase 2 (EC 5.4.2.1)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 5 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Phosphoglycerat-Mutasen 2 aus verschiedenen Orga­ nismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 204 Ba­ senpaaren bestehenden Fragment für die Phosphoglycerat-Mutase 2 aus Mycobacterium tuberculosis (NRDB P71724; 54% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 9 Identifizierung eines E. coli-Klons mit einem Genfragment für die Xylulose-Kinase (EC 2.7.1.17)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 6 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Xylulose-Kinasen aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 633 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Xylulose-Kinase aus Streptomyces rubiginosus (NRDB P27156; 48% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 10 Identifizierung eines E. coli-Klons mit einem Genfragment für eine Fettsäure-CoA-Ligase für langkettige Fettsäuren (EC 6.2.1.3)
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 7 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Fettsäure-CoA-Ligasen für langkettige Fettsäuren aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 369 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Fett­ säure-CoA-Ligase für langkettige Fettsäuren aus Archaeoglobus fulgidus (NRDB 030302; 48% Übereinstimmung auf der Stufe der Ami­ nosäuren).
Beispiel 11 Identifizierung eines E. coli-Klons mit einem Genfragment für die Guanosinpentaphophat-Synthetase
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 8 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit Guanosinpentaphophat-Synthetasen aus verschiede­ nen Organismen. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 606 Basenpaaren bestehenden Fragment für die Guanosinpentapho­ phate-Synthetase aus Streptomyces coelicolor (NRDB 086656; 70% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 12 Identifizierung eines E. coli-Klons mit einem Genfragment für ein NTRB-Homologes
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 9 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit NTRB-Homologen aus verschiedenen Organismen. NTRB ist ein Regulatorgen für die Tanskription, das an der Regulierung der Stickstoffassimilation beteiligt ist. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 645 Basenpaaren bestehenden Fragment für NTRB aus Mycobacterium leprae (NRDB Q50049; 61% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 13 Identifizierung eines E. coli-Klons, der ein nifS-Homologes ent­ hält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 10 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit nifS aus verschiedenen Organismen. NifS ist an der Stickstoffixierung beteiligt. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 594 Basenpaaren bestehenden Fragment für nifs aus Mycobacterium leprae (NRDB Q49690; 62% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 14 Identifizierung eines E. coli-Klons, der ein nifU-Homologes ent­ hält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde und an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, fand sich eine Sequenz, die als SEQ ID NR. 11 beschrieben ist. Bei der Anwendung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) zeigte diese Sequenz Ähnlichkeit mit nifU aus verschiedenen Organismen. NifU ist an der Stickstoffixierung beteiligt. Die größte Ähnlichkeit ergab sich mit einem aus 339 Basenpaaren bestehenden Fragment für nifU aus Mycobacterium leprae (NRDB Q49683; 61% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Sequenzliste

Claims (4)

1. Ein gereinigtes Polynucleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5, SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 7, SEQ ID NR. 8, SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 11.
2. Ein Expressions-Vektor mit einem dem Anspruch 1 entsprechen­ den Polynucleotid.
3. Eine Wirtszelle, die mit dem Expressions-Vektor aus Anspruch 2 transformiert ist.
4. Eine Methode zur Herstellung und Reinigung eines Polypeptids, die aus folgenden Schritten besteht:
  • a) Kultivierung der Wirtszelle aus Anspruch 3 unter Bedin­ gungen, die für die Expression des Peptids geeignet sind; und
  • b) Gewinnung des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
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