DE19918636A1 - Luminescent detection of antigens comprises immobilizing the antigens and contacting them with antibodies and enzymes to cause luminescence - Google Patents
Luminescent detection of antigens comprises immobilizing the antigens and contacting them with antibodies and enzymes to cause luminescenceInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum lumineszenten Nachweis von Antigenen.The invention relates to a method for the luminescent detection of Antigens.
Bekanntlich stellt die Bestimmung von Substanzen, die bei biologischen Prozessen eine Rolle spielen, die biologisch wirksam sind, die bei biolo gischen Prozessen auftreten usw. ein großes Problem dar. So ist bei spielsweise auf dem immunologischen Gebiet die Bestimmung von Anti genen, Haptenen oder Antikörpern äußerst wichtig.As is known, the determination of substances in biological Processes that are biologically effective play a role at biolo processes, etc. is a major problem for example in the immunological field the determination of anti genes, haptens or antibodies are extremely important.
Bereits vor einigen Jahrzehnten sind die ersten Radio-Immuno-Assays entwickelt worden, um die geschilderten Substanzen bestimmen zu kön nen. Später wurden dann sogenannte Enzym-Immuno-Assays entwic kelt, bei denen Enzyme als Marker dienen. Dabei koppelt man die En zyme mit einem Liganden zu einem Ligand-Enzym-Konjugat. Bei diesem Liganden kann es sich um eine der oben aufgeführten Substanzen und somit um einen Antikörper, ein Antigen oder ein Hapten handeln.The first radio immunoassays were made a few decades ago has been developed to determine the substances described nen. So-called enzyme immunoassays were later developed where enzymes serve as markers. Here you couple the En zyme with a ligand to form a ligand-enzyme conjugate. With this Ligands can be one of the substances listed above thus be an antibody, an antigen or a hapten.
In diesen Immuno-Assays setzt man beispielsweise einen mit einem En zym markierten Antikörper mit seinem biochemischen "Gegenstück" (im vorliegenden Fall ein Antigen) um, wobei sich der Ligand zusammen mit dem Enzym an das Antigen anlagert.In these immunoassays, for example, one is set with an en zym labeled antibody with its biochemical "counterpart" (im an antigen) in this case, the ligand coexisting with the enzyme attaches to the antigen.
Zur Detektion der Antigen-Ligand-Enzym-Konjugate läßt man diese dann mit einem Substrat reagieren. Die Enzyme setzen aus dem Substrat ein Reaktionsprodukt frei, das man analytisch bestimmen kann. Dabei nutzt man somit den Verstärkungseffekt über den Substratumsatz der Enzyme pro Zeiteinheit aus. Man kann dadurch die Menge des gebildeten Reak tionsproduktes und somit auch die Menge an gebundenen, mit einem Enzym markierten Liganden qualitativ oder quantitativ bestimmen.These are then left to detect the antigen-ligand-enzyme conjugates react with a substrate. The enzymes set in from the substrate Free reaction product that can be determined analytically. It uses thus the amplification effect via the substrate turnover of the enzymes per unit of time. You can measure the amount of reak formed tion product and thus also the amount of bound, with a Determine enzyme-labeled ligands qualitatively or quantitatively.
Als besonders empfindliche Verfahren haben sich in der letzten Zeit so genannte lumineszente Verfahren herausgestellt, welche sich beispiels weise der Biolumineszenz oder Chemolumineszenz bedienen. Als be sonders vorteilhafte Substrate zur Detektion von mit Enzymen markier ten Liganden haben sich dabei Luciferin-Derivate herausgestellt, die beispielsweise beschrieben sind in der EP 0 243 429 A1, auf die aus drücklich Bezug genommen wird, wobei auch auf die dort aufgeführten Literaturstellen verwiesen wird.Recently, this has proven to be a particularly sensitive process called luminescent methods highlighted, which are for example use the bioluminescence or chemiluminescence. As be particularly advantageous substrates for the detection of labeled with enzymes ten ligands have been found to be luciferin derivatives are described, for example, in EP 0 243 429 A1, to which reference is made is expressly referred to, including those listed there References are referenced.
Die bisher beschriebenen Verfahren leiden jedoch darunter, daß sie häufig nur mit aufwendigen Apparaturen im Laboratorium und somit nicht "vor Ort" durchgeführt werden können oder daß ihre Handhabung insgesamt schwierig ist.However, the methods described so far suffer from the fact that they often only with complex equipment in the laboratory and thus cannot be done "on site" or that their handling is difficult overall.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein einfach durchzu führendes lumineszentes Verfahren zum qualitativen und/oder quantita tiven Nachweis von Antigenen bereitzustellen. Gelöst wird diese Aufga be durch die Lehre der Ansprüche.The object of the present invention is therefore to carry out a simple leading luminescent process for qualitative and / or quantitative to provide tive detection of antigens. This problem is solved be through the teaching of claims.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Teststreifen zum Ein satz gebracht, wie er häufig auch schon für andere Testverfahren ver wendet wird. Dieser Teststreifen weist eine Haftfläche für das zu be stimmende Antigen auf und kann auf einfache Weise gehandhabt wer den.In the method according to the invention, a test strip is used brought set, as he often ver for other test procedures is applied. This test strip has an adhesive surface for it tuning antigen and can be handled easily the.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Antigen in Stufe a) auf die Haftfläche dieses Teststreifens aufgebracht, vorzugsweise dadurch, daß das oder die zu untersuchende(n) Antigen(e) von einer Oberfläche mittels des Teststreifens "abgeklatscht" werden, indem der Teststreifen mit seiner Haftfläche mit demjenigen Ort, an dem sich das zu bestim mende Antigen befindet, in Kontakt gebracht und dieser Ort damit über strichen wird. Mit anderen Worten, die auf der Oberfläche befindlichen Antigene werden durch Überstreichen dieser Oberfläche mit der Haftflä che des Teststreifens auf letzteren übertragen und haften dort auf der Haftfläche fest. Die Teststreifen können danach sofort zur Untersuchung weiterverwendet werden. Die Art der Oberfläche, auf der sich die Anti gene befinden und von der sie quasi abgenommen werden, kann dabei beliebiger Natur und unterschiedlichster Ausgestaltung sein. Als Bei spiele für eine derartige Oberfläche kann man eine humane Schleimhaut oder eine kontaminierte Stelle auf einer Gerätschaft nennen, unn nur ei nige mögliche Varianten aufzuzählen.In the method according to the invention, the antigen in step a) is the adhesive surface of this test strip is applied, preferably by that the antigen (s) to be examined is from a surface can be "clipped" by means of the test strip by the test strip with its adhesive surface with the place where this is to be determined antigen is brought into contact with this place will be deleted. In other words, those on the surface Antigens are removed by painting over this surface with the adhesive surface surface of the test strip is transferred to the latter and adheres there to the Adhesive surface firmly. The test strips can then be examined immediately continue to be used. The type of surface on which the anti genes and from which they are virtually removed, can of any nature and in a wide variety of configurations. As with A human mucous membrane can play for such a surface or name a contaminated spot on a piece of equipment enumerate a few possible variants.
Bei der Probennahme aus festen Materialien erfolgt vor der Durchfüh rung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Extraktion bzw. ein Auf schluß des festen Materials nach per se bekannten Verfahren und Me thoden. Zum Aufbringen des Antigens wird dann der Teststreifen ledig lich in die dabei erhaltene Lösung getaucht. Befinden sich die Antigene bereits in einem flüssigen Medium, dann ist es zur Probennahme bzw. zum Aufbringen des Antigens auf den Teststreifen lediglich erforderlich, diesen in das Medium einzutauchen oder das Medium auf die Haftfläche aufzupipetieren oder aufzutröpfeln.When sampling from solid materials, it is carried out before the execution tion of the inventive method an extraction or an Auf conclusion of the solid material by methods and per se known methods. The test strip is then single to apply the antigen Lich immersed in the resulting solution. Are the antigens already in a liquid medium, then it is for sampling or only required to apply the antigen to the test strip, immerse it in the medium or the medium on the adhesive surface to pipet up or drip on.
Man kann auch davon sprechen, daß mit dem erfindungsgemäß zum Einsatz gebrachten Teststreifen quasi ein Abstrich an dem zu untersu chenden Ort gemacht wird. Beim Überstreichen absorbiert dabei die Haftfläche das nachzuweisende Antigen.One can also speak of the fact that with the invention for Test strips used were practically a smear on the test appropriate place. When painted over, it absorbs the The antigen to be detected.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Anti gen" primär ein "richtiges Antigen". Gleichwohl steht dieser Ausdruck "Antigen" auch für die anderen eingangs erwähnten Liganden wie Anti körper und Haptene, worauf nachstehend noch näher eingegangen wird.For the purposes of the present invention, the term "anti gene "primarily a" correct antigen ". Nevertheless, this expression is there "Antigen" also for the other ligands mentioned above, such as anti body and haptens, which will be discussed in more detail below.
Der mit dem Antigen behaftete Teststreifen wird dann in Stufe b) in eine sogenannte Blockierlösung getaucht, die sich beispielsweise in einem Röhrchen befindet. Diese Blockierlösung enthält verschiedene Proteine und Detergenzien, die freie Bindungsstellen auf der Haftfläche zumin dest teilweise absättigen, damit später keine anderen Proteine oder an deren Stoffe, beispielsweise das Konjugat, unspezifisch absorbiert wer den können. Mit anderen Worten, die Blockierlösung blockiert somit die freien Bindungsstellen auf der Haftfläche des Teststreifens. The test strip with the antigen is then in step b) in a So-called blocking solution immersed, for example, in one Tube. This blocking solution contains various proteins and detergents that bind free sites on the adhesive surface least partially saturate, so that later no other proteins or whose substances, such as the conjugate, are absorbed non-specifically that can. In other words, the blocking solution thus blocks the free binding sites on the adhesive surface of the test strip.
In der Blockierlösung können sich beispielsweise Gelatine, BSA (= Rin derserum Albumin), Milchpulver, Triton X-100 (ionogener, oberflächen aktiver Stoff, der durch Reaktion des t-Octylphenols mit Ethylenoxid ent steht) und Tween 20 (Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat) und Mi schungen einer oder mehrerer dieser Substanzen befinden.For example, gelatin, BSA (= Rin derserum albumin), milk powder, Triton X-100 (ionogenic, surface active substance which ent by reaction of the t-octylphenol with ethylene oxide stands) and Tween 20 (polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate) and Mi of one or more of these substances.
Nach einer Inkubation in dieser Blockierlösung von vorzugsweise eini gen Minuten wird der Teststreifen vorzugsweise gewaschen und in Stufe c) in eine Antikörper-Enzym-Konjugat-Lösung getaucht, die sich eben falls vorzugsweise in einem Röhrchen befindet.After an incubation in this blocking solution of preferably one minutes, the test strip is preferably washed and in step c) immersed in an antibody-enzyme conjugate solution that just if preferably located in a tube.
Der Antikörper dieses Konjugates ist hierbei spezifisch für das nachzu weisende Antigen (oder für die nachzuweisenden Antigene).The antibody of this conjugate is specific for this pointing antigen (or for the antigen to be detected).
Bei dem Enzym dieses Konjugates handelt es sich um ein solches, das aus einem Substrat eine luminogene Verbindung freisetzen kann, die in einer nachfolgenden Reaktion lumineszentes Licht abgeben kann.The enzyme of this conjugate is one that can release a luminogenic compound from a substrate, which in a subsequent reaction can emit luminescent light.
In dieser Stufe c) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit das auf der Haftfläche des Teststreifens befindliche Antigen mit seinem Gegen stück, nämlich dem Antikörper, gekoppelt. Gleichzeitig wird über den Antikörper natürlich auch das Enzym mit an das Antigen gekoppelt.In step c) of the process according to the invention, this is therefore the case antigen located on the adhesive surface of the test strip with its counterpart piece, namely the antibody. At the same time, the Antibodies naturally also couple the enzyme to the antigen.
Es ist nun natürlich auch möglich, auf der Haftfläche des Teststreifens einen Antikörper oder auch ein Hapten mehr oder weniger zu immobili sieren und dann mit einem Konjugat zu verbinden, welches das Gegen stück für diejenige biologische Substanz darstellt, die auf der Haftfläche immobilisiert ist.It is of course now also possible on the adhesive surface of the test strip an antibody or a hapten more or less immobilized and then combine with a conjugate which is the opposite represents the biological substance on the adhesive surface is immobilized.
Nachdem der Teststreifen in die Konjugat-Lösung getaucht worden ist, wird vorzugsweise einige Minuten inkubiert. Dann wird der Teststreifen herausgenommen und vorzugsweise gewaschen. Danach wird der Test streifen in Stufe d) in eine Lösung getaucht, die ein Substrat für das an die Haftfläche des Teststreifens über die Antigen-Antikörper-Brücke ge koppelten Enzyms darstellt. Vorzugsweise handelt es sich dabei um ein bioluminogenes oder chemoluminogenes Substrat.After the test strip is immersed in the conjugate solution, is preferably incubated for a few minutes. Then the test strip removed and preferably washed. After that, the test Strip in stage d) dipped in a solution that is a substrate for the the adhesive area of the test strip over the antigen-antibody bridge coupled enzyme. It is preferably a bioluminogenic or chemiluminogenic substrate.
Es wird dann zweckmäßigerweise einige Minuten inkubiert. Dabei setzt das Enzym aus dem Substrat eine Verbindung frei, die lumineszentes Licht abgeben kann.It is then conveniently incubated for a few minutes. Doing so the enzyme from the substrate releases a compound that is luminescent Can emit light.
Wird ein bioluminogenes Substrat zur Anwendung gebracht, dann tropft man nach dem Entnehmen des Teststreifens einen sogenannten Detek tions-Cocktail in Stufe e) in das Röhrchen und führt dieses zur Licht messung in ein Luminometer ein. Das gemessene Licht ist ein Maß für die Menge des nachzuweisenden Antigens.If a bioluminogenic substrate is used, then drips a so-called detec after removing the test strip cocktail in step e) into the tube and leads it to the light measurement in a luminometer. The measured light is a measure of the amount of antigen to be detected.
Setzt man ein chemoluminogenes Substrat ein, dann führt man das Röhrchen nach dem Entnehmen des Teststreifens in ein Luminometer ein und verschließt lichtdicht. Danach wird ein Tropfen einer Chemolu mineszenz-Reagenz in Stufe e) in das Röhrchen getropft und das emit tierte Licht gemessen. Auch in diesem Fall ist das gemessene Licht ein Maß für die Menge des nachzuweisenden Antigens.If you use a chemiluminogenic substrate, you do it Tube after removing the test strip into a luminometer and closes light-tight. Then a drop of a chemolu minescence reagent in step e) dripped into the tube and the emit measured light. In this case too, the measured light is on Measure of the amount of antigen to be detected.
Die biolumineszente Nachweisreaktion kann man beispielsweise wie folgt durchführen, wobei man sich der Biolumineszenz des Leuchtkäfers Photinus pyralis bedient. Als bioluminogenes Substrat setzt man dabei D-Luciferin-O-phosphat ein. Bei dem Enzym des Antigen-Antikörper- Konjugates handelt es sich um alkalische Phosphatase.The bioluminescent detection reaction can be, for example, how perform following, looking at the bioluminescence of the firefly Served Photinus pyralis. The bioluminogenic substrate is used D-luciferin-O-phosphate. With the enzyme of the antigen-antibody The conjugate is alkaline phosphatase.
Setzt man nun in einem ersten Schritt das Substrat D-Luciferin-O- Phosphat mit der alkalischen Phosphatase des Antigen-Antikörper- Konjugates um, dann entsteht unter anderem D-Luciferin. Letzteres setzt man in einem zweiten Schritt in Anwesenheit von ATP und Mg2+- Ionen sowie dem Enzym Luciferase um. Bei dieser Reaktion entsteht Licht, welches in einem Luminometer nachgewiesen bzw. mengenmäßig bestimmt werden kann. If, in a first step, the substrate D-luciferin-O-phosphate is reacted with the alkaline phosphatase of the antigen-antibody conjugate, D-luciferin, among other things, is formed. The latter is implemented in a second step in the presence of ATP and Mg 2+ ions and the enzyme luciferase. This reaction produces light, which can be detected in a luminometer or quantified.
Die oben geschilderten Schritte lassen sich formelmäßig wie folgt zu
sammenfassen:
The steps outlined above can be summarized as follows:
1. Schritt: Luciferin-O-Phosphat Alkalische Phosphatase → D-Luciferin+P
Step 1: Luciferin-O-Phosphate Alkaline Phosphatase → D-Luciferin + P
2. Schritt: D-Luciferin + ATP + Mg2+ Luciferase → Licht + Oxyluciferin + AMP + PP2nd step: D-luciferin + ATP + Mg 2+ luciferase → light + oxyluciferin + AMP + PP
Diese biolumineszente Nachweisreaktion ist im übrigen schon bekannt und beispielsweise beschrieben in der eingangs genannten EP 0 243 429 A1.This bioluminescent detection reaction is already known and described for example in the above EP 0 243 429 A1.
Will man sich zum erfindungsgemäßen Nachweis des Antigens der Bio lumineszenz bedienen, dann kann man folgende Lösungen bzw. Mate rialien verwenden.If you want to the detection of the antigen of bio according to the invention Use luminescence, then you can use the following solutions or mate Use materials.
Als Blockierlösung in der Stufe b) des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man eine solche ein, die effektiv freie Bindungsstellen auf der Haftfläche des Teststreifens absättigt.As a blocking solution in stage b) of the process according to the invention you use one that effectively free binding sites on the Saturated surface of the test strip saturated.
Als Konjugat-Lösung in der Stufe c) des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man vorzugsweise eine solche ein, die 5 ng Antikörper-Enzym- Konjugat in 1 ml PBS (phosphate buffered salines) enthält. Die Lösung in Stufe c) mit dem bioluminogenen Substrat enthält 0,5 mg LuPo in 1 ml Wasser.As a conjugate solution in stage c) of the process according to the invention it is preferable to use one which contains 5 ng of antibody-enzyme Contains conjugate in 1 ml PBS (phosphate buffered salines). The solution in step c) with the bioluminogenic substrate contains 0.5 mg LuPo in 1 ml Water.
In Stufe e) des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man einen Detekti ons-Cocktail ein, der mit der freigesetzten Verbindung (hier: D-Luciferin) unter Lichtemission reagiert. Dieser Detektions-Cocktail setzt sich vor zugsweise wie folgt zusammen: 25 mmol/l Tris/Acetat-Puffer, 6,25 mmol/l MgCl2, 0,125 mmol/l EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), 0,075 mmol/l DTT (Dithiothreitol), 5 mmol/l ATP (Adenosin-5'-triphosphat) und 1 µg/ml Luciferase des Leuchtkäfers Photinus pyralis, pH = 7,75. In step e) of the method according to the invention, a detection cocktail is used which reacts with the released compound (here: D-luciferin) with light emission. This detection cocktail is preferably composed as follows: 25 mmol / l Tris / acetate buffer, 6.25 mmol / l MgCl 2 , 0.125 mmol / l EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.075 mmol / l DTT (dithiothreitol), 5 mmol / l ATP (adenosine 5'-triphosphate) and 1 µg / ml luciferase from the firefly Photinus pyralis, pH = 7.75.
Anstelle des zur Anwendung gebrachten LuPo können auch alle anderen bioluminogenen Substrate und insbesondere Luciferin-Derivate einge setzt werden.Instead of the LuPo used, everyone else can bioluminogenic substrates and in particular luciferin derivatives be set.
Bedient man sich in der Stufe e) des erfindungsgemäßen Verfahrens der
Chemolumineszenz, dann kann man die Reaktionsfolge schematisch wie
folgt zusammenfassen:
If chemiluminescence is used in stage e) of the process according to the invention, the reaction sequence can be summarized schematically as follows:
A-H Enzym → A + H + R -------→ LichtAH enzyme → A + H + R ------- → light
Dabei bedeuten: A-H = chemoluminogenes Substrat; A und H = Spalt produkte von A-H; R = freigesetzte chemolumineszente Verbindung, die Licht erzeugen kann.Mean: A-H = chemiluminogenic substrate; A and H = gap products from A-H; R = released chemiluminescent compound, the Can produce light.
Bedient man sich der Chemolumineszenz, dann kann man die gleiche Blockierlösung wie bei der oben beschriebenen Biolumineszenz einset zen. Als Konjugat-Lösung in Stufe c) verwendet man vorzugsweise 5 ng Antikörper-POD-Konjugat in 1 ml PBS (POD = Meerrettich Peroxidase). Als chemoluminogenes Substrat wird vorzugsweise 5 mg AE ( = 4-(2- Succinimidyloxycarbonyl-ethyl)phenyl-10-methyl-acridinium-9) in 1 ml Wasser eingesetzt. Zur Detektion der in Stufe d) freigesetzten Verbin dung verwendet man in Stufe e) vorzugsweise einen AE-Detektions- Cocktail mit folgender Zusammensetzung: 10 mmol/l H2O2 in 0,1 mmol/l NaOH. Das gemessene Licht ist dann ein Maß für die Menge des nach zuweisenden Antigens.If chemiluminescence is used, the same blocking solution as for the bioluminescence described above can be used. The conjugate solution in step c) is preferably 5 ng antibody-POD conjugate in 1 ml PBS (POD = horseradish peroxidase). 5 mg of AE (= 4- (2-succinimidyloxycarbonyl-ethyl) phenyl-10-methyl-acridinium-9) in 1 ml of water is preferably used as the chemiluminogenic substrate. To detect the compound released in stage d), an AE detection cocktail with the following composition is preferably used in stage e): 10 mmol / l H 2 O 2 in 0.1 mmol / l NaOH. The measured light is then a measure of the amount of antigen to be detected.
Für die Haftfläche des erfindungsgemäß eingesetzten Teststreifens kön nen alle Materialien eingesetzt werden, welche antigen-absorbierende Eigenschaften haben. Vorzugsweise werden dafür Nitrocellulosemem branen oder Nylonmembranen oder derartige Materialien eingesetzt, die auch für Mikrotiterplattenwände verwendet werden. Alle für die genann ten Zwecke geeigneten, bekannten Materialien können Anwendung fin den. For the adhesive surface of the test strip used according to the invention all materials are used which are antigen-absorbing Have properties. Nitrocellulose membranes are preferred for this Branches or nylon membranes or such materials used can also be used for microtiter plate walls. All for them Suitable, known materials can be used fin the.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend anhand eines Bei spieles näher erläutert, in der die Keimzahl von Listeria monocytogenes (LM) bestimmt wird.The method according to the invention is described below using an example game explained in more detail in the bacterial count of Listeria monocytogenes (LM) is determined.
Ein Teststreifen mit einer Nitrocellulosehaftfläche wird über eine Ober fläche/Probe gestrichen, auf der sich die LM befinden. Alternativ wird der Teststreifen mit der Nitrocellulose-Haftfläche in eine die LM enthal tende, flüssige Probe getaucht. Dabei haften die LM an der Nitrocellulo se-Haftfläche des Teststreifens an.A test strip with a nitrocellulose adhesive surface is placed over a top Painted area / sample on which the LM are located. Alternatively, will the test strip with the nitrocellulose adhesive surface in a containing the LM liquid sample immersed. The LM stick to the nitrocellulo se adhesive surface of the test strip.
Anschließend wird der Teststreifen mit der Haftfläche in ein Reagenz glas überführt, die ca. 0,5 ml Blockierlösung enthält, und dort 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zusammensetzung dieser Blockierlösung kann beispielsweise derjenigen eines Boehringer Blocking Reagent für Western Blots entsprechen wie es von Boehringer Mannheim vertrieben wird.The test strip with the adhesive surface is then placed in a reagent transferred glass, which contains about 0.5 ml of blocking solution, and there for 15 min Incubated at room temperature. The composition of this blocking solution can be, for example, that of a Boehringer Blocking Reagent for Western blots correspond to those sold by Boehringer Mannheim becomes.
Danach wird der Teststreifen mit seiner Nitrocellulose-Haftfläche in ein Reagenzglas getaucht, das 0,5 ml Anti-Listeria monocytogenes- Alkalische Phosphatase-Konjugat (und/oder β-Galactosidase-Konjugat oder ein anderes) enthält und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Konzentration kann dabei beispielsweise 10 µg/0,5 ml betragen.Then the test strip with its nitrocellulose adhesive surface is in one Test tube dipped containing 0.5 ml of anti-Listeria monocytogenes- Alkaline phosphatase conjugate (and / or β-galactosidase conjugate or another) and incubated for 5 min at room temperature. The The concentration can be, for example, 10 µg / 0.5 ml.
Der Teststreifen wird danach unter fließendem Wasser oder mit Hilfe von destilliertem Wasser gewaschen und in ein Reagenzglas getaucht, das 0,5 ml Reagenzlösung enthält (0,5 mg Luciferinphosphat/1 ml Was ser) und 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Der Teststreifen wird da nach verworfen. The test strip is then placed under running water or with the help washed by distilled water and dipped in a test tube, which contains 0.5 ml reagent solution (0.5 mg luciferin phosphate / 1 ml Was ser) and incubated for 2 min at room temperature. The test strip is there after discarded.
Von der zurückgebliebenen Lösung werden 0,1 ml zu 0,4 ml einer Cocktaillösung (41 mmol/l HEPES, 5 mmol/l MgCl2O, 2,6 mmol/l ATP, pH 7,75; enthält 1 µg Luciferase/ml Cocktail) gegeben und in einem Röhr chen-Luminometer gemessen. Das gemessene Licht ist ein Maß für die vorhandene Anzahl von LM. Auf diese Weise ist es möglich, so geringe Mengen wie 100 LM-Zellen zu bestimmen.From the remaining solution, 0.1 ml becomes 0.4 ml of a cocktail solution (41 mmol / l HEPES, 5 mmol / l MgCl 2 O, 2.6 mmol / l ATP, pH 7.75; contains 1 µg luciferase / ml Cocktail) and measured in a tube luminometer. The measured light is a measure of the existing number of LM. In this way it is possible to determine amounts as small as 100 LM cells.
Claims (9)
- a) das Antigen auf die Haftfläche eines Teststreifens aufgebracht wird,
- b) der Teststreifen mit seiner Haftfläche in eine Blockierlösung ge taucht und dort inkubiert wird, so daß diejenigen Stellen auf dem Teststreifen zumindest teilweise abgesättigt werden, die eventuell noch andere Proteine oder Stoffe absorbieren können,
- c) der Teststreifen mit seiner Haftfläche in eine Lösung getaucht wird, in der sich ein Antikörper-Enzym-Konjugat befindet, dessen Antikörper spezifisch für das zu bestimmende Antigen ist und des sen Enzym aus einem Substrat eine luminogene Verbindung frei setzen kann, die lumineszentes Licht abgeben kann, und dort unter Ankopplung des Antigens an den Antikörper inkubiert wird,
- d) der Teststreifen mit seiner Haftfläche in eine Lösung getaucht wird, die das Substrat für das Enzym enthält und inkubiert wird, so daß die luminogene Verbindung freigesetzt wird, und
- e) die freigesetzte luminogene Verbindung auf per se bekannte Weise derart umgesetzt wird, daß Licht abgegeben wird, das detek tiert wird.
- a) the antigen is applied to the adhesive surface of a test strip,
- b) the test strip with its adhesive surface is immersed in a blocking solution and incubated there, so that those areas on the test strip that can possibly still absorb other proteins or substances are at least partially saturated,
- c) the test strip with its adhesive surface is immersed in a solution in which there is an antibody-enzyme conjugate, the antibody of which is specific for the antigen to be determined and whose enzyme can release a luminogenic compound from a substrate, which luminescent light can release, and is incubated there with coupling of the antigen to the antibody,
- d) the test strip with its adhesive surface is immersed in a solution which contains the substrate for the enzyme and is incubated so that the luminogenic compound is released, and
- e) the released luminogenic compound is implemented in a manner known per se such that light is emitted which is detected.
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