DE19916610A1

DE19916610A1 - Nachweis von Antibiotikumresistenzen in Mikroorganismen

Info

Publication number: DE19916610A1
Application number: DE19916610A
Authority: DE
Inventors: Rainer Haas; Karlheinz Trebesius; Heiko Apfel
Original assignee: CREATOGEN BIOSCIENCES GmbH
Current assignee: Creatogen Ag 86156 Augsburg De
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 1999-11-25
Also published as: DE59903029D1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen in Mikroorganismen, insbesondere in Bakterien sowie zur Durchführung des Verfahrens geeignete Reagenzienkits.

Description

Den Grundstein für die Entwicklung einer rRNA-gerichteten in situ- Hybridisierung zum Nachweis von pathogenen Organismen legten Zuckerkandel und Pauling (1965), die in ihrem Artikel : "Molecules as documents of evolutionary history", zum erstenmal auf die Möglichkeit hinwiesen, durch Sequenzvergleiche von Makromolekülen die Evolution der zugehörigen Organismen zu enthüllen. Carl Woese war es dann, der dieses Konzept zur Aufstellung des ersten natürlichen Verwandtschaftssystems bei Prokaryonten benützte (Woese, 1987). Ein weiteres Ergebnis dieser Untersuchungen war, daß rRNA-Sequenzen sogenannte Signatursequenzen aufweisen, die typisch sind für bestimmte Domänen, Phyla, Familien, Gattungen und sogar einzelne Spezies. Der Nachweis dieser Signatursequenzen mit Hilfe von PCR-Primern oder Hybridisierungssonden erlaubt also die Identifikation von Bakterien auf unterschiedlichen taxonomischen Ebenen. Die natürlicherweise vorhandene, hohe Anzahl an rRNA-Molekülen in der bakteriellen Zelle (10⁴-10⁵ in schnell wachsenden Bakterien) erhöht zudem die Sensitivität der Methode und ermöglichte die Anwendung von in situ Hybridisierungstechniken mit rRNA als Zielmolekül. Mit Hilfe radioaktiv markierter Oligonukleotidsonden konnte Giovannoni et al. 1988 als erster rRNA in ganzen bakteriellen Zellen detektieren und DeLong et al. (1989) führte ein Jahr später eine solche in situ Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden durch.

In letzter Zeit ist diese Technik vor allem in der Umweltmikrobiologie häufig eingesetzt worden. Dabei standen die Lokalisation bestimmter physiologischer Gruppen (Wagner et al., 1993; Ramsing et al., 1993) und der Einfluß bestimmter Agentien auf die Populationszusammensetzung eines Ökosystems (Wagner et al., 1995) im Mittelpunkt des Interesses.

Aber auch im Bereich der Lebensmittelhygiene wurde diese Technik erfolgreich zur Detektion von Bakterien eingesetzt (Beimfohr et al., 1993). Ein weiteres Feld der Mikrobiologie, in der die rRNA-gerichtete Ganzzellhybridisierung Anwendung findet, ist die medizinischen Mikrobiologie.

So wurde H. influenzae in Rachenabstrichen von Kindern detektiert (Forsgren et al., 1994), Candida Spezies in Blutkulturen und Gewebeproben von künstlich infizierten Tieren nachgewiesen (Lischewski et al., 1996, Lischewski et al., 1997), pathogene Yersinia Spezies in Gewebeschnitten, Stuhl und Rachenproben detektiert (Trebesius et al., 1998) und Salmonella in Abstrichen ebenso erfolgreich hybridisiert (Nordentoftet al., 1997) wie Bifidobakterien in Stuhlproben (Langendijk et al., 1995).

Wie verschiedene Untersuchungen gezeigt haben, hängt die Anzahl der Ribosomen in schnellwachsenden, heterotrophen Bakterien stark von der Wachstumsrate und der physiologischen Aktivität des Organismus ab (Schaechter et al., 1958). Da die Menge an gebundener Sonde proportional zur rRNA-Menge ist, läßt sich indirekt über die hybridisierungsvermittelte Fluoreszenz auch der Wachstumszustand einer Zelle ermitteln (DeLong et al., 1989).

Betrachtet man den Translationsapparat eukaryotischen und bakteriellen Zellen, so ergeben sich erhebliche Unterschiede in Funktion und Aufbau der einzelnen Komponenten. Diese Unterschiede schaffen ein therapeutisches Fenster für eine Reihe von Wirkstoffen, die spezifisch in den bakteriellen, aber nicht in den eukaryontischen Translationsprozess eingreifen. Tabelle 1 zeigt häufig eingesetzte Antibiotika, die in den Translationsprozess der bakteriellen Zelle eingreifen. Nach den Peptidoglycan-gerichteten Antibiotika besitzen diese Wirkstoffe den zweithöchsten weltweiten Marktanteil.

Der massive therapeutische Einsatz dieser Substanzen führt aber auch zum Auftauchen von Resistenzen bei klinischen Isolaten und somit zu Therapieversagen. Für die Entstehung einer solchen Mutation können eine Reihe von Ursachen verantwortlich sein:

(1) Veränderung der Antibiotikazielstelle
(2) Modifikation des Antibiotikas
(3) Veränderung des Antibiotika-Transports

Bei den MLS-Antibiotika (Makrolid, Lincosamid, Streptogramin B), die ihre Wirkung über eine Blockade des ribosomalen Peptidyltransferasezentrums erzielen, lassen Untersuchungen klinischer Isolate den Schluß zu, daß in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle Veränderungen der Antibiotikazielstelle für die Resistenzentwicklung verantwortlich sind (Versalovic et al., 1997).

Auch dabei sind mehrere Varianten denkbar.

(1) Mutation ribosomaler Proteine
(2) Mutation der rRNA
(3) Posttranskriptionelle Modifikation

Während man früher allgemein annahm, daß die Veränderung ribosomaler Proteine hauptsächlich für die Resistenzentwicklung verantwortlich sei, sprechen experimentelle Daten neueren Ursprungs gegen eine solche Theorie und unterstützen vielmehr die These, daß Veränderungen direkt an der ribosomalen RNA (posttranskriptionelle Methylierung oder Mutation) zur Resistenzentwicklung führen.

Tabelle 1

So zeigten proteinfreie 23Sr NA-Extrakte in vitro Peptidyltrans feraseaktivität, die durch Carbomycin hemmbar war (Noller et al., 1992). Zudem liegen die Affinitätkonstanten für die Bindung zwischen Erythromycin und ribosomalen Proteinen, wie L15, die als potentielle Kandidaten für Resistenzentstehung gehandelt werden, um mehrere Größenordnungen unter der, die für komplette Ribosomen ermittelt wurden (Weisblum, 1995). Vor allem aber weist das Fehlen Erythromycin-resistenter, klinischer Isolate, die eine Mutation in ihren ribosomalen Proteinen aufweisen, auf eine eher geringe Bedeutung dieses Resistenzmechanismus hin (Weisblum, 1995).

Häufig anzutreffen sind jedoch die beiden anderen Resistenzmechanismen, wobei auffällt, daß die Zielregion für beide Veränderungen bestimmte Basen der Domäne V der 23S rRNA betreffen (Brimacombe, 1990).

Ein Adeninrest in E.coli Position 2058 (Nummerierung nach Brosius et al., 1981), der in der Tertiärstruktur der 23S rRNA zwischen den Helices 73 und 74 lokalisiert ist (Nummerierung nach Brimacombe et al., 1980), ist Substrat für die Modifikation durch Methylasen aus der erm-Familie, die aus verschiedenen Makrolid-resistenten, klinischen Isolaten isoliert wurden (Weisblum, 1995). Auch eine A ⇒ G-Transition in dieser Position führt bei einer Reihe von phylogenetisch unterschiedlichen Bakterien (Mycobacterium intracellulare (Meier et al., 1994), H. pylori (Versalovic et al., 1997), E. coli (Sigmund et al., 1988, Vester and Garrett, 1987), Propionibacterium acnes (Ross et al., 1997), Mycoplasma pneumoniae (Lucier et al., 1995) zu einem Resistenz-Phänotyp. Tabelle 2 zeigt eine Reihe weitere Mutationen im Peptidyltransferasezentrum der 23S rRNA, die bei resistenten Bakterien gefunden werden. Die Konserviertheit der Positionen, die zu MLS-Resistenz führen, und deren Auffinden in verschiedensten phylogenetischen Gruppen (nicht nur Bakterien) zeigt die generelle Natur dieses Phänomens an. Da das Auffinden dieser Mutationen relativ neu ist, ist damit zu rechnen, daß in den kommenden Jahren noch bei einer Reihe weiterer klinischer Isolate Modifikationen/Mutationen der rRNA/rDNA als Ursache für Resistenz entwicklung dingfest gemacht werden. Hierfür gibt es bei den Mollicutes (Mycoplasma, Ureaplasma) bereits experimentelle Hinweise (Palu et al., 1989, Stopler and Branski, 1986), für die MLS-Antibiotika auch Mittel der Wahl bei der Therapie sind.

Tabelle 2

Tabelle modifiziert nach Referenz Weisblum, 1995. Cam, Chloramphenicol, Cla, Clarithromycin, Cln, Clindamycin, Ery, Erythromycin, Lin, Lincomycin, Sgb, Streptogramin Typ B. HS, Hypersensitiv; R, resistent; S, sensitiv.

In Anbetracht zunehmender Antibiotika-Resistenzen bei klinisch relevanten Bakterien gewinnt die rasche Identifizierung resistenter Bakterien eine immer größere Bedeutung. Die Anzahl pathogener Bakterienarten, die gegen mindestens ein therapeutisch bedeutsames Antibiotikum resistent sind, nimmt kontinuierlich zu. In Anbetracht dieser Situation kann eine wirksame Therapie nur nach Kenntnis des Resistenzstatus des pathogenen Keims durchgeführt werden. Die allgemein praktizierten Verfahren zur Bestimmung des Resistenzstatus von Bakterien beruhen im wesentlichen auf zeitaufwendige Wachsutmstests, welche die Wirksamkeit der therapeutisch einsetzbaren Antibiotika untersuchen. Zu diesem Zweck müssen die Bakterien in der Regel zweimal angezüchtet werden, was ca. 48 Stunden dauert. Die Untersuchung langsam wachsender Keime dauert entsprechend länger. Gemäß dem gegenwärtigen Stand der Technik kann somit eine hochwirksame Therapie nur mit einer zeitlichen Verzögerung von mindestens 1 bis 2 Tagen eingeleitet werden.

Die Weiterentwicklung der in situ Hybridisierung zum Nachweis von Punktmutationen liefert einen Lösungsansatz für die rasche Identifizierung von Antibiotika-Resistenzen bei Bakterien, insbesondere für solche Antibiotika, die gegen den Translationsapparat der Mikroorganismen ausgerichtet sind. Die Komponenten des Translationsapparates sind in großer Kopienzahl in einer Zelle vorhanden und können somit direkt, d. h. ohne zusätzlichen Amplifikationsschritt, untersucht werden. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist die rRNA, die nach neueren Erkenntnissen an der Ausprägung von Antibiotika-Resistenzen wesentlich beteiligt ist und somit als Indikator herangezogen werden kann.

In den nachfolgenden Ausführungen wird am Beispiel des klinisch bedeutsamen Bakteriums Helicobacter pylori die Vorgehensweise zur Entwicklung von Sonden zur Antibiotika-Resistenzbestimmung dargestellt und die wesentlichen Bestandteile entsprechender Test-Kits exemplarisch aufgezeigt. Nach diesen Vorgaben kann für jedes klinisch relevante Bakterium und für jedes therapeutisch relevante Antibiotikum ein entsprechender Resistenzbestimmungstest abgeleitet werden.

Die Entwicklung von Antibiotikumresistenzen durch Mutationen ribosomaler Nukleinsäuresequenzen hat auch Konsequenzen für die Behandlung von Helicobacter pylori Infektionen. Das Auftreten von spiralförmigen Bakterien in der menschlichen Magenschleimhaut wurde zwar schon seit Anfang dieses Jahrhunderts beschrieben (Bizzozero, 1893). Die Tatsache, daß es sich dabei um pathogene Keime handelt wurde jedoch erst mit der erfolgreichen Isolierung und Kultivierung dieses Bakteriums durch Marshall und Warren (Warren and Marshall, 1983; Marshall et al., 1984) aus der Magenschleimhaut eines Patienten mit einem Magengeschwür (Ulcus ventriculi) realisiert und wissenschaftlich anerkannt. Wie erste Analysen ergaben, handelte es sich bei den isolierten Mikroorganismen um Gram negative, spiralförmige Bakterien mit extrem hoher Beweglichkeit und der ungewöhnliche Fähigkeit im stark sauren Milieu (bis ca. pH 1) zu überleben. Ursprünglich als Campylobacter pylori bezeichnet, wurden die Keime schließlich aufgrund biochemischer und morphologischer Eigenschaften in die neu gegründete Gattung "Helicobacter" eingruppiert (Goodwin et al., 1989).

Schon innerhalb weniger Jahre wurde die Bedeutung der Helicobacter pylori Infektion und die Tragweite dieser Entdeckung klar. Epidemiologische Untersuchungen von Taylor und Blaser (1991) zeigten, daß die H. pylori Infektion weltweit auftritt, und daß ca. 50% der Bevölkerung mit diesem Bakterium infiziert ist, wobei die Infektionsrate in den Entwicklungsländern höher ist als in industrialisierten Ländern. Ferner beobachtet man, daß die Wahrscheinlichkeit einer chronischen H. pylori Infektion mit steigendem Lebensalter drastisch zunimmt. Damit zählt die H. pylori Infektion zu den häufigsten chronischen bakteriellen Infektionen des Menschen.

Heute weiß man, daß die Infektion zwangsläufig zur Auslösung einer bakteriellen Gastritis (Typ-B Gastritis) beim Menschen führt. Es gilt ferner als gesichert, daß die H. pylori Infektion auch eine ursächliche Rolle bei der Entstehung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren (Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni) spielt (Hentschel et al., 1991). Nach einer Studie von Forman et al (Forman et al., 1993) führt eine H. pylori Infektion zu einem 6-12-fach erhöhten Risiko zur Entstehung einiger Formen des Magenkarzinoms (Adenokarzinom). Auch die seltener auftretenden MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue) Lymphome des Magens, die als Vorstufen von B-Zell-Tumoren des Immunsystems angesehen werden, sind vermutlich eine Folge der H. pylori Infektion. Eine antibakterielle Behandlung entsprechender Patienten mit erfolgreicher Eradikation (totaler Elimination) von H. pylori führt sowohl zu einer Abheilung von Magengeschwüren als auch von "low grade" MALT Lymphomen (Sipponen and Hyvärinen, 1993; Isaacson and Spencer, 1993; Stolte and Eidt, 1993). Aufgrund dieser Daten wurde H. pylori von einer Kommission der Weltgesundheitsorganisation WHO als Kanzerogen der Klasse 1 eingestuft.

Bevor die Existenz und die Bedeutung des H. pylori für die Ulkuserkrankungen bekannt waren wurden diese durch sog. Antazida, oder H₂-Rezeptorantagonisten behandelt. Dabei handelt es sich um Substanzen welche die Säuresekretion der Magenparietalzellen inhibieren. Unter dem Einfluß dieser Arzneimittel kommt es meist zur Abheilung von Geschwüren, da jedoch eine der Ursachen dieser Geschwüre, nämlich die H. pylori Infektion, damit nicht eliminiert wird, kommt es in den meisten Fällen nach kurzer Zeit zu einem erneuten Auftreten der Ulzeration (Rezidiv).

Eine weitere häufig angewandte Therapie bei Ulzerationen ist die Wismut- Behandlung. Verschiedene Wismutsalze (CBS, BSS) haben einen bakteriziden Effekt auf H. pylori. Eine totale Eradikation des Keims wird jedoch nur in 8-32% der Fälle erreicht. Die Behandlung führt anscheinend zu einer vorübergehenden Suppression des Keims, aber nach Absetzen der Behandlung kommt es in den meisten Fällen wieder zum Aufflackern der Infektion. Eine längerdauernde Therapie mit hohen Dosen führt zu einer Akkumulation der Substanz in Leber, Niere und im Nervensystem und hat beträchtliche neurologische Nebenwirkungen (Malfertheiner, 1994).

Seit der Erkenntnis, daß es sich bei den gastroduodenalen Ulkuserkrankungen um Infektionskrankheiten handelt, ist ein Ziel der Behandlung die Eradikation der Erreger durch Antibiotika. Die Monotherapie mit verschiedenen Antibiotika (Amoxycillin, Tetrazyklin, Nitrofuran, Furazolidin, Erythromycin u. a.) stellte sich jedoch als nicht zufriedenstellend heraus, da es auch hier nur bei 0-15% der Behandlungen zur Eradikation der Keime kommt. Auch die früher empfohlenen Dual-Therapien mit einem Säureblocker und einem Antibiotikum, wies eine hohe Versagerquote auf (Malfertheiner, 1994).

Die erfolgreichste Behandlung wird zur Zeit durch eine Kombination eines Säureblockers (z. B. Ompeprazol) mit zwei Antibiotika in Form der "französischen" Tripeltherapie (Amoxicillin und Clarithromycin) oder bei Penicillin-Allergie der "italienischen" Tripeltherapie (Clarithromycin und Metronidazol) erreicht, die zu Eradikationsraten von 80-95% führen kann. Clarithromycin wird aufgrund seiner günstigen Eigenschaften immer mehr zum Mittel der Wahl (Graham, 1995). Bei Therapieversagen wegen Clarithromycin- bzw. Metronidazol-Resistenz der Bakterien wird eine Vierfachtherapie empfohlen (Protonenpumpenhemmer, Wismutsalz, Tetrazyklin und Metronidazol/oder Clarithromycin). Dieses Schema verspricht Erfolgsraten um 95%, ist allerdings auch mit erheblichen Nebenwirkungen behaftet.

Eine wichtige Voraussetzung für den Erfolg der Therapie stellt der Antibiotika-Resistenz-Status der Bakterien dar. Sobald eine Resistenz gegen nur eines der beiden eingesetzten Antibiotika vorliegt, tritt eine stark erhöhte Versagerquote bei der Behandlung auf (Buckley et al., 1997). Anlaß zur Beunruhigung gibt allerdings die Beobachtung, daß die Anzahl der Metronidazol- und Clarithromycin-resistenten H. pylori Isolate in jüngerer Zeit stetig ansteigt. Der Grund dafür ist nicht bekannt, könnte aber in der zunehmenden Anzahl der H. pylori Eradikationstherapien liegen. Speziell die in der jüngeren Vergangenheit häufig durchgeführten Dualtherapien mit einem Antibiotikum bei denen häufig Resistenzen auftreten. Eine Resistenz gegen Makrolid-Antibiotika wie Clarithromycin oder Erythromycin beruht auf einer Punktmutation in einer bestimmten Regionen der 23S-rRNA. Solche Mutationen treten anscheinend spontan auf und können durch entsprechende Selektion mit einem Antibiotikum leicht isoliert werden. Eine schnelle und zuverlässige Bestimmung des Resistenz-Status der H. pylori Isolate vor der Therapie ist deshalb in Zukunft von großer Bedeutung.

Die einfachste Methode, eine akute Helicobacter pylori Infektion relativ sicher nachzuweisen, ist der sogenannte Atemtest (Desroches et al., 1997). Hierbei wird die Zersetzung von oral verabreichtem, ¹³C/¹⁴C-markiertem Harnstoff in ¹³CO₂ oder ¹⁴CO₂ und NH₄ durch die bakterielle Urease gemessen. Das ¹³CO₂ oder ¹⁴CO₂ gelangt über die Blutzirkulation in die Lungen, wird dort über den natürlichen Gasaustausch freigesetzt und somit in der Atemluft meßbar. Die meßtechnische Auswertung der Atemluft erfolgt in einem besonderen Gerät, mit dem nur Speziallabors ausgestattet sind, so daß die Befunderhebung oftmals örtlich getrennt von der Probenentnahme erfolgt und somit zeitlich verzögert ist. Andere nichtinvasive Verfahren basieren auf PCR-Reaktionen, die mit Stuhl oder Speichelproben durchgeführt werden (Schwarz et al., 1997). Diese Verfahren besitzen zwar eine sehr hohe Empfindlichkeit, allerdings ist das Auftreten falsch-positiver Befunde im Routinebetrieb erfahrungsgemäß sehr häufig. Weiterhin wird eine apparative und molekularbiologische Grundausstattung benötigt, welche in einer allgemeinen Arztpraxis nicht vorhanden ist. D.h. auch in diesem Fall müssen die Proben in Speziallabors eingeschickt werden, wodurch eine rasche Befunderhebung ausgeschlossen ist. Mittelbare Verfahren, die im Serum oder Speichel gegen Helicobacter gerichtete Antikörper nachweisen, haben wiederum den Nachteil, daß eine akute Infektion nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden kann.

Liegt ein positiver Atemtestbefund vor, wird in der Regel eine Gastroskopie durchgeführt. Oftmals geschieht dies auch bei negativem Befund, insbesondere wenn nach konventioneller Therapie mit Protonenblocker die Symptome nicht abklingen. In der Regel werden bei einer Gastroskopie Gewebeproben entnommen, insbesondere wenn auffällige Veränderungen, wie Entzündungen oder Geschwüre, erkennbar sind. Diese Gewebeproben werden histologisch auf gut- oder bösartige Gewebeveränderungen untersucht. Vor allem werden mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt, die den Keim eindeutig zuordnen sollen und seinen Minimale Hemmkonzentration (MHK) Wert bestimmen. Diese Ergebnisse erlauben eine gezielte Therapieplanung und somit eine hohe Erfolgsgarantie. Zur Durchführung der mikrobiologischen Untersuchungen ist eine Anzüchtung des Keims erforderlich, die mehrere Tage in Anspruch nehmen kann. Danach wird eine ebenfalls zeitaufwendige MHK-Wertbestimmung durchgeführt, die eine Kultivierung des Keims erforderlich macht. Durch diese Untersuchung wird der Therapiebeginn wesentlich verzögert, so daß viele Ärzte auf diese Untersuchung verzichten, was zu Lasten des Patienten geht. Dies hat zur Folge, daß bei einer Therapie zu hohe Antibiotika- Dosierungen angesetzt werden, die mit massiven Nebenwirkungen einhergehen. Im anderen Fall kann die Antibiotika-Dosierung zu niedrig angesetzt sein, da der Nachweis Antibiotika-resistenter Keime nicht durchgeführt wurde. Eine schnelle und zuverlässige Identifizierung des möglicherweise krankheitsverursachenden Keims und die unmittelbare Bestimmung seines Resistenzstatus ist deshalb von größter Bedeutung.

In der Literatur sind kokkoide Formen von H. pylori mehrfach beschrieben. Die klinische Bedeutung dieser Stadien wird allerdings kontrovers diskutiert. Einige Autoren postulieren, daß kokkoide Formen eines morphologische Manifestation des Zelltodes darstellen und nicht mehr zu vegetativen Form revertieren können (Kusters et al., 1997). Andere Gruppen gehen davon aus, daß diese Bakterien lebend, aber nicht kultivierbar sind (VNC, viable but non-culturable). Infektionsexperimente mit verschiedenen Tiermodellen konnten die Frage einer möglichen Aktivierung der kokkoiden Form in die vegetative Form nicht eindeutig klären. Eaton und Mitarbeiter erhielten eine erfolgreiche Infektion von Mini-Schweinen mit vegetativen H. pylori, während kokkoide Formen in diesem Modell keine Infektion zeigten (Eaton et al., 1995). Im Gegensatz dazu wurde von zwei unabhängigen Arbeitsgruppen über eine erfolgreiche Infektion mit VNC H. pylori im Mausmodell berichtet (Cellini et al., 1994; Wang et al., 1997).

Der direkte Nachweis von kokkoiden Formen im menschlichen Magen wurde von Chan et al. anhand von Magengewebeschnitten aus Biopsiematerial erbracht. In 82,8% (53/64) der untersuchten Biopsieproben konnten die Autoren kokkoide Formen von H. pylori mit einer Hematoxylin-Eosin Färbung nachweisen (Chan et al., 1994). Von Cao et al. wurde ein monoklonaler Antikörper zum spezifischen Nachweis von kokkoiden H. pylori im Gewebeschnitt benutzt. Auch hier wurden neben den vegetativen Formen in 100% der Antrumbiopsien (9/9) H. pylori kokkoide Formen nachgewiesen (Cao et al., 1997).

Weitere Arbeiten zeigen, daß kokkoide Formen bevorzugt durch O₂-Streß und durch Gabe von Antibiotika (Wismut Subcitrat, Erythromycin, Amoxicillin, Metronidazol) induziert werden können (Donelli et al., 1998; Bode et al., 1993; Sorberg et al., 1996; Berry et al., 1995), wobei offensichtlich Polyphosphate als Energiedepot genutzt werden, das für mindestens 3 Monate ausreichen könnte (Bode et al., 1993). Die Bindung an Epithelzellen und die Fähigkeit zur Signaltransduktion, (IL-8-Induktion, Rearrangement des Zytoskeletts, Bindung von Plasminogen, Laktoferrin und Vitronectin auf der Bakterienoberfläche) scheint bei der kokkoiden Form vergleichbar zu den vegetativen Formen erhalten zu sein (Khin et al., 1996; Segal est al., 1996). Es scheint wahrscheinlich, daß die kokkoide Form eine Überdauerungsform des Helicobacter darstellt.

Die Erfindung betrifft eine neuartige Methode zur Bestimmung von Antibiotikumreagenzien bei Mikroorganismen, insbesondere bei Bakterien, die auf veränderte Nukleinsäuresequenzen, insbesondere in ribosomalen Nukleinsäuren beruhen. Bei Verwendung von Hybridisierungssonden, die spezifisch für eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäure sequenz sind, können überraschenderweise in einem in situ Nachweis verfahren aufgrund des Auftretens oder des Ausbleibens einer Hybridisierung schnelle und zuverlässige Aussagen über das Vorliegen oder/und die Stärke einer Antibiotikumresistenz bzw. die minimale Hemmkonzentration eines Antibiotikums bei Mikroorganismen aus einer biologischen Probe getroffen werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine unvergleichlich rasche und gezielte Befunderhebung für den behandelnden Arzt, was eine hohe Therapiesicherheit für den Patienten bewirkt und eine erhebliche Kostenreduzierung der Gesamtbehandlung ermöglicht.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen bei Mikroorganismen, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Mikroorganismen enthaltenden Probe,
b) Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einer Hybridisierungs sonde, die spezifisch für eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz in Mikroorganismen ist, unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung der Sonde erlauben und
c) Auswerten der Probe in situ durch Bestimmung des Auftretens oder des Ausbleibens einer Hybridisierung.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden beim erfindungsgemäßen Verfahren mehrere unterschiedliche Hybridisierungs sonden in Form eines Gemisches eingesetzt. Überraschenderweise binden diese unterschiedlichen Hybridisierungssonden unter identischen Hybridisierungsbedingungen mit ausreichender Spezifität an unterschiedliche Zielsequenzen, um eine Sequenzabweichung von nur einer einzigen Base nachweisen zu können.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen bei bakteriellen Keimen verwendet. Die mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz wird insbesondere aus ribosomalen Nukleinsäuresequenzen, besonders bevorzugt aus bakteriellen 23S ribosomalen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt. Besonders bevorzugt werden Nukleinsäuresequenzen aus dem Peptidyltransferase zentrum auf der 23S RNA verwendet, dessen Sequenz in Abb. 1 (für E. coli) dargestellt ist. Besonders bevorzugt umfaßt die ausgewählte Nukleinsäuresequenz einen Bereich entsprechend einem oder mehreren der Nukleotide 2032, 2057, 2058, 2059, 2503 und 2611 auf der E. coli 23S rRNA (Nummerierung nach Brosius et al. 1981), wobei sich Mutationen an diesen Positionen insbesondere auf den Nachweis von Resistenzen gegen Makrolid-Antibiotika, z. B. Clarithromycin und Erythromycin beziehen. Es können jedoch auch Nukleinsäuresequenzen aus der 16S rRNA nachgewiesen werden, beispielsweise solche Nukleinsäuresequenzen, welche eine Resistenz gegen Aminoglycosid-Antibiotika vermitteln.

Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen bei anderen Mikroorganismen, z. B. bei Protozoen, geeignet. Insbesondere kommen Organismen in Betracht, die durch Gabe von Makrolid-Antibiotika bekämpft werden können, z. B. Giardia lamblia, ein im oberen Dünndarm des Menschen vorkommender protozoischer Erreger der Lamblienruhr (Jablonowski et al., 1997), oder Pneumocystis carinii, ein protozoischer Organismus, der bei immundefizienten Patienten, z. B. bei HIV-Patienten, eine oft letal verlaufende Pneumonie auslösen kann.

Gegenüber bekannten Verfahren zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen weist das erfindungsgemäße Verfahren eine Reihe von Vorteilen auf. So können - im Gegensatz zu klassischen biochemischen Detektionsverfahren - durch das erfindungsgemäße Verfahren auch langsam wachsende oder in vitro schwierig oder nicht kultivierbare Pathogene schnell untersucht werden. Darüber hinaus ist aufgrund der in situ Detektion eine direkte Lokalisierung der Keime in betroffenen Gewebearealen möglich. Gegenüber anderen molekularbiologischen Verfahren wie PCR zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß zeit- und arbeitsintensive DNA-Präparationsverfahren wegfallen und daß die Nachweismethode gegenüber evtl. vorhandenen Inhibitoren im Probenmaterial weniger empfindlich ist. Darüber hinaus kann die nachgewiesene Nukleinsäure mit bakteriellen Morphologien, wie z. B. Kokken, Stäbchen etc., assoziiert werden, was zu einer Verbesserung der Verläßlichkeit des Verfahrens führt. Außerdem ist eine Lokalisierung und Quantifizierung des Pathogens in betroffenen Arrealen möglich.

Gegenüber anderen mikroskopischen Verfahren, z. B. Färbeverfahren (Gram, Grocott-Gomori, Giemsa), zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch eine höhere Spezifität und Sensitivität aus. Gegenüber Immunfluores zenzverfahren ist die geringere Größe der Sonde von Vorteil, die eine bessere Penetration ins Gewebe erlaubt, kaum unspezifische Bindung zeigt sowie universell anwendbar und mit geringeren Kosten verbunden ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für alle Mikroorganismen geeignet, insbesondere pathogene Bakterien, wie Streptokokken, Bordetella, Corynebacterium, vor allem für problematische Mikroorganismen, wie Helicobacter pylori, Mycobakterien, Porphyromonas gingivalls, Propionibacterium acnes, Borrella burgdorferi, Mycoplasmen, Chlamydien und Tropheryma whippelli sowie Vertreter der Gattungen Bartonella, Legionella, Norkardia und Actinomyces, aber auch für andere pathogene Keime, wie Pneumocystis carinii und Giardia lamblia.

Gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Mikroorganismen enthaltende Probe, vorzugsweise im Rahmen einer human- oder tiermedizinischen Befunderhebung, bereitgestellt. Diese Probe kann eine beliebige biologische Probe sein, vorzugsweise stammt sie jedoch aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Körperflüssigkeiten, z. B. Gewebeschnitten, Biopsien oder Blutproben. Das erfindungsgemäße Verfahren hat überraschenderweise eine derart hohe Spezifität und Sensitivität, daß die Probe ohne vorherige Kultivierung bzw. Vermehrung der Mikroorgansimen untersucht werden kann.

Besonders bevorzugt wird die Probe vor der Untersuchung mit einem Presumptive-Medium versetzt. Dieses Presumptive-Medium ist ein Medium, dessen Zusammensetzung auf die mikrobielle Flora der klinischen Probe abgestimmt ist, insbesondere auf die eventuell vorhandenen krankheitsverursachenden Keime, und diese über einen begrenzten Zeitraum, z. B. von mehreren Stunden bis mehreren Tagen, lebensfähig konserviert, aber das Wachstum der Keime weitgehend unterdrückt. Ein solches Presumptive-Medium besteht im wesentlichen aus einer speziellen Nährlösung, die gegebenenfalls in einer halbfesten organischen Matrix, z. B. einer Agar-Matrix, vorliegt (Westblom et al., 1991). Die Nährlösung beinhaltet eine Stickstoffquelle und essentielle Komponenten, welche die Stabilität der isolierten Keime verbessern, wie etwa Spurenelemente, z. B. Eisen, Zink, Mangan, Vitamine etc. Alle weiteren Bestandteile dieses Presumptive-Mediums liegen vorzugsweise in einer gepufferten wäßrigen Lösung vor. Bestandteile der Stickstoffquelle sind chemische oder proteolytische Aufschlüsse von Proteinen mikrobieller, tierischer oder pflanzlicher Herkunft, wie z. B.: Peptone, Tryptone oder Casitone oder Gemische von diesen, in Abhängigkeit der Anforderungen der ausgewählten mikrobiellen Flora. Für anaerobe bzw. mikroaerophile Keime werden dem Medium reduzierende Substanzen, wie z. B. reduziertes Cystein oder Thioglykolat, zugemischt oder/und Sauerstoff-abweisende Zusätze beigefügt.

Gegebenenfalls kann die Probenvorbereitung zusätzlich mit einem Anreicherungsverfahren kombiniert werden, insbesondere bei der Isolierung von Keimen aus flüssigen Proben, z. B. Blut- oder Urinproben. Das bevorzugte Anreicherungsverfahren beruht auf einer Bindung der Keime an einer festen Matrix, insbesondere auf der Grundlage elektrostatischer Wechselwirkungen, z. B. an Aktivkohle, oder über definierte Liganden, wie z. B. Polylysin, die an eine feste Matrix gebunden sind. Gemäß dem Verfahren fließt das Blut bei der Entnahme in ein abgeschlossenes Gefäß, z. B. eine Spritze, das diese Matrix enthält. Nach einer kurzen Inkubationszeit wird das Blut durch das o.g. Presumptive-Medium ausgetauscht, wobei die Matrix-adsorbierten Keime im abgeschlossenen Gefäß lebensfähig konserviert werden.

Das Presumptive-Medium kann gegebenenfalls mit Nachweisreagenzien, z. B. Indikatoren, versetzt werden, die das Vorhandensein von pathogenen Leitkeimen innerhalb kurzer Zeit, d. h. innerhalb von Minuten anzeigen. Dieser Indikator kann z. B. ein Substratgemisch für ein sezerniertes Leitenzym (z. B. für die H. pylori Urease) sein, dessen Umsetzung zu einem chromogenen Produkt führt oder/und die Produktion charakteristischer Substanzen wie etwa bestimmte Toxine oder Metaboliten anzeigt.

Vor der Untersuchung auf Antibiotikumresistenzen wird die Probe weiterhin vorzugsweise fixiert, z. B. mit Formaldehyd, Paraformaldehyd oder Glutardialdehyd und vorzugsweise permeabilisiert, um ein besseres Eindringen der Hybridisierungssonden in die Zellen zu erlauben. Das Permeabilisierungsverfahren wird auf das jeweils untersuchte Pathogen ausgerichtet, wobei für Gram-negative Bakterien und Gram-positive Bakterien jeweils geeignete Permeabilisierungsverfahren verwendet werden müssen.

Die Hybridisierungssonden können Nukleinsäuren wie DNA, RNA, Nuklein säureanaloga oder Kombinationen davon sein. Vorzugsweise werden die Hybridisierungssonden aus Nukleinsäuren wie DNA oder Nukleinsäure analoga wie peptidischen Nukleinsäuren (PNA) ausgewählt.

Die Hybridisierungssonden weisen einen Hybridisierungsbereich auf, der mit einer Nukleinsäurezielsequenz des Mikroorganismus selektiv hybridisieren kann. Vorzugsweise hat dieser Hybridisierungsbereich eine Länge entsprechend 10 bis 30 Nukleotidbausteinen, besonders bevorzugt 15 bis 20 Nukleotidbausteinen, insbesondere 17 bis 18 Nukleotidbausteinen. Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hybridisierungssonden eignen sich insbesondere zum Nachweis von Mutationen, z. B. Mutationen von einzelnen Nukleotiden oder kurzen Nukleotidabschnitten, die ausgewählt sind aus Deletionen, Transversionen, Transitionen und Modifikationen, z. B. Methylierungen, der entsprechenden Wildtypsequenz.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Verwendung einer einzigen Hybridisierungssonde. In vielen Fällen hat es sich jedoch als günstig erwiesen, eine Kombination von mehreren Hybridisierungssonden zu verwenden, die spezifisch für unterschiedliche mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenzen sind. Beispiele für erfindungsgemäße Hybridisierungssonden, mit denen der Nachweis von Makrolidresistenzen an den Positionen 2058 und 2059 der 23S RNA möglich ist, sind die Sonden ClaR1 (SEQ ID NO. 1), ClaR2 (SEQ ID NO. 2) und ClaR3 (SEQ ID NO. 3). Diese Sonden können sowohl einzeln als auch in Kombination eingesetzt werden.

Um die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen, können die für mit Antibiotikumresistenzen assoziierten Mutationen spezifischen Hybridisierungssonden in Kombination mit einer oder mehreren Hybridisierungssonden eingesetzt werden, die spezifisch für eine mit dem Wildtyp des Mikroorganismus (d. h. einem Antibiotikum-sensitiven Stamm) assoziierte Nukleinsäuresequenz sind. Beispiel für eine derartige Hybridisierungssonde ist ClaWT (SEQ ID NO. 4), die beispielsweise in Kombination mit den zuvor genannten Sonden ClaR1, ClaR2 und ClaR3 verwendet werden kann.

Bei Verwendung von Wildtyp-spezifischen Sonden und Antibiotikum resistenzen Mutanten-spezifischen Sonden, die jeweils unterschiedliche Markierungsgruppen tragen, kann das Verhältnis von resistenten zu sensitiven Keimen in einer Probe bestimmt werden.

Darüber hinaus kann beim erfindungsgemäßen Verfahren noch zusätzlich eine Hybridisierungssonde verwendet werden, die spezifisch für eine Spezies oder Gattung von Mikroorganismen ist. Derartige Hybridisierungs sonden sind bekannt und vorzugsweise spezifisch gegen ribosomale Nukleinsäuresequenzen, z. B. 23S RNA, 16S RNA oder ribosomale Spacersequenzen, gerichtet. Beispiele für solche Sonden sind Hybridisierungssonden, die gegen Sequenzen aus H. pylori 16S rRNA gerichtet sind, die homolog zu den E. coli Regionen 110-140 oder/und 740-780 sind, insbesondere die zum Spezies-spezifischen Nachweis von Helicobacter pylori verwendeten Hybridisierungssonden Hpy1-16S-753 (SEQ ID NO. 5) und 120b (SEQ ID NO. 6), 585 (SEQ ID NO. 7) und 219 (SEQ ID NO. 8).

Die Spezies-spezifischen Sonden können auch zum Nachweis von Antibiotika-sensitiven Bakterien eingesetzt werden, insbesondere bei Anwendung eines Sondengemisches, das gleichzeitig Sonden zur Bestimmung der Resistenz und der jeweiligen Spezies enthält. In einem derartigen zusammengesetzten Sondengemisch lassen sich z. B. Clarithromycin-resistente Helicobacter Bakterien (Resistenz- und Spezies spezifische Sonde binden) oder andere Clarithromycin-resistente Bakterien (Resistenz-spezifische Sonde bindet) oder Antibiotika-sensitive Helicobacter Bakterien (Resistenz-spezfische Sonde bindet nicht und Spezies-spezifische Sonde bindet) nachweisen.

Vorzugsweise werden beim erfindungsgemäßen Verfahren Hybridisierungs sonden verwendet, die eine Direktmarkierung tragen, d. h. eine oder mehrere Markierungsgruppen sind direkt, vorzugsweise durch kovalente Bindung mit der Sonde verknüpft. Andererseits können auch indirekt markierte bzw. markierbare Sonden verwendet werden, z. B. Sonden, die eine Biotingruppe tragen, die wiederum über die Bindung von Streptavidin nachgewiesen wird, wobei das Streptavidin mit einer geeigneten Markierungsgruppe verknüpft ist. Alternativ können die Hybridisierungssonden auch nicht mit Nukleinsäuresequenzen des Mikroorganismus hybridisierende Sequenzbereiche enthalten, die zur Hybridisierung mit einer weiteren komplementären (direkt oder indirekt) markierten Sonde eingesetzt werden können.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Markierungsgruppen sind an sich beliebig, sofern sie einen ausreichend sensitiven in situ Nachweis ermöglichen. Bevorzugt sind Farbstoff-, Fluoreszenz- oder/und Enzymgruppen. Besonders bevorzugt sind Fluoreszenzmarkierungsgruppen.

Werden beim erfindungsgemäßen Verfahren mehrere Arten von Hybridisierungssonden (z. B. mehrere Mutations-spezifische Sonden, eine oder mehrere Mutations-spezifische Sonden in Kombination mit Wildtyp spezifischen Sonden oder/und Spezies-spezifischen Sonden) verwendet, kann es günstig sein, unterschiedliche, d. h. nebeneinander nachweisbare Markierungsgruppen einzusetzen. So kann man beispielsweise beim zusätzlichen Einsatz Spezies-spezifischer Sonden, die eine von der Markierung der Mutations-spezifischen Sonde unterschiedliche Markierung aufweisen, bei gleichzeitiger Hybridisierung beider Sonden eine dritte unterschiedliche Farbgebung erhalten, die sich aus der Mischung beider Sondenfarben ergibt. Wird z. B. für die Sonden zur Bestimmung der Bakterienspezies ein grünes Fluorophor, z. B. Fluorescein, gewählt, und für die Sonden zur Bestimmung für die Antibiotikumresistenz ein rotes Fluorophor, z. B. Rhodamin, ergibt sich aus beiden Mischfarben gelb. Aufgrund dieser Sondenkombination läßt sich innerhalb einer klinischen Probe gleichzeitig die Identität des Mikroorganismus und das evtl. Vorhandensein einer Antibiotikumresistenz bestimmen. Wenn der nachgewiesene Keim Antibiotika-sensitiv ist, erlaubt die alleinige Bindung der Spezies-spezifischen Sonde eine zuverlässige Identifizierung.

Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren sogar eine zusätzliche Aussage über die minimale Hemmkonzentration (MHK) von antibiotikumresistenten Mikroorganismen. So wurde gefunden, daß bestimmte Punktmutationen bzw. bestimmte Kombinationen von Punktmutationen direkt mit den durch konventionelle Mittel bestimmten MHK-Werten korrelieren. Durch den Einsatz von Hybridisierungssonden, die die Detektion bestimmter Punktmutationen bzw. bestimmter Kombinationen davon erlauben, kann auf diese Weise eine Bestimmung von MHK-Werten vorgenommen werden. Beispielsweise können Hybridisierungssonden für niedrigem mittlere und hohe MHK-Werte speziell hergestellt und eingesetzt werden. Auf diese Weise kann der behandelnde Arzt eine genaue Dosierung des Antibiotikums für die Therapie vornehmen.

Die erfindungsgemäße Hybridisierungssonde ist spezifisch für eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz in Mikro organismen. Dies bedeutet, es existieren Hybridisierungsbedingungen, bei denen die Hybridisierungssonde an eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz hybridisiert, nicht aber an eine entsprechende Nukleinsäuresequenz aus einem Antibiotikum-sensitiven Wildtyp-Organismus. Für einen bestimmten Test geeignete Hybridi sierungsbedingungen, die eine ausreichende Spezifität der Unterscheidung zwischen Wildtyp- und mutierten Sequenzen erlauben, können vom Fachmann ohne weiteres durch empirische Untersuchungen abhängig von der Basenfolge der Hybridisierungssonde und der Zielsequenz ermittelt werden. Als Hybridisierungspuffer wird vorzugsweise ein Puffer verwendet, der 0,5 bis 1,5 M Salz, z. B. NaCl, ein Detergenz, SDS und Formamid enthält. Gewaschen wird vorzugsweise in einem Formamid-freien Puffer. Die Sonden werden derart gewählt, daß die Hybridisierungstemperatur vorzugsweise im Bereich von 45 bis 55°C liegt.

Die Auswertung der Probe erfolgt in situ, vorzugsweise durch mikroskopische Methoden, z. B. mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines in situ Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahrens zum Nachweis von Antibiotikum resistenzen in Mikroorganismen, insbesondere in Bakterien. Vorzugsweise wird das Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahren wie zuvor beschrieben durchgeführt. Insbesondere eignet sich das Verfahren zum Nachweis von Resistenzen gegen Makrolid-Antibiotika. Aber auch zum Nachweis von Antibiotikumresistenzmechanismen gegen Lincosamid-, Aminoglykosid- /Aminocyclitol-, Tetracyclin- und Chloramphenicol-Antibiotika, die auf Änderungen in ribosomalen RNA-Sequenzen beruhen, ist das Verfahren geeignet.

Besonders bevorzugt werden Resistenzen gegen Makrolid-Antibiotika ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Clarithromycin, Erythromycin, Azithromycin und Roxithromycin nachgewiesen. Weiterhin besonders bevorzugt ist auch der Nachweis von Resistenzen gegen Aminoglykosid- Antibiotika ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptomycin, Neomycin, Paromomycin, Kanamycin, Gentamycin, Tobramycin, Amikazin, Netilmicin und Sisomicin.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Reagenzienkit zur Typisierung von Mikroorganismen oder/und zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen in Mikroorganismen. In einer ersten Ausführungsform beruht dieser Reagenzienkit auf einem Nachweis durch in situ Hybridisierung und umfaßt:

(a) Mittel zur Probenvorbereitung und
(b) mindestens eine Hybridisierungssonde, die spezifisch für eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz in Mikroorganismen ist, oder/und mindestens eine Hybridisierungssonde, die spezifisch für eine Spezies oder Gattung von Mikroorganismen ist.

Vorzugsweise umfassen die Mittel zur Probenvorbereitung ein Presumptive- Medium, das eine Zusammensetzung wie zuvor angegeben aufweisen kann. Alternativ oder zusätzlich können die Mittel zur Probenvorbereitung auch Anreicherungsmittel für Mikroorganismen, z. B. eine Adsorptionsmatrix zur Anreicherung von Keimen aus einer flüssigen Probe, Lösungen oder Suspensionen zur Fixierung der Probe, Hybridisierungs- oder/und Waschpuffer umfassen. Die Hybridisierungssonden sind vorzugsweise wie zuvor beschrieben markiert.

Gemäß einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfaßt der Reagenzienkit zur Typisierung von Mikroorganismen oder/und von Antibiotikumresistenzen in Mikroorganismen

(a) ein Presumptive-Medium für Mikroorganismen und
(b) Mittel zur Typisierung oder/und zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen.

Gemäß dieser Ausführungsform sind die Mittel zur Typisierung oder/und zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen nicht auf die Verwendung von Hybridisierungssonden und anderen Hybridisierungsreagenzien beschränkt. Denkbar sind auch Indikatorsubstanzen, die das Vorhandensein von Mikroorganismen anzeigen, z. B. Ureasenachweisreagenzien für Helicobacter pylori, Haemolysinreagenzien für Streptokokken, Nachweisreagenzien für Toxine von Clostridium difficile, Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertussis. Vorzugsweise sind die Typisierungsreagenzien für Mikroorganismenspezies oder -gattungen bereits im Presumptive-Medium gelöst oder suspendiert, so daß ein Presumptive-Medium mit kombiniertem Indikatorsystem vorliegt. Außerdem ist denkbar, daß das Presumptive- Medium mit kombiniertem Indikatorsystem zusätzlich mit einem Anreicherungsverfahren kombiniert wird. In diesem Fall werden die Keime in einem ersten Schritt aus Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, angereichert und in einem zweiten Schritt mit dem Indikator-haltigen Presumptive- Medium versetzt. Darüber hinaus kann der Kit gegebenenfalls in separater Form Mittel zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen, z. B. die zuvor beschriebenen Hybridisierungssonden, und geeignete Puffer enthalten.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung eines Oligonukleotids mit einer Nukleotidsequenz, die zu dem 16S rRNA-Bereich von H. pylori komplementär ist, der den E. coli 16S rRNA Positionen 110 bis 140 (insbesondere 120 bis 137), 740 bis 780 (insbesondere 753 bis 770), 580-610 (insbesondere 585-605) oder 210-245 (insbesondere 219-240) entspricht, zum Spezies-spezifischen Nachweis von Helicobacter pylori oder/und Helicobacter nemestriniae. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß derartige Oligonukleotide, d. h. Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga mit einer Länge von vorzugsweise 10 bis 30 Nukleotidbausteinen, bei Verwendung als Amplifikationsprimer oder Hybridisierungssonden eine signifikant höhere Spezifität bezüglich der Erkennung verschiedener H. pylori-Isolate als andere Sequenzen aufweisen und darüber hinaus eine zuverlässige Unterscheidung von H. pylori und anderen verwandten Spezies erlauben. Vorzugsweise verwendet man ein Oligonukleotid, das die in SEQ ID NO. 5, 6, 7 oder 8 dargestellten Sequenzen oder zumindest einen 10 Nukleotide langen Teilbereich davon enthält. Weiterhin bevorzugt ist, daß das Oligonukleotid eine Markierungsgruppe trägt. Die Spezies-spezifischen Substanzen können einzelnen zur Identifizierung des Keims herangezogen werden. Weiterhin können die Spezies-spezifischen Sonden auch in Kombination mit einem Nachweis von Antibiotikumresistenzen eingesetzt werden. Gegebenenfalls können in einem Test auch zwei oder mehr Spezies-spezifische Sonden eingesetzt werden, wobei sichergestellt wird, daß auch weniger biologisch aktive H. pylori Zellen erfaßt werden, die in der Regel eine geringere Anzahl von Ribosomen enthalten.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Oligonukleotids aus einer bakteriellen 23S rRNA, insbesondere aus einem Bereich, der das Peptidyltransferasezentrum enthält, zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen. Vorzugsweise werden Oligonukleotide verwendet, die spezifisch für eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Mutation der Wildtypsequenz sind und einen Bereich entsprechend einem oder mehreren der Nukleotide 2032, 2057, 2058, 2059, 2503 und 2611 auf der E. coli 23S rRNA umfassen. Besonders bevorzugt verwendet man Oligonukleotide mit der in SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 dargestellten Sequenz. Diese Antibiotikumresistenz-spezifischen Oligonukleotide können gegebenenfalls zusammen mit einem Wildtyp-spezifischen Oligonukleotid verwendet werden, das gegen den gleichen Bereich wie die Resistenz spezifische Sonde gerichtet ist. Vorzugsweise hat das Wildtyp-spezifische Oligonukleotid die in SEQ ID NO. 4 dargestellte Sequenz.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch Oligonukleotide, d. h. Nukleinsäuren oder/und Nukleinsäureanaloga, die die in SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 dargestellte Sequenz oder zumindest einen 10 Nukleotide langen Teilbereich davon enthalten. Gegenstand der Erfindung sind auch Zusammensetzungen, die zwei oder mehrere der genannten Oligonukleotide enthalten. Vorzugsweise tragen ein oder mehrere der Oligonukleotide eine Markierungsgruppe.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert. Es zeigen:

Abb. 1 eine schematische Darstellung des Peptidyltransferase zentrums in bakterieller 23S rRNA. Es handelt sich um eine lineare Darstellung, in der unterstrichen die Positionen angezeigt werden, an denen bereits Resistenzmutationen gefunden wurden. Gefüllte Kreise stellen die Footprints von Erythromycin dar. Die oberen Zahlen beziehen sich auf die Helix-Nummerierung nach Brimacombe und die unteren Zahlen auf die Nukleotidposition in E. coli nach Brosius.

SEQ ID NO. 1-8 die Nukleotidsequenzen der Sonden ClaR1 (1), ClaR2 (2), ClaR3 (3), ClaWT (4), Hpyl-165-753 (5), 120b (6), Hpyl-16S-585 (7) und Hpyl-16S-219 (8).

Beispiele Beispiel 1 Entwicklung einer H. pylori-spezifischen Sondenkombination für die in situ Hybridisierung zum Nachweis Antibiotika-sensitiver H. pylori

Ein Alignment mit 108 annährend vollständigen 16S rRNA Sequenzen von Organismen aus der ε-Gruppe der Proteobakterien (davon 50 Helicobacter Sequenzen und davon wiederum 10 H. pylori Sequenzen) wurde zur Ableitung von spezifischen H. pylori Sonden herangezogen (Neefs et al., 1993). Insgesamt konnten 4 potentielle Zielsequenzbereiche zugeordnet werden, aus denen verschiedene Sondenprototypen zur weiteren Austestung abgeleitet wurden. Die Austestung der verschiedenen Sondenprototypen in einer in situ Hybridisierung ist ein wichtiger Bestandteil der Sondenentwicklungsstrategie. Es gibt Daten, daß bestimmte Bereiche der ribosomalen RNA nicht für die in situ Hybridisierungsreaktion zur Verfügung stehen. Als Ursache dafür werden stabile Sekundärstrukturen und die Belegung von Sondenbindungsstellen mit ribosomalen Proteinen diskutiert (Amann et al., 1995; Frischer, 1996). Insbesondere müssen bei dieser Austestung solche Sondensequenzen herausgefunden werden, welche die nächsten verwandten Spezies von H. pylori wie H. mustelae, H. fells, H. fennellae, C. coli, C. jejuni und W. succinogenes ausschließen (siehe Tabelle 5). Das im Rahmen der Austestung angewandte in situ Hybridisierungsverfahren ist im nachfolgenden Beispiel 2 im Detail beschrieben.

Schließlich konnte pro Region jeweils ein wirksamer Bereich zur Sondenkonstruktion bestimmt werden, in dem die Sonden Hpyl-16S-753, Hypl-16S-120b, Hpyl-16S-585, Hpyl-16S-219 lokalisiert sind. Durch weitere, umfangreiche in situ Bindungsstudien an klinischen Proben haben sich zwei Sondensequenzen als besonders wirksam erwiesen: Hpyl-16S-585 und Hpyl-16S-219. Hpyl-16S-585 ist gegen einen Sequenzbereich der 16S rRNA gerichtet, der nur bei H. pylori und H. nemestrinae vorkommt, nicht aber bei anderen bakteriellen Spezies gefunden wird (Tabelle 3). Die Sonde Hpyl-16S-219 ist gegen eine andere H. pylori spezifische Region gerichtet. Beide Sonden wurden über einen Aminolinker am 5'-Ende entweder mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Cy3 (emittiert rote Fluoreszenz) versehen. Der gleichzeitige Einsatz beider Sonden zum in situ Nachweis von H. pylori ist insbesondere wichtig, um metabolisch weniger aktive H. pylori Zellen zu detektieren. Bakterien mit reduziertem Metabolismus haben in der Regel einen geringeren Gehalt an Ribosomen bzw. rRNA wodurch das Nachweisverfahren an Empfindlichkeit einbüßt, insbesondere dann, wenn nur eine Sonde verwendet wird und diese mit dem vergleichsweise schwach emittierenden Fluorescein-Farbstoff versehen ist.

Tabelle 3

Nukleotidsequenzen von verschiedenen Sonden zur Bestimmung von Helicobacter pylori sowie zur Bestimmung von Makrolid-Resistenzen auf bakterieller 23S rRNA

Zum Austesten der Sonden werden verschiedene Referenzzellen wie bei Amann et al. beschrieben mit 3% gepufferter Paraformaldehydlösung fixiert und mittels Lufttrocknung auf Objektträger immobilisiert (Amann et al., 1990).

5 ng der Sonde werden in einem Hybridisierungspuffer (0,9 M NaCl, 0,02 M Tris/HCl pH 8,0, 0,01% SDS, 20% Formamid) bei 46°C für 90 min mit diesen Objektträgern inkubiert. Anschließend wird bei 48°C für 15' gewaschen (0,25 M NaCl, 0,02 M Tris/HCl pH 8,0, 0,01% SDS). Überschüssiger Waschpuffer wird mit PBS von den Objekträgern entfernt und diese zur Verringerung von Ausbleicheffekten in Citifluor AF1 (Citifluor Ltd., London, UK) eingebettet. Die Analyse der Hybridisierung erfolgt mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Standardfilter für rote und grüne Fluoreszenz). Bei den angegebenen Bedingungen hybridisierten alle der bisher ausgetesteten H. pylori Stämme (16/16) mit der Sonde Hpy-16S-753, während Zellen anderer Helicobacter Spezies und weitere Referenzstämme (6/6) keine Bindung der Sonde zeigten (Tabelle 4). Dabei handelte es sich um die nächsten verwandten Spezies von Helicobacter pylori wie H. mustelae, H. fells, H. fennelliae, C. coli, C. jejuni und W. succinogenes (Tabelle 4). Die Sonde 120b reagierte mit 11 von 16 Stämmen und zeigte damit eine etwas geringere Spezifität bezüglich der Erkennung verschiedener H. pylori Isolate (Tabelle 4).

Tabelle 4

Austestung der Spezifität von zwei H. pylori Sonden

Beispiel 2 Anwendung rRNA-gerichteter fluoreszenzmarkierter Oligonukleotidsonden zum in situ Nachweis von Clarithromycin-resistenen H. pylori

Mittlerweile sind drei verschiedene Mutationen in der 23S rRNA beschrieben worden, die Resistenz gegen das Makrolid Clarithromycin vermitteln können (Versalovic et al., 1997). Entsprechend dieser Angaben können Clarithromycin-Resistenzen durch eine A ⇒ G Transition entweder in der Position 2058* (*Nomenklatur n. Brosius) oder 2059* verursacht werden oder durch eine A ⇒ C Transversion an der Position 2058*. Um alle drei resistenzvermittelnden Punktmutationen gleichzeitig nachweisen zu können, wurden drei verschiedene Sondensätze konstruiert, die den genannten Bereich in unterschiedlicher Weise abdecken. In Anbetracht der besonderen Anforderungen einer in situ Hybridisierung wurden die verschiedenen Sondensätze analog zu den H. pylori spezifischen Sonden hinsichtlich ihrer in situ Bindungseigenschaften ausgetestet (siehe Beispiel 1). Die entscheidenden Auswahlkriterien waren: (1) eindeutiger Nachweis der jeweiligen Punktmutation, (2) gleichzeitiger Nachweis der Punktmutation und der H. pylori spezifischen rRNA Abschnitte durch gleichzeitigen Einsatz der im Beispiel 1 ausgewiesenen Sonden.

Schließlich konnten für den in situ Nachweis der drei resistenzvermittelnden Mutationen drei wirksame Sonden ermittelt werden: ClaR1, ClaR2 und ClaR3. Die Sonden ClaR1 und ClaR3. Die Sonden ClaR1 und ClaR3 sind komplementär zu der an Position 2058* veränderten rRNA, während Sonde ClaR2 komplementär zu der an Position 2059* mutierten rRNA ist. Die Sonden wurden über einen Aminolinker am 5'-Ende entweder mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein (emittiert grüne Fluoreszenz) oder Cy3 (emittiert rote Fluoreszenz) versehen. Die Markierung der Sonden mit dem stärker emittierenden Fluoreszenzfarbstoff Cy3 ist von Vorteil, da hierdurch eine höhere Empfindlichkeit des Nachweises sichergestellt ist, insbesondere wenn es sich um metabolisch weniger aktive H. pylori Zellen handelt (s. o.).

Mit den oben beschriebenen Sonden wurden geeignete Bedingungen ausgetestet und schließlich an insgesamt 20 Clarithromycin-resistenten und 15 Clarithromycin-sensitiven H. pylori Stämmen überprüft. Die Spezifität des Resistenznachweises bezüglich H. pylori konnte eindeutig demonstriert werden, da die beiden Sonden Hpyl-16S-219 und Hpyl-16S-585 mit allen untersuchten H. pylori-Stämmen reagierten, wobei alle verwandten Helicobacter Arten nicht erfaßt wurden. ClaR1 erkennt die Mutation A2058G (Cla^R), ClaR2 erkennt die Mutation A2059G (Cla^R) und ClaR3 erkennt die Mutation A2058C (Cla^R).

Eine Resistenzbestimmung sollte vorzugsweise mit allen fünf Sonden (ClaR1-3; Hpyl-16S-585; Hpyl-16S-219) durchgeführt werden, da hierdurch eine optimale Aussagekraft erzielt wird (s. u.). Es hat sich in dieser Ausführungsform als vorteilhaft erwiesen, den Nachweis der Punktmutationen in einem kompetitiven Hybridisierungsansatz zu führen und somit die Spezifität dieses Nachweises zu gewährleisten. Dem Sondengemisch wurde diesem Zweck zusätzlich eine Sonde beigemischt, die komplementär zur Wildtypsequenz im Bereich der resistenz vermittelnden Mutationen liegt. Nach entsprechenden Austestungen wurde die Sequenz der Sonde ClaWT ermittelt. Die drei Cy3-markierten Sonden ClaR1, ClaR2 und ClaR3 werden gemeinsam mit einer äquimolaren Menge der unmarkierten ClaWT-Sonde eingesetzt. Um gleichzeitig die Identität der vorliegenden Bakterien anzuzeigen, werden zusätzlich die beiden FLUOS- markierten H. pylori-spezifischen Sonden eingesetzt. Entsprechend der dargestellten Anwendungsform können somit folgende Aussagen getroffen werden:

1. Gelbes Fluoreszenz-Signal (Mischfarbe aus rot (Resistenz) und grün (H. pylori) = Clarithromycin-resistenter H. pylori
2. Grünes Fluoreszenz-Signal = Clarithromycin-sensitiver H. pylori
3. Rotes Fluoreszenz-Signal = Clarithromycin-resistentes Bakterium unbekannter Art.

Eine 100%ige Spezifität des eingesetzten Sondengemisches wurde unter folgenden Hybridisierungsbedingungen erzielt:

Hybridisierung: 90 Minuten bei 46°C in 0,9 M NaCl; 0,02 M Tris/HCl pH 8,0; 0,01% SDS; 20% Formamid.
Waschschritt: 15 Minuten bei 48°C in 0,25 M NaCl, 0,02 M Tris/HCl pH 8,0, 0,01% SDS

Tabelle 5

Austestung der ausgewiesenen Einzelsonden an verschiedenen bakteriellen Stämmen und an Magenbiopsine (Antrum) durch in situ Hybridisierung

Beispiel 3 In situ Clarithromycin-Resistenzbestimmung von H. pylori in Gewebeschnitten

Die in situ Resistenzbestimmung von H. pylori in Gewebeschnitten wurde zunächst in einem Tiermodell evaluiert. 6-8 wöchige C57Bl6 Mäuse wurden oral mit 10 Kolonie bildenden Einheiten des H. pylori Stammes P76 infiziert. 4 Tage nach der Infektion wurde die Maus getötet und der Magen steril entfernt. Der Magen wurde mit dem Skalpell zerkleinert und die Teile für 12 h in einer 3% Paraformaldehydlösung eingelegt. Es folgten zwei Waschschritte von jeweils einer Stunde in einer gepufferten Salzlösung, z. B. PBS. Anschließend wurde das Material in ein Medium für Gefrierschnitte eingelegt, worauf das ganze bei -70°C eingefroren wurde. Schließlich wurde von dem eingefrorenen Material mit einem Kryomikrotom Gefrierschnitte von jeweils 5-10 µm Dicke angefertigt und auf Polylysin beschichteten Objektträgern fixiert. Die Durchführung der Nachweisreaktion gemäß den beschriebenen Bedingungen erbrachten ein positives Ergebnis, dergestalt, daß sich auf der Krypteninnenseite der Magenprobe deutlich einzelne H. pylori nachgewiesen werden konnten.

In der Fortsetzung der Untersuchung wurden nunmehr Paraffinschnitte von Magenbiopsaten chronisch infizierter Menschen verwendet, deren mikrobiologischer Hintergrund vorab durch konventionelle Verfahren bestimmt wurde. Die Untersuchung der Gewebeschnitte erfolgte gemäß dem Standardprotokoll, wobei die beiden FLUOS-markierten H. pylori spezifischen Sonden, die Cy3-markierten Sonden ClaR1, ClaR2 und ClaR3 und die unmarkierte ClaWT-Sonde eingesetzt wurde. Insgesamt wurden 27 Magenbiopsieproben untersucht, wobei in 17 Fällen korrekt, d. h. in Übereinstimmung mit dem konventionellen Verfahren, eine H. pylori Infektion diagnostiziert werden konnte. In 5 Fällen wurde korrekt eine Clarithromycin-Resistenz nachgewiesen. In einem Fall wurde sogar eine H. pylori Mischinfektion nachgewiesen, bestehend aus einem Clarithromycin resistenten und einem Clarithromycin-sensitiven Stamm (siehe Tabelle 5).

In einer anderen Anwendungsform werden die Magenbiopsate nicht fixiert und histologisch aufgearbeitet, sondern in ein spezielles Transport- bzw. Presumptive-Medium überführt, das ein langes Überleben des Keims gewährleistet und gegebenenfalls das Vorhandensein von H. pylori in der Probe anzeigt (siehe Beispiel 5). Entnimmt man dem Transportmedium nach unterschiedlich langer Aufbewahrungszeit Proben und untersucht diese mit dem beschriebenen Verfahren, so können die Bakterien überraschender Weise noch nach 7 Tagen eindeutig charakterisiert werden. Besonders überraschend war das Ergebnis, daß die Probe hierzu nicht unbedingt gekühlt (4°C) aufbewahrt werden muß.

Tabelle 6

Kultivierungs- und Hybridisierungsergebnisse von H. pylori Hpci 001- Tübingen nach unterschiedlich langem Transport in CREATOGEN- Transportmedium

Beispiel 4 Vergleich der 23S-rRNA Sequenz verschiedener medizinisch bedeutsamer Bakterien im Bereich der Clarithromycin-Resistenz-Region

Mit Hilfe des Computerprogrammes ARB (Ludwig et al., TU München) wurde die 23S-rDNA von 40 Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien mit der Makrolid-resistenzvermittelnden Region von H. pylori verglichen (Tabelle 6). Die Ergebnisse zeigen bei allen untersuchten Bakterien eine starke Konservierung der Primärstruktur dieser speziellen Region der ribosomalen RNA in der die Resistenz gegen Makrolid-Antibiotika determiniert wird. Allerdings scheint die Bindungsspezifität der ausgewiesenen Sonden ClaR1, ClaR2 und ClaR3 für H. pylori erfüllt zu sein. Da es sich bei den 40 Sequenzen aus der Datenbank wahrscheinlich um die Sequenzen Clarithromycin-sensitiver Bakterien handelt und man davon ausgehen kann, daß die Clarithromycin-Resistenz bei diesen Bakterien, wie bei H. pylori, ebenfalls durch eine Mutation in der Position 2058/2059 der 23S-rDNA (n. Brosius) determiniert wird, kann das beschriebene Verfahren zur in situ Bestimmung von Makrolid-Resistenzen auch bei diesen Bakterien angewandt werden. Es muß lediglich zur eindeutigen Zuordnung des entsprechenden pathogenen Keims, der mit der Krankheitsbildung verknüpft ist, eine Spezies-spezifische Sonde abgeleitet werden und in der beschriebenen Weise mit dem Sondengemisch zur Identifizierung der resistenzvermittelnden Mutation kombiniert werden.

Tabelle 7

Vergleich der 23S-rRNA Sequenz verschiedener Bakterien-Spezies im Bereich der Clarithromycin-Resistenz Region

mis, Anzahl der mismatches zur rRNA Sequenz in dieser Region. Die Startposition der Sondensequenz in der 23S-rRNA der verschiedenen Spezies entspricht Position 2051 in E. coli (Brosius et al., 1981), N, entspricht A, C, G oder T. = identisch zur rRNA-Sequenz.

Beispiel 5 Entwicklung eines Presumptive-Mediums für bakterielle Gastritis mit kombiniertem Urease-Nachweis speziell für Helicobacter pylori

Im Vordergrund steht die Entwicklung eines Presumptive-Mediums, das die Konservierung lebensfähiger Helicobacter pylori aus Magenbiopsien über einen Zeitraum von 5 Tagen, mindestens jedoch über 48 Stunden, ermöglichen soll. Darüber hinaus soll die Begleitflora, sofern vorhanden, erhalten werden, um eine vollständige mikrobiologische Befunderhebung sicherzustellen. Das Wachstum der Keime muß eingeschränkt werden, um die anteilige Zusammensetzung der Keime in der Biopsie möglichst unverändert zu halten. Das Presumptive-Medium besteht im wesentlichen aus einer gepufferten Nährlösung, die bevorzugt in einer halbfesten organischen Matrix vorliegt, wie z. B. (0,2-1,5%) Agar oder (mind. 15%) Gelatine. Die Nährlösung beinhaltet eine Stickstoffquelle und weitere essentielle Komponenten, welche die Stabilität von Helicobacter verbessern. Die Stickstoffquelle nimmt 0,5 bis 5% des Presumptive-Mediums ein. Sie besteht aus chemischen oder proteolytischen Aufschlüssen von Proteinen mikrobieller, tierischer oder pflanzlicher Herkunft, wie z. B.: Peptone, Tryptone oder Casitone oder Gemische von diesen. Besonders bevorzugt sind Medien wie Schivo-Medium® oder Medien auf der Basis von "brain heart infusion" (BHI). Weitere bevorzugte Bestandteile sind Hefe-Extrakt (z. B. 0,01%), Serumproteine, wie Pferdeserum oder foetales Kälberserum oder Rinderserumalbumin oder definierte, organische Substanzen, wie (2,6) Dimethyl)-beta-cyclodextrin und Cholesterol. Die Serumproteine sollten 1-10% des Presumptive-Mediums einnehmen, die organischen Substanzen 0,01-0,2%. Außerdem wird dem Presumptive-Medium reduziertes Cystein oder Thioglykolat zugemischt und/oder Sauerstoff abweisende Zusätze beigefügt. Alle Komponenten liegen in einer gepufferten wäßrigen Lösung vor, deren bevorzugter pH-Wert zwischen 5,5 und 6,5 liegt. Die Biopsieprobe wird in das untere Drittel der halbfesten Matrix eingebracht, wodurch das Eindiffundieren von Luftsauerstoff verhindert wird, was die Überlebensbedingungen des Keims verbessert.

Die Verknüpfung des Presumptive-Mediums mit einem Urease-Nachweistest ist neu. Sie bietet dem Arzt den Vorteil, daß dieser rasch eine mögliche Helicobacter Infektion angezeigt bekommt und direkt weitere Maßnahmen einleiten kann. Das Presumptive-Medium wird zu diesem Zweck zusätzlich mit (0,5-5%) Harnstoff und (0,001-0,01%) Phenolrot oder anderen pH- Indikatoren, wie Bromocresolpurpur, versetzt. Die Umsetzung des Harnstoffs durch die Urease führt u. a. zur Entstehung von Ammoniak, welches den pH-Wert ins Basische verändert und z. B. den pH-Indikator Phenolrot von gelblich in rot bis violett umschlagen läßt. Die Geschwindigkeit des Farbumschlags, die Farbintensität und die Farbgebung korrelieren direkt mit der Menge Urease-produzierender Bakterien. Die Bestandteile des kombinierten Presumptive-Mediums sind so eingestellt, daß eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird (500-2000 Keime/Presumptive- Medium) und eine Autolyse der Keime unterdrückt ist. Alternativ kann dem Presumptive-Medium ein synthetisches Urease-Substrat beigemischt werden, dessen Umsetzung einen Farbumschlag bewirkt.

Vergleichsuntersuchungen belegen, daß andere, routinemäßig angewandte Urease-Nachweisverfahren zu einer raschen Lyse der Keime führen. Dies ist von größter Bedeutung, da neuere Untersuchungen belegen, daß in den Biopsie-Proben oftmals andere Urease-produzierenden Keime, wie z. B. Proteus mirabills, Klebsiella oxytoca und Pseudomonas aeruginosa vorzufinden sind. Im Unterschied zu Helicobacter sezernieren diese Keime keine Urease, sondern das Enzym liegt im Zellinnern vor. In eigenen Untersuchungen wurde festgestellt, daß es in gängigen Urease- Nachweisverfahren, wie dem CLO-Test, zur Lyse der Bakterien kommt, wobei die intrazelluläre Urease freigesetzt wird, die das nun verfügbare Substrat sofort umsetzt. Eine vorläufige Untersuchung von 32 Patienten mit akuter Gastritis hat ergeben, daß mit herkömmlichen Verfahren nur aus 34% der mikrobiologisch untersuchten Biopsien ein Helicobacter isoliert werden konnte. Dabei kann nicht ausgeschlossen werden, daß die Helicobacter-freien Biopsien mit Stämmen besiedelt waren, die sich sehr schlecht anzüchten lassen. Bedeutsam ist allerdings, daß ein Großteil (< 50%) der Helicobacter-freien Biopsien andere Urease-produzierende Keime enthielten, die von den gängigen Urease-Nachweisverfahren angezeigt wurden. Das kombinierte Transport- und Indikatormedium verzögert bzw. verhindert eine Lyse dieser Bakterien und garantiert somit einen Helicobacter-spezifischen Urease-Nachweis.

Tabelle 8

Beispiel 6 Antibiotika-Empfindlichkeitstestung Clarithromycin-resistenter H. pylori Stämme mittels in situ Nachweis durch rRNA-gerichtete fluoreszenzmarkierte Sonden

Aufgrund der Beobachtung von Versalovic et al. (1997), daß die verschiedenen resistenzvermittelnden Punktmutationen auf der 23S rRNA mit der Empfindlichkeit des Keims gegenüber Clarithromycin korrelieren, ergibt sich anhand der vorliegenden, neuen Resultate die Möglichkeit durch den Einsatz der einzelnen Sonden (ClaR1 - 3) eine direkte Antibiotika- Empfindlichkeitstestung durchzuführen.

So führen Mutationen in der Position A2058G zu signifikant höheren Resistenzwerten als Mutationen in der Position A2059G. Wie schon gezeigt, wird die Mutation in der Position A2058G mit der Sonde ClaR1 spezifisch nachgewiesen. In einem Optimierungsprozeß wurde der hochspezifische Nachweis der A2058G Punktmutation durch ein Gemisch bestehend aus der Cy3-markierten ClaR1-Sonde und den unmarkierten Sonden ClaWT und ClaR3 erzielt.

In ähnlicher Weise wurde ein funktionierendes Sondengemisch zum spezifischen Nachweis der A2059G Punktmutation entwickelt, bestehend aus der Cy3-markierten ClaR2-Sonde und der unmarkierten ClaWT-Sonde. Zum Nachweis der Punktmutation A2058C wird die Cy3-markierte Sonden ClaR3 verwendet in Kombination mit der unmarkierten Sonde ClaWT.

Die Hybridisierung wird im Beispiel 2 genannten Puffer durchgeführt. Soll die Antibiotika-Empfindlichkeitstestung mit der Identifizierung von H. pylori gekoppelt werden, so werden den genannten Sondenkombinationen noch die FLUOS-markierten Oligonukleotide Hpyl-16S-585-FLUOS und Hpyl-16S- 219-FLUOS zugegeben.

Tabelle 8

Evaluierung der MHK-Wert Bestimmung durch in situ Hybridisierung mit konventionell charakterisierten H. pylori Isolaten

Beispiel 7

Das Gesamtverfahren der Resistenzbestimmung setzt sich aus zwei aufeinanderfolgenden Teilschritten zusammen, der Probengewinnung (A) und der Nachweisreaktion (B).

Die Probengewinnung umfaßt im wesentlichen die gezielte Gewinnung von biologischen Material in dem sich der krankheitsverursachende Keim angesiedelt hat. Das gewonnene biologische Material kann dann direkt der Nachweisreaktion zugeführt, durch bekannte Verfahren fixiert oder in ein spezielles Presumptive-Medium (siehe Beispiel 5) überführt werden.

Die Nachweisreaktion (in situ Hybridisierung) erfordert im wesentlichen drei Arbeitsschritte, (1) die Immobilisierung der Probe auf einem Träger, (2) die Permeabilisierung der Probe und (3) die eigentliche Hybridisierungsreaktion sowie deren Auswertung.

Im Falle einer mikroskopischen Untersuchung wird die Probe auf einen Objektträger immobilisiert, der in der Regel aus Glas besteht. Es können auch andere Trägermaterialien verwendet werden, z. B. Mikrotiterplatten oder Folien oder Siliciumplatten, in Abhängigkeit der gewählten Untersuchungsform. In der Regel wird die Probe in Form eines Abstrichs auf den Objektträger aufgetragen. Bei Gewebeproben werden bevorzugt Schnitte verwendet. Schließlich wird die Probe über eine Lufttrocknung auf dem Objektträger immobilisiert (Amann et el., 1990), wobei die Fixierung der Probe durch eine Vorbehandlung des Objektträgers, z. B. mit Polylysin oder gar spezifische Rezeptormoleküle, wie Antikörper, verbessert werden kann.

Durch den Permeabilisierungsschritt wird die Probe, insbesondere die in der Probe befindlichen Bakterien für die Sonden durchgängig gemacht. Das Verfahren ist so ausgerichtet, daß insbesondere die Bakterienhülle durchgängig gemacht wird wobei die innere Struktur weitgehend erhalten bleibt. Zur Permeabilisierung von Gram-negativen Bakterien reicht in der Regel ein konventionell durchgeführtes Fixierungsverfahren aus. Die Permeabilisierung Gram-positiver Bakterien erfordert zusätzliche Maßnahmen, z. B. die Verwendung von Komponenten wie etwa organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Toluol, Xylol, Aceton, Ethanol, etc., Detergentien, wie z. B. SDS, Nonidet, etc., und Zellwand auflösenden Enzymen, wie z. B. Lysozym, Lysostaphin, Mutanolysin, etc.

Die Hybridisierungsreaktion wird in zwei Schritten durchgeführt, (a) die Inkubation der permeabilisierten Probe mit der markierten Sonde bzw. dem Sondengemisch und (b) ein nachfolgender Waschschritt zum Entfernen unspezifisch gebundener Sonden mit anschließender Auswertung. Die Inkubation der Sonden (1-1000 ng) erfolgt in einer wässrigen Lösung für mehrere Stunden bei einer Temperatur, die sich aus der Formel zur Berechnung der Dissoziationstemperatur von RNA-DNA Hybriden herleiten läßt (Lathe, 1985 & Wahl, 1987): Td = 81 ,5 + 16,6 Ig[Na⁺] + 0,4(%GC) - 820/n - 0,5(% FA); n = Länge des Oligonukleotids; FA = Formamid. Die wesentlichen Bestandteile der wässrigen Lösung sind chaotrope Substanzen, wie Salze oder/und Formamid, mit denen eine spezifische Bindung der Sonden an die komplementären Zielsequenzen auf der rRNA erreicht wird und ein Detergenz zur Unterdrückung unspezifischer Bindungen der Sonden z. B. an Proteine. Die Lösung zum Herauswaschen der unspezifisch gebundenen Sonden ist prinzipiell ähnlich zusammengesetzt, wobei die Sondenbindung beeinflussenden Bestandteile in niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden und/oder die Temperatur entsprechend erhöht wird. Schließlich wird der überschüssige Waschpuffer wird mit einer gepufferten Salzlösung, z. B. PBS von den Objekträgern entfernt und der Probenbereich in Citifluor AF1 (Citifluor Ltd., London, UK) eingebettet, um die Ausbleichung der fluoreszierenden Sonden bei der Untersuchung zu verringern. Das Ergebnis der Nachweisreaktion wird mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops abgelesen (Standardfilter für rote und grüne Fluoreszenz oder/und Mischfilter für den gleichzeitigen Nachweis von roter und grüner Fluoreszenz).

Beispiel 8

Es gibt Beobachtungen, daß H. pylori unter unvorteilhaften Lebensbedingungen seine Morphologie ändert und sich von der bekannten Stäbchenform in eine kokkoidale Form umwandelt. Von dieser kokkoiden Form ist bekannt, daß sie nicht mehr kultivierbar ist und somit klassischen, mikrobiologischen Untersuchungen nicht zugänglich ist. Sollte es sich bei diesen Formen tatsächlich um Überdauerungsstadien von H. pylori handeln, müssen diese unbedingt einer Diagnose zugeführt werden können.

In einer Versuchsserie wurde überprüft, in wie weit die kokkoiden Formen für das beschriebene Nachweisverfahren zur Bestimmung der Antibiotika- Resistenz verfügbar sind. Ein Clarithromycin-resistenter H. pylori Stamm wurde in seine kokkoide Form überführt, in dem er für eine Woche bei 4°C in destilliertem Wasser aufbewahrt wurde. Nach dieser Zeitspanne waren alle stäbchenförmigen H. pylori Zellen vollständig zu kokkoiden Formen transformiert, die auf gängigen Kulturmedien nicht mehr anwuchsen. Diese kokkoiden Zellen wurden dem beschriebenen Nachweisverfahren mit dem bekannten Sondengemisch unterworfen. Tatsächlich gelang es die kokkoide Form als H. pylori zu identifizieren und, was besonders wichtig ist, die Clarithromycin-Resistenz wurde ebenfalls nachgewiesen. Mittlerweile ist es sogar gelungen, in humanen Gewebebiopsien diese Formen über das beschriebene Verfahren nachzuweisen.

Hiermit steht zum ersten Mal ein Nachweisverfahren für die Bestimmung einer Antibiotika-Resistenz bei kokkoiden Helicobacter zur Verfügung. Darüber hinaus war nicht zu erwarten, daß dieses Verfahren bei kokkoiden H. pylori funktioniert. In zahlreichen Arbeiten wurde berichtet, daß die kokkoide Form einen stark reduzierten rRNA Gehalt hat und diese zudem degradiert ist (Donelli et al., 1998; Narikawa et al., 1997). Unsere Untersuchungen belegen, daß die in H₂O induzierte kokkoide Form einen zum Nachweis ausreichenden rRNA-Gehalt aufweist und sehr gut durch eine, auf die rRNA ausgerichtete in situ Hybrisierung charakterisiert werden kann.

Die Untersuchung kokkoider Formen gewinnt insbesondere bei der Resistenzbestimmung an Bedeutung. Es ist bekannt, daß sich kokkoide Formen bevorzugt bei sublethalen Antibiotikakonzentrationen ausbilden und somit diese Formen in einem möglichen Zusammenhang beim Versagen der Antibiotikatherapie stehen. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, daß diese Formen in hohen Konzentrationen im Stuhl infizierter Menschen vorkommen und somit über das beschriebene Verfahren einfach und rasch, d. h. ohne gastroendoskopische Entnahme einer Biopsieprobe, eine akute H. pylori Infektion mit einem Clarithromycin-resistenten Keim nachgewiesen werden kann.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen bei Mikroorganismen umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Mikroorganismen enthaltenden Probe,
b) Inkontaktbringen der Probe mit mindestens einer Hybridisierungssonde, die spezifisch für eine mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz in Mikroorganismen ist, unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung der Sonde erlauben und
c) Auswerten der Probe in situ durch Bestimmung des Auftretens oder des Ausbleibens einer Hybridisierung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus bakteriellen Keimen und Protozoen ausgewählt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Antibiotikumresistenzen assoziierte Nukleinsäuresequenz aus ribosomalen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz aus bakteriellen 23 S ribosomalen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz einen Bereich entsprechend einem oder mehreren der Nukleotide 2032, 2057, 2058, 2059, 2503 und 2611 auf der E. coli 23S rRNA umfaßt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man langsam wachsende oder/und in vitro schwierig oder nicht kultivierbare Pathogene testet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorgansimen gewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Helicobacter pylori, Mycobacterien, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium acnes, Borrelia burgdorferi, Mycoplasmen, Chlamydien, Tropheryma whippelii, Bartonellen Legionellen, Norkardien und Actinomyceten.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Körperflüssigkeiten stammende Probe verwendet.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ohne vorherige Kultivierung der Mikroorganismen untersucht wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe einer Anreicherungsprozedur für Mikroorganismen unterzogen wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vor der Untersuchung mit einem Presumptive-Medium versetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Presumptive-Medium eine Indikatorsubstanz zur Typisierung von Mikroorganismen enthält.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe vor der Untersuchung fixiert und gegebenenfalls permeabilisiert wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungssonde aus Nukleinsäuren wie DNA oder Nukleinsäureanaloga wie PNA ausgewählt wird.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierungssonde einen Hybridisierungsbereich mit einer Länge entsprechend 10 bis 30 Nukleotidbausteinen, bevorzugt 15 bis 20 Nukleotidbausteinen, insbesondere 17 bis 18 Nukleotidbausteinen aufweist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hybridisierungssonde verwendet, die spezifisch für Mutationen ausgewählt aus Deletionen, Transversionen, Transitionen und Modifikationen der entsprechenden Wildtypsequenz ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kombination von mehreren Hybridisierungssonden verwendet, die spezifisch für unterschiedliche mit Antibiotikumresistenzen assoziierten Nukleinsäuresequenzen sind.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridisierungssonden ClaR1 (SEQ ID NO. 1), ClaR2 (SEQ ID NO. 2) oder/und ClaR3 (SEQ ID NO. 3) verwendet.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich mindestens eine Hybridisierungssonde verwendet, die spezifisch für eine mit einem Wildtyp des Mikroorganismus assoziierte Nukleinsäuresequenz ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridisierungssonde ClaWT (SEQ ID NO. 4) verwendet.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich mindestens eine Hybridisierungssonde verwendet, die spezifisch für eine Spezies oder Gattung von Mikroorganismus ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis von Helicobacter pylori Hybridisierungssonden verwendet, die gegen Sequenzen aus H. pylori 16S rRNA gerichtet sind, die homolog zu den E. coli Regionen 110- 140, 740-780, 585-605 oder/und 210-245 sind.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hybridisierungssonden Hpy1-165-753 (SEQ ID NO. 5), 120b (SEQ ID NO. 6), 585 (SEQ ID NO. 7) oder/und 219 (SEQ ID NO. 8) verwendet.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Hybridisierungssonden verwendet, die eine Direktmarkierung tragen.

25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Hybridisierungssonden verwendet, die mit Farbstoff-, Fluoreszenz- oder/und Enzymgruppen markiert oder markierbar sind.

26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man mehrere Hybridisierungssonden verwendet, die unterschiedlich markiert oder markierbar sind.

27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung der Probe durch mikroskopische Methoden erfolgt.

28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswertung eine quantitative Bestimmung von Antibiotikumresistenzen umfaßt.

29. Verwendung eines in situ Nukleinsäure-Hybridisierungsverfahrens zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen in Mikroorgansimen.

30. Verwendung nach Anspruch 29 zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen in Bakterien und Protozoen.

31. Verwendung nach Anspruch 29 oder 30 zum Nachweis von Resistenzen gegen Makrolid-, Lincosamid-, Aminoglycosid-, Aminocyclitol-, Tetracyclin- und Chloramphenicol-Antibiotika.

32. Verwendung nach Anspruch 31 zum Nachweis von Resistenzen gegen Makrolid-Antibiotika ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Clarithromycin, Erythromycin, Azithromycin und Roxithromycin.

33. Verwendung nach Anspruch 29 oder 30 zum Nachweis von Resistenzen gegen Aminoglykosid-Antibiotika ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Streptomycin, Neomycin, Paromomycin, Kanamycin, Gentamycin, Tobramycin, Amikazin, Netilmicin und Sisomicin.

34. Reagenzienkit zur Typisierung von Mikroorganismen oder/und von Antibiotikumresistenzen in Mikroorganismen durch in situ Hybridisierung umfassend

35. Reagenzienkit nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Probenvorbereitung ein Presumptive-Medium und gegebenenfalls Anreicherungsmittel für Mikroorganismen umfassen.

36. Reagenzienkit nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Presumptive-Medium eine Nährlösung mit einer Stickstoffquelle und weiteren essentiellen Komponenten sowie gegebenenfalls reduzierenden Substanzen oder/und Sauerstoff abweisenden Zusätzen enthält.

37. Reagenzienkit zur Typisierung von Mikroorganismen oder/und von Antibiotikumresistenzen in Mikroorganismen umfassend

(a) ein Presumptive-Medium für Mikroorganismen und
(b) Mittel zur Typisierung von Mikroorganismen oder/und zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen.

38. Reagenzienkit nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das Presumptive-Medium eine Nährlösung mit einer Stickstoffquelle und weiteren essentiellen Komponenten sowie gegebenenfalls reduzierenden Substanzen oder/und Sauerstoff abweisenden Zusätzen enthält.

39. Reagenzienkit nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Typisierung von Mikroorganismen Indikatorsubstanzen umfassen, die im Presumptive-Medium gelöst oder/und suspendiert sind.

40. Reagenzienkit nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Ureaseindikator zum Nachweis von Helicobacter pylori enthält.

41. Verwendung eines Reagenzienkits nach einem der Ansprüche 34 bis 40 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28.

42. Verwendung eines Oligonukleotids aus einem Bereich der V-Domäne der 16S rRNA zum Spezies-spezifischen Nachweis von H. pylori.

43. Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid die in SEQ ID NO. 5, 6, 7 oder/und 8 dargestellte Sequenz oder zumindest einen 10 Nukleotide langen Teilbereich davon enthält.

44. Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO. 5, 6, 7 oder/und 8 dargestellte Sequenz oder zumindest einen 10 Nukleotide langen Teilbereich davon enthält.

45. Oligonukleotid nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierungsgruppe trägt.

46. Verwendung eines Oligonukleotids aus einer bakteriellen 23S rRNA zum Nachweis von Antibiotikumresistenzen.

47. Verwendung nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid die in SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 3 dargestellte Sequenz enthält.

48. Verwendung nach Anspruch 46 oder 47 zusammen mit einer Wildtyp-spezifischen Oligonukleotid, insbesondere einem Oligonukleotid, das die in SEQ ID NO. 4 dargestellte Sequenz enthält.

49. Oligonukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO. 1, 2, 3 oder 4 dargestellte Sequenz oder zumindest einen 10 Nukleotide langen Teilbereich davon enthält.

50. Oligonukleotid nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Markierungsgruppe trägt.