DE19909156A1

DE19909156A1 - Testsystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, sowie dessen Verwendung

Info

Publication number: DE19909156A1
Application number: DE19909156A
Authority: DE
Inventors: Christoph Huels; Bettina Bauer; Claus Simandi; Reinhard Luehrmann; Tilmann Achsel; Hans-Peter Vornlocher
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 1999-03-02
Publication date: 2000-09-07
Also published as: WO2000052201A2; EP1159449A2; US6579681B1; PL355179A1; NZ513908A; CA2363431A1; WO2000052201A3; AU2915400A; JP2002537822A; HUP0203058A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem, enthaltend DOLLAR A (a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure, DOLLAR A (b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls DOLLAR A (g) mindestens eine Zusammensetzung, enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise DOLLAR A (h) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls DOLLAR A (e) weitere Hilfsmittel.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend

a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebenenfalls
c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise
d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
e) weitere Hilfsmittel.

Die meisten für Proteine kodierenden Gene in Eukaryonten werden in ihrer Form im Genom durch eine oder mehrere nicht für das Protein kodierende Sequenzen (Introns) unterbrochen. Bei der Transkription der genomischen DNA in die Boten-RNA (messenger RNA = mRNA) werden diese nicht-codierenden Bereiche (Introns) in das primäre Transkript übernommen. Um eine korrekte Form der mRNA zu generieren, muß diese Vorläufer-mRNA (Prä-mRNA) pro zessiert werden.

Die Prozessierung der Prä-mRNA geschieht durch Entfernen der Introns und Fusion der kodie renden Bereiche (Exons). Erst dann kann ein ununterbrochen zu lesender Nukleotidstrang für die Translation im Zytoplasma zur Verfügung gestellt werden. Die Bildung von mRNA in Eu karyonten erfordert daher einen sogenannten Spleißprozess, in dem die nicht kodierenden Genbereiche (Introns) aus dem primären Gentranskript entfernt werden.

Das Spleißen findet im Kern statt, bevor die mRNA aus dem Kern transportiert wird. Es wird im allgemeinen in einem Zwei-Stufen-Mechanismus durchgeführt, in dem jeweils ein Transeste rifizierungsschritt beteiligt ist (Moore, J.M. et al., (1993) Splicing of precursors to messenger RNAs by the Spliceosome. In The RNA world, Edited by Gesteland R.F., Gesteland, J.F., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 303-358). Der erste Schritt generiert ein freies 5'-Exon und eine sogenannte Lariat-Struktur des Introns, welches immer noch mit dem 3'-Exon ver bunden ist. Die Lariat-Struktur enthält eine verzweigte RNA, die durch eine Veresterung des 5'-Endes des Introns mit einer 2'-Hydroxyl-Gruppe einer Ribose in einem Adenosin, das ca. 20- 40 Nukleotide stromaufwärts des 3'-Endes des Introns gelegen ist, entsteht. Der zweite ka talytische Schritt führt zu einer Ligation der Exons und der Freisetzung des Introns. Obwohl keine Nukleotide während dieser Reaktionen eingebaut werden, ist eine Energiequelle, bei spielsweise ATP, für diese Katalyse notwendig (Guthrie, C. (1991) Science, 253, 157). An dem Vorgang des mRNA-Spleißens sind mehrere Faktoren beteiligt. Zwei Klassen von Spleiß-Faktoren werden zur Zeit unterschieden. Die erste Klasse besteht aus vier in der Evolu tion stark konservierten Protein-RNA-Partikeln (small nuclear ribonucleoprotein particles = snRNPs): U1, U2, U4/U6 und U5, die entweder eine (U1, U2, U5) oder zwei (U4/U6) snRNA Komponenten enthalten (Moore, J.M. et al., (1993) supra; Guthrie, (1991) supra; Green, M. R. (1991). Annu. Rev. Cell Biol., 7, 559). Die zweite Klasse besteht aus bisher wenig cha rakterisierten Proteinen, die nicht fest an die snRNPs gebunden sind und daher nicht-snRNP Spleiß-Faktoren genannt werden (Lamm, G.M. & Lamond, A.J. (1993) Biochim. Biophys. Acta, 1173, 247; Beggs, J.D. (1995), Yeast splicing factors and genetic strategies for their analysis, In: Lamond, A.I. (ed) Pre-mRNA Processing Landes, R. G. Company, Texas, pp. 79- 95. Krämer, A. (1995), The biochemistry of pre-mRNA splicing. In: Lamond, A.I. (ed), Pre- mRNA Processing. Landes, R.G. Company, Texas, pp. 35-64).

Die Zusammensetzung der snRNPs ist am besten in HeLa-Zellen untersucht (Will, C.L. et al., (1995) Nuclear pre-mRNA splicing. In: Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. (eds). Nucleic Acids and Molecular Biology. Springer Verlag, Berlin, pp. 342-372). Bei relativ geringen Salzkon zentrationen, bei denen Kern-Extrakte aus HeLa-Zellen das Spleißen von Prä-mRNA in vitro bewirken können, liegen die snRNPs in einem 12S U1 snRNP, einem 17S U2 snRNP und ei nem 25S [U4/U6.U5] tri-snRNP Komplex vor. Bei höheren Salzkonzentrationen (ca. 350-450 mM) dissoziiert der tri-snRNP-Komplex in einen 20S U5- und einen 12S U4/U6-Partikel. Die U4 und U6 RNAs liegen im U4/U6 snRNP über zwei intermolekulare Helices basengepaart vor (Bringmann, P. et al. (1984) EMBO J., 3, 1357; Hashimoto, C. & Steitz, J.A. (1984) Nucleic Acids Res., 12, 3283; Rinke, J. et al., (1985) J. Mol. Biol., 185, 721; Brow, D.A. & Guthrie, C. (1988) Nature, 334, 213).

Die snRNPs bestehen aus zwei Gruppen von Proteinen. In allen snRNPs ist die Gruppe der allgemeinen Proteine (B/B', D1, D2, D3, E, F und G) enthalten. Zusätzlich enthält jeder snRNP spezifische Proteine, die nur in diesem enthalten sind. So enthält nach dem bisherigen Stand der Forschung der U1 snRNP drei zusätzliche Proteine (70K, A und C) und der U2 snRNP elf weitere Proteine. Der 20S U5 snRNP trägt nach bisherigem Kenntnisstand neun weitere Proteine mit einem Molekulargewicht von 15, 40, 52, 100, 102, 110, 116, 200 und 220 kDa, während der 12S U4/U6 snRNP zwei zusätzliche Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 60 und 90 kDa enthält. Der 25S tri-snRNP [U4/U6.U5] enthält fünf zusätzliche Protei ne mit einem Molekulargewicht von ca. 15.5, 20, 27, 61 und 63 kDa. (Behrens, S.E. & Lühr mann, R. (1991) Genes Dev., 5, 1439; Utans, U. et al., (1992) Genes Dev., 6, 631; Lauber, J. et al., (1996) EMBO J., 15, 4001; Will, C.L. et al. (1995), supra, Will, C.L. & Lührmann, R. (1997) Curr. Opin. Cell Biol., 9, 320-328).

Die Zusammensetzung der Spleiß-Komponenten bei Saccharomyces cerevisiae sind noch nicht im Detail untersucht. Biochemische und genetische Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, daß die Sequenzen sowohl der snRNAs als auch der snRNP-Proteine in der Evolution hoch konserviert sind (Fabrizio, P. et al., (1994) Science, 264, 261; Lauber, J. et al., (1996), supra, Neubauer, G. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 385; Krämer, A. (1995), supra; Beggs, J. D. (1995); supra, Gottschalk, A. et al. (1998) RNA, 4, 374-393).

Um einen funktionellen Spleiß-Komplex (Spliceosom) zu bilden, werden die einzelnen Kom ponenten (prä-mRNA, snRNPs und nicht-snRNP-Proteine) in einem stufenweisen Prozeß zu sammengeführt. Dies wird nicht nur durch Interaktionen der prä-mRNA mit den Protein haltigen Komponenten, sondern auch durch zahlreiche Wechselwirkungen zwischen den Pro teinhaltigen Komponenten selbst erreicht (Moore, J.M. (1993) supra; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1994) Annu. Rev. Genetics, 28, 1; Nilsen, T.W. (1994) Cell, 65, 115). Die Prä- mRNA trägt in ihrer Sequenz spezifische Erkennungssequenzen für die unterschiedlichen Spleißkomponenten. Zunächst bindet das U1 snRNP über diese Erkennungssequenzen an die 5'-Spleiß-Region des Introns der prä-mRNA. Gleichzeitig lagern sich eine noch nicht genau bestimmte Anzahl verschiedener weiterer Faktoren (z. B. SF2/ASF, U2AF, SC35, SF1) an die sen Komplex an und kooperieren mit den snRNAs in der weiteren Formierung des Prä- Spliceosoms. Das U2 snRNP-Partikel interagiert mit der sogenannten Branch-Site im Intron- Bereich (Krämer, A. & Utans, U. (1991) EMBO J., 10, 1503; Fu, X.D. & Maniatis, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 1725; Krämer, A. (1992) Mol. Cell Biol., 12, 4545; Zamore, P.D. et al. (1992) Nature, 355, 609; Eperon, J.C. et al. (1993) EMBO J., 12, 3607; Zuo, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3363; Hodges, P.E. & Beggs, J.D. (1994) Curr. Biol. 4, 264; Reed, R. (1996) Curr. Op. Gen. Dev., 6, 215). In einem letzten Schritt der Bildung des Spliceosoms interagiert der [U4/U6.U5] tri-snRNP und eine Anzahl bisher nicht genauer charakterisierter Proteine mit dem Prä-Spliceosom, um das reife Spliceosom zu bilden (Moore, J.M. et al., (1993) supra).

Für den Vorgang des Spleißens werden verschiedene Wechselwirkungen zwischen Prä-mRNA, snRNAs und sn-RNP gelöst und neue gebildet. So ist bekannt, daß vor oder während des er sten katalytischen Schritts der Spleißreaktion in den interagierenden Strukturen von U4 und U6 zwei Helices voneinander getrennt und durch neue Interaktionen Basenpaarungen zwischen U2- und U6-RNAs gebildet werden (Datta, B. & Weiner, A.M. (1991) Nature, 352, 821; Wu, J.A. & Manley, J.L. (1991) Nature, 352, 818; Madhani, H.D. & Guthrie, C. (1992) Cell, 71, 803; Sun, J.S. & Manley, J.L. (1995) Genes Dev., 9, 843. Gleichzeitig wird die Bindung von U1 an die 5'-Spleißstelle gelöst und die prä-mRNA bindet sich an die Erkennungssequenz ACAGAG der U6 snRNA (Fabrizio, P. & Abelson, J. (1990) Science, 250, 404; Sawa, H. & Abelson, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11269; Kandels-Lewis, S. & Séraphin, B. (1993) Science, 262, 2035; Lesser, C.F. & Guthrie, C. (1993) Science, 262, 1982; Sontheimer, E.J. & Steitz, J.A. (1993) Science, 262, 1989; . Das U5 snRNP interagiert über seinen kon servierten Loop 1 mit Exon-Sequenzen, die nahe an den 5'- und 3'-Spleißstellen gelegen sind. Dieser Vorgang scheint sequenziell abzulaufen, während der gesamte Spleiß-Prozess von Stufe 1 zu Stufe 2 fortschreitet (M. McKeown, (1992) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 8: 133- 155 Newman, A. & Norman, C. (1991) Cell, 65, 115; Wyatt, J.R. et al., (1992) Genes Dev., 6, 2542; Cortes, J.J. et al. (1993) EMBO J., 12, 5181; Sontheimer, E.J. & Steits, (1993) supra). Nach der Beendigung der Spleiß-Reaktion wird die reife mRNA freigesetzt und das Spliceo som dissoziiert (Moore, J.M. et al., (1993) supra).

Durch alternatives Spleißen können aus ein und demselben Primärtranskript verschiedene reife mRNAs gebildet werden, die für verschiedene Proteine kodieren. Dieses alternative Spleißen ist in vielen Fällen reguliert. So kann dieser Mechanismus z. B. dazu genutzt werden, von einem nicht funktionellen zu einem funktionellen Protein umzuschalten (z. B. Transposase bei Droso phila). Weiterhin ist bekannt, daß alternatives Spleißen gewebespezifisch durchgeführt wird. So wird z. B. die Tyrosin-Kinase, die vom src-Proto-Oncogen codiert wird, in Nervenzellen durch alternatives Spleißen in einer speziellen Form synthetisiert.

Fehlerhaft reguliertes oder ausgeführtes alternatives Spleißen kann zu verschiedenen Krank heitsbildern führen. Bei Patienten, die an der Grave's Krankheit leiden, ist gezeigt worden, daß durch fehlerhaftes Spleißen ein entscheidendes Enzym (Thyroperoxidase) in einer inaktiven Form entsteht (Zanelli, E. (1990) Biochem. Biophys. Res. Comm., 170, 725). Untersuchungen für die Krankheit Spinale Muskelatrophy weisen darauf hin, daß ein defektes Genprodukt des Gens SMN (Survival of motor neurons) zu einer erheblichen Störung der Bildung der snRNPs führt. Durch die Inhibierung des Spleißapparates der Muskelneuronen, kommt es zu einer Pa ralyse der Nervenzellen und zu einem Abbau des Muskelgewebes (Fischer, U. et al., (1997), Cell, 9: 1023-9; Liu, Q. et al. (1997), Cell, 90: 1013-21; Lefebvre, S. et al. (1997) Nat. Ge net., 16, 265). Bei der Metastasierung von Krebszellen scheinen unter anderem bestimmte al ternative Spleißvarianten von dem membranständigen Molekül CD44 eine entscheidende Rolle zu spielen. Das CD44-Gen enthält mehrere Exons, von denen 10 nebeneinanderliegende Exons in unterschiedlicher Anordnung bei der mRNA-Generierung aus der prä-mRNA gespleißt wer den. Bei Ratten Karzinomazellen wurde nachgewiesen, daß metastasierende Varianten die Exons 4 bis 7 oder 6 bis 7 tragen. Mit Hilfe von Antikörpern gegen den von Exon 6 kodierten Teil des Proteins konnte die Metastasierung wirksam unterdrückt werden (Sherman, L., et al., (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213: 249-269).

Fehlerhaftes Spleißen kann zu stark ausgeprägten Phänotypen des betroffenen Organismus führen. So ist bekannt, daß eine Punktmutation in einem Intron des β-Globin zu einer β⁺- Thalassaemie führen kann. Durch die Punktmutation entsteht ein falscher Spleißort, der zu einem veränderten Leseraster und zu einer vorzeitigen Termination der Peptidkette führt (Weatherall, D.J. & Clegg, J.B. (1982) Cell, 29, 7; Fukumaki, Y. et al. (1982) Cell, 28, 585). Bei Arabidopsis thaliana Mutanten führt z. B. eine Punktmutation an der 5'-Spleißstelle des Phytochrom B Gens zu einer fehlerhaften Expression des Gens. Durch diese Veränderung kann ein Intron nicht entfernt werden, welches ein Stopcodon in seiner Sequenz enthält. Die Ent wicklung der Pflanzen ist gestört, da das Gen an der Phytomorphogenese beteiligt ist (Bradley, J.M. et al. (1995) Plant Mol. Biol, 27, 1133).

Bisher sind nur wenige Arbeiten bekannt geworden, in denen eine Beeinflussung von Spleiß vorgängen in der Zelle beschrieben worden sind. So kann mit Hilfe von Antiseren oder mono klonalen Antikörpern gegen Komponenten des Spleißapparates die Generierung von reifer mRNA verhindert werden (Padgett, R.A. et al. (1983) Cell, 35, 10; Gattoni, R. et al. (1996) Nucleic Acid Res., 24, 2535).

Das NS1-Protein, das durch das Genom des Influenza Virus codiert wird, kann ebenfalls durch Bindung an die U6 snRNA in das Spleißen eingreifen. Das Protein bindet an die Nukleotide 27-46 und 83-101 der humanen U6 snRNA und verhindert so, daß U6 während des Ablaufs des Spleißvorganges mit den Partnern U2 und U4 interagieren kann (Fortes, P. et al. (1994) EMBO J., 13, 704; Qiu, Y. & Krug, R.M. (1995) J. Virol., 68, 2425. Darüberhinaus scheint das NS1-Protein auch über Bindung an den poly-A-Schwanz der gebildeten mRNA einen Ex port aus dem Kern zu verhindern (Fortes, P. et al. (1994), supra; Qiu, Y. & Krug, R.M. (1994), supra). Ähnliche Wirkungen werden von einem Genprodukt des Herpes Simplex Virus Typ 1 Genoms beschrieben. Das Protein ICP27 konnte in in vitro Experimenten das Spleißen von einer Modell-RNA (β-Globin-Prä-mRNA) wirkungsvoll verhindern (Hardy, W.R. & San dri-Goldin, R.M. (1994) J. Virol., 68, 7790). Außerdem scheinen Peptide, die aus der C- terminalen Domäne der großen Untereinheit der RNA Polymerase II generiert wurden, eben falls in die Spleiß-Vorgänge eingreifen zu können (Yurvey, A. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93, 6975; WO97/20031). Der Einbau von künstlichen Nukleotidanaloga (5-Fluor-, 5-Chlor- oder 5-Bromuridin) in die zu spleißende mRNA kann ebenfalls zu einer Inhibierung des Spleißvorganges in vitro führen (Sierakowska, H. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264, 19185; Wu, X.P. & Dolnick, B. (1993) Mol. Pharmacol., 44, 22).

Eine Anzahl von weiteren Untersuchungen betrifft die Wirkung von Anti-Sense- Oligonukleotiden auf das Spleißen. So scheint das Verhältnis von zwei unterschiedlichen Spleißprodukten der c-erb-Onkogen-mRNA (c-erbA-alpha 1 und 2) der Ratte durch eine wei tere mRNA, rev-ErbA-alpha, reguliert zu werden. Rev-ErbA-alpha ist eine natürlich vorkom mende anti-Sense-RNA, die mit der c-erbA-alpha 2 mRNA aber nicht mit der c-erbA-alpha 1 mRNA paart. Das Spleißen der c-erbA-alpha prä-mRNA zur c-erbA-alpha 2 mRNA konnte durch einen Überschuß an rev-ErbA-alpha mRNA-Konstrukten, die komplementär zur 3'- Spleißstelle waren, wirkungsvoll inhibiert werden (Munroe, S.H. & Lazar, M. A., (1991) J. Biol. Chem., 266(33), 22083). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß durch Generierung von anti-sense-RNA, die an die Intron-Sequenzen der zu spleißenden mRNA binden, ebenfalls Spleißen inhibiert werden kann (Volloch, V. et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 179, 1600). Hodges und Crooke konnten zeigen, daß bei schwach erkannten Spleißstellen die Bin dung von Oligonukleotiden ausreicht, um erfolgreich das Spleißen zu unterbinden. Werden dagegen bevorzugt erkannte Spleißstellen in die Konstrukte eingebaut, werden Oligonukleoti de benötigt, die zusätzliche eine Aktivierung der RNase H bedingen können (Hodges, D. & Crooke S.T. (1995) Mol. Pharmacol., 48, 905). Eine genauere Analyse der für das Spleißen benötigten Sequenzen der prä-mRNA zeigte, daß 19 Nukleotide stromaufwärts vom Branch- Point Adenosin und 25 Nukleotide um die 3'- und 5'-Spleiß-Stelle geeignete Sequenzen zur Generierung von Antisense RNAs sind (Dominski, Z. & Kole, R. (1994) Mol. Cell Biol., 14, 7445). Insbesondere für die Hemmung von Viren wurden Untersuchungen mit Antisense Mo lekülen gemacht. Viren, die höhere Organismen befallen, tragen oft Intron-enthaltende Gene in ihrem Genom. So konnte gezeigt werden, das Antisense Oligonukleotide gegen die 3'- Spleißstelle des immediate early Prä-mRNA 4/5 Gens des Herpes simplex Virus in Vero-Zellen die Replikation des Virus hemmen konnte (Iwatani, W. et al. (1996) Drug Delivery Syst., 11, 427).

Zur Untersuchung des Spleiß-Mechanismus wird im allgemeinen zunächst eine mRNA durch in vitro Transkription hergestellt. Hierzu werden genetische Konstrukte aus Viren, z. B. Adeno viren, oder zellulärer Strukturgene verwendet. Derartige mRNAs enthalten alle wichtigen Strukturelemente, die für die Erkennung der mRNA durch das Spliceosom und den Ablauf des Spleißens notwendig sind. Im allgemeinen wird die mRNA radioaktiv markiert, damit man nach der Auftrennung auf einem denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgel aufgrund der charakteristischen Bandenmuster beurteilen kann, ob eine Spleißreaktion stattgefunden hat, bzw. bei welchem Reaktionsschritt eine Störung stattgefunden hat. Derartige Testsysteme sind jedoch sehr Zeit- und arbeitsaufwendig und daher nicht für das systematische Auffinden von Substanzen, die das Spleißen modulieren können, geeignet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Testsystem zu finden, mit dem auf ein fache und effektive Art und Weise eine große Anzahl von Verbindungen aus chemischen oder natürlichen Substanzbibliotheken auf ihre Wirkung beim Spleißen von Nukleinsäuren unter sucht werden können (sog. High Through-Put Screening).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein Testsystem mit einem gelfreien Nach weissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion geeignet ist, die oben beschriebenen Nachteile des gängigen Testsystems zu überwinden und somit für das High Through-Put Screening bei spielsweise in einer Roboteranlage geeignet ist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Testsystem enthaltend

a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit minde stens einer spleißfähigen Nukleinsäure,
b) mindestens ein gelfreies Nachweissystem zum Nachweis einer Spleißreaktion, gegebe nenfalls
c) mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten, und vorzugsweise
d) geeignete Nachweissonden, und gegebenenfalls
e) weitere Hilfsmittel.

Für die Bereitstellung eines gelfreien Testsystems für die Untersuchung von Spleißvorgängen ist die zu untersuchende Nukleinsäure an einer Festphase zu immobilisieren. Die Immobilisie rung der Nukleinsäure kann beispielsweise kovalent, durch die Einführung von bestimmten Strukturelementen, beispielsweise Aptameren, in die zu spleißende Nukleinsäure und Verwen dung von Bindungspartnern für diese Strukturelemente oder durch eine Hybridisierung erfol gen.

Für das gelfreie Testsystem ist zudem vorteilhafterweise eine geeignete Sonde zu generieren, die den Nachweis des erfolgten Spleißens bzw. des nicht erfolgten Spleißens ermöglicht. Diese Sonde kann beispielsweise ein zur Hybridisierung an die zu untersuchende Nukleinsäure ver wendetes Oligonukleotid oder ein Bindungspartner, der an in die zu untersuchende Nuklein säure eingeführte Strukturelemente bindet, sein.

Das gelfreie Nachweissystem enthält daher vorzugsweise mindestens eine Sonde. Insbesondere ist die Sonde eine zu der spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, eine die spleißfähige Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung und/oder ein die spleißfähige Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die spleißfähige Nukleinsäure mindestens zwei Exons, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.

Beispielsweise ist die komplementäre Nukleinsäure zu mindestens einem Intron, zu mindestens einem Exon und/oder zu mindestens einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron und/oder zu der nach der Fusion der beiden Exons entstandenen Exon/Exon-Grenze komple mentär. Die komplementäre Nukleinsäure dient hierbei als Sonde zum Nachweis einer Spleiß reaktion.

So kann beispielsweise das während der Spleißreaktion freigesetzte Intron mittels des gelfreien Nachweissystems nachgewiesen werden, woraus gefolgert werden kann, daß beide Teilschritte der Spleißreaktion vollständig abgelaufen sind. Alternativ kann anhand eines geeigneten Nach weissystems, beispielsweise einer zu einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron komplementären Nukleinsäure festgestellt werden, ob während des Spleißvorganges das Exon von dem Intron gelöst worden ist, was einen Aufschluß darüber geben kann, ob die erste Spleißreaktion am 5'-Ende des Introns und/oder die zweite Spleißreaktion am 3'-Ende des Introns erfolgte. Andere Nachweisformen sind unten im Detail erläutert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Sonde eine niedermolekulare Verbin dung, beispielsweise Theophyllin, Xanthin oder ein Aminoglycosid wie Tobramycin. Enthält beispielsweise die spleißfähige Nukleinsäure oder eine zur spleißfähigen Nukleinsäure komple mentäre Nukleinsäure des gelfreien Nachweissystems eine sog. Aptamer-Struktur, d. h. eine Bindesequenz für derartige Bindungspartner (siehe z. B. Jenison, R.D. et al. (1994) Science 263, 1425-1429, Hamasaki, K. et al. (1998) Biochem. 37, 656-663 oder Kiga, D. et al. (1998) Nucleic Acids Res., 26 (7), 1755-1760), so kann der Spleißvorgang besonders einfach über den Bindungspartner nachgewiesen werden.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform kann der Bindungspartner ein Nu kleinsäure-Bindeprotein, insbesondere ein "Iron Responsive Element Binding Protein" (IBP) sein, welches eine Erkennungssequenz für ein Nukleinsäure-Bindeprotein, insbesondere ein "Iron Responsive Element" (IRE) erkennt. Der Nachweis eines gegebenenfalls erfolgten Spleißvorganges erfolgt hierbei über das Nukleinsäure-Bindeprotein.

Die beschriebenen Wechselwirkungen zwischen Bindungspartner und Strukturelement in der Nukleinsäure (niedermolekulare Verbindung und Aptamer, IBP und IRE, Oligonukleotid und Sequenz in der Nukleinsäure) sind ebenfalls geeignet die zu untersuchende spleißfähige Nu kleinsäure an einer Festphase zu immobilisieren. Hierzu muß der Bindungspartner in geeigneter Weise an der Festphase verankert werden. Dabei kann beispielsweise der Bindungspartner ko valent an die Festphase gebunden werden. Desweiteren eignen sich die Kopplung von Biotin an die Nukleinsäure und die Verwendung von an der Festphase gebundenem (Strept-)Avidin für eine Verankerung der Nukleinsäure. Diese Verankerung kann beispielsweise auch durch Ver wendung von Antikörper/Antigen-Wechselwirkungen erreicht werden.

Im allgemeinen enthält die Sonde eine Markierung, beispielsweise eine radioaktive Markierung, eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, mit Biotin, mit Digoxigenin und/oder mit Anti körpern. Vorzugsweise ist die Markierung an dem Liganden, beispielsweise an der komple mentären Nukleinsäure, an der niedermolekularen Verbindung oder an dem Nukleinsäure- Bindeprotein angebracht. Insbesondere mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen kann auf einfache und in automatisierten Systemen schnelle Art und Weise festgestellt werden, ob beispielsweise durch Entfernung des Bindungspartners der Sonde in der Nukleinsäure während des Spleiß vorganges eine Spleißreaktion beispielsweise in Anwesenheit von mindestens einer zu untersu chenden Substanz ungestört ablaufen kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die spleißfähige Nukleinsäure und die Son den-bindende Nukleinsäure miteinander verbunden. Dies hat den Vorteil, daß die Spleißreakti on direkt beispielsweise über die Freisetzung der Sonden-bindenden Nukleinsäure nachgewie sen werden kann. Bei dieser Ausführungsform ist die Sonden-bindende Nukleinsäure vorzugs weise eine Nukleinsäure, die eine niedermolekulare Verbindung, beispielsweise ein sogenanntes Aptamer, und/oder ein Nukleinsäure-Bindeprotein binden kann. Da für die Bindung derartiger Sonden im allgemeinen bestimmte Strukturelemente der Nukleinsäuren verantwortlich sind, wird die Sonden-bindende Nukleinsäure bei den folgenden bevorzugten Konstrukten mit "SE" für Strukturelement abgekürzt, wobei "3'-Region" einen Nukleinsäureabschnitt am 3'-Ende der Nukleinsäure bedeutet:

1. Konstrukte mit im 5'-Exon eingeführten Strukturelement (SE)

2. Konstrukt mit im Intron eingeführten Strukturelement

3. Konstrukte mit im 3'-Exon eingeführten Strukturelement

4. Konstrukte mit Kombinationen aus den in 1.-3. aufgeführten Konstrukten

5. Konstrukte mit verschiedenen Strukturelementen

Die Konstrukte zu 1. dienen hierbei insbesondere zum Nachweis, ob das Exon1 von der Intronsequenz während des Spleißvorganges abgetrennt werden konnte. Das Konstrukt zu 2. dient zum direkten Nachweis einer abgetrennten Intronsequenz. Die Konstrukte unter 3. die nen zum Nachweis, ob das Exon2 erfolgreich von der Intronsequenz abgetrennt werden konn te. Eine Kombination der Konstrukte gemäß 4. dient zum Nachweis der einzelnen Zwischen- und Endprodukte während des Spleißvorganges. Exon1 steht im allgemeinen für ein 5' vom Intron gelegenes Exon und Exon2 steht im allgemeinen für ein 3' vom Intron gelegenes Exon.

Die Konstrukte unter 5. enthalten verschiedene zusätzliche Erkennungssequenzen, die zum einen verschiedene Nachweissysteme betreffen können und die zum anderen über deren Bin dungspartner die Bindung der Nukleinsäure an eine feste Phase ermöglichen können. So kann beispielsweise zum Immobilisieren in der 3'-Region eine Sonden-bindende Nukleinsäure ein geführt werden, und gleichzeitig zum Nachweis des Spleißvorganges eine andere Sonden bindende Nukleinsäure im Exon1 (siehe zu 5., erstes Konstrukt). Darüber hinaus können bei spielsweise drei verschiedene Nukleinsäuren eingeführt werden, die zum einen zur Immobilisie rung der gesamten Nukleinsäure und zum anderen zum Nachweis des entfernten Introns und zum Nachweis der Verknüpfung von Exon1 an die restliche Nukleinsäure dient (siehe zu 5., zweites Konstrukt). Die Lokalisation der einzelnen unter 5. beispielhaft aufgeführten Sonden bindenden Nukleinsäuren kann gemäß den oben beschriebenen Konstrukten unter 1.-4. variie ren. Zudem ist die genaue Lokalisation der einzelnen Sonden-bindenden Nukleinsäuren varia bel.

In einer weiteren Ausführungsform ist daher die Nukleinsäure, vorzugsweise die spleißfähige Nukleinsäure, insbesondere eine Nukleinsäure gemäß einer der oben beschriebenen Ausfüh rungsformen, direkt kovalent oder indirekt über ein Strukturelement und Bindungspartner zum Strukturelement oder mittels Hybridisierung an eine feste Phase gebunden.

Die direkte kovalente Bindung kann beispielsweise über die 3'-terminale cis-diol-Gruppe des Riboserückgrates der Nukleinsäure erfolgen. Beispielsweise kann eine RNA an Hydrazingrup pen der festen Phase nach Perjodatoxidation der vicinalen 2', 3'-Hydroxylgruppen der 3'- terminalen Ribose gebunden werden. Für eine indirekte Bindung eignen sich auch geeignete Linker, wie beispielsweise Biotin- oder Dicarbonsäure-Linker. Die Bindung der Nukleinsäure kann jedoch auch, wie oben bereits ausgeführt, über einen Bindungspartner, beispielsweise über Theophyllin, Xanthin oder ein Aminoglycosid wie Tobramycin und/oder über ein Nuklein säure-Bindeprotein, wie beispielswiese IBP, erfolgen.

Für die Immobilisierung einer Nukleinsäure an einen Träger-gebundenen Liganden eignet sich beispielsweise im Falle von Theophyllin als Träger-gebundenen Bindungspartner das Theo phyllin-Aptamer Th (K_d = 0,9 µM) (siehe z. B. Jenison, R.G. et al. (1994) supra) oder im Falle von Tobramycin als Träger-gebundenen Bindungspartner die Minimalversion des Tobramycin- Aptamers To (K_d = 0,2 µM) (Hamasaki, K. et al. (1998) supra). Die Sequenzen der beiden Aptamere sind vorzugsweise:

Die feste Phase ist hierbei beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Glas, Kunststoff oder Polysaccharide, z. B. ein Agarosepolymer.

Sonden-bindende Nukleinsäuren, beispielsweise Aptamere, sind aber auch geeignet, um mar kierte Sonden zu binden, wodurch z. B. die Aptamer-enthaltende Nukleinsäure nachgewiesen und auch quantifiziert werden kann. Beispielsweise kann Tobramycin mit käuflichen, NHZ reaktiven Fluoreszenz-Farbstoffen umgesetzt werden (Wang, Y. et al. (1996) Biochemistry 35, 12338 - 12346). Bei Theophyllin wird vorzugsweise ein 1-Aminoalkyl- oder 1-Thioalkyl- Derivat des 3-Methylxanthins hergestellt, das an das Aptamer binden kann (Jenison, R.D. et al. (1994), supra).

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die spleißfähige Nukleinsäure jede beliebige Nukleinsäu re, die gespleißt werden kann, vorzugsweise eine RNA, beispielsweise in Form einer soge nannten Prä-mRNA oder in Form einer DNA, die RNA-Abschnitte enthält. Für den Fall, daß die RNA zusätzliche Sonden-bindende Sequenzen, wie oben bereits näher beschrieben, enthal ten soll, ist es vorteilhaft, wenn diese auf beiden Exon-Seiten mindestens ca. 25 Nucleotide von der jeweiligen Spleißstelle, auf der Intronseite mindestens ca. 17 Nucleotide vom Branchpoint und/oder mindestens ca. 7 Nucleotide von der 5'-Spleißstelle entfernt sind. Hierdurch wird im allgemeinen gewährleistet, daß die zusätzlichen Sonden-bindenden Sequenzen die Spleißreak tionen nicht stören können.

Eine für das Spleißen im Humansystem geeignete spleißfähige Nukleinsäure ist beispielsweise die MINX-Modell-prä-mRNA (MINIX = miniature wildtype substrate; Zillmann, M., Zapp, M.L., Berget, S.M., (1988), Mol. Cell. Biol., 8: 814-21). In die MINX-kodierende DNA kann vorzugsweise eine zum Nachweis oder zur Immobilisierung geeignete weitere Sonden bindende Nukleinsäure, wie oben bereits beschrieben, eingeführt werden, wobei vorzugsweise die Restriktionsenzymschnittstelle erhalten bleiben soll. Hierdurch kann man bei Bedarf in ei nem weiteren Klonierungsschritt eine weitere gleiche oder verschiedene Sonden-bindende Nukleinsäure für den Nachweis bzw. zur Immobilisierung einbauen, um dadurch die Fluores zenzsignale verstärken oder die Bindung an die feste Phase festigen zu können.

Zur Immobilisierung von Prä-mRNA werden beispielsweise die Aptamere Th oder To am 3'- Ende des Exon2 der Prä-mRNA eingefügt und der entsprechende Bindungspartner an der Festphase kovalent gebunden. Die entsprechenden kodierenden Nukleinsäuresequenzen sind in Fig. 1A und 1B dargestellt.

Hierbei wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-Oligonucleotid in die BamHI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 219 und 220 der korrespondierenden Minx-prä-mRNA, inseriert.

Wie bereits oben erwähnt, können auch Sonden-bindende Nukleinsäuren in die Intron-Struktur der prä-mRNA eingefügt werden, wobei diese durch das Spleißen freigesetzt und somit in der beispielsweise immobilisierten mRNA fehlt. Derartige Konstrukte eignen sich daher zum Nachweis einer Inhibierung des Spleißens im ersten Schritt, d. h. Öffnen der mRNA und La riatbildung, oder im zweiten Schritt, d. h. Entfernung des Lariats. Im Falle einer Inhibierung des Spleißprozesses würden die Sonden-bindenden Nukleinsäuren nicht aus der prä-mRNA entfernt werden und könnten daher beispielsweise nach Immobilisierung der prä-mRNA nach gewiesen werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in Fig. 2A und 2B dargestellt.

Hierzu wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-Oligonucleotid in die PstI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 88 und 89 der korre spondierenden prä-mRNA, inseriert.

Wie bereits oben näher beschrieben, wird die Verbindung zwischen Exon1 und Intron im ersten Spleißschritt durch das Spliceosom an der 5'-Spleißstelle des Introns geöffnet. Erst im zweiten Spleißschritt erfolgt eine kovalente Verknüpfung von Exon1 und Exon2. Das Exon1 ist folg lich während des ersten Schrittes der Spleißreaktion nicht mehr mit der mRNA verbunden und somit aus der Spleißreaktion entfernbar. In Verbindung mit Konstrukten, die beispielsweise eine Aptamerstruktur im Intron haben, kann daher eine Aussage darüber gemacht werden, ob im ersten Spleißschritt beispielsweise eine Inhibierung stattgefunden hat. Werden beispielswei se zwei verschiedenen Aptamere, die verschiedene Sonden erkennen, am 5'-Ende des Exon1 und im Intron der prä-mRNA eingebaut, so kann sowohl der erste Spleißschritt, wie auch der zweite Spleißschritt in einem Testsystem verfolgt werden. Beispiele geeigneter Nukleinsäure konstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in Fig. 3A und 3B dargestellt.

Hierzu wird beispielsweise die entsprechende Aptamersequenz als DNA-Oligonucleotid in die EcoRI-Schnittstelle der kodierenden Minx-DNA, d. h. zwischen Position 9 und 10 der korre spondierenden Minx-prä-mRNA, inseriert.

Für Untersuchungen im Hefesystem kann man beispielsweise von der prä-mRNA für U3 der Hefe ausgehen (Mougin, A. et al., (1996), RNA, 2: 1079-93) und beispielsweise geeignete Aptamere, wie z. B. die oben beschriebenen Theophyllin- oder Tobramycin-Aptamere, einbau en. Beispiele geeigneter Nukleinsäurekonstrukte sind in Form ihrer kodierenden Sequenzen in Fig. 4A bis 4C dargestellt.

Zur Herstellung des Nukleinsäurekonstruktes gemäß Fig. 4A wird beispielsweise ein geeigne tes Aptamer als DNA-Oligonucleotid in die SacII-Schnittstelle der kodierenden U3-DNA, d. h. zwischen Position 22 und 23 der prä-U3RNA, inseriert.

Zur Herstellung des Nucleinsäurekonstruktes gemäß Fig. 4B wird beispielsweise ein geeignetes Aptamer als DNA-Oligonucleotid in die BstNI-Schnittstelle der kodierenden U3-DNA, d. h. zwischen Position 105 und 106 der prä-U3RNA, inseriert.

Die Nukleinsäuresequenz gemäß Fig. 5A stellt ein Beispiel einer Nukleinsäuresequenz mit ei nem "Iron Responsive Element" (IRE) dar, das für Untersuchungen im Humansystem geeignet ist. Das IRE ist hierbei an dem 3'-Ende des Exon2 analog den oben beschriebenen Aptameren eingefügt.

Für Untersuchungen im Hefesystem kann ein IRE-Element beispielsweise an dem 3'-Ende des Exon2 der prä-U3RNA, wie in Fig. 5B dargestellt, eingefügt werden:
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine spleißfähige Nukleinsäure, wie oben beispielhaft dargestellt, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Testsystems.

Zur Durchführung der Untersuchungen der einzelnen Spleißreaktionen mit Hilfe eines erfin dungsgemäßen Testsystems wird üblicherweise eine Zusammensetzung enthaltend die einzel nen Spleißkomponenten, vorzugsweise "Small Nuclear Ribonucleoprotein Particles" snRNP)- Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten verwendet. Insbesondere enthalten die snRNP- Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn man entsprechende Zellextrakte, insbesondere eukaryotische Zellextrakte fiür die Untersuchun gen verwendet. Beispielsweise können die Zellextrakte aus tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, vor allem HeLa-Zellen, insbesondere aus Zellkernextrakten von HeLa-Zellen oder Zellextrakte von Pilzen, insbesondere Hefen, nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren gewonnen werden (siehe Beispiele). Die Zellextrakte enthalten im allgemeinen alle wichtigen Faktoren, um ein Spleißen in vitro durchführen zu können.

Zur Durchführung der Untersuchungen ist es essentiell, weitere Hilfsmittel, wie z. B. Pufferlö sungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalente, insbesondere ATP, einzusetzen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf eine Verfahren zur Herstellung eines Testsystems, bei dem mindestens eine spleißfähige und immobilisierte Nukleinsäure und minde stens ein gelfreies Nachweissystem sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weitere Hilfsmittel zusammengestellt wer den. Bevorzugte Ausführungsformen der einzelnen Komponenten sind bereits oben näher be schrieben worden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, wobei

a) eine oder mehrere gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer zu untersu chenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.

Bevorzugte einzelne Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind oben bereits näher beschrieben.

Die wirksame Substanz kann hierbei eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Fungizid, ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein Insektizid sein, vorzugsweise ist es ein Antibiotikum. Die zu untersuchende Substanz ist im allgemeinen eine natürlich vorkommende, eine natürlich vorkommende und chemisch modifizierte und/oder eine synthetische Substanz. Insbesondere können mit den erfindungsgemäßen Verfahren besonders einfach und schnell sogenannte kom binatorische Substanzbibliotheken durchsucht werden.

In der Beschreibungseinleitung wurde bereits darauf hingewiesen, daß verschiedene Erkran kungen auf eine Störung des Spleißmechanismus zurückzuführen sind. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung auch zur Diagnose einer Erkrankung.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Diagnose ei ner Erkrankung, wobei

a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer Zusammen setzung enthaltend Spleißkomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter ge eigneten Bedingungen inkubiert werden, und
b) daß sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelifeien Nachweissystems nachgewiesen wird.

Die zu diagnostizierenden Erkrankungen sind hierbei vorzugsweise Erbkrankheiten, Krebser krankungen und/oder virale Erkrankungen, insbesondere Grave's Krankheit, spinale Muskela trophie, β'-Thalassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c-Erb-Onkogen, Hepatitis-C Infektionen und/oder Herpes Simplex Virus Infektionen. Die Zusammensetzung enthaltend Spleißkomponenten kann in diesem Fall beispielsweise eine behandelte oder unbehandelte Ge webeprobe des Patienten sein.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu be schränken. Dargestellt sind die Konstrukte in DNA-Sequenzen. Die spleißfähigen RNAs kön nen durch in vitro-Transkription, wie sie weiter unten beschrieben ist, generiert werden.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der an das 3'-Ende des Exon2 einer für Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.

Fig. 1B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der an das 3'-Ende des Exon2 einer für Minx codierenden prä-mRNA ein To-Aptamer eingefügt wurde.

Fig. 2A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der in das Intron einer für Minx codie renden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.

Fig. 2B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der in das Intron einer für Minx codie renden prä-mRNA ein To-Aptamer eingefügt wurde.

Fig. 3A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, in der an das 5'-Ende des Exon1 einer für Minx codierenden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.

Fig. 3B zeigt die Sequenz einer RNA in der an das 5'-Ende des Exon1 einer für Minx codie renden prä-mRNA ein Th-Aptamer eingefügt wurde.

Fig. 4A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Am 5'- Ende des Exon1 ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet.

Fig. 4B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Im Intron ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet.

Fig. 4C zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine U3-prä-mRNA kodiert. Am 3'- Ende des Exon2 ist eine Einfügestelle für ein Th- oder To-Aptamer gekennzeichnet.

Fig. 5A zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine Minx-prä-mRNA kodiert. Am 3'-Ende des Exon2 ist ein die Sequenz für IRE eingefügt.

Fig. 5B zeigt die kodierende Nukleinsäuresequenz, die für eine der U3-prä-mRNA kodiert. Am 3'-Ende des Exon2 ist ein die Sequenz für IRE eingefügt.

Fig. 6 zeigt den zeitlichen Verlauf des Spleißens von MINX- und MINX-IRE-prä-mRNA durch HeLa Kernextrakt.

In vitro transcribierte MINX (Spuren 1-5) und MINX-IRE (Spuren 6-10) prä-mRNAs wurden mit HeLa Kernextrakt für den in der Abbildung angegebenen Zeitraum inku biert. Anschließend wurden die Proben mittels Polyacrylamid/Harnstoff- Gelektrophorese aufgetrennt und die 32P-markierte RNA mit Hilfe von Autoradio graphie nachgewiesen. Mehrfache Banden bei der IRE enthaltenden RNA (Spuren 6- 10) sind durch unvollständige Denaturierung des IRE zu erklären.

Beispiele 1. Das RNA-Konstrukt

Die zu spleißende mRNA besteht aus mindestens zwei Exons, die durch ein Intron getrennt sind. Zusätzlich zu diesen Sequenzen sind Sequenzen enthalten, die geeignet sind, eine spezifi sche Erkennung durch RNA-Bindeproteine oder niedermolekulare Verbindungen zu ermögli chen. Über die Kopplung dieser Bindeproteine oder Verbindungen an eine Matrix wird die mRNA selektiv an die Matrix gebunden. Alternativ erfolgt die Kopplung der mRNA auch ko valent über 3'-OH-Gruppen der Ribose direkt an die Matrix.

2. Präparation der Kernextrakte 2.1 Kernextrakte aus Säugetierzellen

Für das Herstellen von Kernextrakte aus Säugetierzellen werden Zellkulturen mit Hela-Zellen herangezogen. Hierzu werden die Zellen durch Zentrifugation (1000 × g, 10 Min.) aus dem Kulturmedium sedimentiert und mit Phosphatpuffer gewaschen. Anschließend wird das Zellse diment in fünffachem Volumen Puffer A (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, pH 7,9, 4°C) aufgenommen und 10 Minuten inkubiert. Die Zellen werden erneut sedimentiert und in zweifachem Volumen Puffer A aufgenommen. Diese Suspension wird mit einem Dounce Homogenisator (Pistill B) aufgeschlossen (10faches. Auf und Abbewegen des Pistills). Die Kerne werden durch Zentrifugation sedimentiert. Abschließend werden die Kerne erneut in Puffer A aufgenommen und für 20 Minuten bei 25.000 × g zentrifugiert. Das Sedi ment wird in 3 ml Puffer B (20 mM HEPES, 25% (v/v) Glycerin, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM DTT, pH 7,9) aufgenommen und erneut mit dem Dounce Homogenisator aufgeschlossen. Die entstehende Suspension wird 30 Minuten auf einem Magnetrührer inkubiert und anschließend bei 25.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert. Erneut schließt sich eine Zentrifugation bei 25.000 × g (30 Min.) an. Der klare Überstand wird gegen das 50fache Volumen Puffer C (20 mM HEPES, 20% (v/v) Glycerin, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT, pH 7,9) dialy siert. Das Dialysat wird zentrifugiert (25.000 × g, 20 Min.) und der resultierende Überstand kann als Kernextrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden (Dignam; J.D. et al. (1983) Nucleic Acid Res., 11, 1475).

2.2 Zellextrakte aus Hefezellen

Zellextrakte aus Hefezellen werden auf sehr ähnliche Weise hergestellt. Hefezellen eines Pro tease-defizienten Stammes (BJ926, EJ101 oder ähnliche Stämme) werden in der logarithmi schen Wachstumsphase durch Zentrifugation (1500 × g, 5 Min., 4°C) sedimentiert. Die Zellen werden in dem zwei- bis vierfachen Volumen eiskaltem Wasser resuspendiert und erneut bei 1.500 × g (5 Min, 4°C) zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in dem einfachen Volu men Zymolyasepuffer (50 mM Tris HCL, 10 mM MgCl₂, 1M Sorbitol, 30 mM DTT, pH 7,5) aufgenommen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden abzentrifu giert (1.500 × g, 5 Min., 4°C), in dem dreifachen Volumen Zymolyasepuffer mit 2 mg (200 U) Zymolyase 100 T aufgenommen und 40 Minuten bei 30°C auf einem Schüttler (50 RPM) inku biert. Die entstandenen Sphäroblasten werden abzentrifugiert (1.500 × g, 5 Min., 4°C) und ein mal in 2 ml eiskaltem Zymolyasepuffer gewaschen. Das Sediment wird mit zwei Volumen Ly sepuffer (50 mM Tris HCl, 10 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 10 mM Kalium Acetat, 1 mM DTT, Protease Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) gewaschen und schließlich in einem Volumen Ly sepuffer aufgenommen. Die Sphäroblasten werden anschließend in einem Dounce Homogeni sator durch 15- bis 20maliges Auf- und Abbewegen des Pistills (Abstand 1-2 µm) lysiert. Das Lysat wird mit dem gleichen Volumen Extraktionspuffer (Lysepuffer + 0,8 M Ammoniumsul fat, 20% (v/v) Glycerin) versetzt und 15-30 Minuten auf einem Überkopfschüttler inkubiert (4°C). Anschließend wird 90 Minuten bei 100.000 × g zentrifugiert. (4°C). Der Überstand wird gegen das hundertfache Volumen Lagerungspuffer (20 mM Tris HCl, 0,1 mM EDTA, 10% (v/v) Glycerin, 100 mM KCl, 1 mM DTT, Proteae Inhibitoren, 1 mM PMSF, pH 7,5) dialy siert. Das Dialysat wird bei 10.000 × g abzentrifugiert (4°C) und der Überstand in flüssigem Stickstoff gelagert (Dunn, B. & Wobbe, C. R. (1994) Preparation of protein extracts from yeast, In: Ausubel, F.M., et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, 2°d Volume, John Wiley and Sons, Inc., USA pp. 13.13.1-13.13.9).

3. In vitro Spleißen von Konstrukten mit IRE in einem Testsystem

Durch das Ausschneiden des Introns aus der RNA-Sequenz entsteht an der Grenze der beiden nun verbundenen Exons eine Nukleotidsequenz, die in der ungespleißten prä-mRNA nicht vor handen ist (Neosequenz). Diese Sequenz wird zur Generierung von komplementären Nukleo tidsequenzen genutzt, die selektiv nur an diese Neosequenz binden. Durch kovalente Bindung von Fluoreszensfarbstoffen, Biotin, Digoxigenin oder ähnlichen Molekülen bzw. durch radio aktive Markierung, wird indirekt das durchgeführte Spleißen nachgewiesen. Die Auswertung des Assays erfolgt in einem geeigneten Auswertegerät (ELISA-Reader, Fluoreszensmeßgerät etc.).

Alle beschriebenen Versuche wurden nach Standardmethoden, wie sie in (Eperon, LC., and Krainer, A.R. (1994) Splicing of mRNA precursors in mammalian cells. In RNA Processing, vol. I-A Practical Approach (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.) Oxford: IRL Press, pp. 57- 101) beschrieben sind, durchgeführt.

3.1. Durchführung der in vitro Transkription

Das in Fig. 5A beschriebene Konstrukt wurde von dem dafür kodierenden Plasmid mittels in vitro Transkription in die korrespondierende mRNA umgeschrieben. Zur Kontrolle und späte ren Vergleich wurde ebenfalls das entsprechende Konstrukt ohne die IRE-Sequenz in den Ex perimenten eingesetzt.

Zuvor wurden die Konstrukte in den Vektor pGEM-3Zf (Pharmacia) einkloniert und in E. coli vermehrt. Mit Hilfe von Standardtechnologien wurden die Plasmide gereinigt und auf die ge wünschte Konzentration eingestellt. Vor dem Einsatz in der in vitro Transkription wurden die Plasmide mit Hilfe von Restriktionsenzymen linearisiert.

Die Reaktion wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
5 µl 5 × Transkriptionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 7.9, 30 mM MgCl₂, 10 mM Spermidin, 50 mM NaCl)
1 µl BSA (1 mg/ml)
1 µl RNAsin
2,5 µl DTT (100 mM)
1 µl NTP's (ATP, GTP, CTP mit 2,5 mM und UTP mit 1,25 mM)
2 µl ³²P-UTP (3000 Cl/mM)
2 µl MINX Plasmid linearisiert (1 mg/ml)
2,5 µl GpppG-Cap (1 mM)
2 µl SP6 Polymerase
ad 25 µl mit H₂O.

Der Transkriptionsansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert und anschließend über ein präpara tives Gel nach Standardmethoden gereinigt. Zum Auffinden der markierten RNA wurde für 1 Minute ein Röntgenfilm aufgelegt und die Bande mittels eines Skalpells ausgeschnitten. Das Gelfragment wurde zerschnitten und über Nacht bei 4°C mit Elutionspuffer (500 mM Na- Acetat pH 5,1 mM EDTA pH 8, 2,5% Phenol/Chloroform) die RNA aus dem Gel extrahiert.

3.2 Durchführung der Spleißreaktion

7 µl Kernextrakt von HeLa-Zellen ( = 35% v/v) wurden mit 3,25 mM MgCl₂, 35 mM KCl, 2 mM ATP, 20 mM Phosphocreatine, 1U/µl RNAsin und 30.000-50.000 cpm MINX-prä mRNA (Zillmann et al., 1988, Molecular and Cellular Biology, 8: 814) in einem Reaktionsvo lumen von 20 µl für 0, 10, 20, 30 und 40 Minuten bei 30°C inkubiert. Zum Vergleich wurde prä-mRNA eingesetzt, die das IRE nicht enthielt. Anschließend wurden die Reaktionen durch Zugabe von 400 µl Proteinase K-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5, mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% SDS, 0,1 mg Proteinase K) beendet. Die Proben wurden mit 400 µl Phe nol/Chloroform extrahiert und die wässrige Phase mit 2,5 Volumina Ethanol und 1/10 Volu men 3M Natriumacetat (pH 5,2) bei -20°C gefällt. Die RNA wurde abzentrifugiert und mit 70- 80% Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurde die RNA getrocknet.

Die getrocknete RNA wurde in 5 µl Probenpuffer (0,5 × TBE, 80% (v/v) Formamid, 0,1% (w/v) Xylencyanol und 0,1% (w/v) Bromphenolblau) aufgenommen, für 10 Minuten bei 65°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und anschließend mittels eines 8%igen Polyacrylamidgels aufge trennt. Die aufgetrennte RNA wurde mittels Autoradiographie nachgewiesen (siehe Fig. 6).

In den Spuren 1-5 der Fig. 6 ist der zeitliche Verlauf (0, 10, 20, 30, 40 Minuten) der Spleißreaktion der MINX prä-mRNA ohne IRE am 3'-OH Ende gezeigt. Auf der Abbildung ist zu erkennen, daß nach ca. 20 Minuten ein Großteil der Prä-mRNA in die reife mRNA überführt worden ist. In den Spuren 6-10 ist das gleiche Experiment mit der durch IRE am 3'- OH Ende modifizierten prä-mRNA gezeigt. Auch hier ist eine deutliche Spleißreaktion nach 20 Minuten Inkubationszeit zu erkennen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Testsystem enthaltend

2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure mindestens zwei Exons enthält, die durch mindestens ein Intron getrennt sind.

3. Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das gelfreie Nachweissystem mindestens eine Sonde enthält.

4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine zu der spleißfähigen Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäure, eine die spleißfähige Nukleinsäure- bindende niedermolekulare Verbindung und/oder ein die spleißfähige Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein ist.

5. Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die niedermolekulare Verbindung ausgewählt ist aus Theophyllin, Xanthin oder einem Aminoglycosid, vorzugsweise Tobramycin, und das Nukleinsäure- bindende Peptid oder Protein ein "iron responsive element binding protein" (IBP) ist.

6. Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die komplementäre Nukleinsäure komplementär zu mindestens einem Intron, zu mindestens einem Exon und/oder zu mindestens einer Übergangsstelle von einem Exon und einem Intron ist.

7. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-6, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure oder die komplementäre Nukleinsäure des gelfreien Nachweissystems eine Erkennungssequenz für eine Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung und/oder für ein Nukleinsäure-bindendes Peptid oder Protein enthält.

8. Testsystem nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenz für eine Nukleinsäure-bindende niedermolekulare Verbindung eine Aptamersequenz ist.

9. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß das gelfreie Nachweissystem eine Markierung enthält.

10. Testsystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine radioaktive Markierung, eine Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, mit Biotin, mit Digoxigenin und/oder mit Antikörper ist.

11. Testsystem nach einem der Ansprüche 3-8, dadurch gekennzeichnet, daß die spleißfähige Nukleinsäure und die Sonden-bindende Nukleinsäuresequenz miteinander verbunden sind.

12. Testsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei verschiedene Sonden-bindende Nukleinsäuresequenzen mit einer spleißfähigen Nukleinsäure verbunden sind.

13. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure direkt kovalent oder indirekt über ein Strukturelement und einen Bindungspartner zum Strukturelement oder mittels Hybridisierung an eine feste Phase gebunden ist.

14. Testsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die direkte kovalente Bindung über die vicinalen 2',3'-Hydroxylgruppe des Riboserückgrades der Nukleinsäure erfolgt.

15. Testsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturelement ein Biotin- oder Dicarbonsäure-Linker ist.

16. Testsystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Bindungspartner Theophyllin, Xanthin oder einem Aminoglycosid, vorzugsweise Tobramycin, und/oder ein Nukleinsäure- Bindeprotein, insbesondere IBP, ist.

17. Testsystem nach einem der Ansprüche 13-16, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase ausgewählt ist aus Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Glas oder Kunststoff

18. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nukleinsäure eine RNA ist.

19. Testsystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die RNA von einer Nukleinsäure abgeleitet ist, ausgewählt aus einer Sequenz der Formel

wobei (Th/To) eine Sequenz ausgewählt aus

bedeutet.

20. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) "small nuclear ribonucleoprotein particles" (snRNP)- Komponenten und nicht-snRNP-Komponenten enthalten.

21. Testsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die snRNP-Komponenten U1-, U2-, U4-, U5- und/oder U6-Proteine enthalten.

22. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-21, dadurch gekennzeichnet, daß Zusammensetzung gemäß Merkmal (c) ein Zellextrakt, insbesondere ein eukaryotischer Zell- oder Zellkernextrakt ist.

23. Testsystem nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkernextrakt aus tierischen Zellen, insbesondere Säugetierzellen, oder von Pilzen, insbesondere Hefen gewonnen ist.

24. Testsystem nach einem der Ansprüche 1-23, dadurch gekennzeichnet, daß die weiter Hilfsmittel gemäß Merkmal (d) ausgewählt sind aus Pufferlösungen, Stabilisatoren und/oder Energieäquivalenten, insbesondere ATP.

25. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1-24, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine spleißfähige Nukleinsäure gemäß Merkmal (a) und mindestens ein gelfreies Nachweissystem gemäß Merkmal (b) sowie gegebenenfalls mindestens eine Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten gemäß Merkmal (c) und gegebenenfalls weitere Hilfsmitteln zusammengestellt werden.

26. Verfahren zum Auffinden einer wirksamen Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer zu untersuchenden Substanz und mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Substanz eine pharmazeutisch wirksame Verbindung, ein Fungizid, ein Herbizid, ein Pestizid und/oder ein Insektizid ist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die pharmazeutisch wirksame Substanz ein Antibiotikum ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 26-28, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden, natürlich vorkommenden und chemisch modifizierten und/oder synthetischen Substanz.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Substanz in Form einer kombinatorischen Substanzbibliothek eingesetzt wird.

31. Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene immobilisierte Nukleinsäure/n mit mindestens einer spleißfähigen Nukleinsäuresequenz in Anwesenheit von mindestens einer Zusammensetzung enthaltend Splicekomponenten und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, und
b) das sich gegebenenfalls gebildete Spleißprodukt mittels eines gelfreien Nachweissystems nachgewiesen wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung eine Erbkrankheit, eine Krebserkrankung und/oder eine virale Erkrankung ist.

33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung ausgewählt ist aus Grave's Krankheit, spinale Muskelatrophy, β'-Thalassaemie, Krebserkrankungen in bezug auf das c-erb-Onkogen, Hepatitis C Infektion und/oder Herpes Simplex Virus Infektion.

34. Spleißfähige Nukleinsäuren ausgewählt aus einer RNA, die von einer Nukleinsäure abgeleitet ist, ausgewählt aus einer Sequenz der Formel

wobei (Th/To) eine Sequenz ausgewählt aus

bedeutet.

35. Verwendung einer spleißfähigen Nukleinsäure gemäß Anspruch 34 zur Herstellung eines Testsystems.