DE19909146A1 - Verfahren zur gezielten biologischen Synthese von Peptiden - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten nicht-ribosomalen Synthese von Peptiden einer vorbestimmten Struktur unter Verwendung gentechnisch veränderter nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen, die verwendeten gentechnisch veränderten nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen und die damit synthetisierten "Designer"-Peptide.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten nicht-ribosomalen Synthese von Peptiden einer vorherbestimmten Struktur unter Verwendung gentechnisch veränderter nicht- ribosomaler Peptidsynthetasen, die verwendeten gentechnisch veränderten nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen und die damit synthetisierten "Designer"-Peptide.

Nichtribosomale Peptide (NRP) repräsentieren eine große Gruppe von komplexen Metaboliten, die an großen multifunktionellen Enzymen, den sogenannten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) produziert werden. Diese nichtribosomalen Peptide bestehen in der Regel aus 2 bis 48 Resten und weisen eine enorme strukturelle Vielfalt auf, die sich in erster Linie aus der Fähigkeit ihrer NRPS-Matrize erklärt, neben den 20 proteinogenen Aminosäuren auch eine Vielzahl ungewöhnlicher Reste in die Peptidkette einzubauen [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651- 2673]. Derzeit sind bereits über 300 verschiedene, derartige Substrate identifiziert worden. Hierzu zählen z. B. Pseudo-, N-methylierte und D-konfigurierte Aminosäuren sowie auch Carboxy- oder β-Hydroxysäuren. Untereinander sind die einzelnen Reste über Peptidbindungen oder die Bildung von Estern und Lactonen verknüpft. Darüber hinaus treten in der Substanzklasse der nichtribosomal synthetisierten Peptide aber auch Variationen bezüglich der Peptidhauptkette auf. So findet man neben linearen auch zyklische und verzweigt-zyklische Peptide, die durch Acylierungen, Glykosylierungen und die Ausbildung von heterozyklischen Strukturmerkmalen zusätzlich modifiziert sein können. Viele der nichtribosomal synthetisierten Peptide weisen interessante physikochemische oder pharmakologische Eigenschaften auf, so daß einige dieser Verbindungen z. B. als Biotenside, Siderophore, Antibiotika, Cytostatika, Immunsuppressiva oder Antitumorwirkstoffe Anwendung finden.

Es wurden bereits Verfahren zur Synthese von NRPs unter Verwendung von NRPS beschrieben (EP-A 0 789 078). Die beschriebenen Verfahren waren allerdings für eine gezielte gewerbliche Anwendung noch nicht geeignet, vor allem, da die Struktur der synthetisierten Peptide nicht im nötigen Ausmaß zielgerichtet beeinflußt werden konnte.

Die meisten nichtribosomal synthetisierten Peptide besitzen einen einheitlichen Biosynthese- Mechanismus, der durch große multimodulare NRPS vermittelt wird. Jedes Modul repräsentiert hierbei per definitionem eine Einheit, die für die Erkennung, Aktivierung, kovalente Bindung und Inkorporation einer spezifischen Aminosäure in das synthetisierte Peptidprodukt verantwortlich ist. Anhand intensiver molekulargenetischer und biochemischer Analysen konnte gezeigt werden, daß derartige Module ihrerseits aus einzelnen, funktionell aktiven Domänen aufgebaut sind, die spezifische Reaktionen der nichtribosomalen Peptidsynthese katalysieren [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Eine Adenylierungs-(A)-Domäne z. B. erkennt und aktiviert ihre kognate Substrat-Aminosäure als Enzym-assoziiertes Aminoacyladenylat unter gleichzeitiger ATP-Hydrolyse. Diese relativ instabilen Intermediate werden anschließend durch die Übertragung auf die Thiolgruppe eines kovalent mit einer Thiolierungs-(T)-Domäne verknüpften 4'-Phosphopantethein-Kofaktors (4'-PAN) stabilisiert. Unter Beteiligung von Kondensations- (C)-Domänen findet dann, in einer geordneten Folge von Transpeptidierungen der so aktivierten Aminosäuren, ein sukzessives Kettenwachstum bis hin zum fertigen Peptidprodukt statt. Durch eine Modifikation der eingebauten Monomere (z. B. Epimerisierung oder N-Methylierung) bzw. der Peptidhauptkette (z. B. Acylierung oder Glycosylierung) kann die Struktur der gebildeten Produkte zusätzlich verändert werden. Derartige Funktionalisierungen werden durch spezielle Domänen oder Polyketidsynthase-(PKS)-Module innerhalb der NRPS-Matrize katalysiert.

Es konnte gezeigt werden, daß A-Domänen über ihre Substratspezifität und relative Abfolge innerhalb eines spezifischen NRPS-Systems die Primärstruktur (Sequenz) des gebildeten nichtribosomalen Peptides bestimmen. Durch die Auflösung der Kristallstruktur von zwei Mitgliedern der Superfamilie der Adenylat-bildenden Enzyme, hierbei handelte es sich um die Luciferase aus Photinus pyralis [Conti et al., 1996, Structure 4: 287-298] und die A-Domäne der Gramicidin S-Synthetase 1. (nachfolgend mit PheA bezeichnet) aus Bacillus brevis [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183], konnte gezeigt werden, daß, obwohl beide Enzyme nur 16% Identität bezüglich ihrer Primärstruktur besitzen, sie eine ausgesprochen homologe Faltungstopologie aufweisen. Die Struktur von PheA (Abb. 1A), die in Gegenwart ihrer Substrate ATP und Phenylalanin determiniert wurde, gestattete erste Einblicke in die molekularen Mechanismen der Substraterkennung und -aktivierung.

Durch Sequenzvergleiche von NRPS-A-Domänen wurden hochkonservierte Sequenzbereiche, die sogenannten Core-Motive identifiziert, die innerhalb der A-Domänen mit nahezu unveränderter Lokalisation und Aminosäure-Abfolge auftreten. Durch frühere Mutationsanalysen und nun auch durch die Kristallstruktur von PheA konnte gezeigt werden, daß die überwiegende Mehrheit dieser Core-Sequenzen essentiell an der ATP-Bindung und -Hydrolyse beteiligt sind. Darüber hinaus üben einige Core-Motive aber auch Funktionen bei der Bindung der Substrat-Aminosäure aus. So werden z. B. die α-Aminogruppe und α-Carboxygruppe der Substrat-Aminosäure L- Phenylalanin in PheA durch die Reste Asp235 (Core A4) bzw. Lys517 (Core A10) elektrostatisch koordiniert [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Die eigentliche Substratspezifität-vermittelnde Region von PheA befindet sich dagegen in einem ca. 100 Aminosäure-langen Bereich, der innerhalb der Gruppe der A-Domänen eine reduzierte Konservierung aufweist. Diese Region bildet die Bindungstasche für die Seitenkette des Phenylalanin-Substrates aus (Abb. 1B), die auf der einen Seite durch die Reste Ala236, Ile330 und Cys331, sowie auf der anderen Seite durch die Reste Ala322, Ala301, Ile299 und Thr278 aufgebaut wird. Beide Seiten der Tasche sind durch den Indolring des Trp239, der sich am Boden der Tasche befindet, getrennt.

Aus früheren in silico (Computersimulationen) Studien an NRPS-A-Domänen konnte geschlossen werden, daß der Substratspezifität-determinierende Bereich von A-Domänen vermutlich zwischen den Core-Motiven A3 und A6 lokalisiert ist. Diese Region weist eine vergleichsweise reduzierte Konservierung auf, wohingegen jedoch für Domänen gleicher Substratspezifität eine erhöhte Homologiebeziehung postuliert wurde. Dementsprechend sollten Domänen die gleiche Substrate aktivieren in phylogenetischen Bäumen gruppiert auftreten. In detaillierten Analysen ließen sich derartige Korrelationen jedoch nicht verifizieren. Vielmehr zeigte sich, daß der evolutionäre Ursprung (Wirtsorganismus) der A-Domänen einen größeren Einfluß auf deren Bündelung ausübte als ihre Substratspezifität.

Zur Ableitung der Konsensus-Sequenzen ermittelten wir über Sequenzvergleiche mit PheA und Luciferase die korrespondierenden zehn Reste der putativen Bindungstaschen von 160 in öffentlichen Sequenz-Datenbanken zugänglichen A-Domänen. Nachfolgend wurden für jede A- Domäne nur diese zehn Reste als eigenständige Aminosäure-Sequenz verwendet, um Alignments und phylogenetische Untersuchungen mit dem Programm MegAlign von Lasergene durchzuführen. Mittels dieser Untersuchungen wurde ein phylogenetischer Stammbaum erhalten (Abb. 2), in dem sich eine Gruppierung der 10 Aminosäure-großen Sequenzen, gemäß der Spezifität ihrer Herkunftsdomänen offenbart. Dieses Ergebnis gibt einen eindeutigen Hinweis darauf, daß die ausgewählten Reste tatsächlich in die Substraterkennung involviert sind. Basierend auf diesen Untersuchungen können Diskrepanzen zwischen postulierten und beobachteten Substratspezifitäten von A-Domänen erklärt und die Spezifitäten von NRPS- Systemen vorhergesagt werden.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand daher darin, ein einfaches, auch technisch anwendbares Verfahren zu finden, mit Hilfe dessen definierte Peptide zielgerichtet synthetisiert werden können.

Überraschenderweise konnten wir aus den phylogenetischen Studien Konsensus-Sequenzen ableiten, die in gewisser Weise als der nichtribosomale Kode der NRPS zu verstehen sind (Tabelle 1). Ähnlich wie der ribosomale Kode scheint auch dieser Kode degeneriert zu sein, und es konnten bisher z. B. vier verschiedene Kodone für Leu-aktivierende Domänen, drei Kodone für Val- und zwei für Cys-aktivierende Domänen identifiziert werden. Es kann davon ausgegangen werden, daß auch für andere Substrate mehrere Strategien zur Substraterkennung existieren, die mit Hilfe des erfinderischen Verfahrens bestimmt werden können.

Anhand der durch Sequenzvergleiche ermittelten Kodone kann das generelle Erscheinungsbild von Substrat-Bindungstaschen vorhergesagt werden. Als Beispiele sind in Abb. 3 die putativen Bindungstaschen für die Substrat-Aminosäuren Asp, Orn und Val dargestellt. Während Asp235 und Lys517 in allen A-Domänen Schlüssel-Wechselwirkungen mit der Amino- und Carboxygruppe des Substrates vermitteln und daher hochkonserviert sind, wird von den übrigen Resten angenommen, daß sie maßgeblich die Spezifität für eine bestimmte Aminosäure- Seitenkette determinieren. Die entsprechenden Reste (Pos. 236 bis 331) in den drei gegebenen Beispielen untermauern diese Theorie und spiegeln perfekt die Bedürfnisse bezüglich der Polarität und Größe der aktivierten Substrate wider.

• 1. Asp-Aktivierung (Kodon "Asp"): Der basische Rest His322 (eventuell auch Lys278) etabliert eine polare Wechselwirkung mit der aciden Seitenkette, wohingegen der Rest Leu236 die Bindungstasche für die Aufnahme von längerkettigen Substraten (z. B. Glu) verschließt.
• 2. Orn-Aktivierung (Kodon "Orn(2)"): Die aciden Reste Glu278 und Asp331 scheinen eine Schlüsselrolle bei der Erkennung der großen basischen Seitenkette zu spielen.
• 3. Val-Aktivierung (Kodon "Val(3)"): Die gesamte Bindungstasche wird durch hydrophobe Reste aufgebaut. Dem durch die Verzweigung der β-Position entstehenden relativ großen Raumbedarf wird (1) durch die Verwendung kleinerer Seitengruppen im oberen Bereich, sowie (2) räumlich anspruchsvoller Reste im unteren Bereich, die die Bindungstasche ausweiten, Rechnung getragen.

Neben der Degenerierung besteht eine weitere Homologie zum ribosomalen Kode im Auftreten von flexiblen (Wobble-ähnlichen) Positionen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind die Positionen 278, 299 und 331 solche Wobble-ähnlichen Reste, die innerhalb bestimmter Kodone eine erhöhte Flexibilität aufweisen. Allgemein wird beobachtet, daß Bindungstaschen die kleinere Aminosäuren erkennen eine höhere Flexibilität bei Positionen nahe des Bodens der Tasche aufweisen, wohingegen bei großen Substraten eine größere Variabilität im oberen Bereich beobachtet wird (Tabelle 1).

Die Ergebnisse der in silico Studien, die in Abb. 3 und Tabelle 1 zusammengefaßt sind, zeigen, daß die einzelnen Konstituenten einer Bindungstasche unterschiedliche Signifikanz für die Ausbildung einer bestimmten Substratspezifität besitzen. Um diese Beobachtung zu bestätigen wurden die Reste von 160 Bindungstaschen genauer untersucht. Die in Abb. 4 und Tabelle 2 dargestellten Resultate zeigen, daß sich die zehn Konstituenten einer Bindungstasche in drei Gruppen einteilen lassen. Ihre ungleichmässige Variabilität spiegelt wahrscheinlich ihre unterschiedliche Bedeutung bei der Vermittlung der Substratspezifität wider:

• 1. "Invariante" Positionen (Pos. 235 und 517): Asp235 ist lediglich in A-Domänen, die Substrate ohne α-Aminogruppe aktivieren, abwesend. Beispiele hierfür sind z. B. die α- Aminoadipat aktivierenden Domänen der AcvA-Synthetasen oder die Carboxysäure­ aktivierenden Domänen der Enterobactin- (Escherichia coli) und Yersiniabactin-Systeme (Yersinia pestis). Lys517 ist dagegen absolut invariant und bindet sowohl die α-Carboxygruppe der kognaten Aminosäure, als auch das O4' und O5' der ATP/AMP-Ribose-Einheit, wodurch vermutlich beide Substrate in eine Position optimaler Interaktion gebracht werden. Beide Reste vermitteln also wichtige Wechselwirkung mit den (weitgehend) unveränderlichen α-Amino- und α-Carboxygruppen des Substrates, wodurch ihre eigene Invarianz erklärt werden kann.
• 2. "Bedingt variante" Positionen (Pos. 236, 301 und 330): Diese Reste zeigen innerhalb aller untersuchten Domänen eine nur geringe Variabilität und in 93% aller Fälle werden hydrophobe Aminosäuren an diesen Positionen realisiert. Unter Berücksichtigung der geringen Flexibilität dieser Positionen und des unverhältnismäßig geringen Auftretens von geladenen oder polaren Seitenketten kann eine essentielle Bedeutung bei der Vermittlung der Substratspezifität ausgeschlossen werden.
• 3. "Höchst variante" Positionen (Pos. 239, 278, 299, 322 und 331): Diese Positionen weisen die höchste Flexibilität in Bezug auf die verwendeten Aminosäuren auf. Abgesehen von Pos. 299 und 331, die generell sehr adaptiv und Wobble-ähnlich zu sein scheinen (vgl. Tabelle 1), sind alle Positionen für die Etablierung der Substratspezifität prädestiniert. Unter Berücksichtigung ihrer relativen Lokalisation innerhalb der Bindungstasche und der in Tabelle 1 + 2 sowie Abb. 3 gezeigten Daten, kann angenommen werden, daß die Position 322 einen größeren Einfluß auf kleinere Substrat-Reste ausübt, wohingegen die Positionen 239 und 278 eher größere Reste beeinflussen. Diese Hypothese wird z. B. durch die Kodone der Asp- (His322), Glu- (Lys239) und Orn- (Glu278) aktivierenden A-Domänen untermauert (Tabelle 1 + 2). In allen genannten Beispielen sind die Polarität des erkannten Substrates und "höchst varianter" Positionen der Bindungstasche perfekt gekoppelt (vgl. Tabelle 2; dunkelgraue Unterlegung).

Die veränderte DNA wird nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren im Wirtsorganismus chromosomal oder extrachromosomal implantiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die in den Patentansprüchen angeführten Ausführungsformen.

Zur experimentellen Bestätigung mutierten wir mehrere der Spezifität-vermittelnden Aminosäure-Konstituenten der Bindungstasche von PheA und untersuchten die Mutanten auf resultierende Veränderung in (1) der Rate des ATP-Pyrophosphat-Austauschs (Enzymaktivität) und (2) der Aktivierung von mis-kognaten Aminosäuren (Enzymspezifität). Im Hinblick auf den letztgenannten Punkt sollte nicht unerwähnt bleiben, daß das Wildtyp-Protein von vornherein eine signifikante Aktivierung der mis-kognaten Substrate Trp (18%) und Leu (7%) zeigte. Die Ergebnisse unserer PheA-Mutagenese-Experimente sind in Tabelle 3 zusammengefaßt und können wie folgt generalisiert werden:

• 1. Die Substitution gegen etwas größere Aminosäuren ging zwangsläufig auf Kosten des zur Verfügung stehenden Raumes in der Bindungstasche. Als Folge hiervon sank die ATP- Pyrophosphat-Austauschrate dieser Mutanten, während ihre Spezifität für das kognate Substrat Phenylalanin anstieg (z. B. T278M, T278Q, A301V, A3225 und C331L). In allen Fällen konnte die Seitenspezifität für die mis-kognaten Substrate Trp und Leu um einen Faktor 20 reduziert werden.
• 2. Das genaue Gegenteil wurde für Austausche gegen etwas kleinere Gruppen beobachtet, die die Bindungstasche geringfügig erweiterten. In diesen Mutanten konnte die katalytische Aktivität des Wildtyp-Proteins herübergerettet werden, während die Fähigkeit, mis­ kognaten Substrate zu diskrimieren, um bis das 5fache herabgesetzt wurde (z. B. A301G, A322G und I330V).
• 3. Die Mutation der "höchst varianten" Seitenketten (Pos. 239, 278, 322 und 331) verursachten einen bis zu 5fachen Verlust an Enzymaktivität (z. B. W239L, T278M und C331L). Die Einführung polarer oder geladener Seitengruppen veränderten die Gesamtpolarität der Bindungstasche, wodurch das entsprechende Enzym quasi vollständig inaktiviert wurde (z. B. A322D, A322K und A322N).
• 4. Die beobachtete Zunahme der Aktivierung eines bestimmten mis-kognaten Substrates war aufgrund des Spezifität-Kodes (Tabelle 1) vorhersagbar. Beispielsweise blieb die Aktivität und Spezifität für Phe in der Mutante PheA(I330V) unbeeinflusst, doch offenbarte dieses Konstrukt eine signifikante Erhöhung der Aktivierung der mis-kognaten Substrate Trp und Tyr. Interessanterweise besitzen alle Trp- und Tyr-aktivierenden Domänen ein Valin an Position 330.

Ein ähnlicher Zusammenhang konnte auch, wie nachfolgend gezeigt, für Mutationen in Richtung des "Leu(4)"-Kodons (Tabelle 1) beobachtet werden.

"Phe"- und "Leu(4)"-Kodon (Tabelle 1) besitzen eine etwa 60%ige Homologie und Hauptunterschiede betreffen die Positionen 278, 301 und 322 (bemerke: zwei-von-drei Positionen sind "höchst variante" Gruppen). Dementsprechend wurde vermutet und anschließend auch experimentell bestätigt, daß Punktmutationen in Richtung des "Leu(4)"-Kodons (→ T278M and A301G) eine erhöhte Aktivierung von Leucin zeigen (Tabelle 3). Interessanterweise, ist für die Mutante PheA(T278M) die katalytische Effizienz für die unspezifische Aktivierung von L-Leu quasi unbeeinflußt (gleiches V_max), während gleichzeitig die Aktivität für die kognaten Substrate (D- und L-Phe) eine etwa 3fache Erniedrigung erfuhr. Das genaue Gegenteil wurde für die Mutante PheA(A301G) beobachtet. Hier blieb das V_max für die Aktivierung von Phenylalanin unbeeinflußt, während gleichzeitig die katalytische Aktivierung von L-Leu quasi um das zweifache anstieg. All diese Änderungen der Substratspezifität und -aktivität waren signifikant, reproduzierbar und deutlich oberhalb der Standardabweichung. Wie nur drei Unterschiede im Kodon eine Unterscheidung zwischen Phenylalanin und Leucin ermöglichen ist derzeit noch unklar, doch zumindest für die Pos. 301 kann vermutet werden, daß hier aufgrund von Unterschieden in der räumlichen Ausdehnung einer CH- (Phe) versus CH₃-Gruppe (Leu) in der δ-Position der entsprechenden Aminosäure diskrimiert wird. Alle Domänen, die Substrate mit sterisch anspruchsvollen γ- or δ-Positionen aktivieren, besitzen die kleinstmögliche Seitengruppe (Gly) in Position 301 (Tabelle 2 und 3).

Um die Substratspezifität von PheA vollständig zu Leucin zu verändern, konstruierten wir die Doppelmutante PheA(T278M/A301G). Das Kodon dieser Mutante zeigt eine Ähnlichkeit von ca. 80% zum "Leu(4)"-Kodon (vgl. Tabelle 1) und ist im phylogenetische Baum in unmittelbarer Nähe zu Leu-aktivierenden Domänen zu finden (Abb. 2; mittelgraue Unterlegung). Wie in Abb. 5A gezeigt, aktiviert dieses Konstrukt tatsächlich bevorzugt Leu, und zwar mit einer katalytischen Effizienz, die dem Wildtyp-Enzym in nichts nachsteht bzw. dessen Aktivität sogar übertrifft (Aktivität der Mutante für L-Leu: k_cat/K_m = 86 mM^-1 min^-1, Wildtyp-Aktivität für L-Phe: 69 mM^-1 min^-1; Tabelle 4). Es konnte ein mindestens 30facher Zuwachs der L-Leu-spezifischen Aktivierungseffizienz festgestellt werden. Erstaunlicherweise war die Doppelmutante nur geringfügig in der Aktivierung von D-Phe beeinträchtigt, wohingegen die katalytische Effizienz für die Aktivierung des anderen Stereoisomers, L-Phe, eine signifikante, ca. 7fache Verringerung erfuhr (Abb. 5A und Tabelle 4). Für das Wildtyp-Protein PheA konnte im Gegensatz dazu gezeigt werden, daß die Wechselwirkungen des Proteins mit beiden Liganden, L- und D-Phe, fast identisch sind. Wie in Abb. 1B gezeigt, ist der Benzyl-Ring der Seitengruppe von D-Phe um etwa 30° relativ zum L-Phe-Ring gedreht, woraus eine geringfügige Verlagerung der relativen Position des β-C-, aber nicht des α-C-Atoms resultiert.

Wir veränderten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Spezifität einer A-Domäne, deren Kristallstruktur noch nicht aufgeklärt ist. Als Ausgangspunkt dieses Experiments diente die Feststellung, daß die ermittelten Kodons von Asp- und Asn-aktivierenden Domänen sehr ähnlich sind (ca. 80%; vgl. Tabelle 1), und die Hauptunterschiede die Positionen 322 (His vs. Glu; eine "höchst variante" Gruppe) und 330 (Val vs. Ile; eine "bedingt variante" Gruppe) betreffen. Demzufolge wählten wir die Asp-aktivierende A-Domäne des umfassend charakterisierten Surfactin-Biosynthesekomplexes [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831] und unternahmen den Versuch, ihre Spezifität in Richtung Asparagin zu verändern. Für das Wildtyp- Protein AspA konnte eine spezifische Aktivierung von L-Asp, aber nicht L-Asn, mit einer moderaten Aktivität (Wildtyp-Aktivität für L-Asp: k_cat/K_m = 10 mM^-1 min^-1; vgl. Abb. 5B und Tabelle 4) bestätigt werden. Im Gegensatz hierzu offenbarte die Punktmutante AspA(H322E) eine hohe Selektivität für L-Asn (Abb. 5B), wenngleich diese Spezifitätsänderung mit ihrer Abnahme der katalytischen Aktivität (Faktor 10) verbunden war (Aktivität der Mutante für L- Asn: k_cat/K_m = 1 mM^-1 min^-1; Tabelle 4). Somit konnte also mit dem Konstrukt AspA(H322E) gezeigt werden, daß eine vollständige Änderung der Substratspezifität durch die Einführung einer einzigen Punktmutation erzielt werden kann. Die Mutante AspA(H322E) zeigte übrigens darüber hinaus auch eine etwa 5fache Erhöhung der Aktivierungseffizienz für ähnlich-große, aliphatische Asn-Analoga, wie z. B. Ile, Leu und Val.

Die etwa 70fache Zunahme der Effizienz der L-Asn-spezifischen Aktivierung konnte durch die Einführung einer Ile330Val-Punktmutation weiter gesteigert werden. Hierdurch wurde zugleich eine katalytische Aktivität der nunmehr Asn aktivierenden Domäne erreicht, die im selben Größenordnungsbereich der ursprünglichen AspA-Domäne lag.

Bei der Analyse der Kodone von Glu- und Gln-aktivierenden Domänen zeigte sich, daß auch diese Domänen sehr ähnliche Kodone realisieren (Tabelle 1). Der Hauptunterschied betrifft die Position 239 (Lys vs. Gln; eine "höchst variante" Gruppe). Wir wählten daher die Glu-aktivierende Domäne des Surfactin-Biosynthesekomplexes (SrfA-Al) und unternahmen den Versuch die Spezifität in Richtung Glutamin zu verändern. Für das Wildtyp-Protein GluA konnte eine spezifische Aktivierung von L-Glu, aber nicht L-Gln, mit einer moderaten Aktivität (k_cat/K_m = 25 mM^-1 min^-1) bestätigt werden. Im Gegensatz hierzu offenbarte die Punktmutante GluA(K239Q) eine hohe Selektivität für L-Gln, bei einer gleichzeitig nur geringfügig herabgesetzten, katalytischen Aktivität (k_cat/K_m = 20 mM^-1 min^-1). Dieses Ergebnis durfte aufgrund der Kodone der Mutante und Gln-Domänen erwartet werden und zeigt, daß auch mit dem Konstrukt GluA(K239Q) eine vollständige Änderung der Substratspezifität durch die Einführung einer einzigen Punktmutation erzielt werden konnte.

Nachfolgend wird gezeigt, daß die veränderte Substratspezifität einer A-Domäne auch zur in vivo Synthese eines Peptides mit veränderter Primärstruktur ausgenutzt werden kann. Exemplarisch wurde hierzu das Genfragment der Asn-spezifischen Doppelmutante AspA(I330V/H322E) mittels homologer Rekombination ins Chromosom des Surfactin- Produzenten B. subtilis ATCC 21332 transferiert. Diese Integration erfolgte mit Hilfe einer Zweistufen-Rekombinationsmethode [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318] und führte zur Substitution von aspA' gegen aspA(H322A/I330V)' im srfA-B-Gen des Surfactin- Biosynthese-Operons. Die Identität dieses Klones, B. subtilis Asn-5, wurde durch PCR- Amplifikation des mutierten asp(H322E/I330V)'-Genfragments aus dessen Chromosom und anschließende DNA-Sequenzanalyse des Amplifikates verifiziert.

Das Biosurfactant Surfactin ist ein Lipoheptapeptid mit variablem β-Hydroxyfettsäure-Anteil (6-­ 9 Methylengruppen), das am Übergang zur stationären Wachstumsphase produziert und ins Kulturmedium sekretiert wird. Entsprechend wurden zum Nachweis des modifizierten Lipoheptapeptide die B. subtilis-Stämme ATCC 21332 und Asn-5 fermentiert, und Wildtyp- und [Asn-5]Surfactin aus ihren Kulturüberständen präpariert. Die nachfolgende HPLC-MS-Analyse zeigte, daß das [Asn-5]Surfactin im Vergleich zum Wildtyp (1) in gleicher Quantität produziert wurde, (2) eine längere Retentionszeit besaß, und (3) in der ESIMS-Analyse einen Massenunterschied von 1 Da aufwies. Diese Massendifferenz war signifikant, und im negativen Ionenmodus konnten Ioneriserien in einer 14er-Abstufung (variabler Fettsäure-Anteil) für den Wildtyp bei m/z 992 bis 1.034, sowie für die Mutante bei m/z 991 bis 1.033 determiniert werden. Dieser Befund ist, gemeinsam mit der reduzierten hämolytischen Aktivität des [Asn-5]Surfactins, als eindeutiger Hinweis auf die Substitution einer Carboxy- (Asp-5; Wildtyp) gegen eine Carbamid-Gruppe (Asn-5; Mutante) im Surfactin anzusehen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß durch die gezielte Veränderung der Substratspezifität einer A-Domäne innerhalb einer katalytischen NRPS-Matrize auch das korrespondierende Peptidprodukt in vivo verändert werden konnte.

Grundsätzlich sieht das erfinderische Verfahren zur gezielten Synthese von Peptiden so aus: Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich ausgehend von einem natürlich auftretenden, funktionell aktiven NRPS-System durch gerichtete Punktmutationen innerhalb der A-Domänen jede Aminosäureposition des gebildeten nichtribosomal Produktpeptides gezielt zu verändern. Hierzu wird zunächst die DNA der zu verändernden A-Domäne aus dem Chromosom des Produzentenorganismus amplifiziert und in einen E. coli His-tag-Expressionsvektor kloniert.

Mit Hilfe dieses Konstruktes ist es nun möglich ausreichende Mengen an funktionell aktivem A- Domänenprotein zu produzieren, aufzureinigen sowie in vitro auf seine Substratspezifität zu untersuchen. Im folgenden können nun in die rekombinante A-Domänen-DNA gerichtet Punktmutationen eingeführt werden, die gemäß Tabelle 1) zu einer Veränderung der Substratspezifität führen. Zur Verifizierung dieser Änderung werden die mutierten A-Domänen zunächst in E. coli überexprimiert, aufgereinigt und in Bezug auf ihre Substratspezifität untersucht. Kann hierdurch die zu erwartende Spezifitätsänderung bestätigt werden, wird die mutierte A-Domänen DNA über homologe Rekombination gegen die native A-Domänen-DNA im Chromosom des Produzentenorganismus ausgetauscht. Der so erzeugte Produzentenstamm mit mutierter A-Domäne kann nun zur Produktion des veränderten nichtribosomalen Peptides eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch eingesetzt werden, um die Spezifität und/oder Aktivität bekannter biologisch aktiver Peptide zu beeinflussen. Hierzu werden aufgrund des aufgefundenen Codes, bestimmte A-Domänen so verändert, daß die mit Hilfe der veränderten NRPS synthetisierten Peptide die gewünschten Eigenschaften besitzen. Beispielhaft sei hier die Verbesserung der Löslichkeit erwähnt, die durch den Austausch von hydrophoben gegen hydrophile Aminosäuren und umgekehrt erfolgen kann.

Die erfindungsgemäßen Ergebnisse erlauben auch eine gezielte Vorhersage von Substratspezifitäten bereits sequenzierter NRPS-Gene, deren Funktion aber noch nicht bestimmt wurde. Dies gewinnt im Rahmen der durch diverse Genom-Sequenzierungsprojekte stetig zunehmenden Sequenzmengen immer mehr an Bedeutung. So ist es mit dem hier beschriebenen Verfahren z. B. möglich aus der DNA-Sequenz eines NRPS-Clusters die putative Struktur des gebildeten Produktpeptides vorherzusagen. Somit ist eine anschließende Struktur-Funktions­ analyse derartiger Gene sehr erleichtert.

Zur Ableitung der Substratspezifität einer NRPS-A-Domäne mit bekannter DNA-Sequenz wird zunächst ein Sequenzvergleich mit der DNA-Sequenz von PheA durchgeführt. Hierdurch können die korrespondierenden zehn Reste der putativen Bindungstasche der zu untersuchenden A- Domäne identifiziert werden. Diese zehn Reste werden nun nachfolgend als eigenständige Aminosäuresequenz in Alignments und phylogenetische Untersuchungen mit den zehn Resten der Bindungstasche sämtlicher anderen, bekannten A-Domänen eingesetzt. Hierbei ergibt sich eine strikte Gliederung der Sequenzen bezüglich der Substratspezifität der zugehörigen A- Domänen. Somit kann über das Gruppierungsverhalten die Substratspezifität der zu untersuchenden A-Domäne bestimmt werden kann.

Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Erkenntnisse wird es auch möglich aus den bekannten DNA-Sequenzen für bestimmte A-, C- und T-Domänen, sowie ggf. anderen Domänen - wie in Mahariel et al. (1997) beschrieben - NRPS zu synthetisieren, die nicht von natürlichen Synthetasen abgeleitet sind.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie einzuschränken.

BEISPIELE Beispiel 1 PCR Amplifikation und Klonierung der PheA- und AspA-Mutanten

Alle PheA-Mutanten wurden mittels inverser PCR durch gerichtete Mutagenese im Plasmid pPheA erzeugt. Die PCR-Amplifikation des gesamten Plasmides erfolgte mit dem 'Expand Long-Range PCR' System (Boehringer Mannheim; Mannheim, Deutschland, Katalognr.: 1681842) unter Einhaltung des Hersteller-Protokolls. Die folgenden, 5'-phosphorylierten Oligonukleotide (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) wurden verwendet (die jeweils mutierten Kodone sind unterstrichen): (Seq ID-NO: 1) 3'-A236: 5'-ATC AAA AGA GAT GCT GGC A-3'; (Seq ID-NO: 2) 5'-A236L: 5'-TTA TCT GTA TGG GAG ATG TTT ATG-3'; (Seq ID-NO: 3) 3'-W239: 5'-TAC AGA TGC ATC AAA AGA G-3'; (Seq ID-NO: 4) 5'-W239G: 5'- GGA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA AC-3'; (Seq ID-NO: 5) 5'-W239L: 5'-TTA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA-3'; (Seq ID-NO: 6) 3'-T278: 5'-AAT AAC AGT GAT TTC CTT TTG G-3'; (Seq ID-NO: 7) 5'-T278M: 5'-ATG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3'; (Seq ID-NO: 8) 5'-T278Q: 5'-CAG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3'; (Seq ID-NO: 9) 3'-I299: 5'-TAA CGT TTG TAT CGA TAA AAT AC-3'; (Seq ID-NO: 10) 5'-I299T: 5'-ACT ACA GCA GGC TCA GCT AC-3'; (Seq ID-NO: 11) 3'-A301G: 5'-TCC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3'; (Seq ID-NO: 12) 3'-A301 V: 5'-AAC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3'; (Seq ID- NO: 13) 5'-A301: 5'-GGC TCA GCT ACC TCG CCT-3'; (Seq ID-NO: 14) 3'-A322: 5'-AAT GTA AGT TAC TTT CTC CTT C-3'; (Seq ID-NO: 15) 5'-A322D: 5'-AAT GAT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 16) 5'-A322E: 5'-AAT GAA TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 17) 5'-A322G: 5'-AAT GGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 18) 5'-A322I: 5'-AAT ATT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 19) 5'- A322K: 5'-AAT AAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 20) 5'-A322N: 5'-AAT TTG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 21) 5'-A322Q: 5'-AAT CAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 22) 5'-A322S: 5'-AAT AGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 23) 3'-I330: 5'-AGT TGT TTC CGT AGG GC-3'; und (Seq ID-NO: 24) 5'- I330V: 5'-GTT TGT GCG ACT ACA TGG G-3'.

Die PCR-Amplifikate wurden mit dem "QIAquick-spin PCR purification"-System (Qiagen; Hilden, Deutschland, Katalognr.: 28104) aufgereinigt, ihre kohäsiven Enden geglättet und nachfolgend intramolekular ligiert. Die Zugabe der Restriktionsendonuklease DpnI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E0302Z), die eine methylierte Erkennungssequenz benötigt, gestattete einen gezielten Abbau der PCR-Matrize (pPheA; aufgereinigt aus einem dam⁺-Escherichia coli-Stamm) und damit die Vermeidung von falsch­ positiven Klonen. Für alle DNA-Manipulationen sowie die Präparation der rekombinaten Plasmide aus E. coli XL-1-blue (Stratagene, Heidelberg, Deutschland, Best.-Nr.: 200268) kamen Standardmethoden zum Einsatz [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]. Durch die Klonierung der PCR-Amplifikate konnten die folgenden Plasmide erhalten werden: pPheA(A236L) (durch Verwendung der Oligonukleotiden Seq ID-NO: 1 und Seq ID-NO: 2), pPheA(W239G) (Seq ID- NO: 3 plus Seq ID-NO: 4), pPheA(W239L) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 5), pPheA(T278M) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 7), pPheA(T278Q),(Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 8), pPheA(I299T) (Seq ID-NO: 9 plus Seq ID-NO: 10), pPheA(A301G) (Seq ID-NO: 11 plus Seq ID-NO: 13), pPheA(A301V) (Seq ID-NO: 12 plus Seq ID-NO: 13), pPheA(A322D) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 15), pPheA(A322E) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 16), pPheA(A322G) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 17), pPheA(A322I) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 18), pPheA(A322K) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 19), pPheA(A322 N) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 20), pPheA(A322Q) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 21), pPheA(A322S) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 22) und pPheA(I330V) (Seq ID-NO: 23 plus Seq ID-NO: 24). Die Identität aller Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierungen an einem "ABI prism 310 Genetic Analyzer" (ABI; Weiterstadt, Deutschland, Best.-Nr.: 310-A) überprüft und bestätigt.

Das für die Aspartat-aktivierende A-Domäne aus SrfA-B kodierende DNA-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis JH642 mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: (Seq ID-NO: 25) 5'-AspA: 5'-AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3' und (Seq ID-NO: 26) 3'-AspA: 5'-AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3'. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde gereinigt (s. o.), mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1160Z u. E1010Y) verdaut und in den gleichermaßen präparierten "His-tag"-Vektor pQE60 (Qiagen; Hilden, Deutschland, Best.-Nr.: 33603) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pAspA, daß nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pAspA(H322E) mittels inverser PCR verwendet werden konnte (s. o.): (Seq ID-NO: 27) 5'-AspA(H322E): 5'-TAA TGA GTA CGG CCC GAC AGA AGC-3' (Seq ID-NO: 28) und 3'-AspA(H322E): 5'-ATA AAT TCG GTA TGT CCA TAC-3'. Das resultierende Plasmid pAspA(H322E) diente nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pAspA(H322E/I330V) mittels inverser PCR mit den folgenden Primern (Seq ID- NO: 29) 5'-AspA(I330V): 5'-TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3' und (Seq ID-NO: 30) 3'-AspA(I330V): 5'-CTG TGG GCC CGT ACT CAT TAA TAA ATT CGG-3'. Die Identität aller Konstrukte wurde wiederum durch DNA-Sequenzierungen überprüft und bestätigt.

Das für die Glutamat-aktivierende A-Domäne aus SrfA-A kodierende DNA-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis JH642 mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: (Seq ID-NO: 31) 5'-GluA: 5'-TAT GGA TCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3' und (Seq ID-NO: 32) 3'-GluA: 5'-TAT GGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT- 3'. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde gereinigt (s. o.), mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1010Y) verdaut und in den mit Bg/II (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1021Y) geschnittenen "His­ tag"-Vektor pQE60 (Qiagen; Hilden, Deutschland, Best.-Nr.: 33603) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pGluA, daß nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pGluA(K239Q) mittels inverser PCR verwendet werden konnte (s. o.): (Seq ID-NO: 33) 5'-GluA(K239Q): 5'- GTG CAG CAA ATC TTC GCG TCG CTT C-3' und (Seq ID-NO: 34) 3'-GluA(K239Q): 5'-TGA CGC ATC AAA GTG GAA C-3'. Die Identität aller Konstrukte wurde wiederum durch DNA- Sequenzierungen überprüft und bestätigt.

Beispiel 2 Expression und Aufreinigung von Adenylierungsdomänen (Wildtyp und Mutanten)

Die Expression der (mutierten) Genfragmente sowie die Aufreinigung der resultierenden His₆- Fusionsproteine wurde, wie an anderer Stelle beschrieben [Mootz et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850], durchgeführt. Die Ligation in die BamHI-Schnittstelle von pQE60 führte jeweils zur Fusion der Aminosäure-Sequenz "GSRSHHHHHH" an den Carboxy-Terminus des jeweiligen rekombinanten Proteins. Mittels SDS-PAGE konnte gezeigt werden, daß die meisten Proteine annähernd homogen mittels Ni²⁺-Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt werden konnten; zwei Konstrukte jedoch waren unlöslich (vgl. Tabelle 3). Fraktionen, die das jeweilige rekombinante Protein enthielten, wurden vereinigt und gegen Assay-Puffer dialysiert (50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Dithioerythritol (DTE) und 1 mM EDTA). Nach Zugabe von 10% Glycerin (v/v) konnten die Proteine, ohne erkennbaren Verlust ihrer katalytischen Aktivität, bei -80°C gelagert werden. Die Protein-Konzentration der verschiedenen Lösungen wurde mit Hilfe der berechneten Extinktionskoeffizienten bei 280 nm (A_280nm) ermittelt: 64060 M^-1 cm^-1 für PheA und alle PheA-Mutanten außer PheA(W239Xaa), 58370 M^-1 cm^-1 für PheA(W239Xaa), sowie 39780 M^-1 cm^-1 für AspA und AspA(H322E) und 35490 M^-1 cm^-1 für GluA und GluA(K239Q).

Beispiel 3 ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion

Die ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion wurde durchgeführt, um sowohl die katalytische Aktivität als auch die Spezifität der aufgereinigten, rekombinanten A-Domänen zu [Mootz & Marahiel, 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850]. Hierbei wurde die Spezifität jeweils mit allen 20 proteinogenen Aminosäuren, sowie zusätzlich L-Ornithin und D-Phenylalanin, überprüft. Die Reaktionsmischungen enthielten (Endvolumen: 100 µL): 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 2 mM DTE, 1 mM EDTA, 0 bis 2 mM Aminosäure, sowie 250 nM Enzym. Die verschiedenen Reaktionen wurden durch Zugabe von 2 mM ATP, 0.2 mM Natriumpyrophosphat und 0.15 µCi (16.06 Ci/mmol) Natrium-[³²P]pyrophosphat (NEN/DuPont; Deutschland; Best.-Nr.: NEX019) initiiert und für 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend konnten die Austauschreaktionen durch Zugabe von 0.5 mL Stopp-Lösung abgestoppt werden: 1.2% (w/v) Aktiv-Kohle, 0.1 M Natriumpyrophosphat und 0.35 M Perchlorsäure. Die Aktiv-Kohle wurde durch Zentrifugation abgetrennt, einmal mit 1 mL bidestilliertem Wasser gewaschen und in 0.5 mL Wasser resuspendiert. Nach Zugabe von 3.5 mL Szintillationsflüssigkeit (Rotiscint Eco Plus; Roth; Art.-Nr.:0016.2) konnte die Kohle-gebundene Radioaktivität an einem Szintallationsmeßgerät (1900CA Tri-Carb "liquid scintillation analyzer"; Packard) bestimmt werden.

Beispiel 4 Computeranalyse zur Ermittlung der putativen Substrat-Bindungstaschen

Protein-Sequenzen von 160 A-Domänen wurden von öffentlich-zugänglichen Datenbanken (z. B. http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html) bezogen und auf den ca. 100 Aminosäuren großen Bereich zwischen den Core-Motiven A4 und A5 reduziert [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Diese Sequenzen wurden nachfolgend, mittels des Unterprogramms MegAlign aus dem DNAStar-Programmpaket, im Bezug auf Sequenzhomologien ausgerichtet, wobei die Methode "clustal" in ihrer Grundeinstellung zum Einsatz kam. Der einzige Zweck dieser ersten Ausrichtung war es, die anschließende Zuordnung der Konstituenten der putativen Substrat-Bindungstaschen zu erleichtern. Diese Zuordnung konnte letztendlich durch die Berücksichtigung ihrer Lage, relativ zu hoch-konservierten Sequenzmotiven (Core-Motive A4 und A5, sowie die Motive "TPS" und "GE"; strukturelle "Anker") getroffen werden. Alle Sequenzen wurden nachfolgend auf die ermittelten Konstituenten der Bindungstaschen zurecht gestutzt, und neue Ausrichtungen und phylogenetische Untersuchungen wurden mit diesen lediglich zehn Aminosäure-großen Bereichen durchgeführt. Eine Gruppierung der kodierenden Sequenzen gemäß der Substratspezifität ihrer Herkunftsdomänen konnte mit jeder Methode und jedem Parameter-Satz erzielt werden. Der in Abb. 2 gezeigte phylogenetische Baum wurde mit der Methode von Jotun Hein, unter Anwendung der folgenden Parameter, ermittelt: gap penalty 12, gap length penalty 6, und Ktuple 2.

Beispiel 5 Integration des AspA(H322E/I330V)-kodierenden Genfragments ins Chromosom von B. subtilis AS20

Um das Potential unserer Methode zur in vivo Synthese von gerichtet-modifizierten Peptidantibiotika unter Beweis zu stellen, wurde das kodierende Genfragment der AspA- Doppelmutante (Asp(H322E/I331V) in das srfA-Biosynthese-Operon von B. subtilis [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831] eingebracht. Für die Konstruktion des hierzu benötigten Integrationsplasmids mußte zunächst das entsprechende srfA-B-Genfragment, das für das Asp-aktivierende Modul kodiert (Basenpaar 14195-18200; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]), mittels PCR aus dem Chromosom von B. subtilis ATCC 21332 amplifiziert werden (unterstrichen: Restriktionsendonuklease-Schnittstellen): (Seq ID-NO: 35) 5'- homo Asp(ClaI): 5'-TAA ATC GAT GGA GGC TGC CAA GG-3'; und (Seq ID-NO: 36) 3'- homo Asp(SpeI): 5'-TAA ACT AGT CAG TAA ATC CGC CCA GT-3'. Das resultierende Amplifikat wurde gereinigt, mit den Restriktionsenzymen ClaI und SpeI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E11034Y u. E1086Z) verdaut und in den gleichermaßen präparierten Vektor pBluescript SK(-) kloniert (Stratagene, Heidelberg, Deutschland, Best.-Nr.: 212206) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pSK-homoAsp, aus dem nachfolgend mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1040Y u. E1073Y) ein ca. 1.3 kb-großes aspA'-Fragment (Basenpaar 15212-16559; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) herausgeschnitten und gegen das komplementäre, zweifach mutierte Fragment aus pAspA(H322E/I33V) ersetzt wurde. Die Identität des resultierenden Integrationsplasmids pSK-homoAsp(H322E/I330V) konnte durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden.

Zur Integration des mutierten aspA'-Fragmentes in das Surfactin-Biosynthese-Operon wurde auf eine bewährte Ko-Transformationstechnik ("congression") zurückgegriffen [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. Als Wirt diente der B. subtilis Stamm AS20 [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318], in dem das aspA'-Fragment (Basenpaar: 15245-­ 17177; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) deletiert und gegen das Chloramphenicoltransferase-Gen substituiert wurde. B. subtilis AS20 wurde für eine DNA- Aufnahme kompetent gemacht und mit dem Intergrationsvektor pSK-homoAsp(H322E/I330V) sowie dem Helferplasmid pNEXT33A ko-transformiert [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. Das letztgenannte Helferplasmid vermittelte hierbei über sein Neomycin- Resistenzgen zunächst eine positive Selektion, und die erhaltenen Klone konnten anschliessend auf den Verlust ihrer Chloramphenicol-Kassette und damit die Integration des aspA(H322E/I330V)'-Genfragments untersucht werden. Über eine PCR-Amplifikation dieses Bereiches aus dem Chromosom der selektionierten Klone, sowie eine anschließende DNA- Sequenzierung, konnte die Identität des konstruierten Klons B. subtilis Asn-5 verifiziert werden.

Beispiel 6 Surfactin-Präparation und -Analyse.

Die Präparation des Surfactin-Derivats aus B. subtilis Asn-5 erfolgte nach einem Standardverfahren [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. Zur Analyse wurde die erhaltene methanolische Lösung mittels eines 'HP1100 Series LC/MSD' HPLC-System unter Verwendung einer PepRPC HR 5/5-Säule Säule (Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Best.-Nr.: 18-0383-01) aufgetrennt. Die Separation der einzelnen Komponenten wurde bei einer Flußrate von 0.7 mL min^-1 durch Anlegen eines linearen Gradienten von 35% bis 70% Acetonitril (v/v) in 0.1% Trifluoressigsäure (v/v) erzielt. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 214 nm und durch eine massenspektrometrische Online-Analyse der eluierten Substanzen. Als Kontrolle wurde eine Präparation aus dem Wildtyp-Surfactin-Produzenten B. subtilis ATCC 21332 analog aufgearbeitet und analysiert.

LEGENDEN ZU DEN ABBILDUNGEN

Abb. 1 Strukturelle Basis für die Erkennung und Aktivierung von Phenylalanin (aus Conti et al. [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183]). (A) Das Bänder-Diagramm zeigt, daß PheA aus zwei Faltungsdomänen, einer großen N-terminalen (unten) und einer kleineren C- terminalen (oben), besteht. AMP und die Substrat-Aminosäure Phenylalanin sind schwarz gezeigt. (B) Die Bindungstasche für Phenylalanin wird von zehn Aminosäuren gebildet. Asp235 und Lys517 vermitteln elektrostatische Wechselwirkungen (gestrichelte Linien) mit der α- Amino- und α-Carboxylgruppe des Substrates. Die eigentliche Bindungstasche, die die spezifische Erkennung der Phenylalanin-Seitengruppe ermöglicht, wird durch Ala236, Ile330 und Cys331 auf der einen, sowie Ala322, Ala301, I299 und Thr278 auf der anderen Seite gebildet. Beide Seiten werden am unteren Ende durch den Indol-Ring des Trp239 voneinander getrennt gehalten. Diese Architektur gestattet es der Bindungstasche von PheA beide Stereoisomere, L- Phe (hellgrau) und D-Phe (dunkelgrau) ohne erkennbare Änderung der Konformation aufzunehmen.

Abb. 2 Phylogenetischer Baum, konstruiert mit den zehn Spezifität-vermittelnden Aminosäuren der A-Domänen. Die phylogenetische Untersuchung offenbart eine Gruppierung der ermittelten Kodone, gemäß der Spezifität ihrer Herkunftsdomänen (hellgraue Kästen). Dies bestätigt die Richtigkeit des Konzepts der strukturelle Homologie zwischen A-Domänen und zeigt, daß die jeweils ermittelten zehn Aminosäuren wirklich das Kodon für die Erkennung der kognaten Substrat-Aminosäure bilden. Es werden Beispiele gebracht die zeigen, daß die Spezifität von neu-entdeckten Domänen mittels dieser Technik vorhersagbar ist und das die Gruppierung von der experimentell beobachteten Spezifität geleitet wird (dunkelgraue Unterlegung). Dies gilt auch für die konstruierten Mutanten PheA(T278M/A301G) und AspA(H322E), die in der ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion eine Leu bzw. Asn-Spezifität (mittelgraue Unterlegung) zeigen.

Abb. 3 Schematische Darstellung der postulierten Bindungstaschen von drei Adenylierungsdomänen. Die ermittelten Kodone von drei verschiedenen Substraten ("Asp", "Orn(2)" und "Val(3)"; vgl. Tabelle 1) wurden in die in Abb. 1B gezeigte Darstellung der Bindungstasche von PheA projeziert. Aliphatische (hellgrau), polare (gestreift), acide (weiß) und basische (dunkelgrau) Seitengruppen sind schematisch gezeigt. In allen drei Fällen vermitteln Asp235 und Lys517 Wechselwirkungen mit der α-Amino und α-Carboxylgruppe des jeweiligen Substrats, während alle anderen Reste (Xaa236 bis Xaa331) die eigentliche Erkennung der Seitenkette des Substrates vermitteln. Es kann eine perfekte Korrelation zwischen der Polarität der Bindungstasche und des Substrates für alle gezeigten Beispiele beobachtet werden.

Abb. 4 Beobachtete Variabilität der Konstituenten von verschiedenen Substrat- Bindungstaschen. Die konstituierenden Aminosäuren der verschiedenen Positionen in 160 postulierten Substrat-Bindungstaschen wurden auf ihre Variabilität hin untersucht. Die proportionale Verteilung der Natur der. Substrate in den untersuchten A-Domäne ist im mittelgrauen Kasten dargestellt. Die hellgrauen Kästen, die mit jeder Position der Bindungstasche verbunden sind, geben die Anzahl der beobachteten, verschiedenen Reste (Häufigkeit: = 1%), sowie das proportionale Auftreten von hydrophoben, polaren, aciden und basischen Seitengruppen an diesen Stellen wieder. Aufgrund der gezeigten Ergebnisse können die zehn konstituierenden Aminosäuren in drei Untergruppen klassifiziert werden: (1) Die Positionen 235 (Asp: acid, weiß) und 517 (Lys: basisch, dunkelgrau) sind "invariant". (2) Die Positionen 236, 301 und 330 sind lediglich "bedingt variant". Sie offenbaren ein unterdurchschnittliches Auftreten von geladen und polaren Seitengruppen und die überwiegende Mehrzahl (93%) der untersuchten A-Domänen verwendet aliphatische Reste (grau) an diesen Positionen. Als "höchst variant" können die Positionen 239, 278, 299, 322 und 331 angesehen werden, die eine hochgradige Variabilität im Bezug auf die Verwendung unterschiedlicher Aminosäuren zeigen.

Abb. 5 Gezielte Veränderung der Substratspezifität von PheA und AspA. Die Substratspezifität von Wildtyp (weiß) und Mutanten (verschiedene Grau-Töne) wurden mit Hilfe von ATP-Pyrophophat-Austauschreaktionen untersucht. Die verwendeten Substrate sind auf der Abszisse dargestellt, und der beobachtete Maximalwert für die Aktivität eines jedes Protein wurde als 100% festgesetzt. (A) Punktmutationen in PheA in Richtung des "Leu(4)"-Kodons (T278M and A301G) erhöhen geringfügig die Seitenspezifität für Leu, während das bevorzugte Substrat immer noch Phe ist. Die entsprechende Doppelmutante (PheA(T278M/A301G); dunkelgrau) aktiviert dagegen bevorzugt Leu mit einer katalytischen Aktivität, die der Effizienz des Wildtyp- Enzyms PheA für Phe in nichts nachsteht. (B) Eine H322E-Punktmutation in AspA reichte aus, um die Substratspezifität der Mutante vollständig von Asp nach Asn zu verschieben. Die beobachteten Aktivierungsmuster der Mutanten stimmen mit der Lage ihrer Kodons im in Abb. 2 gezeigten phylogenetische Baum überein (mittelgraue Unterlegung).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Verfahren zur gezielten nicht-ribosomalen Synthese von Peptiden einer vorherbestimmten Struktur, wobei in einer gegebenen DNA Sequenz, kodierend für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase, einer oder mehrere A-Domänen kodierende Abschnitte gemäß des in Tabelle 1) vorgelegten nicht-ribosomalen Codes so verändert werden, daß das Expressionsprodukt der veränderten DNA Sequenz das Peptid der vorherbestimmten Struktur exprimiert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei in mindestens einer zu verändernden A-Domäne höchstens 10, bevorzugterweise höchstens 6, besonders bevorzugterweise höchstens 3, ganz besonders bevorzugterweise eine Aminosäure ausgetauscht wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei gezielt bei der gegebenen DNA Sequenz A- Domänen kodierende Abschnitte hinzugefügt oder entfernt werden, um längere oder kürzere Peptide zu synthetisieren.

4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die synthetisierten Peptide antibiotische, immunsuppressive, cytostatische, antiviral, antihelmitisch, fungizide oder oberflächenaktive Wirkung haben.

5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die veränderte nicht- ribosomale Peptidsynthetase in einen Wirtsorganismus eingebaut ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe: Bakterien, Pilze, Hefen, besonders bevorzugt sind Bacilli, Actinomyceten, Myxobakterien, Pseudomonaden und Escherichia Coli, ganz besonders bevorzugt ist Bacillus subtilis.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus eine Pflanze ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Wirtsorganismus ein Säugetier ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Wirtsorganismus ein Mensch ist.

10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die veränderte eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase in isolierter Form eingesetzt wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die veränderte nicht-ribosomale Peptidsynthetase immobilisiert ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die veränderte nicht-ribosomale Peptidsynthetase an einen Träger gebunden ist.

13. DNA Sequenz kodierend für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase worin einer oder mehrere A-Domänen kodierende Abschnitte gemäß des in Tabelle 1) vorgelegten nicht- ribosomalen Codes so verändert wurden, daß das Expressionsprodukt der veränderten DNA Sequenz das Peptid einer vorherbestimmten Struktur, die bevorzugterweise nicht einem natürlichen Peptid entspricht, exprimiert.

14. DNA Sequenz gemäß Anspruch 13, worin in mindestens einer zu verändernden A- Domäne höchstens 10, bevorzugterweise höchstens 6, besonders bevorzugterweise höchstens 3, ganz besonders bevorzugterweise eine Aminosäure ausgetauscht wird.

15. Verwendung der DNA Sequenz gemäß Anspruch 13 oder 14, zur Synthese von Peptiden in einem der Verfahren nach Anspruch 1 bis 11.

16. Peptide, die mittels einem der Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12 synthetisiert worden sind.

17. Peptide gemäß Anspruch 16, die chemisch oder biochemisch modifiziert werden.