DE19908752A1 - Synthetische Peptide des regulatorischen Virusproteins R (Vpr) des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 - Google Patents
Synthetische Peptide des regulatorischen Virusproteins R (Vpr) des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1Info
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-
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Abstract
Die Erfindung betrifft synthetische (s) Peptide des regulatorischen Virusproteins R (Vpr) des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1), insbesondere die chemische Totalsynthese des 96 Aminosäuren langen Vpr-Proteins (sVpr1-96), eines 47 Aminosäuren langen N-terminalen (sVpr1-47), eines 49 Aminosäuren langen C-terminalen Fragmentes davon (sVpr48-96) sowie der Fragmente sVpr1-20 und sVpr21-40 und weiterer Fragmente mit etwa 15 Aminosäuren. Als HIV-1-regulatorische Proteine finden die Produkte Verwendung in biologischen Assays, in der Analyse der molekularen Struktur und der physikochemischen Eigenschaften von Vpr und dessen Domänen oder zur Erzeugung von Antikörpern gegen Vpr-Pepsidsequenzen.
Description
Die Erfindung betrifft synthetische (s) Peptide des regulatorischen Virusproteins R (Vpr) des
Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1), insbesondere die chemische Totalsynthese des
96 Aminosäure langen Vpr-Proteins (sVpr1-96) sowie seiner Sequenzen. Als synthetische
Vpr-Peptide finden sie Verwendung in biologischen Assays, in der Analyse der molekularen
Struktur und den physikochemischen Eigenschaften von Vpr und dessen Domänen sowie zur
Erzeugung von Antikörpern gegen Vpr-Peptidsequenzen.
Die bislang einzige in vitro charakterisierte biochemische Aktivität von Vpr ist die eines
Kationen-selektiven Ionenkanals (Piller et al., 1996, - Literaturverzeichnis am Ende der
Ausführungsbeispiele). Diese Arbeiten basierten auf der Annahme, daß die C-terminale alpha
Helix (Positionen 46 bis 71 in Vpr), welche Ähnlichkeiten zu der Bienengift-Komponente
Melittin besitzt, als Transmembrananker eine Membranpore ausbilden kann. Tatsächlich
konnte rekombinantes, in Escherichia (E.) coli exprimiertes Vpr in künstlichen planaren
Lipidbilayern rekonstituiert werden. Dadurch wurde eine durch das Membranpotential
regulierbare Ionenkanalaktivität ermittelt, deren Regulierbarkeit von der basischen C
terminalen Region abhängt, welche mit der negativ geladenen zytoplasmatischen Seite der
Zellmembran in Wechselwirkung treten soll.
Es liegen Hinweise für Homooligomerisierung von Vpr vor: Ein rekombinantes Vpr-
Fusionsprotein bildet oligomere Strukturen mit Molekulargewichten von <100 kDa (Zhao et al.,
1994b), eine Beobachtung, die bislang an viralen Vpr nicht bestätigt wurde.
Untersuchungen zur molekularen Struktur von Vpr wurden durch zwei Gruppen mittels
Sekundärstruktur-Analysen an kurzen Vpr-Peptiden durchgeführt: NMR-Studien an
überlappenden Peptiden in wässerigem Trifluorethanol (TFE) sowie in
Natriumdodecylsulfat(SDS)-Mizellen identifizierten alpha-helikale Regionen in den Vpr-
Positionen 50-82. (Yao et al., 1998). Das Potential zur Helix-Bildung in der C-terminalen als
auch der N-terminalen Region von Vpr wurde zuvor von verschiedenen Autoren vorhergesagt
(Mahalingam et al., 1995a-d; Yao et al, 1995; Wang et al., 1996b). Neuere Studien mittels
CD-Spektroskopie in TFE-haltigen Lösungen an 25 Aminosäure langen Peptiden (Luo et al.,
1998) zeigten erste experimentelle Hinweise für die Existenz der N- und C-terminalen Helices
in Vpr. Zahlreiche und zum Teil in ihrer Aussage kontroverse Mutationsanalysen haben
versucht, die verschiedenen Primär- und Sekundärstrukturen einzelnen biologischen
Aktivitäten von Vpr zuzuordnen (Mahalingam et al., 1995a-d, 1997; Wang et al., 1996a,b; Nie
et al., 1998; Di Marzio et al., 1995).
Über die chemische Vollsynthese eines Vpr-Proteins wurde erstmals 1997 von Rocquigny und
Mitarbeitern berichtet. Die Autoren beschrieben die Synthese eines 96 Aminosäure großen
Peptides, welches von dem Virusisolat HIV-189,6 (Collman et al. 1992) abstammt. Neben den in
dieser Arbeit beschriebenen Nachteilen (siehe im weiteren Text) ist dieses Protein in 9
Aminosäurepositionen unterschiedlich zu Vpr von HIV-1NL4-3, dessen Darstellung in der
vorliegenden Erfindungsbeschreibung erstmalig berichtet wird. Somit besteht eine 10%-ige
Divergenz zwischen den bereits beschriebenen (Rocquigny et al., 1997) und dem in den
vorliegenden Verfahren dargestellten Produkten, welche die Gesamt- und Teilsequenzen des
Vpr-Proteins von HIV-1NL4-3 (Adachi et al, 1986) betreffen.
Rocquigny und Mitarbeitern (1997) geben keine Angaben über die Reinheit sowie die
physikochemischen Eigenschaften des Vpr-Peptides an. Es wird lediglich mittels der Far-
Westernblot Technik gezeigt, daß SDS-denaturiertes Vpr-Peptid mit dem viralen
Nukleoprotein NCp7 des gleichen HIV-1-Isolates in Wechselwirkung tritt. Dieser Befund der
NCp7-Vpr-Wechselwirkung konnte bislang von keiner der zahlreichen anderen auf dem Vpr-
Gebiet forschenden Gruppen bestätigt werden. Wesentlicher Nachteil dieser Vpr-Synthese ist
die Tatsache, daß für dieses Peptid keine der beschriebenen biologischen Aktivitäten durch
die Autoren gezeigt wurde. Insbesondere wird gezeigt, daß dieses Vpr-Peptid nicht an p6Gag
bindet, eine weithin akzeptierte Eigenschaft von Vpr (Paxton et al., 1993; Lavallee et al, 1994;
Kondo et al., 1995; Lu et al., 1995; Kondo und Göttlinger, 1996). Darüber hinaus wird
beschrieben, daß dieses Peptid kerne Oligomeren bildet, und es liegen Hinweise vor, daß
dieses Peptid in rein wässerigem System unlöslich ist. Von dem gleichen Labor wird in einer
weiteren Studie (Roques et al., 1997) ein Modell der Vpr-NCp7-Wechselwirkung vorgestellt,
welches auf Strukturanalysen an Teilsequenzen dieser Peptide basiert. Die Daten dazu
werden jedoch in dieser Arbeit oder anderen Veröffentlichungen der Autoren nicht näher
beschrieben.
Teilsequenzen von Vpr (Positionen 50-75, 50-82 und 59-86) wurden für NMR-Studien an
synthetischen Peptiden eingesetzt (Yao et al., 1998). Eine andere Gruppe hat zwei 25
Aminosäure lange Peptide aus den Bereichen der vorhergesagten alpha-helikalen Domänen
in Vpr mittels CD-Spektroskopie untersucht (Luo et al., 1998):
Kurze, ca. 20 Aminosäure lange Peptide der C-terminalen Region von Vpr; welche das Motiv
"HF/SRIG" enthalten, haben in einer Konzentration von 0.7 bis 3 micro-M zytotoxische
Wirkungen gegenüber verschiedenen Hefe-Stämmen, wie zum Beispiel Saccharomyces
cerevisiae, Candida albicans und Schizosaccharomyces pombe (Macreadie et al., 1996, 1997)
auslöst. Eine erhöhte Konzentration von bivalenten Kationen, insbesondere Magnesium und
Kalzium, verhindert die Aufnahme der Vpr-Peptide und dadurch deren toxische Effekte.
Weiterführende Studien zeigten, daß ein C-terminales Vpr-Peptid (Positionen 71-82) die
Membranpermeabilisierung, weiterhin eine Reduktion des Mitochondrienmembranpotentials
und letztendlich den Zelltod von CD4+ T-Zellen bewirkt (Macreadie et al., 1997). Schließlich
wurden ähnliche toxische Effekte ebenfalls für Gesamt-Vpr demonstriert (Arunagiri ef al.,
1997). Dazu wurde das gleiche rekombinante Glutathione S-Transferase(GST)-Vpr-
Fusionsprotein eingesetzt, welches zuvor für Ionenkanalstudien an Vpr verwendet wurde
(Piller et al., 1996). Jedoch berichten die Autoren ebenfalls über Probleme mit der Löslichkeit
des rekombinanten Produktes in wässerigen Systemen.
Rekombinantes Vpr des Isolates HIV-1NL4-3 wurde in Insektenzellen nach Infektion mit
rekombinanten Baculoviren exprimiert (Levy et all, 1995). Die Reinigung des Produktes
erfolgte lediglich durch Immunaffilnitätschromatographie an immobilisiertem polyklonalen
Antiserum, welches gegen die N-terminale Domäne von Vpr gerichtet ist. Dazu wurden
Zellkulturüberstände eingesetzt, da rekombinantes Vpr unspezifisch in das Kulturmedium
sekretiert wird. Reinigungsstrategien für die Produktion größerer Mengen an rekombinanten
Vpr wurden nicht beschrieben. In den meisten Fällen wurden von Autoren Vpr-haltige
Zellkulturüberstände für biologische Tests verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, daß
rekombinantes Vpr die Virusreplikation in PBMC (peripheral blood mononuclear cells) und in
verschiedenen latent infizierten Monozyten- und T-Zellinien aktiviert. Wesentliche Nachteile
dieses Verfahrens sind:
- - geringe Ausbeute und keine Möglichkeit zur Herstellung von mg-Mengen an hochreinem Produkt;
- - rekombinantes Vpr wurde im Prozeß der Affinitätsreinigung mit Detergentien versetzt, wodurch Dialyse und Renaturierung notwendig wurden;
- - Studien zu einer möglichen posttranslationalen Modifizierung von Vpr in Insektenzellen wurden nicht beschrieben;
- - die Wirkung von rekombinanten Vpr in HIV-infizierten primären Monozyten/Makrophagen wurde nicht getestet.
Expression, Reinigung sowie biochemische Charakterisierung von rekombinanten Vpr wurden
erstmals 1994 von Zhao und Mitarbeitern beschrieben. Dazu wurde die kodierende Sequenz
des Vpr-Proteins des Isolates HIV-189,6 in E. coli als Fusionsprotein exprimiert. Zum Zweck der
Reinigung und des Nachweises wurde in diesem Verfahren C-terminal eine 25 Aminosäuren
lange Sequenz des heterologen FLAG-Epitopes fusioniert. Außer der Oligomerisierung wurde
über keine biologischen Aktivitäten des rekombinanten Produktes in dieser Arbeit berichtet.
Wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens ist die Tatsache, daß Vpr nicht in seiner
authentischen Sequenz, sondern als Fusionsprotein exprimiert wird.
In einem weiteren Verfahren wurde Vpr des Isolates HIV-1HXB2 in E. coli als GST-
Fusionsprotein exprimiert (Piller et al., 1996). Nach Affinitätschromatographie an Glutathione-
Agarose wurde Vpr durch Thrombin-Spaltung vom Fusionsanteil befreit. Wesentlicher Nachteil
dieses Verfahrens ist die Tatsache, daß Vpr nach Spaltung eine starke Tendenz zur
Aggregation besitzt und nicht in wässeriger Lösung gehalten werden kann. So berichten zum
Beispiel Arunagiri und Mitarbeiter (1997), daß mit diesem Verfahren hergestelltes
rekombinantes Vpr nach Abspaltung des GST-Fusionsanteils nicht in Lösung gehalten werden
kann, sondern nur durch Beibehaltung des heterologen Fusionsanteils Vpr in wässerigen
Systemen getestet werden konnte.
In der Patentanmeldung WO 95/26361 (Azad, A.A., Macreadie, I.G., Arunagiri, C., 1995)
werden biologisch aktive Peptidfragmente des Vpr-Proteins von HIV beschrieben;
pharmazeutische Verbindungen, welche diese Peptide oder biologisch aktive Analoga davon
enthalten; Antagonisten der Vpr-Peptide sowie pharmazeutische Verbindungen, welche diese
Vpr-Antagonisten enthalten. Die chemische Synthese von Gesamt-Vpr-Protein spielt darin
keine Rolle.
In der WO 96/07741 (Cohen, E.; Bergeron, D.; Checroune, F.; Yao, X.-J:; Pignac-Kobinger,
G., 1996) werden chimere Moleküle unter Schutz gestellt, bestehend aus Vpr von HIV-1 und
Vpx von HIV-2, welche spezifisch in HIV-1/HIV-2-Viruspartikel eingebaut werden können und
dort die strukturelle Organisation und funktionelle Integrität von Virionen stören. Sie sind
jedoch für den Einsatz zur Gentherapie von HIV-1/HIV-2-Infektionen ausgeschlossen.
In WO 96/08970 (Weiner, D.B.; Levy, D.N.; Refaeli, Y., 1996) werden Methoden zur
Inhibierung der Zellteilung und der Lymphozyten-Aktivierung unter Anwendung von Vpr-
Proteinen, Fragmenten von Vpr oder Gensequenzen von Vpr beschrieben. Die chemische
Synthese von Vpr-Proteinen spielt darin keine Rolle.
Die Verwendung von vpr Genen im screening assay für anti-HIV-Arzneimittel wird in den US-
Patenten 5721104 und 5639619 beschrieben, zur Bestimmung von HIV-2 in US 5580739, ein
Vpr-Rezeptor-Protein in US 5780238.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Syntheseweg für Vpr-Peptide im mg-
Maßstab zu entwickeln, ihre Reinigung zu ermöglichen, und der Allgemeinheit das Endprodukt
zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch die Bereitstellung des Proteins sVpr1-96 sowie
der Peptide
- - ein 47 Aminosäuren langes N-terminales Peptid (sVpr1-47),
- - ein 49 Aminosäuren langes C-terminales Peptid (sVpr48-96) und von Fragmenten dieser Peptide, zum Beispiel
- - überlappende, etwa 15 Aminosäuren lange Peptide für die Epitop-Charakterisierung und isolelektrische Fokussierung
- - etwa 20 Aminosäuren lange Peptide zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung
einzelner Domänen von Vpr, insbesondere die Peptide sVpr1-20 und sVpr21-40 gelöst:
sVpr1-96:
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu- Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His-Asn-Leu-Gly- Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln- Leu-leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala- Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH
sVpr1-47:
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu- Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His-Asn-Leu-Gly- Gln-His-Ile-Tyr-NH2;
sVpr48-96:
Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile- His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly- Ala-Ser-Arg-Ser-OH
sVpr1-20 als sVpr1-20(Asn5,10,14):
H-Met-Glu-Gln-Ala-Asn-Glu-Asp-Gln-Gly-Asn-Gln-Arg-Glu-Asn-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-NH2 und
sVpr21-40 als sVpr2 l-40(Asn35):
H-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Asn-Arg-Ile-Trp-Leu-His-NH2, Fragmente dieser Peptide - mit etwa 15 Aminosäuren langen Peptiden
sVpr11-25:
Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-,
sVpr41-55:
Asn-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala,
sVpr46-60:
Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-,
sVpr56-70:
Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile,
sVpr66-80:
Gln-Leu-leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg,
sVpr76-96:
Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH.
Die Synthese der C-terminalen Vpr-Peptide erfolgte an einem Serin-Harz mit Hilfe eines
Perkin-Elmer-Synthesizers. Alle N-terminalen Peptide wurden an einem Polystyren-
Polyoxyethylen-Trägerharz synthetisiert. Der Aufbau der Peptide erfolgte mittels
FMOC(Fluormethyloxycarbonyl)-Strategie unter Verwendung von Schutzgruppen. Nach
Beendigung der Synthese erfolgte die Abspaltung der Schutzgruppen mittels eines
Abspaltungsgemisches, bestehend aus 95% Trifluoressigsäure, der 3% Triisopropylsilan und
je nach Peptid 2 bis 5% Ethandithiol zugesetzt wurde. Das Harz wurde abgetrennt, die
Reaktionslösung eingeengt und mit Heptan versetzt. Es wurde erneut eingeengt und das
verbleibende Öl mit Diethylether digeriert. Das rohe Peptid wurde abgesaugt und
anschließend aus Essigsäure lyophilisiert. Zur Reinigung wurden die Rohpeptide an einer
präparativen HPLC-Anlage (High Pressure Liquid Chromatography) chromatographiert. Alle
Peptide wurden an einer Kieselgelsäule mittels eines linearen Gradienten, bestehend aus TFA
(Trifluoressigsäure) in Wasser und TFA in Acetonitril gereinigt. Die Eluate wurden eingeengt
und lyophilisiert.
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäß hergestellten sVpr-
Peptide nach dieser Reinigungsprozedur - im Unterschied zu den bislang beschriebenen
rekombinanten oder synthetischen Produkten - wasserlöslich sind und selbst in hohen
Konzentration von bis zu mM-Lösungen keiner Proteinaggregation unterliegen. Es konnte
gezeigt werden, daß das Protein sVpr1-96 eine gefaltete Struktur annimmt, biologische
Aktivitäten vergleichbar mit viralen Vpr hat und immunologisch reaktiv ist.
Erstmals wird die chemische Synthese des Vpr-Proteins und seiner Fragmente beschrieben,
welcher der Aminosäuresequenz des Virusisolates HIV-1NL4-3 entspricht.
Unter dem Begriff synthetische (s) Vpr-Peptide werden im Rahmen der vorliegenden
Erfindungsbeschreibung die durch Festphasensynthese hergestellten Peptide verstanden,
welche die authentische Aminosäuresequenz des nativen Vpr-Proteins enthalten, so wie
dieses durch das vpr Gen des molekularen Isolates HIV-1NL4-3 kodiert wird.
Das Wesen der Erfindung liegt in einer Kombination bekannter Merkmale (Ausgangsstoffe,
Syntheseharze, Synthesizer) und neuer Lösungswege - der erstmaligen chemischen
Synthese dieser Verbindungen, der Synthesestrategie, der Wahl der spezifischen
Schutzgruppen, dem erfindungsgemäßen Abspaltungsgemisch Trifluoressigsäure-
Triisopropylsilan-Ethandithiol, dem Einsatz eines bestimmten Lösungsmittelgradienten (TFA-
Wasser-: TFA-Acetonitril für die Reinigung - die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer
neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin
liegt, daß nunmehr neue synthetisch hergestellte sVpr-Peptide zur Verfügung stehen.
Die erfindungsgemäß hergestellten synthetischen Peptide zeichnen sich durch folgende
Eigenschaften aus:
Sie haben eine extrem gute Löslichkeit in wässerigen Systemen, welche bis zu mM konzentrierte Peptid-Lösungen erlauben. Dies wiederum ist Voraussetzung für nachfolgende Strukturanalysen von Vpr mittels NMR(Nuclear Magnetic Resonance)-spektroskopischer und RKSA(Röntgenkristallstrukturanalyse)-Techniken.
Sie haben eine extrem gute Löslichkeit in wässerigen Systemen, welche bis zu mM konzentrierte Peptid-Lösungen erlauben. Dies wiederum ist Voraussetzung für nachfolgende Strukturanalysen von Vpr mittels NMR(Nuclear Magnetic Resonance)-spektroskopischer und RKSA(Röntgenkristallstrukturanalyse)-Techniken.
Die Peptide lassen sich unter ökonomisch vertretbaren Bedingungen im mg-Maßstab
herstellen und bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Sie zeigen immunogene und
biologische Eigenschaften, welche identisch sind mit denen von natürlichen Vpr-Proteinen. Sie
lassen sich für vielfältige Gebiete der Grundlagenforschung sowie der angewandten
Forschung auf dem Gebiet der HIV-Virologie einsetzen.
Die erfindungsgemäßen Peptide finden Verwendung in biologischen Assays, in der
Strukturanalyse von Vpr und dessen Domänen, zur Erzeugung von Antikörpern gegen HIV-
Peptidsequenzen, in antiviralen Reagenzien, zum Aufbau von Testsystemen zum Screenen
von potentiellen Vpr-Antagonisten, bei der Etablierung von Zellkultur- und Tiermodellen, zur
Untersuchung der Pathomechanismen von Vpr, für die in vitro Assemblierung von neuartigen
Vektoren für den Einsatz bei Gentransfermethoden in der Gentherapie und zur Entwicklung
von serologischen Testmethoden, insbesondere eines Vpr-Antigen-ELISA.
Die erfindungsgemäß hergestellten Produkte können für die Aufklärung der molekularen
Struktur von Vpr mittels NMR- und CD-spektrokopischen Methoden sowie der Kristallisation
und nachfolgender RKSA eingesetzt werden. Diese Informationen wiederum sind essentiell für
das Verständnis der molekularen Wirkungsweise des Vpr-Proteins im HIV-1-
Replikationszyklus und der damit verbundenen Pathomechanismen einer AIDS-Erkrankung
sowie dem molekularen Design von potentiellen Vpr-Antagonisten.
Weiterhin können mit diesen Produkten in vitro Testsysteme dargestellt werden, welche das
intensive Screening von potentiellen anti-Vpr-wirksamen Reagenzien erlauben. Darüber
hinaus können sie für die Erzeugung und Testung von Vpr-spezifischen Antikörpern und für
serologische Testverfahren angewendet werden.
Die Erfindung wird in der Peptidchemie, der virologischen Grundlagenforschung, der
Strukturanalyse sowie der medizinischen Diagnostik angewendet.
Sie soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf sie beschränkt
zu sein.
Die Synthese der C-terminalen Vpr-Peptide erfolgte an einem Serin-Harz der Fa. Rapp
Polymere Tübingen an einem ABI 433A Synthesizer (Perkin Elmer).
Alle N-terminalen Peptide wurden an einem Polystyren-polyoxyethylen-Trägerharz (TentaGel
R-RAM-Harz der Fa. Rapp Polymere) synthetisiert.
Der Aufbau der Peptide erfolgte mittels FMOC(Fluormethyloxycarbonyl)-Strategie unter
Verwendung nachfolgender Schutzgruppen: O-t.Butylester für Glu und Asp, OtBu-Ether für
Serin, Tyrosin und Threonin, Boc (tert-Butoxycarbonyl-) für Lysin und Tryptophan, Trt (Trityl -
Triphenylmethyl-) für Histidin, Glutamin und Asparagin sowie Pbf (2.2.4.6.7-pentamethyl
dihydrobenzofuran-5-sulfonyl-) für Arginin.
Nach Beendigung der Synthese erfolgte die Abspaltung der Schutzgruppen mittels eines
Abspaltungsgemisches, bestehend aus 95% Trifluoressigsäure, der 3% Triisopropylsilan und
je nach Peptid 2 bis 5% Ethandithiol zugesetzt wurde. Das Harz wurde abgetrennt, die
Reaktionslösung eingeengt und mit Heptan versetzt. Es wurde erneut eingeengt und das
verbleibende Öl mit Diethylether digeriert. Das rohe Peptid wurde abgesaugt und
anschließend aus 10%iger Essigsäure lyophilisiert.
Zur Reinigung wurden jeweils 100 mg Rohpeptid an einer präparativen HPLC-Anlage
(Shimadzu LC-8 Anlage) chromatographiert. Alle Peptide wurden an einer Kieselgelsäule (300
× 400 mm Vydac-RP18-Säule, Korngröße 15-20 µM) mittels eines linearen Gradienten,
bestehend aus A = 1% TFA (Trifluoressigsäure) in Wasser und B = 0,1% TFA in 80%igem
Acetonitril mit einem Fluss von 100 ml/min gereinigt. Die Eluate wurden eingeengt und
lyophilisiert.
Das Peptid wurde an einem TentaGel S-AC-Harz (0,20 mmol/Gramm) an einem ABI 433
aufgebaut. Am Schluß der Synthese wurde die FMOC-Schutzgruppe abgespalten, das Harz
nacheinander mit Dimethylformamid und Methylenchlorid gewaschen und getrocknet. Das
Peptid wurde dann in der eingangs beschriebenen Weise vom Harz abgespalten und
anschließend gereinigt.
Molmasse: 11378 gef. 11381
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu- Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His-Asn-Leu-Gly- Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln- Leu-leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala- Arg-Asn-Gly-Ala-
Ser-Arg-Ser-OH
Molmasse: 11378 gef. 11381
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu- Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His-Asn-Leu-Gly- Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln- Leu-leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala- Arg-Asn-Gly-Ala-
Ser-Arg-Ser-OH
Fig. 1 sVpr1-96 - Direkte Auftrennung im SDS-PAGE (A)
Immunpräzipitation vor SDS-PAGE (B),
Immunpräzipitation vor SDS-PAGE (B),
Fig. 2 sVpr1-96 - Präparative Reinigung des Rohpeptids - HPLC-Chromatogramm,
Fig. 3 sVpr1-96 - Massenspektrum (% Int. und Molmasse),
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Molmasse: 5728 gef. 5728.8
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu- Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His-Asn-Leu-Gly- Gln-His-
Ile-Tyr-NH2
Molmasse: 5728 gef. 5728.8
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu- Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His-Asn-Leu-Gly- Gln-His-
Ile-Tyr-NH2
Fig. 4 sVpr1-47 - Massenspektrum (% Int. und Molmasse)
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile- His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly- Ala-Ser-Arg-Ser-OH
Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile- His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly- Ala-Ser-Arg-Ser-OH
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
H-Met-Glu-Gin-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Argclu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-NH2
H-Met-Glu-Gin-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Argclu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-NH2
Fig. 5 sVpr1-20 - Massenspektrum (%Int. 10% = 111 mV [sum = 9505 mv] Profiles
1-85 Unsmoothed und Molmasse)
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-NH2
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-NH2
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Wildtyp-Sequenz
H-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Asn-Arg-Ile-Trp-Leu-His-NH2
Wildtyp-Sequenz
H-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Asn-Arg-Ile-Trp-Leu-His-NH2
Fig. 6 sVpr21-40 - Massenspektrum (%Int. 10% = 335 mV [sum = 28541 mv] Profiles
1-85 Unsmoothed und Molmasse)
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
H-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Asn-Arg-Ile-Trp-Leu-His-NH2
H-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Asn-Arg-Ile-Trp-Leu-His-NH2
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-
Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Asn-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala
Asn-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-
Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile
Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Gln-Leu-Leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg
Gln-Leu-Leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg
Analog zu Beispielen 1 bis 3.
Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH
Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH
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Fig. 1 sVpr1-96 - Direkte Auftrennung im SDS-PAGE (A),
Immunpräzipitation vor SDS-PAGE (B),
Fig. 2 sVpr1-96 - Massenspektrum,
Fig. 3 sVpr1-96 - Chromatogramm,
Fig. 4 sVpr1-47 - Massenspektrum,
Fig. 5 sVpr1-20 - Massenspektrum,
Fig. 6: sVpr21-40 - Massenspektrum.
Claims (9)
1. Synthetische Peptide des regulatorischen Virusproteins R (Vpr) des Humanen
Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1).
2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um
- 1. 2.1. ein 96 Aminosäuren langes Vpr-Protein (sVpr1-96)
- 2. 2.2. ein 47 Aminosäuren langes N-terminales Peptid (sVpr1-47)
- 3. 2.3. ein 49 Aminosäuren langes C-terminales Peptid (sVpr48-96) sowie
- 4. 2.4. Fragmente dieser Peptide, zum Beispiel
- 1. 2.4.1. überlappende, etwa 15 Aminosäuren lange Peptide für die Epitop-Charakterisierung und isolelektrische Fokussierung
- 2. 2.4.2. etwa 20 Aminosäuren lange Peptide zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung einzelner Domänen von Vpr, insbesondere
- 3. 2..2.1. die Peptide sVpr1-20 und
- 4. 2.4.2.2. sVpr21-40
handelt.
3. Peptide nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich
- 1. 3.1. bei dem 96 Aminosäuren langen Vpr-Protein um
sVpr1-96
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu- Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His- Asn-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile lle-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg- Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH - 2. 3.2. bei dem 47 Aminosäuren langen N-terminalen Peptid um
sVpr1-47
H-Met-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu- Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Pro-Arg-Ile-Trp-Leu-His- Asn-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-NH2 - 3. 3.3. bei dem 49 Aminosäuren langen C-terminalen Peptid um
sVpr48-96
Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg Arg-Ala-Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH - 4. 3.4. bei den Fragmenten dieser Peptide um die etwa 15 Aminosäuren lange Peptide
- 1. 3.4.1. sVprl1-25
Gln-Arg-Glu-Pro-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu- - 2. 3.4.2. sVpr41-55
Asn-Leu-Gly-Gln-His-l le-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala - 3. 3.4.3. sVpr46-60
Ile-Tyr-Glu-Thr-Tyr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala-Gly-Val-Glu-Ala-Ile- - 4. 3.4.4. sVpr56-70
Gly-Val-Glu-Ala-Ile-Ile-Arg-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-leu-Phe-Ile - 5. 3.4.5. sVpr66-80
Gln-Leu-leu-Phe-Ile-His-Phe-Arg-Ile-Gly-Cys-Arg-His-Ser-Arg - 6. 3.4.6. sVpr76-96
Cys-Arg-His-Ser-Arg-Ile-Gly-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Arg-Ala-Arg-Asn-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser-OH
- 1. 3.4.1. sVprl1-25
- 5. 3.5. bei den etwa 20 Aminosäuren langen Peptiden um
- 1. 3.5.1. die Peptide sVpr1-20 als
sVpr1-20(Asn5,10,14)
H-Met-Glu-Gln-Ala-Asn-Glu-Asp-Gln-Gly-Asn-Gln-Arg-Glu-Asn-Tyr-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-NH2 und - 2. 3.5.2. sVpr21-40 als
sVpr 21-40(Asn35)
H-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-Leu-Lys-Ser-Glu-Ala-Val-Arg-His-Phe-Asn-Arg-Ile-Trp-Leu-His-NH2
- 1. 3.5.1. die Peptide sVpr1-20 als
handelt.
4. Verfahren zur Herstellung von neuen synthetischen Peptiden des regulatorischen
Virusproteins R (Vpr) des Humanen lmmundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) nach den Ansprüchen
1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Synthese der C-terminalen Vpr-Peptide an einem
Serin-Harz mit Hilfe eines Perkin-Elmer-Synthesizers erfolgt, alle N-terminalen Peptide an
einem Polystyren-Polyoxyethylen-Trägerharz synthetisiert werden und der Aufbau der Peptide
mittels FMOC-Strategie unter Verwendung von Schutzgruppen erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß nach Beendigung der Synthese
die Abspaltung der Schutzgruppen mittels eines Abspaltungsgemisches, bestehend aus 95%
Trifluoressigsäure, der 3% Triisopropylsilan und je nach Peptid 2 bis 5% Ethandithiol
zugesetzt wurde, erfolgt und das Harz abgetrennt wird.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Rohpeptide an
einer präparativen HPLC-Anlage chromatographiert und die Peptide an einer Kieselgelsäule
mittels eines linearen Gradienten, bestehend aus TFA (Trifluoressigsäure) in Wasser und TFA
in Acetonitril, gereinigt werden.
7. Verwendung der Peptide nach den Ansprüchen 1 bis 6 in biologischen Assays, in der
Strukturanalyse von Vpr und dessen Domänen, zur Erzeugung von Antikörpern gegen HIV-
Peptidsequenzen, in antiviralen Reagenzien, zum Aufbau von Testsystemen zum Screenen
von potentiellen Vpr-Antagonisten, bei der Etablierung von Zellkultur- und Tiermodellen zur
Untersuchung der Pathomechanismen von Vpr, bei der in vitro Assemblierung von neuartigen
Vektoren für den Einsatz bei Gentransfermethoden in der Gentherapie, und zur Entwicklung
von serologischen Testmethoden, insbesondere eines Vpr-Antigen-ELISA.
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Acquired Immune Defic.Syndr. 1994, 7 (7), S. 635-40 * |
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