DE19903519A1 - Biologisches Testverfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein biologisches Testverfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zu dessen Durchführung.

Biologische Testverfahren gewinnen in der humantoxikologi­ schen und ökotoxikologischen Bewertung von Schadstoffen in Umweltproben zunehmend an Bedeutung, da sie im Gegensatz zur chemischen Analyse nicht die Stoffkonzentration, sondern die toxischen Wirkungen der Testsubstanz in den Mittelpunkt der Untersuchung stellen. Zur Bestimmung der toxischen Wirkung einer Testsubstanz auf das Wachstum eines phototrophen Testorganismus existieren genormte biologische Testverfahren (DIN 38 412 L33, 1991 sowie EN 28 629 L9, 1993) mit plankto­ nischen Süßwasseralgen, nämlich der Scenedesmus supspicatus oder der Selenastrum capricornutum als stellvertretende Testorganismen für die Primärproduzenten im Plankton des Süß­ wassers.

Der Wachstumshemmtest nach der EN 28 692 dient zur Bestimmung der toxischen Wirkungen chemischer Verbindungen, insbesondere in Abwasserproben, Bodenproben und Abfällen (Testsubstanz), auf das Wachstum von planktonischen Süßwasseralgen. Hierzu werden die Zellen der Süßwasseralgen während eines 72 Stunden dauernden Tests über mehrere Generationen in einem definier­ ten Medium kultiviert und die Zellzahl nach 24, 48 und 72 Stunden gemessen. Als Ergebnis erhält man eine Aussage über den Einfluß des Volumenanteils der Testsubstanz in den Testansätzen auf das Wachstum des Testorganismus.

Als Rahmenbedingung für den Wachstumshemmtest werden kon­ stante Temperaturen, homogene Lichtbedingungen sowie eine gleichmäßig suspendierte Lösung des Testorganismus vorausge­ setzt.

Der in der DIN 38 412 L33 beschriebene Scenedesmus-Chloro­ phyll-Fluoreszenztest dient der Bestimmung, der nicht gifti­ gen Wirkung von Abwasser (Testsubstanz) gegenüber Grünalgen über Verdünnungsstufen. Aus dem Vergleich der Zellvermehrung in einem insgesamt 72 Stunden dauernden Test unter definier­ ten Versuchsbedingungen mit und ohne Einwirkung der Testsub­ stanz ergibt sich die Hemmwirkung. Sie ist ein Maß für die toxische Wirkung der Testsubstanz gegenüber dem Testorganis­ mus.

Nach 72-stündiger Inkubation der Testalgen in mehreren Testansätzen mit unterschiedlichen Volumenanteilen der Test­ substanz wird die Algenbiomasseproduktion der Testalgen unter Einwirkung des Abwassers mit der Produktion in einer Mischung, die kein Abwasser enthält, verglichen. Die Rahmen­ bedingungen für dieses Testverfahren entsprechen denen nach der EN 28 692.

Apparativ werden die vorerwähnten biologischen Testverfahren in einem thermostatisierten Raum mit gleichmäßiger Beleuch­ tung durchgeführt, in dem auf einem Schüttler etwa 40 250-ml fassende Erlenmeyerkolben als Testgefäße angeordnet sind. Das Gesamtvolumen jedes Testansatzes in allen Testgefäßen beträgt 100 ml. Zur Messung der Zellzahl während der Dauer eines Tests wird vorzugsweise ein Partikelzählgerät oder ein Mikroskop mit Zählkammer verwendet. Alternativ kann die Zellzahl des Testorganismus, hier der Algen, durch indirekte Verfahren be­ stimmt werden, in dem Photometer, Turbidimeter oder Fluorime­ ter verwendet werden, die empfindlich genug sind, und deren Meßwerte ausreichend eng mit der Zellzahl korrelieren.

Verwendet man als thermostatisierten Raum mit homogener Be­ leuchtung einen handelsüblichen Schüttelschrank, ist die maximale Anzahl der Testansätze mit unterschiedlichen Volu­ menanteilen an Testsubstanz (Verdünnungsstufen) je Schüttel­ schrank relativ gering. Geht man von 6-8 Verdünnungsstufen und von 2-3 Parallelansätzen für jede Verdünnungsstufe so­ wie 3 identischen Kontrollansätzen ohne Testsubstanz (Nährlö­ sung, deionisiertes Wasser und Algenzellen) und einem Null­ wert (Nährlösung und deionisiertes Wasser) aus, lassen sich maximal 3 Tests in einem handelsüblichen Schüttelschrank gleichzeitig durchführen.

Sowohl bei dem Fluoreszenztest als auch dem Wachstumshemmtest erfolgen die Messungen manuell. Beim Fluoreszenztest wird zu Beginn und nach 72 Stunden von allen Test- und Kontrollan­ sätzen die Fluoreszenz bei λ = 685 nm mit einem Fluoreszenz-Spek­ trophotometer gemessen. Hierzu wird aus allen Kulturgefä­ ßen eine Probe von ca. 1 ml entnommen. Beim Wachstumshemmtest gestaltet sich die Messung aufwendiger. Mindestens alle 24 Stunden wird die Zellzahl gemessen. Diese Messungen werden an kleinen Volumina, laut der EN 28 692 beispielsweise 5 ml, durchgeführt. Die den Testansätzen entnommenen Volumina wer­ den wie bei dem Fluoreszenztest nicht ersetzt. Darüber hinaus ist es beim Wachstumshemmtest erforderlich, daß von einem Test- oder Parallelansatz jeder Verdünnungsstufe sowie den Kontrollansätzen die PH-Werte gemessen werden.

Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein biologisches Testverfahren zur Be­ stimmung von toxischen Wirkungen einer Testsubstanz vorzu­ schlagen, daß den gleichzeitigen Test einer höheren Anzahl Testansätze auf engerem Raum ermöglicht, bei dem ein ge­ ringeres Gesamtvolumen an Testsubstanz benötigt wird, um ar­ beits- und umwelthygienische Nachteile der Tests mit toxi­ schen Testsubstanzen zu reduzieren und weniger Chemikalien für die Herstellung der Testansätze benötigt. Schließlich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens vorzuschlagen.

Die Lösung basiert auf dem Gedanken, daß bisher für derartige biologische Testverfahren übliche Gesamtvolumen der Testan­ sätze in jedem Testgefäß von 100 ml auf etwa 2 ml zu ver­ ringern. Im einzelnen wird die Aufgabe bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, daß als Testgefäße die Kavitäten mindestens einer Mikrotitrationsplatte verwen­ det werden.

Überraschend hat sich herausgestellt, daß die Repräsentativi­ tät an der Reduktion des Gesamtvolumens der Testansätze in jedem Testgefäß von 100 ml auf etwa 2 ml nicht leidet. Insbe­ sondere wenn die in den eingangs genannten Normen vorgese­ henen Testorganismen eingesetzt werden, ist sichergestellt daß Zellen des Testorganismus in ausreichender Zahl in den einzelnen Kavitäten der Mikrotitrationsplatten vorhanden sind.

Schließlich liegen die Testsubstanzen bei normgerechter Durchführung des Verfahrens entweder vollständig in Wasser gelöst vor oder sind zumindest durch Filtration von ihren gröberen Bestandteilen befreit, so daß insoweit durch die Übertragung auf den Mikrotitrationsmaßstab keine Probleme entstehen.

Durch die Übertragung des Testverfahrens auf den Mikrotitra­ tionsplattenmaßstab wird das Gesamtvolumen an Testsubstanz sowie der Verbrauch an Chemikalien erheblich reduziert. Schließlich wird durch diese einfache Maßnahme das bisher in erster Linie manuell durchgeführte Testverfahren automati­ sierbar.

In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird der Testor­ ganismus durch Schütteln mit veränderlichen Schüttelinter­ vallen und/oder veränderlichen Schüttelfrequenzen in Suspen­ sion gehalten. Die Schüttelamplitude besitzt einen Gesamthub, auch Orbit genannt, von etwa 1-2 mm gegenüber einer Schüttelamplitude von etwa 5 cm, wie sie bei herkömmlichen Schüttelschränken üblich ist. Die Schüttelfrequenz beträgt 500 1/min bis 1350 1/min. Das Schütteln kann im Dauerbetrieb, jedoch auch mit in der Dauer veränderlichen Pausen erfolgen. Während des Tests sind definierte Temperatur- und Lichtbe­ dingungen erforderlich. Die Test- und Kontrollansätze werden normgerecht bei 23 ±2°C unter Dauerbeleuchtung inkubiert, wobei die Temperaturabweichungen während des Tests nicht mehr als ±1°C betragen sollen. Richtwert für die Beleuchtung ist eine photosynthetisch wirksame Photonenraumbestrahlung von 0,72 × 10²⁰ Photonen je (m².s).

Um die Temperatur mittels eines Reglers auf der eingestellten Temperatur zu halten, kommt beispielsweise ein thermostati­ sierter Raum zur Durchführung des Tests in Frage. Die Be­ leuchtung kann dann durch eine oder mehrere Leuchtstofflampen nach DIN EN 60081, Lichtfarbe universal weiß, gewährleistet werden. Alternativ können die Temperatur- und Lichtbe­ dingungen durch ein Lichtthermostat sichergestellt werden.

Um die Aussagekraft der Testverfahren zu verbessern, insbe­ sondere Wachstumskinetiken bzw. -verläufe des Testorganismus zu erfassen, wird die Zellzahl in den Testgefäßen in regelmä­ ßigen Abständen, mindestens jedoch 10 mal während eines üb­ licherweise 72 Stunden dauernden Tests gemessen.

Um das Testverfahren zu automatisieren, ist es in einer Aus­ gestaltung der Erfindung vorgesehen, daß die Zellzahl mit Hilfe indirekter Verfahren bestimmt wird, in dem Photometer, Turbidimeter oder Fluorimeter in an sich bekannter Weise ver­ wendet werden, deren Meßwerte ausreichend eng mit der Zellzahl korrelieren.

Da aufgrund der Mikrotitrationsplatten alle Testansätze le­ diglich mit einem Gesamtvolumen zwischen 0,2 ml bis 2,5 ml, insbesondere von 2 ml befüllt werden müssen, reduziert sich nicht nur das Gesamtvolumen an Testsubstanz sowie der Ver­ brauch an Chemikalien, sondern auch der personelle Aufwand für die Durchführung der Tests.

Eine Möglichkeit die Testgefäße der Mikrotitrationsplatten während der Inkubation so abzudecken, daß die Testorganismen Kohlenstoffdioxid aus der Umgebungsluft entnehmen und Sauer­ stoff abgeben können, jedoch gleichzeitig die Verdunstung der Testansätze reduziert wird, besteht darin, die Mikrotitra­ tionsplatten mit mindestens einem an seinem Auflagerand einen gasdurchlässigen Kunststoff, z. B. aus geschäumtem Silikon-Kaut­ schuk, aufweisenden Deckel abzudecken und auf jeden Deckel ein geringen Anpreßdruck auszuüben. Bei manueller Durchführung des Verfahrens ist es auch möglich, Deckel auf die Mikrotitrationsplatten aufzusetzen und die Platte mit aufgesetztem Deckel mit einer gasdurchlässigen Folie, z. B. mit Folie aus einem Polyoliphen-Paraffinwachs-Gemisch zu um­ wickeln.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens weist einen temperierten und beleuchteten Inkuba­ tionsschrank mit mindestens einer Schütteleinrichtung für Mi­ krotitrationsplatten auf, die in dem Inkubationsschrank auf Halterungen angeordnet sind.

Die Schütteleinrichtung ist so ausgebildet, daß sie die oben genannten Bereiche für die Schüttelamplitude und Schüttelfre­ quenz abdecken kann. In einer Ausgestaltung der Erfindung er­ folgt die Temperierung des Inkubationsschrankes über die Schütteleinrichtung, beispielsweise mit Peltier-Elementen.

Mit sogenannten Gewebekulturplatten aus Polystyrol werden die DIN-Kriterien für die Referenztestsubstanzen Kaliumdichromat und Dichlorphenol im Mikrotitrationsmaßstab problemlos einge­ halten. Alternativ können Mikrotitrationsplatten aus Quarz­ glas eingesetzt werden, die allerdings wesentlich teurer sind, als die Gewebekulturplatten aus Polystyrol.

Um die Testansätze indirekt auch von unten zu beleuchten, ist es in einer Ausgestaltung der Erfindung vorgesehen, daß jede Schütteleinrichtung, insbesondere deren Tablar, mit einer spiegelnden Fläche versehen ist, und auf jeder Fläche min­ destens eine transparente Halterung, beispielsweise aus Plexiglas, für Mikrotitrationsplatten angeordnet ist. Der Ab­ stand zwischen den Mikrotitrationsplatten und der spiegelnden Fläche beträgt etwa 2 cm.

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt indirekt mittels Photome­ ter, Turbidimeter oder Fluorimeter, wobei die Vorrichtung in einer Ausgestaltung der Erfindung eine Transporteinrichtung aufweist, um die Mikrotitrationsplatten zwischen dem Inkuba­ tionsschrank und einer Meßkammer zu transportieren, die diese Meßgeräte enthält. Die Auswertung der Signale der Meßgeräte erfolgt vorzugsweise rechnergestützt.

Da zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Schütteln in Intervallen genügt, ist es in einer Ausgestal­ tung der Erfindung möglich, daß die Transporteinrichtung zu­ gleich als Schütteleinrichtung dient und auf weitere Schütteleinrichtungen, die unmittelbar auf die Halterungen für die Mikrotitrationsplatten wirken, verzichtet wird.

Um die Testansätze maschinell zu erstellen, kann die Vorrich­ tung einen automatischen Dispenser zum Befüllen und/oder Pi­ pettieren der Kavitäten der Mikrotitrationsplatten aufweisen. Der Dispenser kann beispielsweise an einem Roboterarm ange­ ordnet sein.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispie­ len des näheren erläutert.

Es zeigen

Fig. 1 eine Vorderansicht eines beleuchteten Inkuba­ tionsschrankes gem. der Erfindung,

Fig. 2 Mikrotitrationsplattenhalterungen auf einem Tablar für einen Inkubationsschrank nach Fig. 1 sowie

Fig. 3 Mikrotitrationsplattenhalterungen auf einem Tablar mit einer Transporteinrichtung für einen Inkuba­ tionsschrank nach Fig. 1 sowie eine Darstellung einer Meßkammer.

Der insgesamt mit 1 bezeichnete Inkubationsschrank umfaßt eine Bedieneinheit 2, eine Schütteleinrichtung 3 für Mikro­ titrationsplatten 7 und eine Beleuchtungseinheit 4. Über die Bedieneinheit 2 wird die Temperatur im Inkubationsschrank 1 und die Schüttelfrequenz, Amplitude sowie die Intervalldauer der Schütteleinrichtung 3 eingestellt. Auf einer spiegelnd ausgebildeten Oberfläche 5 der als Tablar ausgebildeten Schütteleinrichtung 3 sind Plexiglashalterungen 6 zur Auf­ nahme der in Fig. 1 nicht gezeigten Mikrotitrationsplatten 7 angeordnet. Die Plexiglashalterungen 6 fixieren die Mikro­ titrationsplatten 7 in einem Abstand von etwa 2 cm von der spiegelnden Oberfläche 5.

Die Beleuchtungseinheit 4 besteht abhängig von der Größe des Inkubationsschranks 1 aus einer oder mehreren Leuchtstofflam­ pen nach DIN EN 60 081, die eine Lichtmenge von 120 µmol Quanten/s m² im Inneren des Inkubationsschrankes 1 gewährlei­ sten. Um eine unerwünschte Aufheizung des Innenraums des In­ kubationsschrankes 1 zu vermeiden, sind die Drosseln 8 der Leuchtstofflampen außen am Inkubationsschrank 1 angebracht.

Aus Fig. 2 ist die Schütteleinrichtung 3 mit in den Plexi­ glashalterungen 6 eingesetzten Mikrotitrationsplatten 7 er­ kennbar. Fig. 2 verdeutlicht, daß anstelle der bisher üb­ lichen 40 Testansätze mühelos die dreifache Menge an Testan­ sätzen in einem gleich großen Inkubationsschrank unterge­ bracht werden können.

Fig. 3 schließlich zeigt ein für einen vollautomatischen Be­ trieb ausgebildetes Tablar 11, das allerdings keine Schüttel­ einrichtung aufweist. Die Mikrotitrationsplatten 7 befinden sich übereinstimmend auf Halterungen und werden über einen in Fig. 3 nicht dargestellten Fördermechanismus in Richtung der Pfeile 12 auf ein Transportband 13 geschoben. Das Transport­ band 13 dient sowohl dem Abtransport der Mikrotitrations­ platten 7, als auch als Schütteleinrichtung. Die Programmie­ rung und Bedienung des Transportbandes 13 erfolgt ebenfalls über die Bedieneinheit 2. Das Transportband 13 führt über eine Schleuse 14 aus dem Inkubationsschrank 1 hinaus und reicht bis an eine Meßeinheit 16 nach Art einer Brücke 17 heran. Ein nur schematisch dargestellter Greifarm 18 der Meßeinheit 16 transportiert die Mikrotitrationsplatten 7 wei­ ter in eine Meßkammer 19 der Meßeinheit 16, in der ein nicht dargestelltes Fluori- und Photometer zur Bestimmung der Zellzahl angeordnet sind. Weiter befindet sich in der Meßein­ heit 16 eine nicht dargestellte Recheneinheit mit der erfor­ derlichen Datenaufnahme- und Auswertungssoftware für die Meß­ daten des Fluori- und Photometers.

Das Hochfahren der Schütteleinrichtung auf die Mindest­ schüttelfrequenz von 500 1/min muß langsam erfolgen, um ein Überschwappen der Testansätze zwischen den einzelnen Kavitä­ ten zu verhindern.

Schließlich kann die Schütteleinrichtung in einer definierten Position anhalten, um das Zusammenspiel mit dem automatisch arbeitenden Greifarm, dem Fördermechanismus und einen ggf. vorhandenen automatischen Dispenser problemlos zu ermög­ lichen.

Claims (14)

1. Biologisches Testverfahren zur Bestimmung von toxischen Wirkungen einer Testsubstanz auf das Wachstum eines pho­ totrophen Testorganismus in mehreren Testansätzen mit un­ terschiedlichen Volumenanteilen an Testsubstanz, wobei das Gesamtvolumen der Testansätze in allen Testgefäßen gleich ist, bei dem die Testansätze über eine Mindest­ dauer unter definierten Temperatur- und Lichtbedingungen inkubiert werden, wobei während der Dauer eines Tests der Testorganismus in Suspension gehalten und zu mindestens zwei Zeitpunkten dessen Zellzahl in jedem Testgefäß be­ stimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Testgefäße die Kavitäten mindestens einer Mikrotitrationsplatte (7) verwendet werden.

2. Biologisches Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Testorganismus durch Schütteln mit veränderlichen Schüttelintervallen und /oder veränder­ lichen Schüttelfrequenzen in Suspension gehalten wird.

3. Biologisches Testverfahren nach Anspruch 1 oder 2, da­ durch gekennzeichnet, daß die Temperatur- und Lichtbe­ dingungen einstellbar sind und zumindest die Temperatur mittels eines Reglers auf der eingestellten Temperatur gehalten wird.

4. Biologisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellzahl in den Test­ gefäßen in regelmäßigen Abständen, mindestens zehn mal während eines Tests gemessen wird.

5. Biologisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellzahl mit Hilfe in­ direkter Verfahren bestimmt wird, in dem Photometer, Tur­ bidimeter oder Fluorimeter verwendet werden, deren Meß­ werte ausreichend eng mit der Zellzahl korrelieren.

6. Biologisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß alle Testansätze mit einem Gesamtvolumen zwischen 0,2 ml bis 2,5 ml, insbesondere von 2 ml befüllt werden.

7. Biologisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtbedingungen der­ art eingestellt werden, daß eine Beleuchtung jeder Mikro­ titrationsplatte mit einer Lichtmenge von mindestens 120 µmol Quanten/ s m²gewährleistet ist.

8. Biologisches Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Testgefäße der Mikro­ titrationsplatten während der Inkubation so abgedeckt werden, daß die Testorganismen Kohlenstoffdioxid aus der Umgebungsluft entnehmen und Sauerstoff abgeben können, jedoch gleichzeitig die Verdunstung der Testansätze redu­ ziert wird.

9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein temperierter und be­ leuchteter Inkubationsschrank (1) mindestens eine Schütteleinrichtung (3, 13) für Mikrotitrationsplatten aufweist, die in dem Inkubationsschrank (1) auf Halte­ rungen (6) angeordnet sind.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß jede Schütteleinrichtung (3) mit einer spiegelnden Fläche (5) versehen ist und auf jeder Fläche mindestens eine transparente Halterung (6) für Mikrotitrationsplatten (7) angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeich­ net, daß sie eine Transporteinrichtung (13) aufweist, um Mikrotitrationsplatten (7) zwischen dem Inkubations­ schrank (1) und einer Meßkammer (16) zu transportieren, die ein Photometer und/oder Turbidimeter und/oder Fluori­ meter enthält.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Transporteinrichtung (13) zugleich als Schüttelein­ richtung dient.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß jeder Halterung (6) für Mikrotitra­ tionsplatten (7) eine einzeln ansteuerbare Schüttelein­ richtung zugeordnet ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung einen automatischen Dispenser zum Befüllen und/oder Pipettieren der Kavitäten der Mikrotitrationsplatten (7) aufweist.