DE19900284B4

DE19900284B4 - Verfahren zum effizienten Einschleusen von DNA in Eukaryontenzellen unter Verwendung eines adenoviralen Vektors

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Publication number: DE19900284B4
Application number: DE1999100284
Authority: DE
Inventors: Ingo Prof. Dr. Schmidt-Wolf; Peter Buttgereit
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 1999-01-07
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2019-01-08
Also published as: DE19900284A1

Abstract

Verfahren zum Einschleusen von DNA in Eukaryontenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Adenoviren, die die einzuschleusende DNA enthalten, mit Liposomen vorinkubiert werden und anschließend mit Eukaryontenzellen in Kontakt gebracht werden, wobei die Vorinkubation für etwa 30 Minuten bei etwa 37°C durchgeführt wird, wobei es sich bei den Eukaryontenzellen nicht um menschliche embryonale Stammzellen handelt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einschleusen von DNA (Desoxyribonukleinsäure) in Eukaryontenzellen, insbesondere Lymphozyten, unter Verwendung eines adenoviralen Vektors und ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation unter Nutzung des oben genannten Verfahrens.
Der Transfer genetischer Information auf Eukaryontenzellen gehört zu den meistbearbeiteten Arbeitsgebieten der modernen biomedizinischen Forschung. Besonders auf dem Feld der Gentherapie hängen weitere Fortschritte in hohem Maße von der Entwicklung geeigneter Systeme zur Einschleusung exogener DNA in Zielzellen ab, da gentherapeutische Ansätze sowohl einen effizienten Transfer von Genen als auch eine korrekte Expression der Genprodukte in den Zielzellen erfordern. Es sind daher zahlreiche Verfahren zum Gentransfer auf Eukaryontenzellen entwickelt worden.
Einige dieser Verfahren beruhen auf der Transfektion von Zielzellen unter Zuhilfenahme von Liposomen. Diese Verfahren weisen jedoch den Nachteil auf, daß das Spektrum der damit transfizierbaren Zellen begrenzt ist. So können z.B. Lymphozyten, die besonders aussichtsreiche Zielzellen für gentherapeutische Ansätze darstellen, nach diesen Verfahren nicht mit ausreichender Effizienz transfiziert werden. Ähnliche Einschränkungen gelten auch für Verfahren, die auf der Transfektion von Eukaryontenzellen mittels Elektroporation beruhen.
Wegen ihres hocheffizienten Gentransfers auf Eukaryontenzellen haben sich Vektorsysteme, die auf Viren beruhen, als besonders erfolgversprechend erwiesen. Ein Großteil dieser Systeme beruht auf Retroviren, die eine hohe Transfereffizienz aufweisen, aber nur sich aktiv teilende Zellen infizieren.
Adenovirale Vektoren bieten einige potentielle Vorteile gegenüber retroviralen Vektoren, im speziellen für die Immunmodulation von Lymphomzellen. Mehrere Publikationen kommen jedoch zu dem Ergebnis, daß humane lymphoide Zellen gegenüber adenoviralen Infektionen resistent sind (Prince HM, Dessureault S. Gallinger S, Krajden M, Sutherland DR, Addison C. Zhang Y, Graham FL, Stewart AK: Efficient adenovirus-mediated gene expression in maligant human plasma cells: relative lymphoid cell resistance. Exp. Hematol. 26:27, 1998; Cantwell MJ, Sharma S, Friedmann T. Kipps TJ: Adenovirus vector infection of chronic lymphocytic leukemia B cells. Blond 88:4676, 1996; Silver L, Anderson CW: Interaction of human adenovirus serotype 2 with human lymphoid cells. Virology 165:377, 1988). Darüber hinaus kommen mehrere Autoren zu dem Ergebnis, daß adenovirale Vektoren durch ihre suboptimale Effizienz und durch ihre Toxizität bei hohen Konzentrationen für den Transfer genetischer Information auf Zielzellen nur von eingeschränktem Nutzen sind (Rosenfeld MA, Yoshimura K, Trapnell BC, Yoneyama K, Rosenthal ER, Dalemans W, Fukayama M, Bargon J, Stier LE, Stratford Perricaudet L, et al.: In vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to the airway epithelium. Cell 68:143, 1992; Rystal RF, McElvaney NG, Rosenfeld MA, Chu CS, Mastrangeli A, Hay JG, Brody SL, Jaffe HA, Eissa NT, Danel C: Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat Genet 8:42, 1994; Knowles MR, Hohneker KW, Zhou Z, Olsen JC, Noah TL, Hu PC, Leigh MW, Engelhardt JF, Edwards LJ, Jones KR, et al.: A controlled study of adenoviral-vector-mediated gene transfer in the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis. N Engl J Med 333:823, 1995; Schulick AH, Newman KD, Virmani R, Dichek DA: in vivo gene transfer into injured carotid arteries. Optimization and evaluation of acute toxicity. Circulation 91:2407, 1995). Prince et al. (Prince HM, Dessureault S. Gallinger S, Krajden M, Sutherland DR, Addison C. Zhang Y, Graham FL, Stewart AK: Efficient adenovirus-mediated gene expression in maligant human plasma cells: relative lymphoid cell resistance. Exp. Hematol. 26:27, 1998) berichten von einer Transfektionseffizienz für B-Lymphozyten von lediglich 14%. Die Expression von LacZ oder Luciferase war in nach dem Transfektionsverfahren behandelten Lymphomzellen fast 100 mal niedriger als in entsprechend behandelten OCI-My5 Myelomzellen, auch wenn sehr hohe Multiplizitäten der Infektion verwendet wurden.
Die WO 98/46781 beschreibt ein Expressionssystem, umfassend eine Transkriptionseinheit, die ein Transgen enthält und zusammen mit einem Teil oder der ganzen Adenvirus E4-Genregion in eine Zelle eingebracht wird, um eine persistente Expression des Transgens zu ermöglichen.
Die WO 98/50053 betrifft die Verwendung eines modifizierten Adenovirus als Vehikel zur Genübertragung. Die US 5 543 328 beschreibt einen Adenvirus als Vehikel zur Genübertragung, der so modifiziert ist, dass er einen Liganden aufweist, der das Targeting auf einem erwünschten Zelltyp ermöglicht.
Qiu C., et al. ("Cationic liposomes enhance adenovirus entry via a pathway independent of the fiber receptor and alpha(v)-integrins", in: Hum Gene Ther. 1998 Mar 1; 9(4):507-20) beschreibt, daß die Fähigkeit von adenoviralen Sektoren, eine effiziente Genübertragung sowohl in vitro als auch in vivo zu ermöglichen, durch das Vorliegen spezifischer Oberflächenrezeptoren begrenzt ist. Des Weiteren wird ausgeführt, dass auch der Einsatz von Liposomen nicht zu einer Verbesserung der adenoviral mediierten Genübertragung auf wichtige Zielzellen geführt hat.
Ein Überblick über gängige Transfektionsverfahren findet sich in "Human Cancer and Gene Therapy in Ann. Hematol. (1994) 69, 273-279. Die dort geschilderten Verfahren weisen die vorstehend genannten Nachteile auf.
Demzufolge liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem unter hoher Effizienz DNA in ein breites Spektrum von Eukaryontenzellen eingeschleust werden kann und eine vorteilhafte Verwendung der Verfahrenserzeugnisse vorzuschlagen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe zunächst durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Adenviren, die die einzuschleusende DNA enthalten, mit Liposomen vorinkubiert werden und anschließend mit Eukaryontenzellen in Kontakt gebracht werden, wobei die Vorinkubation für etwa 30 Minuten bei etwa 37°C durchgeführt wird, wobei es sich bei den Eukaryontenzellen nicht um menschliche embryonale Stammzellen handelt. Die Lösung obiger Aufgabe erfolgt auch durch die Verwendung der nach obigem Verfahren erhaltenen modifizierten Eukaryontenzellen zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation.
Das Spektrum der Eukaryontenzellen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, unterliegt keinen prinzipiellen Einschränkungen. Bevorzugte Zielzellen sind dabei Säugerzellen, insbesondere humane Zellen. Im Hinblick auf gentherapeutische Anwendungen sind vorzugsweise Lymphozyten von Interesse. Besonders bevorzugte Zellen sind Lymphomzellen, insbesondere B-Lymphomzellen, die interessante Ansatzpunkte für Gentherapiekonzepte zur Behandlung von Krebserkrankungen darstellen, u.a. aufgrund der Tatsache, daß vergrößerte Lymphknoten leicht zugänglich sind und diese Zellen für immunologische Strategien geeignet erscheinen. So reagieren z.B. viele Lymphome auf eine Behandlung mit Interferon α. EBV (Epstein-Barr-Virus) basierte Vektoren können zum gezielten Gentransfer auf EBV-assoziierte Neoplasmen verwendet werden. In einem anderen Ansatz konnte gezeigt werden, daß die gezielte Zerstörung des beta-1 Integrin-Gens in einer Lymphomzellinie die Fähigkeit dieser, Metastasen auszubilden, stark reduzierte. Lymphomzellen sind resistent gegenüber den meisten bisherigen Verfahren zum Gentransfer, die sich als zu toxisch für diese Zellen erwiesen haben. Insbesondere die Verfahren zur Transfektion mittels Elektroporation oder unter Zuhilfenahme von Liposomen sind bei Lymphomzellen weitgehend wirkungslos.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird DNA in Eukaryontenzellen eingeschleust. Hierbei ist das Einschleusen von DNA, die ein oder mehrere Gene umfaßt, von bevorzugtem Interesse. Vorzugsweise umfaßt die DNA zusätzlich regulatorische Elemente. Als regulatorische Elemente sind Promotoren, Polyadenylierungssignale und/oder Replikationsursprünge besonders hervorzuheben. Im Hinblick auf gentherapeutische Anwendungen ist die Übertragung von DNA besonders bevorzugt, die die Expression des entsprechenden Genproduktes in den Zielzellen zur Folge hat. Bei dem exprimierten Genprodukt handelt es sich vorzugsweise um ein Cytokin. Besonders bevorzugte Cytokine sind, insbesondere im Zusammenhang mit gentherapeutischen Ansätzen an Lymphomzellen, die Interleukine IL-2, IL-7 und IL-12.
Es wird aber auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, DNA in Zellen einzuschleusen, um die Expression eines anderen Gens zu unterdrücken. Hierunter fallen vorzugsweise sogenannte "anti-sense"-Gene, die eine "anti-sense"-RNA oder ein Ribozym codieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der "anti-sense"-RNA um eine bcl-2 "anti-sense"-RNA, d.h. um eine RNA, die die Expression des bcl-2-Gens behindert oder unterbindet.
Das erfindungsgemäße Verfahren beinhaltet vorzugsweise die Inkubation der Eukaryontenzellen mit Adenviren, die die einzuschleusende DNA enthalten, wobei die Inkubation in einem Inkubationspuffer stattfindet. Bei dem Inkubationspuffer handelt es sich vorzugsweise um PBS (phosphate buffered saline, 10 mmol/l Natrium/Kaliumphosphat-Puffer pH 7,2, 0,8% NaCl und 0,02% KCl) + 1 mmol/l MgCl₂/1% Pferdeserum (im folgenden HS, für horse serum, genannt). Ein wichtiger experimenteller Parameter ist dabei das Zahlenverhältnis von Viren zu Zellen. Dieses Zahlenverhältnis wird durch die Multiplizität der Infektion (im folgenden MOI, für multiplicity of infection, genannt) ausgedrückt, die als der Quotient aus der Anzahl der eingesetzten Viren und der Anzahl der zu infizierenden Zellen definiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die MOI etwa 1 bis 200.
Von entscheidender Bedeutung ist auch die Zeitdauer, über die die Inkubation der Eukaryontenzellen mit den Adenviren erfolgt und ein geringes Inkubationsvolumen. Lange Inkubationszeiten erhöhen dabei im allgemeinen die Effizienz des Transfers der genetischen Information und das geringe Volumen erhöht die Anzahl der Treffer von Adenoviren auf die Zelle. Gleichzeitig wachst jedoch auch das Risiko toxischer Wirkungen auf die Zellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht lange Inkubationszeiten, ohne daß dabei die Viabilität der Zielzellen beeinträchtigt wird. Vorzugsweise wird nach etwa 2 Stunden Inkubation, beispielsweise bei etwa 37°C, der Zielzellen mit den Adenoviren, die die einzuschleusende DNA enthalten, vollständiges Zellkulturmedium zugegeben und die Inkubation dann für etwa 1 bis 14 Tage fortgesetzt.
Wie oben gesagt, führt die Transfektion von Eukaryontenzellen unter Zuhilfenahme von Liposomen oft zu unbefriedigenden Ergebnissen, insbesondere wenn es um den Transfer genetischer Information auf Lymphozyten geht. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß das beschriebene Verfahren zu besonders guten Ergebnissen führt, wenn es mit einer Behandlung durch Liposomen kombiniert wird. Daher werden die Adenoviren vor der Inkubation mit den Eukaryontenzellen mit Liposomen vorinkubiert. Diese Vorinkubation findet für etwa 30 Minuten bei etwa 37°C statt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet, Eukaryontenzellen zu erhalten, die durch den Transfer genetischer Information modifiziert worden sind. Vorzugsweise werden dabei Eukaryontenzellen erhalten, in denen die eingeschleusten Fremdgene exprimiert werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich, eine therapeutisch wirksame Zellpräparation herzustellen, indem eine Population von Zellen eines Säugers entnommen und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert wird.
Das vorliegende Verfahren eignet sich zum Transfer genetischer Information auf ein breites Spektrum von Eukaryontenzellen, insbesondere Lymphozyten. Es wurde gefunden, daß ein transferiertes Gen in bis zu 100% der behandelten Zellen exprimiert wurde, ohne daß die so behandelten Zellen in ihren Wachstumseigenschaften in größerem Umfang beeinträchtigt worden sind. Gegenüber Retroviren, deren Einsatz auf sich aktiv teilende Zellen beschränkt ist, bietet das vorliegende adenovirale System den Vorteil, daß es auch bei sich nicht aktiv teilenden Zellen anwendbar ist. Ein weiterer Vorteil von Adenoviren besteht darin, daß von ihnen leicht hohe Titer erhalten werden können. Die Tatsache, daß durch Adenoviren übertragene DNA offensichtlich nicht ins Genom der Zielzelle integriert wird und die daraus resultierende Genexpression daher transient (nicht anhaltend) ist, ist für viele gentherapeutische Ansätze ohne Nachteile bzw. sogar von Vorteil.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die wichtigsten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens in der hohen Effizienz des Gentransfers, der Anwendbarkeit auf ein breites Spektrum von Eukaryontenzellen und der leichten Durchführbarkeit liegen.
Dem Verständnis der nachfolgenden Beispiele sollen die folgenden Ausführungen dienen:
In den Beispielen wird die Erfindung zum Transfer genetischer Information mit bisher üblichen Verfahren, d.h. Transfektion durch Elektroporation sowie Transfektion unter Zuhilfenahme von Liposomen, verglichen. Als Zielzellen wurden die Zellinien Raji (humane Burkitt-Lymphomzellinie, erhalten von DSMZ, Braunschweig, Deutschland), Daudi (humane Burkitt-Lymphomzellinie, erhalten von DSMZ, Braunschweig, Deutschland), OCI-Ly8-LAM53 (R. Levy, Stanford University, USA) und SU-DHL-4 (B-Lymphomzellinie, R. Levy, Stanford University, USA) verwendet. Die Zellinien wurden in dem Medium RPMI 1640 mit Glutamax (GIBCO, Berlin, Deutschland), supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS (PAA, Martinsried, Deutschland)) und mit 50 μg/ml Penicillin in einem Feuchtinkubator mit 5% CO₂ bei 37°C kultiviert.
Die Vermehrung des Adenvirus erfolgte in der Ad5 E1-transformierten humanen embryonischen Retina-Zellinie 911 (Fallaux FJ, Kranenburg O, Cramer SJ, Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC, Van Der Eb AJ: Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Hum Gene Ther 7:215, 1996). Diese Zellinie wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM, GIBCO) kultiviert, das mit 10% FCS, 50 μg/ml Streptomycin und 50 μg/ml Penicillin supplementiert war.

Als zu transferierendes Gen wurde β-gal ausgewählt, das eine einfache Bestimmung der Effizienz des Transfers erlaubt, da sein Genprodukt bei Inkubation der behandelten Zellen mit X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, β-Gal staining kit, Invitrogen, de Schelp, Niederlande) zu einer deutlich sichtbaren und auswertbaren Blaufärbung führt. Zur Auswertung wurden nach jedem Versuch mindestens 400 Zellen ausgezählt. Die bei den Versuchen verwendeten Plasmide sind in Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 1

Vektor	Firma	Merkmale	Referenz
pcDNA3.1/HisB/LacZ	Invitrogen (Niederlande)	8578bp; CMV-Promoter; LacZ ORF, BGH Polyadenylierungssignal	Invitrogen (Niederlande)
Ad-β-Gal	K. Brand (Humboldt Universität, Berlin, Deutschland)	E1 und E3 deletiert Replikationsdefektiv Adenovirus Typ 5, E. coli LacZ Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promoters	K. Brand (Sandig v, Brand K. Herwig S, Lukas J, Bartek J, Strauss M: Adenovirally transferred p16INK4/CDKN2 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nat Med 3:313, 1997

Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele 1 bis 5 näher erläutert werden.
Beispiel 1
Transfektion durch Elektroporation
Raji- und Daudi-Zellen wurden unter Verwendung des Elektroporationssystems easyject plus^® von Eurogentec, Seraing, Belgien, mit dem Plasmid pcDNA3.1/HisB/LacZ transfiziert. Dazu wurden 5 × 10⁶ Zellen in 500 μl komplettem RPMI 1640 Medium inkubiert und mit 30 μg pcDNA3.1/HisB/LacZ gemischt. Diese Mischung wurde in 4 mm Elektroporationsküvetten transferiert, 10 Minuten auf Eis inkubiert und mit einem Einfach- oder Doppel-Pulsprogramm gepulst. Die Parameter für den ersten Puls waren 250 V und 1650 bis 2100 μF. Nach dem Puls wurden die Zellen bei einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro ml in komplettes RPMI 1640 Medium transferiert. Die Transfektionseffizienz wurde 24 und 48 Stunden nach der Transfektion bestimmt.
1 zeigt, daß nach diesem Verfahren nur eine sehr niedrige Transfektionseffizienz erreicht wurde. Sowohl für Daudi- als auch für Raji-Zellen lag sie bei unter 2%. Die Viabilität der Zellen war durch die Elektroporation nicht beeinträchtigt (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 2
Transfer durch Lipofection

Raji- und Daudi-Zellen wurden mit pcDNA3.1/HisB/LacZ unter Verwendung verschiedener liposomaler oder liposomen-ähnlicher Reagenzien (Tabelle 2) transfiziert. Die Transfektionen wurden so ausgeführt, wie es in den jeweiligen Handbüchern der Reagenzien beschrieben ist. Die Zellen wurden in 24-Napfplatten bei Dichten zwischen 0,5 bis 5 × 10⁵ Zellen pro ml in RPMI 1640 mit oder ohne FCS (wie in den jeweiligen Handbüchern beschrieben) ausgesät. Die DNA/Transfektionsreagenzmischungen wurden hergestellt, indem zunächst getrennt eine geeignete Menge des Reagenzes (0,1 bis 10 μl) und der DNA (0,1 bis 5 μg) in serumfreiem Opti-MEM (GIBCO, Berlin, Deutschland) oder RPMI 1640 verdünnt wurde. Anschließend wurde die Transfektionslösung der DNA-Lösung zugegeben und es wurde für 10 bis 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Nach Bildung des Transfektionsreagenz-/DNA-Komplexes wurde dieser tropfenweise den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden, wie in den jeweiligen Handbüchern beschrieben, für 2 bis 24 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. In einigen Fällen war es nicht notwendig, die Transfektionskomplexe zu entfernen. Nach 24 bis 48 Stunden wurden die Zellen auf β-Gal Expression gefärbt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2

Transfektionsreagenz/Methode	Merkmale	Zellinie	Effizienz (Prozentsatz der Zellen die β-Galatosidase exprimieren)
Superfect^® (Qiagen, Hilden, Deutschland)	nicht-liposomales hochverzweigtes polykationisches Transfektionsreagenz	Daudi: Raji:	< 1% < 1%
Effectene^® (Qiagen, Hilden, Deutschland)	nicht-liposomales Lipid, verwendet einen spezifischen DNA-kondensierenden Verstärker	Daudi: Raji:	< 1% 1-3,5%
Dosper^® (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)	polykationisches Lipid (1,3-Dioleoyl-oxy-2-(6-carboxyspermyl)-propylamid)	Daudi: Raji:	< 1% < 1%
Fugene 6^® (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)	nicht-liposomale Zubereitung	Daudi: Raji:	< 1% < 1%
Lipofectamine^® (Gibco-Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland)	3:1-Formulierung eines polykationischen Lipids (DOSPA) und eines neutralen Lipids (Dope)	Daudi: Raji:	< 1% 5-10%
DAC-30^® (Eurogentec, Seraing, Belgien)	liposomale Formulierung eines monokationischen Cholesterinderivates	Daudi: Raji:	0% 0%

Vergleich der verschiedenen liposomalen Transfektionsreagenzien bezüglich der Transfektionseffizienz von Daudi- und Rajizellen
Die Transfektionseffizienz lag sowohl für Daudi- als auch für Rajizellen unter 1%, außer bei Effectene^® und Lipofectamine^®, die bei Rajizellen Transfektionseffizienzen von bis zu 10% zeigten.
Beispiel 3
Adenoviraler Gentransfer (erfindungsgemäßes Verfahren)
Der rekombinante adenovirale Vektor Ad-β-Gal trägt das E.coli LacZ-Gen, das β-Galactosidase (β-Gal) codiert, unter der Kontrolle des Promotors des Rous-Sarcom-Virus. Ad-β-Gal wurden von Dr. Karsten Brand zur Verfügung gestellt. Plaque Essays wurden im wesentlichen wie von Graham und Prevec beschrieben (Graham F, Prevec L: Manipulation of Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology 7: Gene Transfer and Expression Protocols; 109, 1991) ausgeführt. Dabei wurden Adenovirusstammtiter einer Serienverdünnung in jeweils 2 ml DMEM (GIBCO) mit 2% Pferdeserum (HS) unterzogen und nahezu konfluenten 911-Zellen in 6-Napfplatten zugegeben. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur (25°C) wurde das Medium durch F-15 Minimal-essentiell-Medium (MEM, GIBCO) ersetzt, das 1% Agarose (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), 20 mmol/l Hepes pH 7,4, 0,0025% L-Glutamin, 5% Hefeextrakt, 8,4% NaHCO₃, 50 μg/ml Streptomycin und 50 μg/ml Penicillin und 2% HS enthielt. Der Plaque-Titer des Ad-β-Gal betrug 3,5 × 10⁹ p.f.u./ml (p.f.u. steht dabei für Plaque forming units, also Plaque-bildende Einheiten). Die Produktion der Adenoviruschargen wurde ausgeführt, wie von Fallaux et al. beschrieben (Fallaux FJ, Kranenburg O, Cramer SJ, Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC, Van Der Eb AJ: Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Hum Gene Ther 7:215, 1996). Dazu wurden nahezu konfluente 911-Monoschichten in 175 cm²-Kolben in 2 ml PBS, das 1% HS enthielt, mit 5 p.f.u. pro Zelle infiziert. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Inoculum durch frisches Medium ersetzt (DMEM/2% HS). Nach 48 Stunden wurden die nahezu vollständig abgelösten Zellen geerntet und in 1 ml PBS/1%HS aufgenommen. Der Virus wurde durch drei Zyklen von schnellem Tieffrieren und Auftauen isoliert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 3000 U/min für 10 Minuten geklärt. Die Virusstammchargen wurden in PBS/10% Glycerin bei -80°C aufbewahrt. Die Infektion der Zellen wurde bei 5 × 10⁵ Zellen in 50 μl PBS + 1 mmol/l MgCl₂/1%HS, bei verschiedenen MOI (0 bis 200), mit Ad-β-Gal ausgeführt. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurde den infizierten Zellen 1 ml vollständiges Kulturmedium (ein Medium, das neben den essentiellen Verbindungen auch viele Verbindungen enthält, die der Organismus selbst synthetisieren kann, wodurch die Wachstumsrate erhöht wird, ein Beispiel ist RPMI 1640 + Glutamax + 10% hitzeinaktiviertes FCS) zugegeben. Da kein sichtbarer toxischer Effekt im Vergleich zu den Kontrollen (nur PBS + 1 mmol/l MgCl₂/1%HS) beobachtet wurde, war es nicht notwendig, die Viren zu entfernen.
2 zeigt, daß nach diesem Verfahren ein effizienter Transfer der genetischen Information auf die Zellen gelang.
Die Transfektionseffizienz war dosisabhängig. Bei einer MOI von 200 waren 100% sowohl der Daudi- als auch der Rajizellen nach 48 und 72 Stunden transfiziert. Die Daudi- und Rajizellen wurden dem Ad-β-Gal für 1 bis 14 Tage ausgesetzt. X-Gal-Färbung zeigte 100% infizierte Zellen nach 72 Stunden.
Beispiel 4
Adenoviraler Gentransfer unter Zuhilfenahme von Liposomen
Die Versuche erfolgten wie in Beispiel 3 beschrieben, jedoch wurde Ad-β-Gal zusätzlich vor der Infektion der Zielzellen mit Lipofectamine^® (GIBCO) bei einer Endkonzentration von 20 μg/ml in 50 μl opti-MEM vorinkubiert. Die Virus-Lipid Mischung wurde für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, bevor sie den Zielzellen zugesetzt wurde.
3 zeigt, daß durch dieses Verfahren die Transfektionseffizienz nochmals gesteigert werden konnte.
Im Vergleich zum Verfahren ohne Liposomen führte die Verwendung kationischer Liposomen zu mehr transfizierten Zellen bei Infektion mit niedrigeren Konzentrationen des Adenvirus. Bei niedrigeren Vektorkonzentrationen (MOI 50) erhöhten die Liposomen die Transfektionseffizienz (3). Bei höheren Vektorkonzentrationen waren die durch Liposomen erzielten Verbesserungen geringer.
Beispiel 5
Wachstumseigenschaften nach der Transfektion
Um eine mögliche Beeinträchtigung des Wachstumsverhaltens der infizierten Zellen zu untersuchen, wurde ihr Wachstumsverhalten mit dem nicht infizierter Zellen verglichen. Die Viabilitätsbestimmung erfolgte durch Trypanblauausschluß. Als Vergleichszellen dienten Zellen, die mit leerem Inkubationspuffer (PBS + 1 mmol/l MgCl₂/1%HS) behandelt worden waren. Nicht infizierte und Ad-β-Gal-infizierte Zellen wurden nach der Infektion bis zu 14 Tage lang alle 24 Stunden ausgezählt.
4 zeigt, daß die infizierten Zellen in ihrem Wachstum nicht beeinträchtigt waren. Das Zellwachstum nach adenoviraler Transfektion mit einer MOI von bis zu 200 unterschied sich nicht signifikant von dem untransfizierter Zellen.

Claims

Verfahren zum Einschleusen von DNA in Eukaryontenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass Adenoviren, die die einzuschleusende DNA enthalten, mit Liposomen vorinkubiert werden und anschließend mit Eukaryontenzellen in Kontakt gebracht werden, wobei die Vorinkubation für etwa 30 Minuten bei etwa 37°C durchgeführt wird, wobei es sich bei den Eukaryontenzellen nicht um menschliche embryonale Stammzellen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Eukaryontenzellen Säugerzellen, insbesondere humane Zellen, sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Eukaryontenzellen Lymphozyten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Eukaryontenzellen Lymphomzellen, insbesondere B-Lymphomzellen, sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA ein oder mehrere Gene umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA zusätzlich regulatorische Elemente umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass es die Expression des Genproduktes beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Genprodukt um ein Cytokin handelt.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Cytokin um IL-2, IL-7 oder IL-12 handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die Transkription zu einer "anti-sense"-RNA beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der "anti-sense"-RNA um bcl-2 "anti-sense"-RNA handelt.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es die Inkubation der Eukaryontenzellen mit Adenoviren, die die einzuschleusende DNA enthalten, beinhaltet, wobei die Inkubation in folgendem Inkubationspuffer stattfindet: PBS + 1 mmol/l MgCl₂/1%HS
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Multiplizität der Infektion (MOI) von etwa 1 bis 200 eingesetzt wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach etwa 2 Stunden Inkubation vollständiges Zellkulturmedium zugegeben wird und die Inkubation dann für etwa 1 bis 14 Tage fortgesetzt wird.
Verwendung der nach einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15 erhaltenen modifizierten Eukaryontenzellen zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation.