DE19858447A1 - Isolating and purifying nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein einfaches und extrem schnelles Verfahren zur Isolierung und Reinigung großer Mengen von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien. Es ist für eine Vielzahl von biologisch-, molekularbiologisch-, forensisch-, medizinisch- analytisch- sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die forensische Medizin, medizinische Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und alle anderen angrenzenden Gebiete.The invention relates to a simple and extremely fast method for isolation and Purification of large amounts of short and long chain nucleic acids different biological and other raw materials. It is for a variety from biological, molecular biological, forensic, medical-analytical and biochemical laboratories of great importance. With that Fields of application of the invention forensic medicine, medical diagnostics, Molecular biology, biochemistry, genetic engineering and all other related areas.
Alle kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 A1).All commercially available kits are based on the well known principle of Binding of nucleic acids to mineral carriers in the presence of solutions different chaotropic salts and use suspensions as carrier materials finely ground glass powder (e.g. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), diatomaceous earth (Sigma) or silica gel. (Diagen, DE 41 39 664 A1).
Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials wie auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu Isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.A practical method for a variety of different applications Isolation of nucleic acids is shown in US 5,234,809 (Boom). There is a Process for isolating nucleic acids from nucleic acids Starting materials by incubating the starting material with a chaotropic Buffer and a DNA-binding solid phase. The chaotropic buffers realize both the lysis of the starting material and the binding of the Nucleic acids to the solid phase. The method is well suited for making nucleic acids Isolate small amounts of sample and finds viral especially in the area of isolation Nucleic acids its practical application.
Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren zu entwickeln, insbesondere von Plasmid-DNS, vorzugsweise aus unterschiedlichsten Ausgangsmengen, welches zu isolierten Nukleinsäuren führt, die den hohen Qualitätsparametern nachfolgender Applikationen gerecht werden, extrem einfach in der Durchführung, schnell und kostengünstig ist.The object of the invention was to provide a method for isolating Develop nucleic acids, especially from plasmid DNA, preferably from different starting amounts, which leads to isolated nucleic acids that the meet the high quality parameters of subsequent applications, extremely simple in the implementation, is fast and inexpensive.
Die Aufgabe wurde gemäß den Ansprüchen realisiert, erfindungsgemäß durch ein kombiniertes Batch-Säulenverfahren, indem die Nukleinsäurebindung an mineralische Trägermaterialien als Batch-Verfahren erfolgt und man die gebundenen Nukleinsäuren danach chromatographisch aufbereitet. The object was achieved according to the claims, according to the invention by a Combined batch column process by binding the nucleic acid to mineral Carrier materials are carried out as a batch process and the bound nucleic acids then processed chromatographically.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und
langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen
Ausgangsmaterialien ist gekennzeichnet durch
The method according to the invention for the isolation and purification of short- and long-chain nucleic acids from different biological and other starting materials is characterized by
- - Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,Lysis of materials containing nucleic acids,
- - Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,- incubation with a mineral carrier material,
- - Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,- application to membranes that have a pore size that is larger, than the particle size of the carrier materials,
- - Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel überraschend auf der Membran zurückbleiben.- Separation of the nucleic acids from the carrier material by elution, wherein the carrier particles surprisingly remain on the membrane.
Als bevorzugte Ausgangsmaterialien, die Nukleinsäuren enthalten, kommen komplexe biologische Systeme, wie z. B. Blut, Gewebe, Urin oder Stuhlproben, die gegebenenfalls an festen Materialien gebunden sind, in Frage. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch auch für die Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus anderen Ausgangsmaterialien geeignet, wie z. B. aus bakteriellen Lysaten, pflanzlichen Komponenten, von DNS-Fragmenten aus PCR-Ansätzen oder aus Agarosegelen.Complexes are preferred starting materials which contain nucleic acids biological systems, such as B. blood, tissue, urine or stool samples, if necessary bound to solid materials. The method according to the invention is but also for the isolation and purification of short and long chain nucleic acids suitable from other starting materials, such as. B. from bacterial lysates, vegetable components, from DNA fragments from PCR batches or from Agarose gels.
Bevorzugte Trägermaterialien sind Siliziumverbindungen, wie z. B. Siliciumdioxid, Kieselsäuren oder Silicagele. Die erfindungsgemäß eingesetzten Siliciumverbindungen weisen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm bis 5000 nm, vorzugsweise 7-40 nm oder 500-5000 nm, auf.Preferred carrier materials are silicon compounds, such as. B. silicon dioxide, Silicas or silica gels. The silicon compounds used according to the invention have an average particle size of 7 nm to 5000 nm, preferably 7-40 nm or 500-5000 nm.
Die Lyse der Ausgangsstoffe und die anschließende Inkubation mit den Trägermaterialien erfolgt in einem Puffersystem, das chaotrope Salze aufweist. Chaotrope Salze sind z. B. Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid, Natriumperchlorat, Natriumjodid und/oder Harnstoff- vorzugsweise in Konzentrationen 1 bis 10 M.The lysis of the starting materials and the subsequent incubation with the carrier materials takes place in a buffer system that has chaotropic salts. Chaotropic salts are e.g. B. Guanidine isothiocyanate, guanidine hydrochloride, lithium chloride, sodium perchlorate, Sodium iodide and / or urea - preferably in concentrations of 1 to 10 M.
Als die Lyse fördernde Komponenten werden Detergentien wie z. B. TritonX-100, Tween, N-Lauryl-Sarcosyl, SDS und/oder CTAB, ggf. Protein-abbauende Enzyme, wie z. B. Proteinasen eingesetzt.Detergents such as e.g. B. TritonX-100, Tween, N-Lauryl-Sarcosyl, SDS and / or CTAB, optionally protein-degrading enzymes, such as. B. Proteinases used.
Erfindungsgemäß werden zur Separierung der verwendeten mineralischen Trägermaterialien Membranen verwendet, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die der eingesetzten Trägermaterialien, vorzugsweise in Zentrifugationskartuschen, wobei man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert. Bevorzugt werden gemäß der Erfindung Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt. According to the invention are used to separate the mineral Carrier materials used membranes that have a pore size that is larger, than that of the carrier materials used, preferably in centrifugation cartridges, where the pore size of the membranes depending on the average Specified particle size of the carrier material used. Are preferred according to the Invention nylon or polysulfone membranes used.
Die Träger mit den fixierten Nukleinsäuren werden vor oder nach ihrem Aufbringen auf die Membran gewaschen. Die anschließende Elution der Nukleinsäure vom Träger wird fachgemäß mit Puffern geringer Ionenstärke durchgeführt.The carriers with the fixed nucleic acids are applied before or after their application washed the membrane. The subsequent elution of the nucleic acid from the support becomes professionally carried out with buffers of low ionic strength.
Es ist allgemein naheliegend, daß die für Nukleinsäurereinigungen effektiv nutzbaren Zentrifugationsmembranen eine Porengröße aufweisen müssen, die kleiner ist, als die der eingesetzten Trägermatrices, da mineralische Partikel, welche kleinere Partikeldurchmesser als die Poren von den Zentrifugationsmembranen haben, während eines Zentrifugationsschrittes immer durch die Poren zentrifugiert werden.It is generally obvious that those which can be used effectively for nucleic acid purifications Centrifugation membranes must have a pore size that is smaller than that of carrier matrices used, since mineral particles, which are smaller Particle diameter than the pores of the centrifugation membranes have while of a centrifugation step are always centrifuged through the pores.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß ein kombiniertes Batch- Säulen-Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren unter Einbeziehung von mineralischen Trägerpartikeln, die sogar sehr viel kleiner als die Porendurchmesser kommerziell verfügbarer Zentrifugationssäulen sein können, möglich ist.The invention is based on the surprising finding that a combined batch Column method for the isolation of nucleic acids including mineral carrier particles that are even much smaller than the pore diameter commercially available centrifugation columns may be possible.
Überraschenderweise kann ein solches Kombinationsverfahren sogar mit mineralischen Trägermaterialien kleiner 50 nm realisiert werden, wodurch der Vorteil der extrem hohen Bindungsoberflächen solcher Partikeln ausgenutzt werden kann.Surprisingly, such a combination process can even use mineral Carrier materials smaller than 50 nm can be realized, which gives the advantage of extremely high Binding surfaces of such particles can be exploited.
Das erfindungsgemäße Verfahren der Kombination eines Batch- mit einem Säulenverfahren ist durch die Verwendung beliebiger mineralischer Trägermaterialien, auch sehr kleiner mineralischer Trägerpartikel und deren extrem großen spezifischen Oberflächen, hinsichtlich der Volumina der Ausgangsmaterialien nicht limitiert.The inventive method of combining a batch with a Column process is through the use of any mineral carrier materials, also very small mineral carrier particles and their extremely large specific ones Surfaces, not limited in terms of the volumes of the starting materials.
Das bedeutet, notwendige Ausgangslösungen, welche in Abhängigkeit von der Menge des Ausgangsmaterials (z. B. bakterielle Lysate) ansonsten erhöht werden müssen, sind nicht mehr limitiert, da die Schritte der Bindung der Plasmid-DNA an die verwendeten Trägerpartikel nicht innerhalb einer Säule erfolgen müssen.This means necessary starting solutions, which depend on the amount of Starting material (e.g. bacterial lysates) would otherwise not have to be increased more limited because the steps of binding the plasmid DNA to the used Carrier particles do not have to take place within a column.
Das Verfahren liefert sehr hohe Ausbeuten an hochreiner DNA und ist außerdem sehr einfach in der Durchführung und kann im Vergleich zu weitverbreiteten Anionenaustauschersystemen z. B. bei der Isolierung von Plasmid-DNA in einer sehr viel kürzeren Zeit realisiert werden.The process gives very high yields of high-purity DNA and is also very good easy to implement and can be compared to widespread Anion exchange systems e.g. B. in the isolation of plasmid DNA in a very much can be realized in a shorter time.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt werden. The invention is to be illustrated below using exemplary embodiments.
2 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 1 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 100 µl Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 300 µl Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des Reaktionsgefäßes. Durch Zugabe von 300 µl Solution III (Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 5minutigen Zentrifugationsschritt bei 14.000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 20 µl einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica- Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine Minizentrifugationssäule (z. B. Micro Spin Nylon oder Micro Spin PSE; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 1 Minute bei bei 12.000 rpm an die Oberfläche der Filtermembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60% Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 12.000 rpm für 2 min wird der restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von 100 µl eines Niedrigsalzpuffers (z. B. 10 mM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 1 Minute bei 12.000 rpm. Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid-DNA.2 ml of a bacterial overnight culture are placed in a 2 ml Eppendorf reaction tube transferred and centrifuged for 1 min at 12,000 rpm. The cell pellet is then with 100 µl Solution I (Tris-HCl, EDTA; glucose) resuspended. The cell lysis is carried out by Add 300 µl Solution II (NaOH; SDS) by briefly swirling the Reaction vessel. By adding 300 µl Solution III (sodium acetate; Guanidinium hydrochloride) the necessary neutralization reaction takes place. Chromosomal DNA and proteins are subsequently subjected to a 5-minute centrifugation step 14,000 rpm sedimented and the clear centrifuged supernatant is subsequently with 20 ul a suspension of a mineral carrier material consisting of silica Incubated nanoparticles (average particle size 40 nm). The solution will be then on a mini centrifugation column (e.g. Micro Spin Nylon or Micro Spin PSE; LIDA) transferred. The carrier particles with the bound plasmid DNA are by centrifugation for 1 minute at 12,000 rpm on the surface of the filter membrane spent and there by adding a washing solution (60% ethanol; NaCl) and one again centrifugation step washed. The washing step is one more time repeated. The remaining ethanol is removed by centrifugation at 12,000 rpm for 2 min finally removed from the carrier material. Detachment of the bound plasmid DNA is done by adding 100 µl of a low salt buffer (e.g. 10 mM Tris-HCl) 70 ° C and subsequent centrifugation for 1 minute at 12,000 rpm. The centrifugate contains the isolated plasmid DNA.
Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Miniprep) aus individuellen Einzelzellkolonien ist in Abb. 1 dargestellt.The gel electrophoretic representation of isolated plasmid DNA (miniprep) from individual single cell colonies is shown in Fig. 1.
25 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 50 ml Flacon-Reaktionsgefäß überführt und für 10 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 1 ml Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 1,8 ml Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des Reaktionsgefäßes und Inkubation für 5 min. . Durch Zugabe von 1,8 ml Solution III (Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) und nachfolgender Inkubation für 10 min auf Eis erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 10minütigen Zentrifugationsschritt bei 5000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 150 µl einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica-Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine Zentrifugationssäule (z. B. Macro Spin Nylon; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm an die Oberfläche der Filtermembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60% Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 min oder durch die Inkubation der Zentrifugationssäule bei 37°C für 10 min wird der restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von 200 µl-300 µl eines Niedrigsalzpuffers (z. B. 10 mM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm. Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid-DNA.25 ml of a bacterial overnight culture are placed in a 50 ml flacon tube transferred and centrifuged for 10 min at 5,000 rpm. The cell pellet is then marked with 1 ml Solution I (Tris-HCl, EDTA; glucose) resuspended. The cell lysis is carried out by adding of 1.8 ml Solution II (NaOH; SDS) by briefly swirling the Reaction vessel and incubation for 5 min. . By adding 1.8 ml of Solution III (Sodium acetate; guanidinium hydrochloride) and subsequent incubation for 10 min The necessary neutralization reaction takes place in ice. Chromosomal DNA and proteins are subsequently subjected to a centrifugation step at 5000 rpm for 10 minutes sedimented and the clear centrifuged supernatant is then with 150 ul one Suspension from a mineral carrier material consisting of silica nanoparticles (average particle size 40 nm) incubated. The solution is then on a Centrifugation column (e.g. Macro Spin Nylon; LIDA) transferred. The carrier particles with the bound plasmid DNA are centrifuged for 5 minutes at 5000 rpm the surface of the filter membrane is placed and there by adding a washing solution (60% ethanol; NaCl) and a new centrifugation step. Of the Wash step is repeated one more time. By centrifugation at 5000 rpm for 10 min or by incubating the centrifugation column at 37 ° C for 10 min residual ethanol finally removed from the support material. Detaching the bound Plasmid DNA is made by adding 200 µl-300 µl of a low salt buffer (e.g. 10 mM Tris-HCl) at 70 ° C and subsequent centrifugation for 5 minutes at 5000 rpm. The centrifugate contains the isolated plasmid DNA.
Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Midipreparation) aus individuellen Einzelzellkolonien ist in Abb. 2 dargestellt. The gel electrophoretic representation of isolated plasmid DNA (midipreparation) from individual single cell colonies is shown in Fig. 2.
Claims (11)
- - Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,
- - Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,
- - Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,
- - Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel auf der Membran zurückbleiben.
- Lysis of materials containing nucleic acids,
- - incubation with a mineral carrier material,
- Application to membranes which have a pore size which is larger than the particle size of the carrier materials,
- - Separation of the nucleic acids from the carrier material by elution, the carrier particles remaining on the membrane.
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