DE19856301C1 - Regulatory protein pKe83 from human epidermal keratinocytes and related nucleic acid, vectors and antibodies - Google Patents
Regulatory protein pKe83 from human epidermal keratinocytes and related nucleic acid, vectors and antibodiesInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid, das einem natürlicherweise in Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich (d. h. in Funktion und Wirkung gleich) ist. Sie betrifft außerdem eine isolierte Nukleinsäure, die ein solches für humane Keratinozyten typisches Polypeptid bzw. Protein kodiert, sowie die Verwendung dieses Polypeptids und dieser Nukleinsäure für nachweisende, insbesondere diagnostische, und/oder für therapeutische Zwecke, und Reagenzien, die unter Verwendung wenigstens eines dieser Moleküle hergestellt sind, insbesondere rekombinante Vektormoleküle und Antikörper.The invention relates to an isolated polypeptide which is naturally present in Keratinocytes occurring and in the activated state of the keratinocytes expressed protein is similar or similar (i.e. in function and Effect is the same). It also relates to an isolated nucleic acid, the one encodes such a typical polypeptide or protein for human keratinocytes, and the use of this polypeptide and nucleic acid for demonstrative, especially diagnostic, and / or for therapeutic Purposes, and reagents using at least one of these Molecules are produced, in particular recombinant vector molecules and Antibody.
Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik werden in der Dermatotherapie zur Beeinflussung epidermaler Störungen wie z. B. der Autoimmun dermatosen "Pemphigus vulgaris" und "Bullöses Pemphigoid" im wesentlichen Medikamente mit breitem Wirkungsspektrum eingesetzt, insbesondere lokal bzw. systemisch applizierte Glukokortikoide, Vitamin-A- Säure-Derivate, Antimetabolite und Zytostatika, oder es wird mit mehr oder weniger unspezifischen Maßnahmen wie z. B. der sog. "Farbstofftherapie" oder der "Lichttherapie" behandelt. Die bekannten Wirkstoffe bzw. Maßnahmen haben jedoch allesamt den Nachteil, daß sie wenig spezifisch sind und damit naturgemäß zahlreiche Nebenwirkungen hervorrufen.According to the current state of the art in dermatotherapy to influence epidermal disorders such as B. the autoimmune dermatoses "Pemphigus vulgaris" and "Bullous Pemphigoid" in essential drugs with a wide range of effects used, in particular locally or systemically administered glucocorticoids, vitamin A Acid derivatives, antimetabolites and cytostatics, or it is used with more or less non-specific measures such as B. the so-called "dye therapy" or the "light therapy" treated. The known active ingredients or However, measures all have the disadvantage that they are not very specific are and thus naturally cause numerous side effects.
Die Bereitstellung spezifischerer Wirkstoffe scheiterte bislang an dem in der Dermatologie seit langem bestehenden grundsätzlichen Problem, daß die Zahl der zellulären Zielmoleküle, im folgenden allgemein als Zielstrukturen ("Targets") benannt, die als Angriffspunkt für eine (spezifische) Beeinflussung des zellulären Stoffwechsels - insbesondere unter medizinischen oder auch kosmetischen Gesichtspunkten - dienen könnten, in epidermalen Keratinozyten eng begrenzt ist.The provision of more specific active ingredients has so far failed because of the Dermatology long-standing fundamental problem that the Number of cellular target molecules, hereinafter generally referred to as target structures ("Targets") named as a point of attack for a (specific) Influencing cellular metabolism - especially under medical or cosmetic aspects - could serve in epidermal keratinocytes is narrowly limited.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue Zielstrukturen in epidermalen Keratinozyten bereitzustellen, die als Angriffspunkt für Diagnostika, Therapeutika, Kosmetika oder allgemein für die Beeinflussung des zellulären Stoffwechsels dienen können.The object of the present invention is therefore to create new target structures in epidermal To provide keratinocytes that act as a target for diagnostics, therapeutics, Cosmetics or generally serve to influence the cellular metabolism can.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Polypeptids bzw. Proteins der eingangs genannten Art, das bei aktivierten Keratinozyten mit mit erhöhter Expression der Aktivierungsmarker uPA und uPA-R aufreguliert, d. h. vermehrt exprimiert bzw. produziert und auf einem höheren Konzentrationsspiegel gehalten wird, und das entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz, die durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion oder -inversion als Allel oder Derivat daraus entstanden ist, aufweist. Im letzteren Fall, d. h. im Fall des Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion, -oder - inversion als Allel oder Derivat aus einer der in den Sequenzprotokollen dargestellten Aminosäuresequenzen entstanden ist, ist dieses Polypeptid zur Beeinflussung der Zellmorphologie, Zellproliferation, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zelldifferenzierung (von Keratinozyten) geeignet. Das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 wird im folgenden auch mit Protein "pKe#83" bezeichnet.One solution to this problem is to provide a polypeptide or Proteins of the type mentioned at the beginning, which with activated keratinocytes with increased Expression of the activation markers uPA and uPA-R upregulated, d. H. increased expressed or produced and kept at a higher concentration level, and that either in the sequence listing SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 amino acid sequence shown or an amino acid sequence that by amino acid substitution, deletion, insertion or inversion as an allele or derivative arose from it. In the latter case, i. H. in the case of the polypeptide with a Amino acid sequence, which by amino acid substitution, deletion, insertion, or inversion as an allele or derivative from one of the sequences shown in the sequence listing Amino acid sequences has arisen, this polypeptide is used to influence the Cell morphology, cell proliferation, cell adhesion, cell migration and / or Cell differentiation (from keratinocytes) is suitable. The polypeptide with the Amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 is also referred to below as protein "pKe # 83".
Eine weitere Lösung der genannten Aufgabe besteht in der Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäure, die ein derartige Protein, das einem natürlicherweise in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich ist, kodiert, und die entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder eine hierzu komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist, wobei in diesem Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 anstelle von "T" auch "U" stehen kann. Zu dieser erfindungsgemäßen Gruppe von Nukleinsäuren bzw. Nukleotidsequenzen gehören insbesondere auch Splice-Varianten (z. B. SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 6) und Sense- oder Antisense-Oligonukleotide, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleotidsequenz hybridisieren, vorzugsweise identisch mit bzw. (partiell) komplementär zu dieser sind. Zwei bevorzugte Splice-Varianten der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 sind in den Sequenzprotokollen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5 dargestellt.Another solution to the above task is to provide one isolated nucleic acid containing such a protein that is naturally found in human keratinocytes occurring and in the activated state of the keratinocytes the expressed or similar protein is similar, or encoded, and which is either the one in the Sequence listing SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence shown or a corresponding one complementary nucleotide sequence or a partial sequence of one of these two Nucleotide sequences or all or part of one of these two Has nucleotide sequences hybridizing nucleotide sequence, in which Sequence listing SEQ ID NO: 1 can also be "U" instead of "T". To this belong to the group of nucleic acids or nucleotide sequences according to the invention in particular also splice variants (e.g. SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6) and Sense or antisense oligonucleotides with the in the sequence listing SEQ ID NO: 1 hybridize nucleotide sequence shown, preferably identical to or (partially) are complementary to this. Two preferred splice variants of the Nucleotide sequence according to the invention according to SEQ ID NO: 1 are in the Sequence listings SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 are shown.
Die Erfindung umfaßt infolgedessen auch Proteine bzw. Polypeptide der eingangs genannten Art, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche aus einer solchen Splice-Variante resultiert, insbesondere aus der Splice-Variante einer mRNA, die mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz identisch oder ganz oder teilweise komplementär dazu ist. Diese Proteine bzw. Polypeptide zeichnen sich außerdem dadurch aus, daß sie die in aktivierten humanen epidermalen Keratinozyten mit erhöhter Expression der Aktivierungsmarker uPA und uPA-R aufreguliert werden und daß sie zur Beeinflussung der Zellmorphologie, Zellproliferation, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zelldifferenzierung (von Keratinozyten) geeignet sind.As a result, the invention also includes proteins or polypeptides at the outset mentioned type, which have an amino acid sequence, which from such Splice variant results, in particular from the splice variant of an mRNA that is associated with the nucleotide sequence specified in the sequence listing SEQ ID NO: 1 is identical or is completely or partially complementary to it. Draw these proteins or polypeptides are also characterized by the fact that they are activated in human epidermal Keratinocytes with increased expression of the activation markers uPA and uPA-R are regulated and that they influence the cell morphology, Cell proliferation, cell adhesion, cell migration and / or cell differentiation (from Keratinocytes) are suitable.
Die erfindungsgemäßen Sense- und Antisense-Oligonukleotide umfassen jeweils mindestens 6, vorzugsweise 8-25 Nukleotide.The sense and antisense oligonucleotides according to the invention each comprise at least 6, preferably 8-25 nucleotides.
Der Begriff "hybridisiert" bezieht sich auf die im Stand der Technik bekannten Hybridisierungsverfahren unter üblichen, insbesondere unter hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen. Die konkreten Hybridisierungsparameter wählt der Fachmann anhand der eingesetzten Nukleotidsequenz und seines allgemeinen Fachwissens (vgl.: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons Inc., Suppl. 37, Chapter 4.9.14).The term "hybridized" refers to those known in the art Hybridization methods under usual, especially under highly stringent Hybridization conditions. The user selects the specific hybridization parameters Expert on the basis of the nucleotide sequence used and its general Expertise (see: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons Inc., Suppl. 37, Chapter 4.9.14).
Neben den in den Sequenzprotokollen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleotidsequenzen und den diesen Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen umfaßt die vorliegende Erfindung auch solche Nukleotidsequenzen, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Der Begriff "hybridisieren" bzw. "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989, 1.101 bis 1.104 verwendet. Demnach spricht man von einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS, vorzugsweise mit niedriger konzentriertem SSC, insbesondere 0,2 × SSC, bei einer Temperatur von wenigstens 55°C, vorzugsweise 62°C und besonders bevorzugt 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Jede Nukleotidsequenz, die unter derartigen Waschbedingungen mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 oder mit einer der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenz hybridisiert, gehört zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung.In addition to those in the sequence listing SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 shown nucleotide sequences and these sequences in the context of Degeneration of the nucleotide sequences corresponding to the genetic code includes the The present invention also includes those nucleotide sequences which are therefore stringent Hybridize conditions. The term “hybridize” or “hybridization” according to present Invention is as in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989, 1,101 to 1,104 used. Accordingly, one speaks of a hybridization under stringent Conditions if after washing for 1 hour with 1 × SSC and 0.1% SDS, preferably with a lower concentrated SSC, in particular 0.2 × SSC, at a temperature of at least 55 ° C, preferably 62 ° C and particularly preferably 68 ° C still a positive hybridization signal is observed. Any nucleotide sequence found under such Washing conditions with a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 or with one of the sequences SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 as part of the Degeneration of the genetic code corresponding nucleotide sequence hybridized belongs to the subject of the present invention.
Die erfindungsgemäße(n) Nukleinsäure(n) kann (können) sowohl aus einer natürlichen Quelle als auch synthetisch oder halbsynthetisch gewonnen werden. In der Praxis hat sich besonders die Ausführung als cDNA bewährt.The nucleic acid (s) according to the invention can either be from a natural source as well as synthetic or semi-synthetic become. In practice, execution as a cDNA has proven particularly useful.
Das Polypeptid, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 aufweist und von der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure kodiert wird, und das im folgenden als Protein "pKe#83" bezeichnet ist, wird in humanen epidermalen Keratinozyten aufreguliert, nämlich verstärkt exprimiert (produziert) und auf einem im Vergleich zum Ausgangszustand signifikant höheren Konzentrationsspiegel gehalten, wenn sich diese Zellen im "aktivierten" Zustand befinden, d. h. unter anderem im Zustand der Proliferation und/oder Migration, z. B. nach einer unfallbedingten Hautverletzung oder bei den autoimmunologisch ausgelösten bullösen Dermatosen "Pemphigus vulgaris" (ausgelöst durch Autoantikörper gegen Desmosomen) und "Bullöses Pemphigoid" (ausgelöst durch Autoantikörper gegen Hemidesmosomen). Der aktivierte Zustand der humanen epidermalen Keratinozyten äußert sich auch in einer im Vergleich zum Ruhezustand (Ausgangszustand) erhöhten Expression der bekannten Aktivierungsmarker uPA (Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und uPA-R (Rezeptor für Urokinase-Typ Plasminogenaktivator) und kann anhand dieser Marker qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden (vgl.: Schäfer, et al., 1996: Dispase-mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. Cell Res. 228, pp. 246-253).The polypeptide which has the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 and from the nucleic acid shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1 is encoded, and which is hereinafter referred to as protein "pKe # 83" upregulated in human epidermal keratinocytes, namely increased expressed (produced) and on a compared to the initial state significantly higher concentration levels were maintained when these cells are in the "activated" state, d. H. among other things in the state of Proliferation and / or migration, e.g. B. after an accident Skin injury or in the case of the autoimmunologically triggered bullous Dermatoses "Pemphigus vulgaris" (triggered by autoantibodies against Desmosomes) and "Bullous Pemphigoid" (triggered by autoantibodies against hemidesmosomes). The activated state of human epidermal Keratinocytes also manifest themselves in a compared to the resting state (Initial state) increased expression of the known activation markers uPA (urokinase-type plasminogen activator) and uPA-R (receptor for Urokinase-type plasminogen activator) and can use these markers qualitatively and quantitatively proven (see: Schäfer, et al., 1996: Dispase-mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. Cell Res. 228, pp. 246-253).
Das Protein pKe#83 weist eine sog. Prenyl-Gruppen-Bindungsstelle ("CAAX Box") auf. Hierbei handelt es sich um eine Bindungsstelle, die bei einer Vielzahl eukaryontischer Proteine eine posttranslationelle Veränderung erlaubt, indem eine Farnesyl- oder eine Gerany-Geranyl-Gruppe an einen Cysteinrest angehängt wird, der drei Aminosäuren vom C-Terminus entfernt ist, und wobei die beiden am C-Terminus gelegenen Aminosäuren in der Regel aliphatisch sind. Ras Proteine und eine Vielzahl von G-Proteinen weisen eine solche CAAX Box auf.The protein pKe # 83 has a so-called prenyl group binding site ("CAAX Box "). This is a binding site that is associated with a Large number of eukaryotic proteins a post-translational change allowed by attaching a farnesyl or gerany-geranyl group to one Cysteine residue is attached, which removes three amino acids from the C-terminus and where the two amino acids located at the C-terminus in the Are generally aliphatic. Ras proteins and a variety of G proteins have such a CAAX box.
Zudem besitzt das Protein "pKe#83" eine Reihe putativer Phosphorylierungsstellen. Die genannten Motive weisen darauf hin, daß das Protein pKe#83 in Signaltransduktionsabläufe eingebunden ist.In addition, the protein "pKe # 83" has a number of putative Phosphorylation sites. The motifs mentioned indicate that the Protein pKe # 83 is involved in signal transduction processes.
Mit der (isolierten) Bereitstellung des Proteins "pKe#83", nämlich mit der Beschreibung von Nukleotidsequenzen, die dieses Protein kodieren, und mit der Angabe (einer) seiner Aminosäuresequenz(en) ist es möglich, den Stoffwechsel physiologisch aktiver bzw. aktivierter Keratinozyten - und selbstverständlich auch anderer das Protein "pKe#83" exprimierende Zellen - gezielt zu beeinflussen, insbesondere zu Zwecken der medizinischen Therapie und kosmetischen Behandlung.With the (isolated) provision of the protein "pKe # 83", namely with the Description of nucleotide sequences encoding this protein and with by stating (one) of its amino acid sequence (s) it is possible to Metabolism of physiologically active or activated keratinocytes - and of course also other cells expressing the protein "pKe # 83" - to influence specifically, especially for medical purposes Therapy and cosmetic treatment.
Die Erfindung betrifft desweiteren rekombinante DNS-Vektormoleküle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfassen, und die die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins pKe#83, in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle aufweisen. Bei diesen DNS-Vektormolekülen handelt es sich vorzugsweise um Abkömmlinge des Plasmids pUEX-1 und/oder des Plasmids pGEX-2T und/oder des Plasmids pcDNA3.1, da sich diese Vektoren in der Praxis als sehr gut geeignet erwiesen haben. Besonders bevorzugt sind das Vektorkonstrukt pGEX-2T/pKe#83 gemäß dem in Fig. 2 offenbarten Vektorprotokoll und das Vektorkonstrukt pcDNA3.1/pKe#83- FLAG gemäß dem in Fig. 3 offenbarten Vektorprotokoll. Als eukaryontische Zelle kommen insbesondere Zellen aus Zellkulturen, z. B. Cos-Zellen, in Betracht, ebensogut kann die betreffende Zelle aber auch Bestandteil eines lebenden Organismus, z. B. einer transgenen Maus, sein.The invention further relates to recombinant DNA vector molecules which comprise a nucleic acid according to the invention and which have the ability to express in a prokaryotic or eukaryotic cell a protein which occurs in human keratinocytes and is expressed more strongly in the activated state of the keratinocytes, in particular the protein pKe # 83 . These DNA vector molecules are preferably descendants of the plasmid pUEX-1 and / or the plasmid pGEX-2T and / or the plasmid pcDNA3.1, since these vectors have proven to be very suitable in practice. The vector construct pGEX-2T / pKe # 83 according to the vector protocol disclosed in FIG. 2 and the vector construct pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG according to the vector protocol disclosed in FIG. 3 are particularly preferred. As eukaryotic cells come in particular cells from cell cultures, e.g. B. Cos cells, into consideration, but the cell in question can also be part of a living organism, for. B. a transgenic mouse.
Die Erfindung umfaßt deshalb auch transformierte Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, die mit einem aktivierbaren Promotor gekoppelt ist, der in diesen Zellen natürlicherweise oder als Folge einer Rekombination enthalten ist, und die (infolgedessen) die Fähigkeit zur Expression eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins "pKe#83", besitzen.The invention therefore also includes transformed host cells, the one contain nucleic acid according to the invention with an activatable Promoter is coupled to these cells naturally or as a result recombination is included, and (as a result) the ability to Expression of an occurring in human keratinocytes and in activated state of the keratinocytes increased expressed protein, in particular the protein "pKe # 83".
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektormoleküls zur Herstellung transgener Säugetiere, insbesondere Mäuse oder Ratten.The invention further relates to the use of an inventive Nucleic acid or a vector molecule according to the invention for the production transgenic mammals, especially mice or rats.
Die erfindungsgemäßen Transfektanten ermöglichen Forschungs- und Entwicklungsarbeiten zum Zweck der weitergehenden Aufklärung der durch das Protein "pKe#83" induzierten Veränderungen der Zellmorphologie und zellulären Basisfunktionen wie Proliferation, Adhäsion, Migration und Differenzierung, insbesondere im Hinblick auf die Beantwortung der Frage, ob das Protein "pKe#83" selbst eine "pathogene" Aktivität besitzt. The transfectants according to the invention enable research and Development work for the purpose of further elucidation of the the protein "pKe # 83" induced changes in cell morphology and basic cellular functions such as proliferation, adhesion, migration and Differentiation, especially with regard to answering the question, whether the protein "pKe # 83" itself has a "pathogenic" activity.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Reagenz zum indirekten Nachweis eines in humanen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten Zustand der Keratinozyten verstärkt exprimierten Proteins, insbesondere des Proteins "pKe#83", wobei dieses Reagenz dadurch charakterisiert ist, daß es wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt. "Zum indirekten Nachweis" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß tatsächlich die das Protein kodierende mRNA direkt nachgewiesen wird - und somit das Protein nur indirekt (vermittels dieser mRNA).The present invention also relates to a reagent for indirect detection of an occurring in human keratinocytes and in activated state of the keratinocytes increased expressed protein, especially the protein "pKe # 83", whereby this reagent is characterized in that it has at least one nucleic acid according to the invention includes. In this context, "for indirect detection" means that the mRNA encoding the protein is actually detected directly - and thus the protein only indirectly (by means of this mRNA).
Das Protein "pKe#83" und die damit, d. h. mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz verwandten Polypeptide, d. h. die Polypeptide, die durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Inversion von dieser Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 ableitbar sind oder die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus einer Splice- Variante einer mRNA resultiert, welche mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 oder einer Teilsequenz davon identisch oder komplementär dazu ist oder zumindest hybridisiert, bieten vielfältige Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der dermatologischen Forschung und Entwicklung. Insbesondere können Antikörper gegen diese Polypeptide bzw. Proteine hergestellt werden, die dann mit entsprechender Modifikation entweder als Diagnostika oder als Therapeutika oder auch als Kosmetika ("cosmeceuticals") einsetzbar sind.The protein "pKe # 83" and that with it, d. H. with that in the sequence listing SEQ ID NO: 3 shown amino acid sequence related polypeptides, d. H. the polypeptides by substitution, deletion, insertion and / or Inversion of this amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 can be derived or have an amino acid sequence that consists of a splice Variant of an mRNA results which corresponds to the nucleotide sequence Sequence listing SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof identical or complementary to it or at least hybridized, offer a wide range Possible applications in the field of dermatological research and development. In particular, antibodies against these polypeptides or proteins are produced, which are then modified accordingly either as diagnostics or as therapeutics or as cosmetics ("cosmeceuticals") can be used.
Die Erfindung umfaßt folglich auch die Verwendung eines solchen Proteins bzw. Polypeptids zur Herstellung eines (monoklonalen oder polyklonalen) Antikörpers gegen dieses Polypeptid, den besagten Antikörper selbst und ebenso seine Verwendung zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von dermatologischen Erkrankungen, zur kosmetischen Behandlung der Epidermis und zur Diagnostik und/oder kosmetischen Behandlung von anderen das Protein "pKe#83" exprimierenden Geweben oder Organen. The invention consequently also includes the use of such a protein or polypeptide for the production of a (monoclonal or polyclonal) Antibody against this polypeptide, said antibody itself and likewise its use for diagnostic and / or therapeutic Treatment of dermatological diseases, for cosmetic Treatment of the epidermis and for diagnosis and / or cosmetic Treatment of other tissues expressing the protein "pKe # 83" or organs.
Auch Sense- und/oder Antisense-Oligonukleotide kommen nach neueren wissenschaftlichen Erkenntnissen als Wirkstoffe für eine Pharmakotherapie in Betracht (vgl. G. Hartmann et al. 1998: Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Ärzteblatt 95, Heft 24, C1115-C1119) - und überdies als Wirkstoffe mit einem in der Pharmakotherapie grundsätzlich neuen Wirkprinzip.According to recent scientific knowledge, sense and / or antisense oligonucleotides are also suitable as active ingredients for pharmacotherapy (cf. G. Hartmann et al. 1998: Antisense oligonucleotides, Deutsches Ärzteblatt 95 , No. 24, C1115-C1119) - and moreover as active ingredients with a principle of action that is fundamentally new in pharmacotherapy.
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung erfindungsgemäßer Sense- oder Antisense-Oligonukleotide zur Diagnostik und/oder therapeutischen Behandlung, insbesondere von dermatologischen Erkrankungen, oder zur kosmetischen Behandlung, insbesondere der Epidermis.The present invention therefore also relates to the use Sense or antisense oligonucleotides according to the invention for diagnosis and / or therapeutic treatment, especially dermatological Diseases, or for cosmetic treatment, especially the Epidermis.
Eine technisch und wirtschaftlich bedeutende Einsatzmöglichkeit eines erfindungsgemäßen Polypeptids und ebenso einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure besteht nicht zuletzt auch darin, daß mit Hilfe eines solchen Moleküls in einem "Screening"-Verfahren aus einer sehr großen Anzahl bereitstehender Stoffe solche herausselektiert werden können, die spezifisch an die betreffende Nukleinsäure oder das betreffende Polypeptid binden. Diese Stoffe können dann als Ausgangsmaterial (Leitstruktur) für die Entwicklung pharmakologisch einsetzbarer Substanzen dienen und bieten damit die Voraussetzungen für die Entwicklung alternativer Pharmazeutika zur Diagnose und Therapie, insbesondere der eingangs erwähnten dermatologischen Erkrankungen und/oder anderer Erkrankungen, bei denen das Protein "pKe#83" eine wichtige Rolle spielt.A technically and economically important application of a polypeptide of the invention and also one of the invention Last but not least, nucleic acid consists in the fact that with the help of such Molecule in a "screening" process from a very large number available substances can be selected out that are specific bind to the nucleic acid or polypeptide in question. These substances can then be used as the starting material (lead structure) for the Serve and offer development of pharmacologically usable substances thus the prerequisites for the development of alternative pharmaceuticals for diagnosis and therapy, especially those mentioned at the beginning dermatological diseases and / or other diseases in which the protein "pKe # 83" plays an important role.
Im Hinblick darauf betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Identifizierung pharmakologisch einsetzbarer Substanzen, die an das Polypeptid bzw. die Nukleinsäure binden und dadurch dessen bzw. deren Funktion und/oder Expression beeinflussen, insbesondere inhibierend oder aktivierend wirken.In view of this, the invention also relates to the use of a polypeptide according to the invention or a polypeptide according to the invention Nucleic acid for the identification of pharmacologically usable substances, that bind to the polypeptide or the nucleic acid and thereby its or influence their function and / or expression, in particular have an inhibiting or activating effect.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen näher erläutert. Von den im Rahmen dieser Beispiele erwähnten Figuren zeigenThe invention is based on manufacturing and Application examples explained in more detail. Of those in these examples show mentioned figures
Fig. 1: einen rt-PCR-Nachweis von "pKe#83"-spezifischer mRNA Fig. 1 shows a RT-PCR detection of "pKe # 83" -specific mRNA
Fig. 2: das Vektorkonstrukt pGEX-2T/pKe#83 Fig. 2: the vector construct pGEX-2T / pKe # 83
Fig. 3: das Vektorkonstrukt pcDNA3.1/pKe#83-FLAG Fig. 3: the vector construct pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG
Fig. 4: einen Immunoblot-Nachweis von rekombinantem pKe#83 Protein in E. Coli-Zellen nach Transfektion mit dem Vektorkonstrukt pGEX-2T/pKe#83 FIG. 4 shows an immunoblot detection of recombinant pKe # 83 protein in E. coli cells after transfection with the vector construct pGEX-2T / pKe # 83
Fig. 5: einen Immunoblot-Nachweis von rekombinantem pKe#83 Protein in Cos-Zellen nach Transfektion mit dem Vektorkonstrukt pcDNA3.1/pKe#83-FLAG FIG. 5 shows an immunoblot detection of recombinant pKe # 83 protein in Cos cells after transfection with the vector construct pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG
Fig. 6: einen Immunblot-Nachweis von anti-Protein pKe#83- Antikörpern aus Kaninchenserum auf rekombinantem pKe#83- Protein (A) und einen Immunblot-Nachweis von exprimiertem Protein pKe#83 in transfizierten Cos-Zellen mit anti-Protein pKe#83-Antikörpern aus Kaninchenserum (B) FIG. 6 shows an immunoblot detection of anti-protein pKe # 83- antibodies from rabbit serum by recombinant pKe # 83- protein (A) and an immunoblot detection of expressed protein pKe # 83 in transfected COS cells with anti-protein pKe # 83 antibodies from rabbit serum (B)
Fig. 7: einen "Sandwich"-ELISA-Test unter Verwendung von Antikörpern, die gegen das Protein pKe#83 gerichtet sind. Fig. 7: a "sandwich" ELISA using antibodies directed against the pKe # 83 protein.
Fig. 8: einen Immunfluoreszenztest unter Verwendung von Kaninchen "anti-pKe#83 IgG" auf Normalhautschnitten (C), NHEK-Sheets direkt nach Dispase-induzierter Ablösung und (A) und NHEK- Sheets 8 Stunden nach Dispase-induzierter Ablösung (B). FIG. 8 shows an immunofluorescence assay using rabbit "anti-pKe # 83 IgG" in normal skin sections (C), NHEK sheets induced dispase directly after separation and (A) and NHEK- Sheets 8 hours after dispase-induced detachment (B ).
Fig. 9: Keratinozyten (HaCaT-Zellen) nach Behandlung mit pKe#83- spezifischen Antisense Oligonukleotiden (B) und Kontroll- Olligonukleotiden (A) Fig. 9: keratinocytes (HaCaT cells) upon treatment with pKe # 83- specific antisense oligonucleotides (B) and control Olligonukleotiden (A)
Als Polynukleotidquelle dienten humane epidermale Keratinozyten einer Zellkultur bzw. eines Zellkulturmodells, das in der Publikation von Schäfer B. M. et al., 1996: Dispase-mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R, CD87), Exp. Cell Res. 228, pp. 246-253, ausführlich beschrieben ist. Auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. Diese Zellkultur bzw. dieses Zellkulturmodell zeichnet sich dadurch aus, daß sie/es erlaubt, Keratinozyten durch enzymatische Zerstörung der Zell/Matrix-Kontakte, beispielsweise durch eine Dispase induzierte Ablösung der Keratinozyten von der Kulturmatrix, vom ruhenden [uPA-/uPA-R] in den aktivierten [uPA+/uPA-R+] Zustand zu überführen. Die Induktion des aktivierten Zustands ist reversibel: die (erneute) Ausbildung eines konfluenten (= maximal dicht gewachsenen), mehrschichtigen Zellverbands aus differenzierten Keratinozyten führt zur Abregulierung von uPA und uPA-R, d. h. zur Drosselung der Produktion und Einstellung auf einem niedrigeren Konzentrationsspiegel (siehe dazu die Publikation von Schäfer B. M. et al., 1996: Differential expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA), its receptor (uPA-R), and inhibitor type-2 (PAI- 2) during differentiation of keratinocytes in an organotypic coculture system. Exp. Cell Res. 220, pp. 415-423).Human epidermal keratinocytes of a cell culture or a cell culture model served as the polynucleotide source, which is described in the publication by Schäfer BM et al., 1996: Dispase-mediated basal detachment of cultured keratinocytes induces urokinase-type plasminogen activator (uPA) and its receptor (uPA-R , CD87), Exp. Cell Res. 228, pp. 246-253, is described in detail. We hereby expressly refer to the content of this publication. This cell culture or this cell culture model is characterized in that it allows keratinocytes to be separated from the resting [uPA - / uPA-R] by enzymatic destruction of the cell / matrix contacts, for example by a dispase-induced detachment of the keratinocytes from the culture matrix. convert to the activated [uPA + / uPA-R + ] state. The induction of the activated state is reversible: the (renewed) formation of a confluent (= maximally densely grown), multi-layered cell structure from differentiated keratinocytes leads to the down regulation of uPA and uPA-R, i.e. to a reduction in production and adjustment to a lower concentration level (see see the publication by Schäfer BM et al., 1996: Differential expression of urokinase-type plasminogen activator (uPA), its receptor (uPA-R), and inhibitor type-2 (PAI-2) during differentiation of keratinocytes in an organotypic coculture system. Exp. Cell Res. 220, pp. 415-423).
Die Zellen dieser Zellkultur bzw. dieses Zellkulturmodells werden im folgenden auch als NHEK (= "normale humane epidermale Keratinozyten") bezeichnet.The cells of this cell culture or this cell culture model are in the following also as NHEK (= "normal human epidermal keratinocytes") designated.
Für die Bereitstellung der Zellkultur bzw. des Zellkulturmodells wurden folgende Maßnahmen durchgeführt: Mittels Hautbiopsie erhaltene NHEK wurden über Nacht bei 4°C trypsiniert und anschließend nach der "Feeder Layer"-Technik von J. G. Rheinwald und H. Green (1975, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells, Cell 6, pp. 331-334) in Petrischalen oder in 175 cm2 Kulturflaschen für die Dauer von 8 Tagen in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) mit einem Gehalt von 10 Vol.% fötalem Kälberserum (FCS) und Zusätzen an Adeninhemisulfat, Insulin, Transferrin, Trijodthyronin, Hydrocortison, Forskolin, epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Gentamycin) unter Differenzierungsbedingungen, insbesondere erhöhten Kalziumspiegeln, kultiviert (37°C, 7% CO2). Die Kultivierung erfolgte damit gemäß herkömmlicher und im Stand der Technik geläufigen Bedingungen. Unter diesen Bedingungen bilden Keratinozyten konfluente zwei- bis dreischichtige sog. "Epidermisäquivalente" oder Keratinozyten-"Sheets" aus.The following measures were carried out to provide the cell culture or the cell culture model: NHEK obtained by skin biopsy were trypsinized overnight at 4 ° C. and then using the "Feeder Layer" technique by JG Rheinwald and H. Green (1975, Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells, Cell 6, pp. 331-334) in petri dishes or in 175 cm 2 culture bottles for 8 days in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) with a content of 10 Vol.% Fetal calf serum (FCS) and additions of adenine hemisulfate, insulin, transferrin, triiodothyronine, hydrocortisone, forskolin, epidermal growth factor (EGF) and antibiotics (penicillin, streptomycin and gentamycin) under differentiation conditions, in particular increased calcium levels, 37 ° C, cultivated, cultivated 7% CO 2 ). The cultivation was thus carried out in accordance with conventional conditions known in the art. Under these conditions, keratinocytes form confluent two- to three-layer so-called "epidermal equivalents" or keratinocyte "sheets".
Diese Epidermisäquivalente bzw. Keratinozytensheets wurden durch eine 30-minütige Behandlung mit Dispase II (2,4 mg/ml in DMEM ohne FCS) von der Kulturmatrix abgelöst, zweimal in DMEM gewaschen und anschließend für die Dauer von 4-8 Stunden in komplettem, konditioniertem DMEM inkubiert. Die Inkubation in konditioniertem DMEM erfolgte, um den Einfluß von frischem FCS auszuschließen. Während der Inkubation fand in diesen flotierenden Keratinozytensheets eine Aufregulierung der bekannten Aktivierungsmarker uPA und uPA-R sowie des hierin erstmals beschriebenen Proteins pKe#83 statt. Die uPA/uPA-R-Aufregulierung war mittels bekannter Techniken wie Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay (ELISA), in situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz nachweisbar. Aus den inkubierten Zellen wurde mittels der im Stand der Technik bekannten Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode (vgl.: Chromczynski P. and Sacchi N., 1986: Single-step method of RNA Isolation by acid guanidinlum thiocyanate phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: pp. 156-159) die gesamte RNA gewonnen (Kit "RNA- Clean" der Firma AGS, Heidelberg). Aus der Gesamt-RNA wurde die mRNA mittels Bindung an Poly-T-beschichtete Kügelchen isoliert. Diese mRNA diente als Ausgangsmaterial für den nächstfolgenden Verfahrensschritt der Subtraktionsklonierung.These epidermal equivalents or keratinocyte sheets were replaced by a 30-minute treatment with Dispase II (2.4 mg / ml in DMEM without FCS) from the culture matrix detached, washed twice in DMEM and then for a period of 4-8 hours in complete, conditioned DMEM incubated. Incubation in conditioned DMEM was done to influence excluded from fresh FCS. During the incubation took place in this floating keratinocyte sheets an upregulation of the known Activation markers uPA and uPA-R as well as the first in this described protein pKe # 83 instead. The uPA / uPA-R upregulation was using known techniques such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), detectable in situ hybridization and immunofluorescence. From the incubated cells using the known in the art Guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction method (see: Chromczynski P. and Sacchi N., 1986: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinlum thiocyanate phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: pp. 156-159) the entire RNA was obtained (kit "RNA Clean "from AGS, Heidelberg). The mRNA was converted from the total RNA isolated by binding to poly-T coated beads. This mRNA served as the starting material for the next step of the process Subtraction cloning.
Für den Einsatz in Kontrollversuchen bzw. für Vergleichspräparate wurde mRNA von adhärenten Keratinozytensheets isoliert, und zwar nach dem gleichen Verfahrensmuster wie vorstehend beschrieben, ausgenommen der Abweichung, daß für die Dauer der Dispasebehandlung zusätzlich zu der Dispase ein Dispasehemmer, z. B. Phosphoramidon (100 µg/ml), appliziert wurde.For use in control experiments or for comparative medicinal products mRNA isolated from adherent keratinocyte sheets, after the same procedure as described above, except the Deviation that for the duration of the disposition treatment in addition to the Dispase a dispase inhibitor, e.g. B. phosphoramidon (100 ug / ml), applied has been.
Nach dem Prinzip der Subtraktionsklonierung wurde eine Genbank erstellt, die vorzugsweise cDNA der dyshäsionsinduzierten Gene enthielt, d. h. solcher Gene, die nach Ablösung der Keratinozytensheets vermehrt in diesen (bzw. deren Zellen) exprimiert wurden. Zu diesem Zweck wurde die aus den Zellen der adhärenten Keratinozytensheets gewonnene mRNA erneut an poly-T-beschichtete Kügelchen gebunden, auf diesen in einzelsträngige cDNA umgeschrieben und anschließend gegen die mRNA abgelöster, d. h. nicht-adhärenter Keratinozytensheets hybridisiert. Diejenigen mRNA-Moleküle, die lediglich im nicht-adhärenten Zustand, d. h. nach Dyshäsion exprimiert wurden und infolgedessen keinen Hybridisierungspartner fanden, verblieben im Überstand. Sie wurden in cDNA umgeschrieben und in den Klonierungsvektor pUEX-1 kloniert.A gene bank was created based on the principle of subtraction cloning, which preferably contained the cDNA of the dyshesion-induced genes, d. H. those genes that increase in number after the keratinocyte sheets are detached these (or their cells) were expressed. For this purpose the mRNA obtained from the cells of the adherent keratinocyte sheets again bound to poly-T coated beads, on these in single-stranded cDNA and then rewritten against the mRNA detached, d. H. non-adherent keratinocyte sheets hybridized. Those mRNA molecules that are only in the non-adherent state, i.e. H. were expressed after dyshesion and consequently none Hybridization partners found remained in the supernatant. You were in rewritten cDNA and cloned into the cloning vector pUEX-1.
Die daraus resultierende Genbank wurde zwecks Überprüfung anschließend noch einem Southernblot-Verfahren mit [32P]-markierter cDNA adhärenter und nicht-adhärenter Keratinozytensheets unterworfen. Diejenige cDNA oder vielmehr die sie enthaltenden Wirtszellklone - hier des E. coll Stamms MC1061 -, die nach Dyshäsion eine deutliche Aufregulation zeigten, wurden anschließend über Nacht bei 30°C unter üblichen Kulturbedingungen kultiviert bzw. vermehrt. Aus diesen E. coli-Klonen wurde die Plasmid-DNA (pUEX1-cDNA) herauspräpariert, und die aus dem pUEX1-Vektor herausgeschnittenen cDNA-Fragmente wurden mittels Random-priming [32P]-markiert. Die markierte cDNA wurde als Sonde in Northernblots mit RNA aus adhärenten und nicht-adhärenten Keratinozytensheets eingesetzt. Die Klone, die cDNA enthielten, die bei Verwendung als Sonde im Northernblot-Verfahren kein oder nur ein geringes Signal mit der RNA adhärenter Keratinozyten, dagegen ein deutliches Signal mit RNA nicht adhärenter Keratinozytensheets erkennen ließen, wurden für den nachfolgenden Verfahrensabschnitt der Sequenzierung ausgewählt.The resulting library was then subjected to a Southern blot procedure with [ 32 P] -labelled cDNA-adherent and non-adherent keratinocyte sheets for the purpose of checking. The cDNA or rather the host cell clones containing it - here of the E. coll strain MC1061 - which showed significant upregulation after dyshesion, were then cultivated or propagated overnight at 30 ° C. under normal culture conditions. The plasmid DNA (pUEX1 cDNA) was prepared from these E. coli clones, and the cDNA fragments cut out from the pUEX1 vector were labeled by random priming [ 32 P]. The labeled cDNA was used as a probe in Northern blots with RNA from adherent and non-adherent keratinocyte sheets. The clones which contained cDNA, which, when used as a probe in the Northern blot method, gave no or only a slight signal with the RNA-adherent keratinocytes, but a clear signal with RNA with non-adherent keratinocyte sheets, were selected for the subsequent process step of the sequencing.
Bei der Sequenzierung der betreffenden Klone mittels des "nicht radioaktiven Cycle-Sequencing", das eine Modifikation der Sequenzierungsmethode nach Sanger (F. Sanger et al., 1977: DNA sequencing with chain terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467) darstellt und mittlerweile eine dem Stand der Technik geläufige Methode ist, wurde unter anderem das Gen mit der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 erhalten. Außerdem wurden die in den Protokollen SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5 dargestellten Splice- Varianten gefunden. Das Gen mit der Nukleotidsequenz gemäß Protokoll SEQ ID NO: 1 und das zugehörige Protein erhielten die Bezeichnung "pKe#83".When sequencing the clones in question using the "not radioactive cycle sequencing ", which is a modification of the Sanger sequencing method (F. Sanger et al., 1977: DNA sequencing with chain terminating inhibitors, Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467) and is now a state of the art One of the methods was the gene with the nucleotide sequence obtained according to sequence listing SEQ ID NO: 1. In addition, the in the protocols SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 5 shown splice- Variants found. The gene with the nucleotide sequence according to the protocol SEQ ID NO: 1 and the associated protein were given the name "pKe # 83".
Nähere Untersuchungen der zu dem Gen pKe#83 gehörigen, d. h. pKe#83-
spezifischen mRNA (aus abgelösten, d. h. nicht-adhärenten
Keratinozytensheets) lieferten die Informationen, daß diese mRNA eine
Größe von etwa 2,6 kb aufweist. Die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1
enthält am 3'Ende an Position 1651-1653 ein Stopcodon, das den
mutmaßlichen Ort des Transkriptionsendes vorgibt. An Position 2612-2617,
genau 26 Nukleinsäuren vor der poly-A-Site befindet sich eine sog.
Polyadenylation site. Es wurde eine Splice-Variante (SEQ ID NO: 2)
gefunden, die um 111 Nukleinsäuren (Position 669-780) kürzer ist, und eine
zweite Splice-Variante (SEQ ID NO: 5), die um 108 Nukleinsäuren (Position
670-777) kürzer ist. Fig. 1.C zeigt das Ergebnis der Klonierung der pKe#83
Gesamt-cDNA-Sequenz, es gilt:
Closer investigations of the mRNA belonging to the pKe # 83 gene, ie pKe # 83-specific (from detached, ie non-adherent keratinocyte sheets) provided the information that this mRNA has a size of about 2.6 kb. The nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 contains a stop codon at the 3 'end at position 1651-1653, which specifies the putative location of the transcription end. At position 2612-2617, exactly 26 nucleic acids in front of the poly-A site, there is a so-called polyadenylation site. A splice variant (SEQ ID NO: 2) was found, which is 111 nucleic acids (position 669-780) shorter, and a second splice variant (SEQ ID NO: 5), which is 108 nucleic acids (position 670- 777) is shorter. FIG. 1.C shows the result of cloning the pKe # 83 total cDNA sequence, the following applies:
Spur 1 = DNA Molekulargewichtsmarker VI (154-2176 Bp, Boehringer Mannheim),
Spur 2 = SEQ ID No: 1 (1570 Bp)
Spur 3 = SEQ ID No: 2 (1460 Bp).
Lane 1 = DNA molecular weight marker VI (154-2176 bp, Boehringer Mannheim),
Lane 2 = SEQ ID No: 1 (1570 bp)
Lane 3 = SEQ ID No: 2 (1460 bp).
Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion konnte gezeigt werden, daß die pKe#83-spezifische mRNA nach Dispase-induzierter Ablösung der NHEK eine Aufregulation erfährt. In Fig. 1.A ist das Ergebnis einer Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription (rt-PCR) der mRNA in cDNA und Amplifikation mit pKe#83-spezifischen Oligonukleotid-Primern dargestellt. Dieses Ergebnis beinhaltet die Aussage, daß direkt nach der Ablösung der NHEK nur wenig pKe#83-mRNA vorhanden oder jedenfalls nachweisbar war, daß aber bereits 2 Stunden später eine deutliche Aufregulation festgestellt werden konnte. With the help of the polymerase chain reaction, it could be shown that the pKe # 83-specific mRNA undergoes an upregulation after dispase-induced detachment of the NHEK. The result of a polymerase chain reaction after reverse transcription (rt-PCR) of the mRNA in cDNA and amplification with pKe # 83-specific oligonucleotide primers is shown in FIG. 1A. This result contains the statement that immediately after the detachment of the NHEK, only a little pKe # 83 mRNA was present or was detectable in any case, but that a clear upregulation could be determined just 2 hours later.
Anhand des genetischen Codes der "pKe#83"-cDNA wurde mit Hilfe eines computergestützten Verfahrens (Programm "HUSAR" [= Heidelberg Unix Sequence Analysis Ressources] Version 4.0, Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, 1997] von der Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 eine Aminosäuresequenz abgeleitet, die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 3 dargestellt ist. Die strukturelle Analyse dieser Aminosäuresequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 3 mit eben diesem Programm lieferte folgende Informationen:Based on the genetic code of the "pKe # 83" cDNA, a computer-aided procedure (program "HUSAR" [= Heidelberg Unix Sequence Analysis Ressources] Version 4.0, German Cancer Research Center Heidelberg, 1997] from the nucleotide sequence an amino acid sequence according to sequence listing SEQ ID NO: 1 derived, which is shown in the sequence listing SEQ ID NO: 3. The structural analysis of this amino acid sequence according to the sequence listing SEQ ID NO: 3 with this program provided the following information:
Aus der Aminosäurezusammensetzung des Proteins pKe#83 errechnet sich ein Molekulargewicht von 60380 Da mit einem isoelektrischen Punkt von pH 5,3.The amino acid composition of the protein pKe # 83 is calculated a molecular weight of 60380 Da with an isoelectric point of pH 5.3.
Das Protein pKe#83 weist eine sog. Prenyl-Gruppen-Bindungsstelle ("CAAX Box") auf und eine Reihe möglicher Phosphorylierungsstellen (9x Proteinkinase C, 15x Caseinkinase II, 2x Tyrosinkinase). Diese Motive sind ein Indiz dafür, daß das Protein pKe#83 in Signaltransduktionsabläufe eingebunden ist.The protein pKe # 83 has a so-called prenyl group binding site ("CAAX Box ") and a number of possible phosphorylation sites (9x protein kinase C, 15x casein kinase II, 2x tyrosine kinase). These motives are an indication that the protein pKe # 83 is involved in signal transduction processes is involved.
Mittels der Polymerasekettenreaktion nach reverser Transkription (rt-PCR) wurde pKe#83-spezifische mRNA in Zellen (NHEK) von Keratinozytensheets nach Dispasebehandlung und in HaCaT-Zellen nachgewiesen. Hierfür wurde RNA aus Zellen von Keratinozytensheets nach Dispasebehandlung und unterschiedlich langer weiterer Inkubationszeit und aus HaCaT-Zellen jeweils mit Standardmethoden (Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform- Extraktionsmethode) isoliert und nach Standardmethoden in cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde einer PCR unterzogen, bei der aus der pKe#83-spezifischen cDNA ein Teilfragment von 388 Bp amplifiziert wurde. Als Primer-Paar wurde eine Kombination aus pKe#83-forward-10 (1032GAATAGACCAGAGATGAAAAGGCAG1056) und pKe#83-reverse-17 (1418CGGTTCAGCAGCTCATACC1399) eingesetzt. Es wurden 10 ng cDNA mit je 10 µM Primer zusammen mit einem Gemisch aus hitzestabiler DNA- Polymerase, ATP, TTP, GTP, CTP und Polymerasepuffer (vgl. z. B.: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons Inc., Suppl. 37, Chapter 15), hier im Beispiel in Form des im Handel gebrauchsfertig erhältlichen "PCR-Master-Mix" der Firma Clontech, in Ansatz gebracht. Zusätzlich wurden folgende Kontrolluntersuchungen durchgeführt: 1. der vorstehend beschriebene Reaktionsansatz mit dem Plasmid pUEX/pKe#83 anstelle der cDNA ("Positivkontrolle"), 2. der vorstehend beschriebene Reaktionsansatz ohne Zusatz von cDNA ("Negativkontrolle"), 3. der vorstehend beschriebene Reaktionsansatz mit GAPDH-spezifischen Primern (#302047, Stratagene; "GAPDH-Kontrolle").The polymerase chain reaction after reverse transcription (rt-PCR) was used to detect pKe # 83-specific mRNA in cells (NHEK) of keratinocyte sheets after dispase treatment and in HaCaT cells. For this, RNA was isolated from cells of keratinocyte sheets after dispase treatment and different incubation times of different lengths, and from HaCaT cells using standard methods (guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction method) and rewritten to cDNA using standard methods. This cDNA was subjected to a PCR in which a partial fragment of 388 bp was amplified from the pKe # 83-specific cDNA. A combination of pKe # 83-forward-10 ( 1032 GAATAGACCAGAGATGAAAAGGCAG 1056 ) and pKe # 83-reverse-17 ( 1418 CGGTTCAGCAGCTCATACC 1399 ) was used as the primer pair. 10 ng of cDNA with 10 μM primer each were used together with a mixture of heat-stable DNA polymerase, ATP, TTP, GTP, CTP and polymerase buffer (see, for example: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, 1997, John Wiley & Sons Inc., Suppl. 37, Chapter 15), here in the example in the form of the commercially available "PCR master mix" from Clontech. In addition, the following control tests were carried out: 1. the reaction mixture described above with the plasmid pUEX / pKe # 83 instead of the cDNA ("positive control"), 2. the reaction mixture described above without the addition of cDNA ("negative control"), 3. the reaction mixture described above Reaction mixture with GAPDH-specific primers (# 302047, Stratagene; "GAPDH control").
Die Reaktionsprodukte der PCR-Reaktion wurden im Agarosegel
elektrophoretisch aufgetrennt. Fig. 1.A zeigt das Ergebnis einer pKe#83-
spezifischen PCR Auftrennung. Es gilt:
The reaction products of the PCR reaction were separated electrophoretically in the agarose gel. FIG. 1.A shows the result of PCR pKe # 83- specific separation. The following applies:
Spur 1 = DNA Molekulargewichtsmarker VII (359-8576 Bb, Boehringer Mannheim)
Spur 2 = HaCaT
Spur 3 = HMEC (Zellinie, in der pKe#83 nicht nachweisbar ist)
Spur 4 = NHEK T0 (direkt nach Ablösung),
Spur 5 = NHEK T2 (2 h nach Ablösung)
Spur 6 = NHEK T4 (4 h nach Ablösung)
Spur 7 = NHEK T8 (8 h nach Ablösung),
Spur 8 = pUEX/pKe#83-Plasmid
Spur 9 = keine cDNA.
Lane 1 = DNA molecular weight marker VII (359-8576 Bb, Boehringer Mannheim)
Lane 2 = HaCaT
Lane 3 = HMEC (cell line in which pKe # 83 is undetectable)
Lane 4 = NHEK T0 (immediately after detachment),
Lane 5 = NHEK T2 (2 hours after detachment)
Lane 6 = NHEK T4 (4 h after detachment)
Lane 7 = NHEK T8 (8 h after detachment),
Lane 8 = pUEX / pKe # 83 plasmid
Lane 9 = no cDNA.
Ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von 390 Bp wurde in den Spuren 2, 5-8 nachgewiesen, d. h. pKe#83-spezifische mRNA wurde in den Keratinozytensheets (NHEK) zu den Zeitpunkten 2, 4 und 8 Stunden nach Dispase-induzierter Ablösung und ebenso in HaCaT-Zellen nachgewiesen.A PCR product of the expected size of 390 bp was found in the lanes 2, 5-8 demonstrated, d. H. pKe # 83-specific mRNA was found in the Keratinocyte sheets (NHEK) at 2, 4 and 8 hours after Dispase-induced detachment and also detected in HaCaT cells.
Fig. 1.B zeigt das Ergebnis einer GAPDH-spezifischen PCR. Es gilt:
Fig. 1.B shows the result of a GAPDH-specific PCR. The following applies:
Spur 1 = DNA Molekulargewichtsmarker VII (359-8576 Bb, Boehringer Mannheim)
Spur 2 = HaCaT
Spur 3 = HMEC
Spur 4 = NHEK T0
Spur 5 = NHEK T2
Spur 6 = NHEK T4
Spur 7 = NHEK T8
Lane 1 = DNA molecular weight marker VII (359-8576 Bb, Boehringer Mannheim)
Lane 2 = HaCaT
Lane 3 = HMEC
Lane 4 = NHEK T0
Lane 5 = NHEK T2
Lane 6 = NHEK T4
Lane 7 = NHEK T8
Diese GAPDH-spezifische PCR ("GAPDH-Kontrolle") beweist, daß ein negatives PCR Ergebnis im pke#83-spezifischen Ansatz nicht auf ein Nichtvorhandensein von cDNA zurückzuführen ist, da in allen Reaktionsansätzen von T0-T8 ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von 600 Bp nachweisbar war.This GAPDH-specific PCR ("GAPDH control") proves that a negative PCR result in the pke # 83-specific approach does not affect one Absence of cDNA is due to the fact that in all Reaction batches of T0-T8 a PCR product of the expected size 600 bp was detectable.
Die rt-PCR ermöglicht den Nachweis der pKe#83-Expression auch in Fällen, in denen der Nachweis des pKe#83-Proteins aufgrund zu niedrigen Expressionsspiegels mit immunhistologischen Methoden, dem ELISA oder mit Immunoblot-Verfahren nicht gelingt. Rt-PCR enables the detection of pKe # 83 expression even in cases in which the detection of the pKe # 83 protein is too low Expression level with immunohistological methods, the ELISA or not succeed with immunoblot procedures.
Zur Herstellung bzw. Expression des rekombinanten pKe#83-Proteins wurden zwei Wege beschritten. Zum einen wurde das Vektorkonstrukt pGEX-2T/pKe#83 gemäß Vektorprotokoll in Fig. 2 für die Expression in Bakterien (E. coli DH5α) hergestellt. Zum anderen wurde das Vektorkonstrukt pcDNA3.1/pKe#83-FLAG gemäß Vektorprotokoll in Fig. 3) zum Zweck der Expression in eukaryontischen Zellen (Cos-Zellen) hergestellt.Two methods were used to produce or express the recombinant pKe # 83 protein. On the one hand, the vector construct pGEX-2T / pKe # 83 was produced according to the vector protocol in FIG. 2 for expression in bacteria (E. coli DH5α). On the other hand, the vector construct pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG was produced according to the vector protocol in FIG. 3) for the purpose of expression in eukaryotic cells (Cos cells).
Das Vektorkonstrukt pGEX-2T/pKe#83 wurde nach Standardprotokollen für die Transformation von E. coli DH5α eingesetzt. Das pKe#83-Glutathion-S- Transferase-(GST)-Fusionsprotein wurde in Bakterien exprimiert, das bakterielle Lysat wurde im Immunoblot mit anti-GST-Antikörpern untersucht, und zwar im Vergleich zu Lysat von Bakterien, die mit einem Kontrollplasmid (kein GST) transformiert wurden.The vector construct pGEX-2T / pKe # 83 was generated according to standard protocols for used the transformation of E. coli DH5α. The pKe # 83-glutathione-S Transferase (GST) fusion protein was expressed in bacteria that bacterial lysate was examined in immunoblot with anti-GST antibodies, compared to the lysate of bacteria with a control plasmid (no GST) were transformed.
Das pKe#83/GST-Fusionsprotein wurde durch Affinitätschromatographie mit Hilfe von Gluthathion-Sepharose 4B aus den Bakterienlysaten gereinigt. Die Fraktionen dieser Reinigung wurden dann im Immunoblot mit anti-GST- Antikörpern untersucht.The pKe # 83 / GST fusion protein was determined by affinity chromatography Purified from bacterial lysates with the help of gluthathione-Sepharose 4B. The Fractions from this purification were then immunoblotted with anti-GST Antibodies examined.
Das Produkt des Immunoblots ist in Fig. 4.B abgebildet, Fig. 4.A zeigt die
entsprechende Proteinfärbung (Ponceau-Rot) des Blots vor
Antikörperfärbung. Es gilt:
The product of the immunoblot is shown in Fig. 4.B, Fig. 4.A shows the corresponding protein staining (Ponceau red) of the blot before antibody staining. The following applies:
Spur 1 = Bakterienlysat der Kontrolltransfektante
Spur 2 = Bakterienlysat der pUEX-2T/pKe#83-GST Transfektante
Spur 3 = Säulendurchlauf
Spur 4-6 = Waschfraktion 1-3
Spur 7-11 = Elutionsfraktion
Spur 12 = pKe#83/GST-Fusionsprotein vor Thrombinverdau
Spur 13 = pKe#83/GST-Fusionsprotein nach ThrombinverdauLane 1 = bacterial lysate of the control transfectant
Lane 2 = bacterial lysate of the pUEX-2T / pKe # 83-GST transfectant
Lane 3 = column run
Lane 4-6 = wash fraction 1-3
Lane 7-11 = elution fraction
Lane 12 = pKe # 83 / GST fusion protein before thrombin digestion
Lane 13 = pKe # 83 / GST fusion protein after thrombin digestion
Das pKe#83/GST-Fusionsproteins hatte ein apparentes Molekulargewicht von ca. 90 KDa. Das erlaubt den Schluß, daß das 90 KDa pKe#83/GST- Fusionsprotein aus dem GST-Protein (ca. 26 kDa) und einem ca. 60-65 KDa großen Fragment des Proteins pKe#83 besteht.The pKe # 83 / GST fusion protein had an apparent molecular weight of approx. 90 KDa. This allows the conclusion that the 90 KDa pKe # 83 / GST- Fusion protein from the GST protein (approx. 26 kDa) and an approx. 60-65 KDa large fragment of the protein pKe # 83 exists.
Im eukaryontischen System wurde der pcDNA3.1/pKe#83-FLAG Vektor
(Fig. 3) in sog. Cos-Zellen, d. h. in Zellen der im Stand der Technik allgemein
bekannten Cos-Zellinie, transformiert. Die Zellen wurden nach
Standardverfahren durch Behandlung mit DEAE-Dextran/Chloroquin zur
Aufnahme der Plasmid-DNA gebracht. Danach wurden die transformierten
Zellen drei Tage unter Standardbedingungen (37°C und 7% CO2) inkubiert.
Die Cos-Zellen wurden lysiert und im Immunoblot unter Verwendung eines
Antikörpers gegen das FLAG-Epitop analysiert. Fig. 5 zeigt das Produkt des
Immunoblots:
In the eukaryotic system, the pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG vector ( FIG. 3) was transformed into so-called Cos cells, ie into cells of the Cos cell line which is generally known in the art. The cells were brought up to the plasmid DNA by treatment with DEAE-dextran / chloroquine according to standard procedures. The transformed cells were then incubated for three days under standard conditions (37 ° C. and 7% CO 2 ). The Cos cells were lysed and analyzed in the immunoblot using an antibody against the FLAG epitope. Fig. 5 shows the product of the immunoblots:
Spur 1 = mit pcDNA3.1/pKe#83-FLAG Vektorkonstrukt transfizierte Cos-
Zellen entwickelt mit einem isotyp-identischen Kontroll-
Antikörper,
Spur 2 = mit dem pcDNA3.1 Vektor (ohne pKe#83) transfizierte Cos-
Zellen entwickelt mit einem isotyp-identischen Kontroll-
Antikörper,
Spur 3 = mit pcDNA3.1/pKe#83-FLAG Vektorkonstrukt transfizierte Cos-
Zellen entwickelt mit dem anti-FLAG Antikörper,
Spur 4 = mit dem pcDNA3.1 Vektor (ohne pKe#83) transfizierte Cos-
Zellen entwickelt mit dem anti-FLAG Antikörper,
Spur 5 = FLAG-markiertes Kontrollprotein das die Funktionalität des anti-
FLAG-Antikörpers zeigt.Lane 1 = cos cells transfected with pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG vector construct developed with an isotype-identical control antibody,
Lane 2 = cos cells transfected with the pcDNA3.1 vector (without pKe # 83) developed with an isotype-identical control antibody,
Lane 3 = cos cells transfected with pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG vector construct developed with the anti-FLAG antibody,
Lane 4 = cos cells transfected with the pcDNA3.1 vector (without pKe # 83) developed with the anti-FLAG antibody,
Lane 5 = FLAG-labeled control protein which shows the functionality of the anti-FLAG antibody.
Das Ergebnis dieses Versuch belegt die Expression des pKe#83-FLAG- Fusionsproteins in Cos-Zellen, die mit dem Vektorkonstrukt pcDNA3.1/pKe#83-FLAG transfiziert wurden.The result of this experiment demonstrates the expression of pKe # 83-FLAG Fusion protein in cos cells using the vector construct pcDNA3.1 / pKe # 83-FLAG were transfected.
Gereinigtes rekombinantes pKe#83-Nichtfusionsprotein wurde für die adjuvanzunterstützte Immunisierung von Kaninchen und Mäusen eingesetzt. Die Details des Immunisierungsverfahrens sind im Stand der Technik allgemein geläufig. Die Immunisierung von Kaninchen wurde im Kundenauftrag von der Fa. Dr. J. Pineda Antikörper-Service (Berlin) durchgeführt. Es wurden Seren vor ("Präimmunserum") und nach ("Postimmunserum") Immunisierung gewonnen. Aus den Seren wurde die IgG-Fraktion nach Standardverfahren mittels Ammoniumsulfatfällung isoliert. Die resultierenden IgG-Präparationen werden im folgenden als "anti-pKe#83 IgG" bezeichnet.Purified recombinant pKe # 83 non-fusion protein was used for the adjuvant-assisted immunization of rabbits and mice. The details of the immunization procedure are in the prior art common knowledge. The immunization of rabbits was in the Customer order from Dr. J. Pineda Antibody Service (Berlin) carried out. Sera were taken before ("preimmune serum") and after ("Postimmune Serum") Immunization won. The serums became the IgG fraction isolated by standard methods using ammonium sulfate precipitation. The resulting IgG preparations are referred to below as "anti-pKe # 83 IgG ".
Das Kaninchen "anti-pKe#83 IgG" zeigte eine deutliche Immunreaktion mit
dem für die Immunisierung verwendeten rekombinanten pKe#83 Protein.
Das Produkt dieses Immunblots ist in Fig. 6.A dargestellt. Es gilt:
The rabbit "anti-pKe # 83 IgG" showed a clear immune reaction with the recombinant pKe # 83 protein used for the immunization. The product of this immunoblot is shown in Figure 6.A. The following applies:
Spur 1 = Präimmun Kaninchen IgG, 1 : 10000 verdünnt,
Spur 2 = anti-pKe#83 IgG 1 : 50000 verdünnt
Spur 3 = anti-pKe#83 IgG 1 : 100000 verdünnt
Spur 4 = anti-pKe#83 IgG 1 : 200000 verdünntLane 1 = preimmune rabbit IgG, diluted 1: 10,000,
Lane 2 = anti-pKe # 83 IgG diluted 1: 50000
Lane 3 = anti-pKe # 83 IgG diluted 1: 100000
Lane 4 = anti-pKe # 83 IgG diluted 1: 200000
Der Pfeil markiert die Position des pKe#83-Proteins.The arrow marks the position of the pKe # 83 protein.
Mit dem polyklonalen Kaninchen "anti-pKe#83 IgG" und polyklonalem Maus
"anti-pKe#83 IgG" wurden darüberhinaus Zellysate von pKe#83-
transfizierten Cos-Zellen im Immunblotverfahren auf die Expression des
Proteins pKe#83 getestet. Das Produkt dieses Immunblots ist in Fig. 6.B
dargestellt. Es gilt:
With the polyclonal rabbit "anti-pKe # 83 IgG" and polyclonal mouse "anti-pKe # 83 IgG", cell lysates from pKe # 83-transfected Cos cells were also tested for the expression of the protein pKe # 83 by immunoblotting. The product of this immunoblot is shown in Figure 6.B. The following applies:
Spur 1 = Präimmun Kaninchen IgG,
Spur 2 = Kaninchen "anti-pKeh83 IgG",
Spur 3 = normal Maus IgG,
Spur 4 = Maus anti-pKe#83 IgG,
Spur 5 = anti-FLAG Antikörper.Lane 1 = preimmune rabbit IgG,
Lane 2 = rabbit "anti-pKeh83 IgG",
Lane 3 = normal mouse IgG,
Lane 4 = mouse anti-pKe # 83 IgG,
Lane 5 = anti-FLAG antibody.
Immunhistologie: Mit Hilfe eines Kryotoms wurden 5 µm-dicke Gefrierschnitte von Geweben aus Hautbiopsien von klinisch unauffälliger Normalhaut und von Dispase-abgelösten NHEK-"Sheets" zum Zeitpunkt T0 und T8 hergestellt. Diese wurden bei Raumtemperatur luftgetrocknet und in 100% Azeton fixiert (anstelle von Azeton kann ebensogut auch 100% Methanol, 100% Ethanol oder 4%-iges Paraformaldehyd verwendet werden). Danach wurden die Schnitte gemäß im Stand der Technik bekannter sog. "Blockierungsverfahren" behandelt, um unspezifische Bindungsstellen für den Antikörper zu blockieren. Im vorliegenden Beispielfall wurden zwei Blockierungsschritte durchgeführt: (1) eine Blockierung mit Avidin/Biotin und (2) eine Blockierung mit Normalserum. Im ersten Blockierungschritt wurde die Avidin/Biotin-Blockierung unter Verwendung des Avidin/Biotin-Blockierungskits der Firma Vector- Laboratories nach Herstellervorschrift eingesetzt, d. h. es wurde bei Raumtemperatur zunächst 15 Minuten mit der Avidin-Fertiglösung und nachfolgend 15 Minuten mit der mit der Biotin-Fertiglösung inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit 10 Vol-% Normalserum in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (Normalserum der Spezies, aus der der Zweitantikörper stammt, hier Ziege-Normalserum, PBS = Phosphate buffered sahne = Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2-7,4).Immunohistology: Using a cryotome was 5 µm thick Frozen sections of tissues from skin biopsies of clinically unremarkable Normal skin and from Dispase-detached NHEK "sheets" at time T0 and T8 manufactured. These were air dried at room temperature and in 100% acetone fixed (instead of acetone, 100% Methanol, 100% ethanol or 4% paraformaldehyde is used become). After that, the cuts were made according to the state of the art known so-called "blocking method" treated to unspecific Block binding sites for the antibody. In the present For example, two blocking steps were carried out: (1) one Blocking with avidin / biotin and (2) blocking with normal serum. in the The first blocking step was the avidin / biotin blocking Using the Avidin / Biotin Blocking Kit from Vector- Laboratories used according to the manufacturer's instructions, d. H. it was at Room temperature first 15 minutes with the avidin ready solution and subsequently incubated for 15 minutes with the biotin solution. The sections were then run with 10% by volume normal serum in PBS for 15 Incubated for minutes at room temperature (normal serum of the species from which the second antibody comes from normal goat serum, PBS = phosphate buffered cream = phosphate-buffered saline, pH 7.2-7.4).
Im Anschluß an die Blockierung wurden die Schnitte in PBS mit einem Gehalt an 5 µg/ml Kaninchen "anti-pKe#83 IgG" für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Entfernung des nichtgebundenen Antikörpers wurden die Schnitte anschließend in PBS mit einem Gehalt an 0,2% (Gewicht/Volumen) bovinem Serumalbumin gewaschen. Es folgt die Inkubation mit einem beispielsweise Biotin-markierten und gegen Kaninchen-IgG-gerichteten Antikörper aus der Ziege (1 : 500 verdünnt in PBS/ 0,2% BSA; 30 Minuten bei Raumtemperatur), ein weiterer Waschschritt, sowie die Aufbringung eines mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3-markierten Streptavidins (1 : 1000 in PBS/0,2% BSA verdünnt). Anstelle von Cy3 kann auch ein anderer Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung des Streptavidins verwendet werden, z. B. FITC. Nach einem letzten Waschschritt wurden die Schnitte mit Eindeckmedium, z. B. Elvanol oder Histogel, eingedeckt und im Fluoreszenzmikroskop untersucht und ausgewertet.Following the blocking, the cuts were made in PBS with a Content of 5 µg / ml rabbit "anti-pKe # 83 IgG" for 1 hour Incubated at room temperature. To remove the unbound antibody the sections were then made in PBS containing 0.2% (Weight / volume) bovine serum albumin washed. The follows Incubation with, for example, a biotin-labeled and against Goat rabbit IgG-directed antibody (diluted 1: 500 in PBS / 0.2% BSA; 30 minutes at room temperature), another washing step, and the application of a Cy3-labeled with the fluorescent dye Streptavidins (1: 1000 diluted in PBS / 0.2% BSA). Instead of Cy3 can another fluorescent dye for labeling streptavidin are used, e.g. B. FITC. After a last washing step, the Cuts with mounting medium, e.g. B. Elvanol or Histogel, covered and in Fluorescence microscope examined and evaluated.
In Fig. 8 sind die Ergebnisse eines derart durchgeführten Immunfluoreszenztests dargestellt: Das Kaninchen "anti-pKe#83 IgG" zeigt auf Normalhautschnitten eine schwache intrazelluläre und eine starke Zellmembran-assoziierte Immunfärbung (Fig. 8.C). Die NHEK "Sheets" T0 (= direkt nach Dispase-induzierter Ablösung vom Substrat) zeigen nur eine leichte Hintergrundfärbung (Fig. 8.A) während die NHEK "Sheets" T8 (= 8 Stunden nach der Dispase-induzierten Ablösung vom Substrat) eine deutliche Immunfärbung aufweisen (Fig. 8.B). Dieses Ergebnis beinhaltet die Aussage, daß direkt nach der Ablösung wenig Protein pKe#83 vorhanden oder jedenfalls nachweisbar war, aber 8 Stunden später bereits eine vermehrte Expression stattgefunden hatte und infolgedessen deutlich höhere Mengen Protein pKe#83 nachgewiesen werden konnten.The results of an immunofluorescence test carried out in this way are shown in FIG. 8: The rabbit "anti-pKe # 83 IgG" shows weak intracellular and strong cell membrane-associated immunostaining on normal skin sections ( FIG. 8.C). The NHEK "Sheets" T0 (= directly after dispase-induced detachment from the substrate) show only a slight background staining ( FIG. 8.A) while the NHEK "Sheets" T8 (= 8 hours after the dispase-induced detachment from the substrate) show one have clear immunostaining ( Fig. 8.B). This result includes the statement that little protein pKe # 83 was present or at least detectable immediately after detachment, but that increased expression had already taken place 8 hours later and consequently significantly higher amounts of protein pKe # 83 could be detected.
Enzyme-linked Immunosorbent Asssy (ELISA): Zur Quantifizierung des pKe#83-Proteins in komplexen Lösungen wurde ein sog. "Sandwich"-ELISA (Fig. 7) durchgeführt. Hierzu wurde eine Mikrotiterplatte mit einem gegen pKe#83 gerichteten Antikörper (z. B. Kaninchen anti-pKe#83 IgG, 1 µg/Vertiefung) beschichtet. Dann wurden die noch verbliebenen unspezifischen Bindungsstellen der Mikrotiterplatte durch Behandlung mit 0,1 Gewichts-% Gelatine in phospatgepufferter Kochsalzlösung ("PBS/Gelatine") blockiert. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte mit unterschiedlichen Konzentration des pKe#83-Proteins als Kalibrator, bzw. mit Verdünnungen unbekannter Proben (in denen die pKe#83-Konzentration festgestellt werden sollte) in Ansatz gebracht. Nach einem Waschschritt mit 0,05 Volumen-% Tween-20 in PBS (PBS/Tween) wurde die Platte mit einer IgG Präparation aus einer zweiten Spezies (z. B. mit Maus anti-pKe#83 IgG) inkubiert (z. B. eine Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur). Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS/Tween wurde die Platte mit einer Peroxidase-markierten kommerziellen Kaninchen anti Maus-IgG Antikörper- Präparation inkubiert (z. B. Fc-spez. Fab2-POX von Dianova GmbH, Hamburg). "Peroxidase" steht hier stellvertretend für praktisch jede beliebige Markierung des Antikörpers, z. B. mit Enzymen, Fluoreszenzmolekülen oder Lumineszenzmolekülen. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung ungebundener enzymmarkierter Antikörper wurde das farblose Peroxidase- Substrat Ortho-Phenylendiamin zugesetzt, welches durch die Peroxidase- Aktivität in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Die Quantifizierung der Farbbildung erfolgt in einem Mikrotiterplattenphotometer bei 490 nm gegen 405 nm (Ordinate).Enzyme-linked Immunosorbent Asssy (ELISA): A so-called "sandwich" ELISA ( FIG. 7) was carried out to quantify the pKe # 83 protein in complex solutions. For this purpose, a microtiter plate was coated with an antibody directed against pKe # 83 (eg rabbit anti-pKe # 83 IgG, 1 µg / well). Then the remaining unspecific binding sites of the microtiter plate were blocked by treatment with 0.1% by weight gelatin in phosphate-buffered saline ("PBS / gelatin"). The microtiter plate was then mixed with different concentrations of the pKe # 83 protein as a calibrator or with dilutions of unknown samples (in which the pKe # 83 concentration should be determined). After a washing step with 0.05% by volume Tween-20 in PBS (PBS / Tween), the plate was incubated with an IgG preparation from a second species (e.g. with mouse anti-pKe # 83 IgG) (e.g. one hour with shaking at room temperature). After a further washing step with PBS / Tween, the plate was incubated with a peroxidase-labeled commercial rabbit anti-mouse IgG antibody preparation (for example Fc-specific Fab 2- POX from Dianova GmbH, Hamburg). "Peroxidase" is representative of virtually any label on the antibody, e.g. B. with enzymes, fluorescent molecules or luminescent molecules. After a further washing step to remove unbound enzyme-labeled antibodies, the colorless peroxidase substrate ortho-phenylenediamine was added, which is converted into a colored product by the peroxidase activity. The color formation is quantified in a microtiter plate photometer at 490 nm against 405 nm (ordinate).
Das Ergebnis des Versuchs ist in Fig. 7 dargestellt. Es zeigt, daß die Farbkonzentration (angegeben als Absorption in der Ordinate) der Menge des eingesetzten pKe#83-Proteins (= des "Kalibrators", in der Abszisse dargestellt) proportional ist. Um die Funktionalität des Testsystems zu demonstrieren, wurden gleichzeitig Lysate von zwei verschiedenen Cos- Transfektanten-Ansätzen getestet, die sich in der Expression von pKe#83 unterscheiden. Die Cos-Zellen des einen Ansatzes wurden mit dem Vektorkonstrukt pcDNA3.1/pKe#83 (Ansatz "Cos pKe#83") und die des anderen Ansatzes mit dem pcDNA3.1 Vektor ohne Insert (Ansatz "Cos") transfiziert.The result of the experiment is shown in Fig. 7. It shows that the color concentration (indicated as absorption in the ordinate) is proportional to the amount of pKe # 83 protein used (= the "calibrator" shown in the abscissa). In order to demonstrate the functionality of the test system, lysates from two different cos-transfectant approaches, which differ in the expression of pKe # 83, were tested simultaneously. The cos cells of one approach were transfected with the vector construct pcDNA3.1 / pKe # 83 (approach "Cos pKe # 83") and those of the other approach with the pcDNA3.1 vector without insert (approach "Cos").
Zellen dieser Transfektanten-Ansätze wurden nach Standardverfahren unter Verwendung des Detergenzes Triton X-100 lysiert. Diese Lysate wurden in einer 1 : 10-Verdünnung in PBS/Tween 20 im ELISA getestet. Lysate des "Cos pKe#83"-Transfektanten-Ansatzes zeigten eine positive Reaktion zeigen. Unter Berücksichtigung der Kalibratordaten wurde eine Konzentration von ca. 120 ng pKe#83/ 106 Cos pKe#83-Zellen festgestellt. Bei den Lysaten der Kontroll-Transfektanten-Ansätze "Cos" konnte kein Protein pKe#83 nachgewiesen werden. Durch den Einsatz dieses Testverfahrens ist folglich eine Quantifizierung einer unbekannten Menge des Proteins pKe#83 in einer Probe möglich.Cells from these transfectant batches were lysed according to standard procedures using the detergent Triton X-100. These lysates were tested in a 1:10 dilution in PBS / Tween 20 in an ELISA. Lysates from the "Cos pKe # 83" transfectant approach showed a positive response. Taking the calibrator data into account, a concentration of approx. 120 ng pKe # 83/10 6 Cos pKe # 83 cells was determined. No protein pKe # 83 could be detected in the lysates of the control transfectant batches "Cos". By using this test method it is therefore possible to quantify an unknown amount of the protein pKe # 83 in a sample.
Die Substanz Ortho-Phenylendiamin steht hier stellvertretend für jedes beliebige Peroxidase-Substrat, das infolge der Peroxidase-Aktivität seine Farbe nachweisbar verändert. Anstelle der hier beispielhaft verwendeten polyklonalen Antikörper können ebensogut monoklonale Antikörper, die gegen das Protein pKe#83 gerichtet sind, eingesetzt werden. Anstatt des indirekten Ansatzes über einen markierten speziesspezifischen anti-IgG Antikörper kann auch die Durchführung mit einem direkt markierten anti- pKe#83-Antikörper erfolgen.The substance ortho-phenylenediamine is representative of everyone here any peroxidase substrate due to its peroxidase activity Color demonstrably changed. Instead of the example used here polyclonal antibodies may as well be monoclonal antibodies that are directed against the protein pKe # 83. Instead of indirect approach via a labeled species-specific anti-IgG Antibodies can also be performed with a directly labeled anti pKe # 83 antibodies occur.
Antisense-Oligonukleotide werden von Zellen, auch Keratinozyten, aufgenommen (vgl.: G. Hartmann et all 1998: Antisense-Oligonukleotide, Deutsches Ärzteblatt 95, Heft 24, C1115-C1119). Sie binden in spezifischer Weise an die in der Zelle vorliegende mRNA und hemmen deren Translation und damit die Expression des entsprechenden Proteins (vgl.: Y.-S. Lee et all 1997, Definition by specific antisense oligonucleotides of a role for protein kinase Cα in expression of differentiation markers in normal and neoplastic mouse epidermal keratinocytes, Molecular Carcinogenesis 18: 44-53). Geeignete Antisense-Oligonukleotide wurden anhand der pKe#83- spezifischen Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) hergestellt. Sie wurden mit geeignetem Puffermedium (sog. "Oligopuffer") auf eine Konzentration von 100 µM eingestellt. HaCaT-Zellen wurden bei 37°C und 7% CO2 bis zu einer Konfluenz von 70-80% kultiviert. Die Zellen wurden abtrypsiniert (10 Minuten 0,2 Gewichts-% EDTA, 0,1 Gewichts-% Trypsin, 5-10 Minuten) und auf eine Konzentration von 25000 Zellen/ml eingestellt. Pro Vertiefung einer Mikrotiter-Kulturplatte (96 Vertiefungen) wurden 100 µl Zellsuspension (entspricht 2500 Zellen) einpipepttiert. Die Zellen wurden 1 Stunde unter den vorgenannten Kultivierungsbedingungen inkubiert, danach erfolgte die Zugabe des Antisense-Oligonukleotids (2 µl einer 100 µM-Lösung) und eine weitere Inkubation von 24-48 Stunden. Als Negativkontrolle dienten Zellansätze, denen Oligonukleotide mit der gleichen Basenverteilung aber zufällig ausgewählter Sequenz zugegeben wurden. Antisense oligonucleotides are taken up by cells, including keratinocytes (see: G. Hartmann et all 1998: Antisense oligonucleotides, Deutsches Ärzteblatt 95, No. 24, C1115-C1119). They bind specifically to the mRNA present in the cell and inhibit its translation and thus the expression of the corresponding protein (see: Y.-S. Lee et all 1997, definition by specific antisense oligonucleotides of a role for protein kinase Cα in expression of differentiation markers in normal and neoplastic mouse epidermal keratinocytes, Molecular Carcinogenesis 18: 44-53). Suitable antisense oligonucleotides were prepared using the pKe # 83-specific nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1). They were adjusted to a concentration of 100 µM with a suitable buffer medium (so-called "oligo buffer"). HaCaT cells were cultured at 37 ° C and 7% CO 2 to a confluency of 70-80%. The cells were trypsinized (10 minutes 0.2% by weight EDTA, 0.1% by weight trypsin, 5-10 minutes) and adjusted to a concentration of 25000 cells / ml. 100 μl of cell suspension (corresponding to 2500 cells) were pipetted in per well of a microtiter culture plate (96 wells). The cells were incubated for 1 hour under the above-mentioned cultivation conditions, followed by the addition of the antisense oligonucleotide (2 μl of a 100 μM solution) and a further incubation of 24-48 hours. Cell batches served as negative controls, to which oligonucleotides with the same base distribution but a randomly selected sequence were added.
Die solcherart behandelten Zellen wurden mit Hilfe eines Mikroskops hinsichtlich phänotypischer Veränderungen untersucht. Das Ergebnis der mikroskopischen Analyse ist in Fig. 9 dargestellt: Fig. 9.A zeigt HaCaT- Zellen, die mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelt worden sind, Fig. 9.B zeigt HaCaT-Zellen, die mit pKe#83-spezifischen Antisense- Oligonukleotiden behandelt worden sind.The cells treated in this way were examined with the aid of a microscope for phenotypic changes. The result of the microscopic analysis is shown in FIG. 9: FIG. 9.A shows HaCaT cells which have been treated with control oligonucleotides, and FIG. 9.B shows HaCaT cells which have been treated with pKe # 83-specific antisense Oligonucleotides have been treated.
Die mikroskopischen Untersuchungen zeigten, daß in den mit Antisense- Oligonukleotiden behandelten HaCaT-Kulturen stark vergrößerte Zellen auftraten (Fig. 9.B, Pfeile), die in den mit Kontroll-Oligonukleotiden behandelten Kulturen nicht zu finden waren. Diese großen Zellen entsprechen in ihrer Morphologie differenzierten Keratinozyten. Der Befund weist darauf hin, daß mit pKe#83-spezifischen Antisense-Oligonukleotiden behandelte Zellen eine vermehrte Tendenz zur Differenzierung aufweisen.The microscopic examinations showed that in the HaCaT cultures treated with antisense oligonucleotides, greatly enlarged cells appeared ( FIG. 9B, arrows), which were not found in the cultures treated with control oligonucleotides. The morphology of these large cells corresponds to differentiated keratinocytes. The finding indicates that cells treated with pKe # 83-specific antisense oligonucleotides have an increased tendency to differentiate.
Claims (22)
das einem natürlicherweise in humanen epidermalen Keratinozyten vorkommenden und im aktivierten, durch eine erhöhte Expression der Aktivierungsmarker uPA und uPA-R gekennzeichneten Zustand dieser Keratinozyten aufregulierten, nämlich verstärkt exprimierten Protein gleicht oder ähnlich ist,
und das entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte oder eine durch Aminosäure substitution, -deletion, -insertion, -oder -inversion als Allel oder Derivat daraus entstandene Aminosäuresequenz aufweist,
und wobei die durch Aminosäuresubstitution, -deletion, -insertion, -oder - inversion als Allel oder Derivat entstandenen Aminosäuresequenzen zur Beeinflussung der Zellmorphologie, Zellproliferation, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zelldifferenzierung geeignet sind.1. isolated polypeptide,
which is similar or similar to a protein which occurs naturally in human epidermal keratinocytes and is regulated in the activated state of these keratinocytes, which is characterized by an increased expression of the activation markers uPA and uPA-R, namely is more strongly expressed,
and which either has the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence resulting therefrom by amino acid substitution, deletion, insertion, or inversion as an allele or derivative,
and wherein the amino acid sequences resulting from amino acid substitution, deletion, insertion, or inversion as an allele or derivative are suitable for influencing cell morphology, cell proliferation, cell adhesion, cell migration and / or cell differentiation.
die ein Protein gemäß Anspruch 1 codiert,
und die entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder die hierzu komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist. 2. Isolated nucleic acid,
encoding a protein according to claim 1,
and which has either the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or the complementary nucleotide sequence or a partial sequence of one of these two nucleotide sequences or a nucleotide sequence hybridizing wholly or partially with one of these two nucleotide sequences.
daß es eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus einer Splice-Variante einer mRNA resultiert, welche
entweder die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder die hierzu komplementäre Nukleotidsequenz oder eine Teilsequenz einer dieser beiden Nukleotidsequenzen
oder eine ganz oder teilweise mit einer dieser beiden Nukleotidsequenzen hybridisierende Nukleotidsequenz aufweist,
daß es in aktivierten humanen epidermalen Keratinozyten mit erhöhter Expression der Aktivierungsmarker uPA und uPA-R aufreguliert wird, und daß es zur Beeinflussung der Zellmorphologie, Zellproliferation, Zelladhäsion, Zellmigration und/oder Zelldifferenzierung geeignet ist.8. Isolated polypeptide, characterized in
that it has an amino acid sequence resulting from a splice variant of an mRNA which
either the nucleotide sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1 or the complementary nucleotide sequence or a partial sequence of one of these two nucleotide sequences
or has a nucleotide sequence hybridizing wholly or partially with one of these two nucleotide sequences,
that it is upregulated in activated human epidermal keratinocytes with increased expression of the activation markers uPA and uPA-R, and that it is suitable for influencing cell morphology, cell proliferation, cell adhesion, cell migration and / or cell differentiation.
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