DE19850186A1

DE19850186A1 - New primers and probes for the detection of HIV

Info

Publication number: DE19850186A1
Application number: DE1998150186
Authority: DE
Inventors: Gerd Haberhausen; Pia Kasper; Christoph Kessler
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2000-05-25
Also published as: JP2004500014A; EP1124993A2; WO2000029611A3; WO2000029611A2

Abstract

The invention relates to a method for the subtype and/or species-comprehensive detection of HI viruses in a sample while using at least one oligonucleotide which contains at least 10 successive nucleotides from (i) a highly preserved region of the LTR region, of the gag gene or of the pol gene of HIV, (ii) of a corresponding region of another HI virus isolate, (iii) of a corresponding region of a consensus sequence stemming from a plurality of HI virus isolates or of sequences complementary thereto.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren in einer Probe sowie dazu geeignete Oligonukleotide.The invention relates to a method for subtyping and / or cross-species detection of HI viruses in a sample as well suitable oligonucleotides.

Der Nachweis von HIV ist von großer Bedeutung in der analytischen Diagnostik. Es existiert eine Anzahl von Nachweisverfahren, die auf der immunologischen Detektion von HIV-spezifischen Antikörpern, HIV-eigenen Proteinen, beispielsweise der Reversen Transkriptase, oder von HIV- spezifischen Nukleinsäuren beruhen.The detection of HIV is of great importance in the analytical Diagnostics. There are a number of detection methods available on the immunological detection of HIV-specific antibodies, HIV-specific Proteins, for example, the reverse transcriptase, or of HIV based on specific nucleic acids.

Da HIV und dessen genetisches Material nur in sehr geringen Konzentrationen in Körperflüssigkeiten vorkommen, ist die Sensitivität der Nachweisverfahren ein wichtiger Faktor für die Verwendbarkeit solcher Verfahren.Because HIV and its genetic material is only very low Concentrations occur in body fluids, the sensitivity of the Detection method an important factor for the usability of such Method.

Aus diesem Grund wird derzeit die PCR (Polymerase Chain Reaction), die auf einer Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren beruht, in zunehmendem Maße verwendet. Anwendungen dieses Verfahrens zum direkten Nachweis von HIV sind beispielsweise in EP-B-0 200 362 und EP-B-0 201 184 beschrieben.For this reason, the PCR (Polymerase Chain Reaction), the is based on an amplification of the nucleic acids to be detected, in increasingly used. Applications of this method to direct detection of HIV are described, for example, in EP-B-0 200 362 and EP-B-0 201 184 described.

Die PCR oder Polymerase-Kettenreaktion erlaubt die Amplifikation von Nukleinsäureabschnitten mit Hilfe von Oligonukleotiden, sogenannten Primern, die spezifisch mit den nachzuweisenden Nukleinsäuren hybridisieren. Dabei entstehen Amplifikationsprodukte, welche wiederum mit weiteren spezifischen Oligonukleotiden, sogenannten Sonden, detektiert werden können. The PCR or polymerase chain reaction allows the amplification of Nucleic acid sections using oligonucleotides, so-called Primers specific with the nucleic acids to be detected hybridize. This produces amplification products, which in turn with further specific oligonucleotides, so-called probes detected can be.

Voraussetzungen für eine erfolgreiche PCR zum Nachweis von HIV ist erstens eine möglichst genaue Übereinstimmung der komplementären Basenfolge der verwendeten Primer mit derjenigen der nachzuweisenden Nukleinsäure, damitdie Hybridisierung möglichst spezifisch ist. Andererseits ist es jedoch auch vorteilhaft, möglichst viele Varianten von HIV mit denselben Primern amplifizieren zu können. Seit der Entdeckung des HIV-1 wurde festgestellt, dass die Nukleinsäuresequenzen von HI-Viren unterschiedlicher Provenienz sich unterscheiden. Die unterschiedlichen Typen von HIV-1 werden üblicherweise als Subtypen bezeichnet. Derzeit sind mindestens 9 Subtypen bekannt, die als Subtypen A bis H und O bezeichnet werden (Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos, Natl. Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1994; Herausgeber G. Meyers et al., I-A-1). Bisher wurden noch keine Primer oder Sonden entwickelt, mit denen sämtliche bekannten Subtypen von HIV-1 erkannt werden können. Weiterhin wäre es von Vorteil, zusätzlich auch HIV-2 und dessen Subtypen mit denselben Primern und Sonden erkennen zu können. Von HIV-2 sind derzeit die Subtypen A, B, C und D bekannt.Requirements for a successful PCR to detect HIV first, the closest possible match of the complementary ones Base sequence of the primers used with that of the to be detected Nucleic acid, so that the hybridization is as specific as possible. on the other hand However, it is also beneficial to have as many variants of HIV as possible to be able to amplify the same primers. Since the discovery of HIV-1 It was found that the nucleic acid sequences of HI viruses differ in their provenance. The different ones Types of HIV-1 are commonly referred to as subtypes. Currently At least 9 subtypes are known, which are subtypes A to H and O. (Human Retroviruses and AIDS, Los Alamos, Natl. Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1994; Publisher G. Meyers et al., I-A-1). So far, no primers or probes have been developed with which all known subtypes of HIV-1 can be detected. Furthermore, it would be beneficial, in addition, HIV-2 and its subtypes to recognize with the same primers and probes. Of HIV-2 are currently the subtypes A, B, C and D known.

In der europäischen Patentanmeldung EP 0 403 333 werden Primer und Sonden beschrieben, die jeweils mit Basensequenzen aus konservierten Regionen der gag-, vpr- und pol-Gene der HIV-1-Isolate Bru, Mal und Eli sowie mit den entsprechenden Regionen von HIV-2 ROD und SIV Mac hybridisieren. Weiterhin werden Primer und Sonden offenbart, die jeweils mit Abschnitten aus den env-, nef1-, vif1- und vpr-Genen von HIV-1 Bru, Mal und Eli hybridisieren, sowie solche, die mit Abschnitten aus den nef2-, vif2- und vpx-Genen von HIV-2 ROD und SIV Mac hybridisieren. Obwohl einige dieser Oligonukleotide offenbar speziesübergreifend hybridisieren, ist nichts darüber ausgesagt, welche Subtypen der einzelnen Viren erkannt werden. European Patent Application EP 0 403 333 discloses primers and Probes, each conserved with base sequences from Regions of the gag, vpr and pol genes of HIV-1 isolates Bru, Mal and Eli as well as with the corresponding regions of HIV-2 ROD and SIV Mac hybridize. Furthermore, primers and probes are disclosed, each with sections from the env, nef1, vif1 and vpr genes of HIV-1 Bru, Mal and Eli hybridize, as well as those with sections from the Nef2, Hybridize vif2 and vpx genes of HIV-2 ROD and SIV Mac. Even though it seems that some of these oligonucleotides hybridize across species Nothing is said about which subtypes of each virus detected become.

In der europäischen Patentanmeldung EP 727 497 sind Primer und Sonden offenbart, die einen Sequenzabschnitt aus dem pol-Gen von HIV-1 amplifizieren und dadurch fünf Subtypen von HIV-1 erkennen können.In European patent application EP 727 497 are primers and probes discloses a sequence portion of the pol gene of HIV-1 amplify and thereby recognize five subtypes of HIV-1.

EP 0 617 132 offenbart ebenfalls Primer und Sonden zum Nachweis von HIV-1, die in der Lage sind, zwischen HIV-1 und seinen phylogenetisch nächsten Verwandten zu unterscheiden, wie etwa HTLV-II oder HIV-2. Die dort ausgewählten Oligonukleotide hybridisieren mit einer Reihe von Regionen aus dem HIV-Genom, einschließlich des LTR und der meisten Strukturgene.EP 0 617 132 also discloses primers and probes for the detection of HIV-1, which is able to fight between HIV-1 and its phylogenetic to differentiate their closest relatives, such as HTLV-II or HIV-2. The oligonucleotides selected there hybridize with a series of Regions of the HIV genome, including the LTR and most Structural genes.

Da es bisher noch kein Primerpaar gibt, welches für einen subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis geeignet ist, werden derzeit häufig mehrere Primerpaare zur Amplifikation eingesetzt. Dies führt jedoch einerseits zu erhöhten Reagenzkosten und andererseits zu einer erheblich komplexeren PCR.Since there is still no primer pair, which for a subtyp and / or cross-species evidence is currently commonly several Primer pairs used for amplification. However, this leads on the one hand increased reagent costs and on the other hand to a much more complex PCR.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens zum subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI- Viren in einer Probe. Insbesondere war es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem mehr Subtypen von HIV-1 und/oder HIV-2 detektiert werden können, als es bisher möglich war.The object of the present invention was therefore to provide a Method for subtyping and / or cross-species detection of HI Viruses in a sample. In particular, it was an object of the invention To provide methods with which more subtypes of HIV-1 and / or HIV-2 can be detected, as it was previously possible.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von Nukleinsäuren von HI-Viren in einer Probe durch
Hybridisierung der Nukleinsäuren mit mindestens einem mit HIV- Nukleinsäuren spezifisch hybridisierenden Oligonukleotid, welches mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
This object is achieved by a method for subtypes and / or species-spanning detection of nucleic acids of HI viruses in a sample
Hybridization of the nucleic acids with at least one oligonucleotide which specifically hybridizes with HIV nucleic acids and which comprises at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the LTR region, the gag gene or the pol gene of HIV, represented by one of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to 13 given sequences,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of a consensus sequence several HIV virus isolates,

oder dazu komplementären Sequenzen enthält.or complementary sequences.

Bevorzugt wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis von Nukleinsäuren von HI-Viren in einer Probe durch
Hybridisierung der Nukleinsäuren mit einer Oligonukleotidkombination, umfassend zwei oder mehr mit HIV- Nukleinsäuren spezifisch hybridisierende Oligonukleotide, die jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
Preferably, this object is achieved by a method for subtypes and / or species-spanning detection of nucleic acids of HI viruses in a sample
Hybridization of the nucleic acids with an oligonucleotide combination comprising two or more oligonucleotides specifically hybridizing with HIV nucleic acids, each of which comprises at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the LTR region, the gag gene or the pol gene of HIV, represented by one of the sequences shown in SEQ ID NO: 1 to 13 given sequences,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
(c) a corresponding region of one of several HI Virus isolate-derived consensus sequence,

oder dazu komplementären Sequenzen enthalten, und
Durchführung eines Amplifikationsschrittes.or contain complementary sequences, and
Carrying out an amplification step.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht den Nachweis von mehr Subtypen von HIV-1 und HIV-2 (subtypübergreifender Nachweis) als es im bisherigen Stand der Technik möglich war. Der subtypübergreifende Nachweis bedeutet, daß mindestens 2 Subtypen einer jeweiligen Spezies mit einer einzigen Sonde oder einer einzigen Oligonukleotidkombination detektiert werden können. Wie bereits oben erwähnt, ist es bisher nicht möglich gewesen, mit herkömmlichen Nachweisverfahren die Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von HIV-1 mit einer einzigen Sonde oder einem einzigen Amplifikationsprimerpaar bestehend aus zwei Oligonukleotiden zu detektieren. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es nun möglich, mindestens 7 von 9 Subtypen von HIV-1, insbesondere einschließlich Subtyp O in Verbindung mit anderen Subtypen mit Hilfe besonders weniger und im besten Fall mit denselben Oligonukleotiden zu erkennen. In einer bevorzugten Ausführungsform können alle bisher bekannten 9 Subtypen erkannt werden. Von HIV-2 können mit dem subtypübergreifenden Nachweis mindestens 2, bevorzugt mindestens 3 und am meisten bevorzugt alle Subtypen A, B, C und D von HIV-2 erkannt werden. Zusätzlich zum subtypübergreifenden Nachweis können auch Nukleinsäuren von HIV-1 und HIV-2 speziesübergreifend detektiert werden. Speziesübergreifend bedeutet, daß verschiedene Spezies von Immunodefizienzviren mit denselben Oligonukleotiden erkannt werden, z. B. HIV-1 und HIV-2. Bevorzugt werden mindestens 7 der derzeit bekannten 9 Subtypen von HIV-1, sowie weitere der derzeit bekannten Subtypen von HIV-2 detektiert. Besonders bevorzugt können alle 9 Subtypen von HIV-1 plus weitere Subtypen von HIV-2, besonders bevorzugt plus alle derzeit bekannten Subtypen von HIV-2 detektiert werden.The inventive method allows the detection of more Subtypes of HIV-1 and HIV-2 (subtyping evidence) as it is in Previous state of the art was possible. The subtypes Detection means that at least 2 subtypes of a given species with a single probe or a single oligonucleotide combination can be detected. As mentioned above, it is not yet have been possible, with conventional detection methods subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O of HIV-1 with a single probe or a single amplification primer pair consisting of two oligonucleotides to detect. By the method according to the invention it is now possible at least 7 out of 9 subtypes of HIV-1, including in particular Subtype O in conjunction with other subtypes using especially less and to recognize at best with the same oligonucleotides. In a preferred embodiment, all previously known 9 subtypes be recognized. HIV-2 can be subtypes-spanning Detection at least 2, preferably at least 3 and most preferred all subtypes A, B, C and D of HIV-2 are detected. In addition to subtypes can also detect HIV-1 and nucleic acids HIV-2 can be detected across species. Cross species means that different species of immunodeficiency viruses with the same Oligonucleotides are detected, for. HIV-1 and HIV-2. To be favoured at least 7 of the currently known 9 subtypes of HIV-1, as well as others the currently known subtypes of HIV-2 detected. Especially preferred can all 9 subtypes of HIV-1 plus other subtypes of HIV-2, especially preferred plus all currently known subtypes of HIV-2 be detected.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Amplifikation von Nukleinsäureabschnitten von HI-Viren mit Hilfe von spezifischen Oligonukleotiden, die als Primer oder als Sonden fungieren können.The inventive method is based on an amplification of Nucleic acid sections of HI viruses using specific Oligonucleotides that can act as primers or as probes.

Ein Oligonukleotid ist ein einsträngiges lineares Nukleinsäuremolekül. Im Allgemeinen weisen Oligonukleotide 10 bis 100 Basen auf. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind bevorzugt 10 bis 80, besonders bevorzugt 10 bis 60, noch stärker bevorzugt 10 bis 30 und am meisten bevorzugt 20 bis 30 Nukleotide lang. Wie bei Nukleinsäuren unterscheidet man auch hier zwischen Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden, zu den Oligoribonukleotiden zählt man jedoch auch Verbindungen, bei denen der Wasserstoff der Hydroxygruppe durch organische Reste, beispielsweise eine Allylgruppe, ersetzt ist. Solche Verbindungen sind dem Fachmann seit längerem bekannt. Weiterhin können durch den Begriff "Oligonukleotid" beispielsweise auch Moleküle umfaßt sein, bei denen das Zuckerphosphatrückgrat durch ein Peptidrückgrat ersetzt ist. Diese Gruppe von Verbindungen wird PNA genannt. Allen Oligonukleotiden ist gemeinsam, dass sie am Rückgrat Basen aufweisen, welche zu Wasserstoffbrückenbindungen mit hierzu komplementären Basen in der Lage sind. Zu den Basen gehören die natürlichen Basen A, G, C, T und U, jedoch auch künstliche Basen, wie etwa Deaza-G.An oligonucleotide is a single-stranded linear nucleic acid molecule. in the Generally, oligonucleotides have 10 to 100 bases. The Oligonucleotides according to the invention are preferably 10 to 80, especially preferably 10 to 60, more preferably 10 to 30 and most preferably 20 to 30 nucleotides long. As with nucleic acids different here too between oligodeoxyribonucleotides and Oligoribonukleotiden, to the oligoribonucleotides but also counts Compounds in which the hydrogen of the hydroxy group by organic radicals, for example an allyl group, is replaced. Such Compounds have long been known to the skilled person. Furthermore you can by the term "oligonucleotide", for example, also includes molecules where the sugar phosphate backbone is through a peptide backbone is replaced. This group of compounds is called PNA. all Oligonucleotides have in common that they have bases on the backbone, which to hydrogen bonds with complementary bases are able to. The bases include the natural bases A, G, C, T and U, but also artificial bases, such as Deaza-G.

Ein Oligonukleotidprimer ist ein Oligonukleotid, welches mit einer zweiten, ebenfalls einsträngigen Nukleinsäure hybridisieren kann und anschließend durch eine DNA-Polymerase entlang der als Matrize dienenden zweiten Nukleinsäure mit Nukleosidtriphosphaten ergänzt werden kann, sodass eine doppelsträngige Nukleinsäure entsteht. Normalerweise besitzt der Primer daher an seinem 3'-Ende, d. h. an dem Ende, an dem Nukleotidbausteine angesetzt werden, am 3'-C-Atom des Zuckers eine Hydroxylgruppe.An oligonucleotide primer is an oligonucleotide which has a second, can also hybridize single-stranded nucleic acid and then by a DNA polymerase along the second template Nucleic acid can be supplemented with nucleoside triphosphates, so that a double-stranded nucleic acid is formed. Usually has the primer therefore at its 3 'end, d. H. at the end, at the nucleotide building blocks be set at the 3'-C-atom of the sugar, a hydroxyl group.

Eine Oligonukleotidkombination umfaßt mehrere Oligonukleotide, bevorzugt umfaßt sie ein Primerpaar oder eine Kombination aus Primern und Sonden, wie etwa ein Primerpaar und eine Sonde. Ein Primerpaar besteht aus zwei Oligonukleotidprimern, welche die Amplifikation eines bestimmten Abschnittes einer Nukleinsäure erlauben. Bevorzugt hybridisieren die beiden Primer des Primerpaares mit unterschiedlichen Strängen der Ursprungsnukleinsäure dergestalt, dass die jeweiligen Verlängerungsprodukte einander überlappen. Dies führt dann dazu, dass jeder der Primer mit dem Verlängerungsprodukt des jeweils anderen Primers hybridisieren kann und ein Abschnitt, der zwischen den beiden Primern liegt, als Amplifikationsprodukt vervielfacht wird. Sogenannte Sonden sind ebenfalls einsträngige Oligonukleotide, die zwar auch als Primer fungieren können, aber hauptsächlich dafür vorgesehen sind, mit bereits amplifizierten Nukleinsäureabschnitten spezifisch zu hybridisieren, um somit einen Nukleinsäurenachweis zu ermöglichen. Die Bezeichnung "Oligonukleotid" umfasst somit die Begriffe Primer und Sonde, die sich lediglich ihrer Funktion nach unterscheiden. Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Oligonukleotide können auch Markierungsgruppen enthalten, wie etwa radioaktive Marker oder Fluoreszenzmarker. Insbesondere sind es die Sonden, die Markierungen aufweisen.An oligonucleotide combination comprises several oligonucleotides, preferably it comprises a primer pair or a combination of primers and probes, such as a primer pair and a probe. A primer pair consists of two Oligonucleotide primers that amplify a particular Allow section of a nucleic acid. Preferably, the two hybridize Primer of the primer pair with different strands of the Source nucleic acid such that the respective Extension products overlap each other. This then causes that each of the primers with the extension product of the other primer can hybridize and a section that lies between the two primers, multiplied as amplification product. So-called probes are also single-stranded oligonucleotides, which also act as primers can, but are mainly intended, already amplified with Nucleic acid sections specifically to hybridize, thus a Nucleic acid detection to allow. The term "oligonucleotide" thus includes the terms primer and probe, which only their Function differ according to. The process according to the invention used oligonucleotides may also contain labeling groups, such as radioactive markers or fluorescent markers. In particular, they are the probes that have markers.

Unter Amplifikation wird die Vervielfältigung von Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten verstanden. Ein bekanntes Amplifikationsverfahren ist die eingangs erwähnte PCR. Bei diesem Verfahren wird zunächst ein normalerweise doppelsträngiges DNA-Molekül denaturiert, d. h. in seine Einzelstränge aufgespalten. Dann werden die Amplifikationsprimer unter Bedingungen hinzugegeben, die eine Hybridisierung der Primer mit der Ziel- DNA-Sequenz erlauben. Mit Hilfe eines Polymeraseenzyms sowie Nukleotidbausteinen werden dann die Primer entlang der Nukleinsäurematrize ergänzt. Anschließend werden die neugebildeten doppelsträngigen Nukleinsäuren wieder denaturiert und es beginnt ein neuer Polymerasezyklus. Herkömmliche PCR-Verfahren verwenden typischerweise zwischen 25 und 40 Zyklen. Eine Amplifikation im Sinne der Erfindung kann also auch nötige Vorbereitungsschritte zur Nukleinsäureamplifikation miteinschließen, wie z. B. das Denaturieren der doppelsträngigen DNA.Amplification is the amplification of nucleic acids or Nucleic acid sections understood. A known amplification method is the initially mentioned PCR. This procedure is first usually denatured double-stranded DNA molecule, d. H. in his Single strands split. Then the amplification primers are submerged Conditions were added which allow hybridization of the primers with the target Allow DNA sequence. With the help of a polymerase enzyme as well Nucleotide building blocks will then be the primers along the Nucleic acid template supplemented. Subsequently, the newly formed denatured double-stranded nucleic acids again and it starts a new one Polymerase cycle. Conventional PCR methods typically use between 25 and 40 cycles. An amplification according to the invention can So also necessary preparation steps for nucleic acid amplification include such. B. denaturing the double-stranded DNA.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeuted hierin die Vereinigung zweier komplentärer Nukleinsäureeinzelstränge zu einem Doppelstrang. Dazu müssen die Einzelstränge nicht 100% komplementär sein, sondern können Abweichungen in der Basenfolge aufweisen. Um eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Hybridisierung zu erreichen, müssen die Einzelstränge, in diesem Fall die Oligonukleotide, unter den herrschenden Hybridisierungsbedingungen jedoch hinreichend spezifisch sein.The term "hybridization" herein means the union of two complementary nucleic acid single strands to a double strand. To the single strands need not be 100% complementary but can Have deviations in the base sequence. One for the inventive method to achieve suitable hybridization must the single strands, in this case the oligonucleotides, are among the prevailing ones Hybridization conditions, however, be sufficiently specific.

Um die eingangs genannten Vorteile des hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens zu gewährleisten, müssen die verwendeten Oligonukleotide zumindest zwei Bedingungen erfüllen. Sie müssen einerseits spezifisch genug sein, um ausschließlich mit Nukleinsäuren zu hybridisieren, die von HI-Viren stammen. Andererseits variieren gerade diese Viren in einigen Genomregionen sehr stark, d. h. dass relativ große Unterschiede in der Basensequenz vorliegen. Aufgrund dieser Unterschiede unterscheidet man einerseits zwischen HIV-1 und HIV-2 als auch zwischen sogenannten Subtypen, die relativ eng verwandte Stämme desselben Virus darstellen. Bezogen auf die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung bedeutet dies, dass diese außerdem in der Lage sein müssen, nicht nur ein bestimmtes Virus oder einen bestimmten Subtyp zu erkennen, sondern sie müssen eine Basensequenz aufweisen, die eine Hybridisierung mit möglichst vielen oder sogar allen bekannten Subtypen von HIV-1 oder von HIV-2 oder sogar von beiden erlaubt.To the above-mentioned advantages of the described here To ensure the inventive method, the used Oligonucleotides meet at least two conditions. You have to on the one hand be specific enough to hybridize exclusively with nucleic acids, that come from HI viruses. On the other hand, just these viruses vary in very strong in some genome regions, d. H. that relatively big differences in the base sequence are present. Because of these differences is different on the one hand between HIV-1 and HIV-2 and between so-called Subtypes that are relatively closely related strains of the same virus. With respect to the oligonucleotides of the present invention, this means that they also need to be capable, not just a specific one To recognize virus or a specific subtype, but they must have one Have base sequence that hybridizes with as many as possible or even all known subtypes of HIV-1 or HIV-2 or even of both allowed.

Zu diesem Zweck wählt man normalerweise die Oligonukleotide aus relativ konservierten Regionen des Genoms der nachzuweisenden Viren aus und verwendet dann die jeweilige Komplementärsequenz. Aus dem Stand der Technik sind bereits einige hochkonservierte Regionen bekannt (siehe oben). Konservierte Regionen sind Nukleinsäureabschnitte auf dem Genom von HIV, die im Vergleich zum Rest des Genoms nur sehr geringe Unterschiede in der Basensequenz aufweisen. In diesem Zusammenhang spricht man auch von Basenidentität, die in Prozent ausgedrückt wird, oder von Homologie.For this purpose one normally selects the oligonucleotides from relative conserved regions of the genome of the virus to be detected, and then uses the respective complementary sequence. From the state of Technique are already some highly conserved regions known (see above). Preserved regions are nucleic acid segments on the genome of HIV, which is very small compared to the rest of the genome in the base sequence. In this context one speaks also of base identity, expressed as a percentage, or of Homology.

Überraschenderweise wurden nun in der vorliegenden Erfindung Oligonukleotide gefunden, die sowohl einen subtypübergreifenden Nachweis als auch einen speziesübergreifenden Nachweis von HIV ermöglichen. Diese Oligonukleotide hybridisieren mit neu entdeckten hochkonservierten Regionen von HIV. Diese befinden sich in der LTR-Region, dem gag- und dem pol-Gen. Diese Regionen sind relativ klein, sie erlauben mit einer durchschnittlichen Länge von 50 bis 100 Nukleotiden jedoch die Hybridisierung mit einem oder mehreren Oligonukleotiden. Die Festlegung der Regionen des HIV-Genoms basiert hierin, wie auch in den meisten zitierten Dokumenten des Stands der Technik, auf der Nummerierung des HIV-1-Isolats HXB2, wie veröffentlicht in: Wong-Staal et al., Nature 313, 277-284 (1985). Die Sequenzen dieser neuen hochkonservierten Bereiche sind jeweils in den SEQ ID NO. 1 bis 13 angegeben, deren Sequenzen sich auf die Sequenz von HIV-1 HXB2, Zugangsnummer K03455 der HIV Sequence Data Base (http://HIV-web.lanl.gov./) beziehen. Die Lage der hochkonservierten Sequenzen ist wie folgt:
SEQ ID NO. 1: LTR-Region, Position 504-565, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 2: gag-Gen, Position 761-822, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 3: gag-Gen, Position 1786-1847, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 4: pol-Region, Position 2307-2360, Länge 54 Nukleotide
SEQ ID NO. 5: pol-Gen, Position 2376-2434, Länge 59 Nukleotide
SEQ ID NO. 6: pol-Gen, Position 2568-2632, Länge 65 Nukleotide
SEQ ID NO. 7: pol-Gen, Position 3093-3145, Länge 53 Nukleotide
SEQ ID NO. 8: pol-Gen, Position 4131-4207, Länge 77 Nukleotide
SEQ ID NO. 9: pol-Gen, Position 4333-4399, Länge 67 Nukleotide
SEQ ID NO. 10: pol-Gen, Position 4638-4696, Länge 59 Nukleotide
SEQ ID NO. 11: pol-Gen, Position 4884-4984, Länge 101 Nukleotide
SEQ ID NO. 12: pol-Gen, Position 5034-5095, Länge 62 Nukleotide
SEQ ID NO. 13: pol-Gen, Position 4410-4506, Länge 97 Nukleotide. Surprisingly, oligonucleotides have now been found in the present invention, which allow both a subtype-spanning detection as well as a cross-species detection of HIV. These oligonucleotides hybridize to newly discovered highly conserved regions of HIV. These are located in the LTR region, the gag and the pol gene. These regions are relatively small, but with an average length of 50 to 100 nucleotides allow hybridization with one or more oligonucleotides. The definition of the regions of the HIV genome is based herein, as in most cited prior art documents, on the numbering of HIV-1 isolate HXB2 as published in: Wong-Staal et al., Nature 313, 277- 284 (1985). The sequences of these new highly conserved regions are shown in SEQ ID NO. 1-13, the sequences of which relate to the sequence of HIV-1 HXB2, accession number K03455 of the HIV Sequence Data Base (http://HIV-web.lanl.gov./). The location of the highly conserved sequences is as follows:
SEQ ID NO. 1: LTR region, position 504-565, length 62 nucleotides
SEQ ID NO. 2: gag gene, position 761-822, length 62 nucleotides
SEQ ID NO. 3: gag gene, position 1786-1847, length 62 nucleotides
SEQ ID NO. 4: pol region, position 2307-2360, length 54 nucleotides
SEQ ID NO. 5: pol gene, position 2376-2434, length 59 nucleotides
SEQ ID NO. 6: pol gene, position 2568-2632, length 65 nucleotides
SEQ ID NO. 7: pol gene, position 3093-3145, length 53 nucleotides
SEQ ID NO. 8: pol gene, position 4131-4207, length 77 nucleotides
SEQ ID NO. 9: pol gene, position 4333-4399, length 67 nucleotides
SEQ ID NO. 10: pol gene, position 4638-4696, length 59 nucleotides
SEQ ID NO. 11: pol gene, position 4884-4984, length 101 nucleotides
SEQ ID NO. 12: pol gene, position 5034-5095, length 62 nucleotides
SEQ ID NO. 13: pol gene, position 4410-4506, length 97 nucleotides.

Die erfindungsgemäß geeigneten Oligonukleotide weisen bevorzugt Basensequenzen auf, die innerhalb der oben genannten hochkonservierten Regionen oder deren Komplementärsequenzen liegen.The oligonucleotides suitable according to the invention are preferred Base sequences that are highly conserved within the above Regions or their complementary sequences.

Der Begriff "überlappen" soll hierin so verstanden werden, daß die erfindungsgemäßen Oligonukleotide jeweils mit mindestens 10 aufeinander folgenden Basen aus einer der hochkonservierten Regionen überlappen.The term "overlap" is to be understood herein to mean that the Oligonucleotides of the invention each with at least 10 consecutive overlap following bases from one of the highly conserved regions.

Bevorzugt überlappen die Oligonukleotide mit jeweils einer der Regionen mit den SEQ ID NO: 4, 5, 9, 10 und 13, bevorzugt 4, 5, 9 und 10. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform überlappen die Oligonukleotide mit jeweils einer der Regionen mit den SEQ ID NO: 6, 8, 10, 11 und 13.Preferably, the oligonucleotides overlap each with one of the regions SEQ ID NO: 4, 5, 9, 10 and 13, preferably 4, 5, 9 and 10. In a In another preferred embodiment, the oligonucleotides overlap in each case one of the regions with the SEQ ID NO: 6, 8, 10, 11 and 13.

Obwohl die hochkonservierten Regionen in Bezug auf ein einziges HIV-1- Virusisolat angegeben sind, weist natürlich der Begriff "hochkonservierte Region" über eine einzige spezifische Sequenz hinaus und umfasst somit alle entsprechenden Regionen von verschiedenen HIV-Stämmen oder -Isolaten, die mit HIV-1 oder mit HIV-2 verwandt sind. Erfindungsgemäß geeignete Oligonukleotidsequenzen können auch eine Basensequenz aufweisen, die eine Konsensussequenz aus hochkonservierten Regionen von mehreren HI- Virusisolaten oder -stämmen darstellt. D. h. dass beispielsweise eine Basenabfolge von mehreren Basen einem HI-Virusisolat entspricht und eine weitere Basenabfolge im selben Oligonukleotid einem anderen HI-Virusisolat entspricht. Das Oligonukleotid enthält dann heterologe Basenfolgen. Bevorzugt umfassen die Oligonukleotide jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus einer der zuvor genannten Regionen. Stärker bevorzugt enthalten sie 15 bis 30 solcher Nukleotide.Although the highly conserved regions have a single HIV-1 Of course, the term "highly conserved Region "beyond a single specific sequence and thus includes all corresponding regions of different HIV strains or isolates, that are related to HIV-1 or HIV-2. According to the invention suitable Oligonucleotide sequences may also have a base sequence which a consensus sequence of highly conserved regions of several HI Represents virus isolates or strains. Ie. that for example a Base sequence of several bases corresponds to a HI virus isolate and a more base sequence in the same oligonucleotide another HI virus isolate equivalent. The oligonucleotide then contains heterologous base sequences. Preferably, the oligonucleotides each comprise at least 10 successive nucleotides from one of the aforementioned regions. More preferably, they contain from 15 to 30 such nucleotides.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst mindestens die folgenden Schritte:
The method according to the invention comprises at least the following steps:

a) contacting a sample with the oligonucleotide (s) under Conditions in which hybridization of the / Oligonucleotides (s) with HIV nucleic acids present in the sample, selected from HIV-1 or / and HIV-2, takes place,
b) determining the presence or / and amount of HIV Nucleic acids in the sample.

In Schritt (b) wird bevorzugt ein Amplifikationsschritt durchgeführt.In step (b), an amplification step is preferably carried out.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird der subtyp- oder/und speziesübergreifende Nachweis von HI- Virusnukleinsäuren dadurch ermöglicht, dass mindestens zwei erfindungsgemäße Oligonukleotide verwendet werden. Bevorzugt werden diese Oligonukleotide als Amplifikationsprimer eingesetzt dergestalt, dass sie beispielsweise jeweils nahe an einem Ende einer der hochkonservierten Regionen hybridisieren und somit bei der Amplifikation (bevorzugt PCR) ein Amplifikationsprodukt erzeugen, welches einem Abschnitt der betreffenden hochkonservierten Region entspricht. Der Nachweis dieses Amplifikationsproduktes und somit der HIV-spezifischen Nukleinsäure kann dann mit Hilfe einer Sonde erfolgen, die entweder eines der als Primer verwendeten Oligonukleotide ist oder ein zusätzliches Oligonukleotid, welches innerhalb der amplifizierten Sequenz hybridisiert. Der Vorteil dieser bevorzugten Ausführungsform ist, dass ein einziges Oligonukleotid oder Primerpaar ausreicht, um subtyp- oder/und speziesübergreifend HI-Viren nachzuweisen.In a preferred embodiment of the method according to the invention the subtype or / and cross-species detection of HI Virus nucleic acids thereby allowing at least two Oligonucleotides according to the invention can be used. To be favoured these oligonucleotides used as amplification primers such that for example, each near one end of one of the highly conserved Regions hybridize and thus in the amplification (preferably PCR) Produce amplification product, which a section of the relevant highly conserved region. The proof of this Amplification product and thus the HIV-specific nucleic acid can Then use a probe that is either one of the primers used oligonucleotide or an additional oligonucleotide, which hybridizes within the amplified sequence. The advantage of this preferred embodiment is that a single oligonucleotide or Primer pair is sufficient to subtype and / or cross-species HI viruses demonstrated.

Statt der Verwendung einer Sonde zum Nachweis des Amplifikationsprodukts können auch beispielsweise DNA-bindende Reagenzien, wie etwa ein DNA-bindender Farbstoff (z. B. Sybergreen) bei der Detektion verwendet werden (WO 97/46707).Instead of using a probe to prove the Amplification product may also be, for example, DNA-binding Reagents such as a DNA-binding dye (e.g., Sybergreen) in the Detection can be used (WO 97/46707).

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden Oligonukleotidkombinationen oder Primerpaare verwendet, von denen jeweils nur ein Oligonukleotidprimer innerhalb einer der konservierten Regionen liegt, während der andere Primer außerhalb liegt, so daß das so erzeugte Amplifikationsprodukt nur teilweise aus einer Basensequenz aus einer der hochkonservierten Regionen besteht. Der letztere Primer ist bevorzugt subtypspezifisch und/oder speziesspezifisch, so daß mit einer derartigen Kombination Subtypen oder die Spezies gezielt nachgewiesen werden können.According to a further preferred embodiment of the method of Invention uses oligonucleotide combinations or primer pairs, only one oligonucleotide primer within each of these conserved regions, while the other primer lies outside, so that the amplification product thus produced only partially from a Base sequence consists of one of the highly conserved regions. The the latter primer is preferably subtype-specific and / or species-specific, so that with such a combination subtypes or the species targeted can be detected.

In diesem Fall werden bevorzugt zwei oder mehr Primerpaare als Oligonukleotidkombination verwendet, wobei mindestens zwei Oligonukleotide jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus einer Sequenz (i), (ii), (iii) oder dazu komplementären Sequenzen, wie oben beschrieben, enthalten. Die Gesamtheit der Primerkombinationen erlaubt somit einen subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren.In this case, preferably two or more primer pairs than Used oligonucleotide combination, wherein at least two Each oligonucleotide comprises at least 10 consecutive nucleotides a sequence (i), (ii), (iii) or sequences complementary thereto, as above described, included. The totality of the primer combinations allowed thus a subtyp- or / and species-spanning detection of HI viruses.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Oligonukleotidkombindation mindestens zwei, bevorzugt drei Oligonukleotide (z. B. ein Primerpaar oder ein Primerpaar plus Sonde), die jeweils mindestens 10 Nukleotide aus
In a further preferred embodiment, an oligonucleotide combination suitable for the method according to the invention comprises at least two, preferably three oligonucleotides (eg a primer pair or a primer pair plus probe), each of which has at least 10 nucleotides

a) the same highly conserved region, the gag gene or the pol gene of HIV, represented by one of SEQ ID NO: 1 to 13 specified sequences,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
(c) a corresponding region of one of several HI Virus isolate-derived consensus sequence,

oder dazu komplementären Sequenzen enthalten.or contain complementary sequences.

Bevorzugt werden das mindestens eine und bevorzugt die mindestens zwei Oligonukleotid(e) so ausgewählt, dass sie einen subtypübergreifenden Nachweis von HIV-1 ermöglichen, d. h. dass Nukleinsäuren von mindestens 7 der Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von HIV-1, bevorzugt von allen Subtypen erkannt werden. The at least one and preferably the at least two are preferred Oligonucleotide (s) selected so that they are a subtype-spanning Enable detection of HIV-1, d. H. that nucleic acids of at least 7 of the subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O of HIV-1, preferably of all Subtypes are detected.

Bevorzugt werden für den subtypübergreifenden Nachweis mindestens ein und bevorzugt mindestens zwei Oligonukleotid(e) verwendet, die jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
At least one and preferably at least two oligonucleotide (s), each of which has at least 10 consecutive nucleotides, are preferably used for the subtype-spanning detection

a) a highly conserved region of the LTR, gag gene or polynomial Gene of HIV, represented by one of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12 and 13 indicated sequences,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
(c) a corresponding region of one of several HI Virus isolate-derived consensus sequence,

Bevorzugt werden zum subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HIV-1 und HIV-2 mindestens ein und bevorzugt mindestens zwei Oligonukleotid(e) verwendet, die jeweils mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
Preferably, at least one and preferably at least two oligonucleotide (s) each comprising at least 10 consecutive nucleotides are used for the detection of HIV-1 and HIV-2 by subtype and / or species

a) a highly conserved region of the LTR, gag gene or pol gene of HIV, represented by one of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 and 13 specified sequences,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of one of several HIV isolates derived consensus sequence, or complementary thereto Contain sequences.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass ganz bestimmte Oligo nukleotide besonders für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind. Diese Oligonukleotide sind in den in SEQ ID NO: 14 bis 25 angegebenen Sequenzen dargestellt. Wie bereits eingangs erwähnt, können diese Oligo nukleotide aus natürlichen oder synthetischen Nukleinsäurebausteinen bestehen, oder sogar aus der bereits genannten PNA. Bevorzugt trägt mindestens eines der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Oligonukleotide eine oder mehrere Markierungen. Als Markierungen eignen sich Fluoreszenzmarker oder radioaktive Marker, wie z. B. [³²P]-markierte Nukleotide.It has surprisingly been found that very specific oligonucleotides are particularly suitable for the process according to the invention. These oligonucleotides are shown in the sequences shown in SEQ ID NO: 14 to 25. As already mentioned, these oligo nucleotides can consist of natural or synthetic nucleic acid components, or even from the already mentioned PNA. Preferably, at least one of the oligonucleotides used in the method according to the invention carries one or more labels. As markers are fluorescent marker or radioactive marker, such. B. [ ³² P] -labeled nucleotides.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid, welches mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide aus
Another object of the invention is an oligonucleotide which comprises at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the HIV pol gene by any of those given in SEQ ID NO: 4, 5, 9 or 10 sequences
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of one of several HIV isolates derived consensus sequence, or complementary thereto Sequences, or one of those shown in SEQ ID NO: 14 to 25 Contains sequences.

Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Oligonukleotid eines der in den SEQ ID NO. 14 bis 25 dargestellten Oligonukleotide. Die Länge des erfindungsgemäßen Oligonukleotids beträgt bevorzugt 10 bis 80 Nukleotide. Besonders bevorzugt umfasst es ungefähr 20 bis 30 Basen und weist einen GC-Gehalt von zwischen 40 und 60% auf. Außerdem ist es vorteilhaft, wenn die Oligonukleotide keine Selbstkomplementarität am 3'-Ende aufweisen und darüber hinaus keinen CG-Run am 3'-Ende besitzen. Ein GC- Run ist eine Basenabfolge, die vorwiegend oder ausschließlich aus den Basen C und G besteht. Weiterhin sollten die Oligonukleotide keine Palindrome beinhalten. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide weisen bevorzugt maximal 2 Mismatches zu den entsprechenden mit ihnen hybridisierenden Sequenzen der gleichen Positionen aller Subtypen auf. Bevorzugt weist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid an seinem 3'-Ende keine Mismatches mit Nukleotidsäuren der Subtypen A, B, C, D, E, F, G, H und O von HIV-1 und/oder der Subtypen A, B, C und D von HIV-2 auf.Preferably, the oligonucleotide of the invention is one of the SEQ ID NO. 14 to 25 shown oligonucleotides. The length of the oligonucleotide according to the invention is preferably 10 to 80 nucleotides. More preferably, it comprises about 20 to 30 bases and has one GC content of between 40 and 60%. It is also beneficial if the oligonucleotides do not self-complement at the 3'-end and also have no CG run at the 3 'end. A GC Run is a sequence of bases that consists mainly or exclusively of the Bases C and G exists. Furthermore, the oligonucleotides should not Include palindromes. The oligonucleotides according to the invention have prefers a maximum of 2 mismatches to the corresponding ones with them hybridizing sequences of the same positions of all subtypes. An oligonucleotide according to the invention preferably has at its 3 'end no mismatches with nucleotidic acids of subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O of HIV-1 and / or subtypes A, B, C and D of HIV-2.

Bei Primerpaaren werden die Primer jeweils so gewählt, dass die 5'-Enden der Primer maximal 80 Basen voneinander entfernt positioniert sind, bezogen auf die Regionen, in denen die Primer auf der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisieren. Besonders bevorzugte Primerpaare sind solche, bei denen innerhalb dieses von den Primern amplifizierbaren Bereiches eine weitere HIV-spezifische Sequenz liegt. Diese Sequenz kann dann bevorzugt verwendet werden, um mit Hilfe einer für sie spezifischen Sonde die Amplifikationsprodukte nachzuweisen. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind bevorzugt mit mindestens einer der oben genannten Markierungsgruppen versehen.For primer pairs, the primers are each chosen so that the 5 'ends the primers are positioned a maximum of 80 bases apart, relative to the regions in which the primers are to be detected Hybridize nucleic acid. Particularly preferred primer pairs are those in which within this range amplifiable by the primers a another HIV-specific sequence is located. This sequence may then be preferred used to probe with the help of a specific probe for them Demonstrate amplification products. The invention Oligonucleotides are preferred with at least one of the above Marking groups provided.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Kombination von zwei oder mehr Oligonukleotiden, welche beide die oben genannten erfindungsgemäßen Eigenschaften aufweisen und die in ihrer Gesamtheit für den subtyp-und/oder speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren geeignet sind.Another aspect of the present invention is thus also a Combination of two or more oligonucleotides, both of which are the above have mentioned properties of the invention and in their Entity for sub-species and / or cross-species detection of HI viruses are suitable.

Weiterhin umfaßt die Erfindung Kombinationen von Oligonukleotiden. Bevorzugt sind Kombinationen aus mindestens zwei Oligonukleotiden, die jeweils mindestens 10 aufeinander folgende Nukleotide aus
Furthermore, the invention comprises combinations of oligonucleotides. Preferably, combinations of at least two oligonucleotides are each at least 10 consecutive nucleotides

(a) the same highly preserved region of the LTR region, the gag Gene or the pol gene of HIV, represented by one of the in SEQ ID NO: 1 to 13 specified sequences,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
(c) a corresponding region of one of several HI Virus isolate-derived consensus sequence,

Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination von mehreren Oligonukleotiden, wobei mindestens zwei erfindungsgemäße Oligonukleotide vorliegen, sowie weitere Oligonukleotide, welche jeweils eine für einen einzigen Subtyp von HIV-1 oder/und HIV-2 spezifische Sequenz enthalten, wobei die Gesamtheit der Oligonukleotide in der Oligonukleotidkombination einen subtyp- oder/und speziesübergreifenden Nachweis von HI-Viren erlaubt.Yet another aspect of the present invention is a combination of several oligonucleotides, wherein at least two of the invention Oligonucleotides are present, as well as other oligonucleotides, which in each case one specific to a single subtype of HIV-1 or / and HIV-2 Sequence containing the entirety of the oligonucleotides in the Oligonucleotide combination a subtyp- and / or cross-species Detection of HIV viruses allowed.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagenzienkits, der mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder eine erfindungsgemäße Oligonukleotidkombination als Primer oder als Sonden zum Nachweis von HI-Viren oder deren Nukleinsäuren, sowie zur Durchführung einer Hybridisierung und Amplifikation von Nukleinsäuren in einer Probe geeignete Mittel umfasst.Another object of the present invention is to provide a Reagent kits, the at least one inventive oligonucleotide or an oligonucleotide combination according to the invention as a primer or as Probes for the detection of HI viruses or their nucleic acids, as well as for Carrying out a hybridization and amplification of nucleic acids in a sample suitable means.

Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligonukleotidkombinationen als Primer oder/und Sonden zum Nachweis von HI-Viren, insbesondere zum subtyp- und/oder speziesübergreifenden Nachweis.Moreover, the invention relates to the use of oligonucleotides or Oligonucleotide combinations as primers or / and probes for the detection of HI viruses, in particular for subtypes and / or cross-species Proof.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung in veranschaulichender, aber keinesfalls erschöpfender Weise erläutern.The following examples are intended to illustrate the present invention illustrative, but by no means exhaustive.

Examples example 1 Sensitivity, specificity and dynamic range based on HIV Plasma dilution series

Zur Untersuchung von Blutproben wurde RNA aus HIV-positivem Plasma mit einer Ausgangskonzentration von 15.000 Genomäquivalenten (geq) HIV pro ml isoliert. Dieses Plasma wurde sukzessive um den Faktor 10 in negativem Plasma verdünnt und nach Probenvorbereitung jeweils in Doppelbestimmungen mit den entsprechenden Primerpaaren amplifiziert. Als Kontrollen dienten ein HIV-negatives Plasma und Wasser. Zur Bestimmung der Spezifität wurde zusätzlich ein HBV- und ein HCV-positives Plasma mitprozessiert. Nach Amplifikation wurden alle Proben gemessen (ECL- Detektion, Elecsys® 1010). RNA from HIV-positive plasma was used to examine blood samples a starting concentration of 15,000 genome equivalents (qq) of HIV per ml isolated. This plasma was successively by a factor of 10 in negative Plasma diluted and after sample preparation in each case in Double determinations amplified with the corresponding primer pairs. When Controls were HIV-negative plasma and water. For determination the specificity was additionally an HBV and a HCV positive plasma mitprozessiert. After amplification, all samples were measured (ECL Detection, Elecsys® 1010).

1. Sample preparation

Zunächst wurden 420 µl Plasma mit 80 µl Proteinase K (25 mg/ml) gemischt und einige Sekunden gevortext. Dann wurden 500 µl Lysepuffer (5,4 M Guanidinium-Thiocyanat, 10 mM Harnstoff, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X100, pH 4,4) hinzugegeben, der 1 µg Carrier-RNA (PolyA/ml) enthielt. Die Mischung wurde gevortext und anschließend für 10 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurden 500 µl Isopropanol-MGP hinzugegeben (6 mg magnetische Glaspartikel in Isopropanol). Das Gemisch wurde wieder gevortext und anschließend für 20 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die MGPs wurden mittels Magnetseparation von der Lösung getrennt. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. 750 µl Waschpuffer (20 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 70% Ethanol) wurden hinzugegeben, die MGPs wurden durch Vortexen resuspendiert, und es wurde eine erneute Magnetseparation durchgeführt. Der Waschvorgang wurde insgesamt 5 × wiederholt, und schließlich wurden 100 µl DEMC-Wasser zur Elution hinzugegeben. Es wurde 15 Minuten bei 80°C geschüttelt und dann eine weitere Magnetseparation durchgeführt. 10 µl des Eluats wurden für eine RT-PCR eingesetzt.First, 420 μl of plasma were mixed with 80 μl proteinase K (25 mg / ml) and vortexed for a few seconds. Then, 500 μl lysis buffer (5.4 M Guanidinium thiocyanate, 10mM urea, 10mM Tris-HCl, 20% Triton X100, pH 4.4) containing 1 μg of carrier RNA (polyA / ml). The Mix was vortexed and then at 10 minutes Room temperature shaken. Then, 500 μl of isopropanol-MGP added (6 mg magnetic glass particles in isopropanol). The mixture was vortexed again and then for 20 minutes at Room temperature shaken. The MGPs were made by magnetic separation separated from the solution. The supernatant was removed and discarded. 750 μl wash buffer (20 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 70% Ethanol) were added and the MGPs were vortexed resuspended, and another magnetic separation was performed. The washing was repeated a total of 5 times, and finally Add 100 μl of DEMC water for elution. It was 15 minutes at Shaken 80 ° C and then carried out a further magnetic separation. 10 μl of the eluate were used for RT-PCR.

2. Primers and probes used

In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die verwendeten Primer und Sonden dargestellt sowie deren zugehörige hochkonservierte Region, Position im Genom und das mit Primerpaaren hergestellte Amplifikationsprodukt. In Table 1 below are the primers and probes used represented as well as their associated highly conserved region, position in the Genome and the amplification product prepared with primer pairs.

Tabelle 1 Table 1

3. Amplification mix and thermocycler protocol for RT-PCR Mastermix

Reagenzienreagents Endkonzentration im MastermixFinal concentration in the master mix 5 × Bicin-Puffer5 × bicine buffer 1 ×1 × MnOAcMnOAc 2,5 mM2.5mM dNTPs (einschließlich dUTP)dNTPs (including dUTP) 200 µM/600 µM200 μM / 600 μM Vorwärtsprimerforward primer 0,3 µM0.3 μM Rückwärtsprimer (biotinyliert)Reverse primer (biotinylated) 0,3 µM0.3 μM Tth-PolymeraseTth polymerase 10 Einheiten10 units UNGUNG 2 Einheiten2 units Gesamtvolumen:total volume: 100 µl100 μl

Cycler:Cycler: 10 Minuten, 37°C: UNG-Dekontaminierung10 minutes, 37 ° C: UNG decontamination 30 Minuten, 60°C, Reverse Transkription30 minutes, 60 ° C, reverse transcription 30 Sekunden, 95°C: Denaturierung@30 seconds, 95 ° C: denaturation @ 5 Zyklen5 cycles 15 Sekunden, 95°C: Denaturierung15 seconds, 95 ° C: denaturation 20 Sekunden, 50°C: Hybridisieren/Elongation@20 seconds, 50 ° C: Hybridize / Elongation @ 30 Zyklen30 cycles 15 Sekunden, 94°C: Denaturierung15 seconds, 94 ° C: denaturation 20 Sekunden, 60°C: Hybridisierung/Elongation@20 seconds, 60 ° C: hybridization / elongation @ 7 Minuten, 72°C: endgültige Elongation@7 minutes, 72 ° C: final elongation @ Halten bei 50°CHold at 50 ° C

4. Detection

Die gesamte Detektionsreaktion erfolgte voll automatisiert mit Hilfe eines Elecsys® 1010-Analyse-Automaten.The entire detection reaction was fully automated with the help of a Elecsys® 1010 analysis machine.

Zunächst wurden 10 µl Amplifikat und 35 µl Denaturierungslösung (BM-ID- Nr. 1469053, Boehringer Mannheim) entnommen. In einem Reaktionsgefäß wurde für 5 Minuten bei 37°C inkubiert, und dann wurden 120 µl Hybridisierungslösung (BM-ID-Nr. 1469045, Boehringer Mannheim versetzt mit 25 ng/ml Ruthenium-markierter Sonde) hinzugegeben. Es wurde wiederum für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Dann wurden 35 µl einer Elecsys® SA Magnetbeadlösung hinzugegeben (BM-ID-Nr. 1719556, Boehringer Mannheim). Die Lösung wurde für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Elektrochemilumineszenz von 120 µl des Reaktionsgemisches wurde in der Elecsys® 1010-Messzelle gemessen. Zur Hybridisierung wurden die entsprechenden Ruthenium-markierten Sonden laut Tabelle 1 verwendet.First, 10 μl of amplificate and 35 μl of denaturing solution (BM-ID No. 1469053, Boehringer Mannheim). In a reaction vessel was incubated for 5 minutes at 37 ° C and then 120 μl Hybridization solution (BM-ID No. 1469045, Boehringer Mannheim offset with 25 ng / ml ruthenium-labeled probe). It was again incubated for 30 minutes at 37 ° C. Then 35 μl of a Elecsys® SA magnetic bead solution added (BM-ID 1719556, Boehringer Mannheim). The solution was left at 37 ° C for 10 minutes incubated. The electrochemiluminescence of 120 μl of the reaction mixture was measured in the Elecsys® 1010 measuring cell. For hybridization were the corresponding ruthenium-labeled probes according to Table 1 used.

5. Ergebnisse 5. Results

Ergebnis (ECL-counts × 100) Result (ECL-counts × 100)

Die Signale der neuen Primer zeigen gegenüber den Referenzen eine ähnliche Sensitivität. Es erfolgt eine sehr gute Signalabstufung innerhalb der Verdünnungsreihe.The signals of the new primers show a comparison with the references similar sensitivity. There is a very good signal grading within the Dilution series.

Der erhöhte Background bei den Primerpaaren SK und GH-A3 ist vermutlich auf ein nicht optimales Amplifikationsprotokoll zurückzuführen. The increased background of the primer pairs SK and GH-A3 is probably due to a non-optimal amplification protocol.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. A method for subtypes and / or cross-species detection of nucleic acids of HI viruses in a sample
Hybridization of the nucleic acids with an oligonucleotide combination comprising two or more oligonucleotides specifically hybridizing with HIV nucleic acids, each of which comprises at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the LTR region, the gag gene or the pol gene of HIV, represented by one of the sequences given in SEQ ID NO: 1 to 13,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of a consensus sequence derived from several HIV isolates,

or contain complementary sequences, and
Carrying out an amplification step.

2. The method according to claim 1, characterized in that it comprises the steps:

a) contacting a sample with the oligonucleotides under conditions in which hybridization of the oligonucleotides with HIV nucleic acids present in the sample takes place from HIV-1 or / and HIV-2,
b) determining the presence and / or amount of HIV nucleic acids in the sample.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that a single oligonucleotide combination is used.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized, that for amplification of HIV nucleic acids two or more Oligonucleotide combinations are used, each Oligonucleotide combination comprising a first oligonucleotide, the at least 10 consecutive nucleotides from a sequence according to claim 1 (i), (ii), (iii) or sequences complementary thereto and a second oligonucleotide containing a subtype and / or allows species-specific hybridization with HIV nucleic acids, the totality of the oligonucleotide combinations being a subtype and / or cross-species detection of HIV viruses.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that an oligonucleotide combination is used, wherein at least two oligonucleotides each have at least 10 consecutive nucleotides

a) the same highly conserved region of the LTR region, the gag gene or the pol gene of HIV, represented by one of the sequences given in SEQ ID NO: 1 to 13,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of a consensus sequence derived from several HIV isolates,

or contain complementary sequences.

6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that for sub-type detection the oligonucleotides so selected that at least 7 of the subtypes of HIV-1, selected from subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O. at least 2 of the subtypes of HIV-2 selected from the subtypes A, B, C and D are detected.

7. The method according to claim 6, characterized in that at least two oligonucleotides are used for the detection, each of at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the LTR, gag gene or pol gene of HIV, represented by one of the sequences given in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12 and 13 .
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of a consensus sequence derived from several HIV isolates,

or contain complementary sequences.

8. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized, that for cross-species detection, the oligonucleotides so selected that at least 7 of the subtypes of HIV-1, selected from the subtypes A, B, C, D, E, F, G, H and O, as well as additionally at least one of the subtypes of HIV-2 selected from Subtypes A, B, C and D are detected.

9. The method according to claim 8, characterized in that at least two oligonucleotides are used for the detection, each of at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the LTR, gag gene or pol gene of HIV, represented by one of the sequences given in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10 and 13,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of a consensus sequence derived from several HIV isolates,

or contain complementary sequences.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized, the oligonucleotides have the sequence shown in SEQ ID NO. 14 to 25 indicated Have or contain sequences.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized, in that at least one oligonucleotide has one or more labels having.

12. oligonucleotide, characterized in that it comprises at least 10 consecutive nucleotides

a) a highly conserved region of the pol gene of HIV, represented by one of the sequences given in SEQ ID NO: 4, 5, 9 or 10,
b) a corresponding region of another HIV virus isolate,
c) a corresponding region of a consensus sequence derived from several HIV isolates,

or sequences complementary thereto, or contains one of the sequences shown in SEQ ID NO: 14 to 25.

13. oligonucleotide according to claim 12, characterized, that it comprises 10 to 80 nucleotides.

14. Oligonucleotide according to one of claims 12 or 13, characterized, that at its 3 'end there are no mismatches with nucleic acids of the Subtypes A, B, C, D, E, F, G, H, and O of HIV-1 and the subtypes A, B, C and D of HIV-2.

15. Oligonucleotide according to one of claims 12 to 14, characterized, that it has one or more markings.

16. Combination of a plurality of oligonucleotides, comprising at least two oligonucleotides, characterized in that the at least two oligonucleotides each have at least 10 consecutive nucleotides

or contain complementary sequences.

17. A combination of a plurality of oligonucleotides, comprising at least two oligonucleotides selected from the oligonucleotides according to one of claims 12 to 15, and optionally further Oligonucleotides, each one for a single subtype of HIV-1 and / or HIV-2 specific sequence, wherein the Whole of oligonucleotides a subtyp and / or cross-species detection of HI viruses allowed.

18. Reagent kit comprising an oligonucleotide according to one of Claims 12 to 15 or an oligonucleotide combination according to Claim 16 or 17 as primers and / or probes for the detection of HI viruses or their nucleic acids, as well as to carry out a Hybridization and amplification of nucleic acids in a sample suitable means.

19. Use of Oligonucleotides or Oligonucleotide Combinations according to one of claims 12 to 17 as primer and / or probes for the subtypes and / or cross-species detection of HI viruses.