DE19838495A1 - Biotechnologisch hergestellte Speicheldrüsen-Organoide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Speicheldrüsenorganoide. Speicheldrüsenzellen werden dem Patienten entnommen, separiert, kultiviert und dem Patienten wieder zugeführt. Nebenwirkungen einer Strahlentherapie bei Tumorpatienten werden gemildert.

Description

Die Erfindung betrifft Speicheldrüsen-Organoide, die in der Therapie bei Pa­ tienten mit Kopf- und Halsmalignomen eingesetzt werden.

Die Strahlentherapie ist nach der Operation die wichtigste Therapiemodalität in der Behandlung maligner Tumoren der Kopf- und Halsregion. Als Folge der Bestrahlung entsteht oft eine irreversible Schädigung der speichelproduzieren­ den Azinuszellen in den Kopfspeicheldrüsen. Patienten mit reduzierter Spei­ chelsekretion leiden an Xerostomie mit den Folgeerscheinungen Dysphagie, Mukositis und rezidivierenden oropharyngealen Infekten. Eine kausale Thera­ pie dieser Folgeerscheinungen gibt es zur Zeit nicht.

Zur Prophylaxe der radiogenen Speicheldrüsenschädigung sind modifizierte Bestrahlungsschemata entwickelt worden. Bei bilateraler Bestrahlung kann beispielsweise die Glandula parotis im kontralateralen Bestrahlungsfeld aus­ gespart werden (Eisbruch, 1996). Weitere prophylaktische Maßnahmen sind die Zahnsanierung vor Bestrahlungsbeginn und eine suffiziente Oralhygiene.

Die symptomatische Behandlung umfaßt den Einsatz verschiedener Speichel­ ersatzstoffe oder von Präparaten zur Stimulation der sekretorischen Restakti­ vität der Speicheldrüsen z. B. mit Pilocarpin (Jacobs, 1996, Hamlar, 1996).

Auch chirurgische Verfahren, wie die mikrochirurgisch-anastomosierten Gastro-Omentum-Lappen (Braye, 1995) und das Jejunum-Transplantat (Lam, 1995) wurden zur Behandlung der radiogenen Xerostomie erprobt, konnten sich jedoch nicht durchsetzen.

Die dargestellten Methoden sind nur teilweise bis unzureichend in der Lage die Nebenwirkungen der Strahlentherapie zu beherrschen (Kamprad, 1998). Ab einer Strahlendosis von 50 Gy ist eine irreversible Xerostomie nicht ver­ meidbar (Richter, 1996).

Als Folge der radiogenen Xerostomie treten einschneidende Veränderungen in der Lebensqualität des Patienten auf. Die ausgeprägte Mundtrockenheit führt zu großflächigen Entzündungsreaktionen im Mund- und Rachenraum. Jeder Schluckvorgang ist äußerst schmerzhaft. Um diesen Schmerzen nicht übermäßig ausgesetzt zu sein, reduzieren die Patienten ihre Nahrungszufuhr. In der Folge treten für Tumorpatienten besonders gravierende Gewichtsverlu­ ste mit allgemeinem Kräfteverfall auf. Die soziale Reintegration der Patienten in das Berufs- und Freizeitleben wird zusätzlich verzögert oder ganz unmög­ lich. Zusätzliche Beeinträchtigungen und Kosten entstehen, wenn endoskopi­ sche oder chirurgische Maßnahmen erforderlich werden.

Die Anlage einer perkutanen Enterogastrostomie (PEG) ist eine minimal-inva­ sive Methode um die gastrointestinale Nahrungsaufnahme zu gewährleisten. Ihre wichtigsten Nachteile sind ein verlängerter stationärer Aufenthalt und nachfolgend die erforderliche Versorgung mit teurer Sondennahrung.

Die Mechanismen der Zell- und Gewebeschädigung durch eine Bestrahlung und deren Bedeutung für eine gestörte Speichelsekretion sind nur unvollstän­ dig geklärt. (Kamprad, 1998). Die Reduktion der Strahlendosis im Bereich der kontralateralen Speicheldrüsen bietet eine mögliche Alternative zur Erhaltung sekretorisch aktiver Zellen (Eisbruch, 1996). Als nachteiliger Effekt ist eine verminderte antineoplastische Wirkung nicht sicher auszuschließen.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die Lebensqualität des bestrahlten Patienten auf einem deutlich höheren Stand als bisher möglich zu erhalten und wiederherzustellen. Anders als bei den bisher bekannten Methoden soll dieses Ziel erstmals durch einen kausalen Ansatz erreicht werden.

Die Erfindung soll die Ursachen der Nachteile bisheriger Methoden beseitigen. Die Aufgabe wird darin gesehen, die bisher unvermeidlich auf­ tretenden Schädigungen der speichelproduzierenden Azinuszellen zu vermei­ den.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Konservierung und Vermehrung patienteneigenen, unbestrahlten Speicheldrüsengewebes auf entsprechenden Trägermaterialien außerhalb des menschlichen Körpers und Zuführen des kultivierten Gewebes in den Körper des Patienten gelöst.

Als Ausgangsmaterial wird humanes Speicheldrüsengewebe und Microcarrier verwendet.

Nach Entnahme des Drüsengewebes, die nach entsprechender Aufklärung des Patienten (Gutachten der Ethik-Kommission der Universität Leipzig, Reg. Nr. 593) im Rahmen einer laterofacialen Parotidektomie oder Submandibulek­ tomie durchgeführt wird, erfolgt die Weiterbearbeitung im Labor.

Die Drüsenzellen werden mechanisch und durch enzymatische Dissoziation mit 0,5% Protease-Lösung vereinzelt. Entsprechend der Präparationsanlei­ tung des Herstellers werden die Microcarrier vorbereitet. Zur Zeit werden Cy­ todex 3- und Cytopore 1-Microcarrier der Firma Pharmacia LKB Biotechnolo­ gy, Uppsala, Schweden verwendet.

Es hat sich herausgestellt, daß die 0,5%-ige Protease-Lösung durch eine 0,1%ige Collagenase-Lösung substituiert werden kann.

Möglich sind auch Microcarrier bzw. Microkapseln auf der Basis von Biomate­ rialien oder autogenen Substanzen (z. B. Kollagen oder Subkutanfett) als Organoidmatrix.

Drüsenzellen und Microcarrier werden gemeinsam in Dulbeccos modifizier­ tem Eagle Medium oder NCTC 135 Medium inkubiert. Weitere Mediumzusät­ ze sind Hepes-Puffer (1%), Penicillin-Streptomycin (1%), ggf. Nystatin (1%), fetales Kälberserum (10% - nur DMEM) und Ultroser (2% - nur für NCTC 135). Mögliche Kulturverfahren sind die Petrischalen-Kultur, Suspensions- oder Rotationskulturen.

Experimente zeigten, daß die Speicheldrüsenzellen auch in definiertem Kera­ tinocyten SF-Medium gezüchtet werden können.

Für die klinische Anwendung der Speicheldrüsen-Organoide wird dem Tumor­ patienten während der primären chirurgischen Therapie Speicheldrüsengewe­ be entnommen. Bei Patienten, die primär bestrahlt werden sollen, kann das Gewebe durch eine Biopsie in Lokalanästhesie gewonnen werden. Nach Ab­ lauf der Strahlentherapie werden die in-vitro hergestellten Speicheldrüsen- Organoide durch Injektion an ihren therapeutischen Wirkort gebracht. Die In­ jektion erfolgt direkt an verschiedenen Punkten in die Mundschleimhaut oder intraduktal in die Ausführungsgänge der jeweiligen Kopfspeicheldrüse.

Das vorgestellte Verfahren bietet erstmals einen Ansatz für die kausale The­ rapie der radiogenen Xerostomie. Es handelt sich um eine minimal-invasive Methode und erfordert in der Anwendung keine zusätzlichen operativen Maß­ nahmen. Hierdurch wird der Patient nicht zusätzlich belastet. Zusätzlich kön­ nen Kosten für Operationen und stationäre Behandlungen eingespart werden.

Die Möglichkeit der Standardisierbarkeit im Rahmen eines bio­ technologischen Verfahrens ist gegeben. Dadurch kann eine hohe Sicherheit während der Herstellung der Speicheldrüsen-Organoide und der klinischen Anwendung (vergleichbar mit der Transfusion einer Eigenblutspende) ge­ währleistet werden.

Die Erfindung wird nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläu­ tert, ohne auf dieses beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiel Enzymatische Aufspaltung von humanen Speicheldrüsen

• 1. Das Gewebe wird vom OP bis zum Labor in Tubes mit ca. 10 ml HBSS (Hanks) transportiert und mit Skalpell und Pinzette in 3-4 mm große Stücke zerkleinert und 2 × in HBSS gewaschen (1200 U/min), 5 min).
• 2. Inkubation mit 0,1%iger Collagenaselösung (Collagenase in HBSS gelöst) bei 37 Grad C für 2-3 Stunden mit einem heizbaren Magnetrührer bis zur Trü­ bung der Lösung (Fettabspaltung).
• 3. Isolation der abgelösten Zellen durch Filtration durch ein Sieb, dabei wer­ den herausgelöste Zellen und Gewebefragmente von größeren Stücken ge­ trennt
• 4. 2maliges Waschen der Zellsuspension mit HBSS (1200 U/min. 5 min)
• 5. Reinigung des Zellpellet von Erythrozyten mittels sterilen Bidest (2-3 ml, 5 min einwirken, dann Zentrifugation bei 1200 U/min. 5 min), Wiederholung wenn nötig.
• 6. Nochmaliges Waschen mit HBSS
• 7. Resuspension der Zellen in Kulturmedium, Bestimmung der Zellzahl mittels CASY
• 8. Zellzahleinstellung und Aussaat der Zellen in Kulturflasche oder -gefäße.

Claims (6)

1. Speicheldrüsenorganoid, bestehend aus kultivierten Speicheldrüsenzellen, die sich auf einer Matrix befinden.

2. Speicheldrüsenorganoid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrix patienteneigenes Gewebe nach Modifizierung als Trägermaterial verwendet wird.

3. Speicheldrüsenorganoid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrix Kollagen oder Subkutanfett eingesetzt werden.

4. Verfahren zur Herstellung von Speicheldrüsenorganoid, dadurch gekenn­ zeichnet, daß einem Patienten entnommene Speicheldrüsenzellen mechanisch und durch enzymatische Dissoziation mit einer 0,5%igen Protease-Lösung vereinzelt werden und in Microcarrier eingebracht werden, in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium oder NCTC 135 Medium inkubiert werden, wobei die Medien an sich bekannte Zusätze enthalten können, und das hergestellte Organoid separiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzymlö­ sung eine 0.1%ige Collagenase-Lösung eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Inkubationsmedium definiertes Keratinocyten SF-Medium verwendet wird.