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DE19834087C1 - Wäßrige Konservierungslösung und Verfahren zur Aufbewahrung tierischen Gewebes - Google Patents

Wäßrige Konservierungslösung und Verfahren zur Aufbewahrung tierischen Gewebes

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Publication number
DE19834087C1
DE19834087C1 DE19834087A DE19834087A DE19834087C1 DE 19834087 C1 DE19834087 C1 DE 19834087C1 DE 19834087 A DE19834087 A DE 19834087A DE 19834087 A DE19834087 A DE 19834087A DE 19834087 C1 DE19834087 C1 DE 19834087C1
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DE
Germany
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mol
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proportion
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tissue
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DE19834087A
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English (en)
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Massoud Mirzaie-Sedaposhteh
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MIRZAIE SEDAPOSHTEH MASSOUD
Original Assignee
MIRZAIE SEDAPOSHTEH MASSOUD
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
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Abstract

Die Erfindung betrifft eine wäßrige Lösung zur Aufbewahrung tierischen Gewebes (MM-Lösung) und ein Verfahren zur Aufbewahrung tierischen Gewebes, wie Herzklappen. Die MM-Lösung besteht aus mindestens 8 Komponenten. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein durch Fixation, Antikalzifizierung, Sterilisation und Waschung vorbehandeltes tierisches Gewebe in die MM-Lösung gegeben und dort über eine Dauer von ungefähr 0,5 bis zu ungefähr 18 Monaten bei Temperaturen von etwa 1 bis 24 DEG C belassen. DOLLAR A Die erfindungsgemäße MM-Lösung ist für Menschen nicht toxisch. Sie hat sich selbst nach mehr als 6 Monaten als steril erwiesen. Ihr müssen keinerlei antibiotisch wirkende Stoffe hinzugefügt werden. Das in der MM-Lösung aufbewahrte tierische Gewebe ist auf einen Organismus artfremd implantierbar und in Bezug auf ihn biokompatibel. Durch die Aufbewahrung von tierischen Herzklappen in der erfindungsgemäßen MM-Lösung lassen sich durch Reduzierung der Ischämiezeit die Ergebnisse der Herzklappen ersetzenden Operationen entscheidend verbessern.

Description

Die Erfindung betrifft eine wäßrige Lösung zur Aufbewahrung tierischen Gewebes (MM- Lösung) und ein Verfahren zur Aufbewahrung tierischen Gewebes, wie Herzklappen, wobei das aufbewahrte tierische Gewebe zur weiteren Verwendung, wie zur Transplantation auf artfremdes Gewebe, geeignet ist.
Bei biologischen Herzklappen, die primär vom Schweineherzen entnommen werden, wird lediglich die Aortenklappe explantiert. Diese Herzklappen durchlaufen bis zu ihrem Einsatz im menschlichen Körper verschiedene Prozesse. Diese dienen zur:
Fixation des Gewebes, vor allem des Kollagens,
Antikalzifizierungsverfahren,
Sterilisation der Klappen und
Aufbewahrung in einer biokompatiblen Lösung
Als Ziel gilt die Herstellung von biologischen Herzklappen, die beim Menschen biokompatibel sind, d. h. als Schweinegewebe nicht abgestoßen werden, eine sehr geringe Verkalkung zeigen, eine hohe Reißfestigkeit aufweisen und leicht zu implantieren sind.
Zu den Fixationsverfahren:
A. Fixationsmittel:
Die Fixation der Herzklappen dient in erster Linie zur Verfestigung der Kollagenfasern durch Quervernetzung. Dadurch wird das Gewebe jedoch steifer. Ursprünglich wurde als Fixationsmittel Formaldehyd eingesetzt. Die mit Formaldehyd fixierten Gewebe weisen eine hohe Elastizität mit niedrigerer Reißfähigkeit bei hohen Drücken auf, sodaß diese Methode bald verlassen wurde. Die mit Glycerol behandelten Gewebe zeigen schon in Versuchen zur Bestimmung der Kalzifizierungstendenz biologischer Herzklappen in Ratten eine sehr hohe Verkalkungstendenz. Als Alternativmethode befindet sich die Fixation mit Epoxy compounds, wie Denacol, in Versuchsstadien. Dabei handelt es sich um zusammengesetzte chemische Substanzen, die in der Lage sind, sich an die Amnio- (NH2-) und Carboxyl-(COOH-) Gruppe der Aminosäure zu binden. Die Bindung an die COOH-Gruppe spielt eine große Rolle in dem gesamten Fixationsverfahren, da die freien Carboxyl-Gruppen des fixierten Gewebes die Verkalkung der Herzklappen fördern. Andere nicht chemische Fixationsverfahren, wie die Photo-Oxidation, haben sich in den Tierversuchen in Schafen nicht bewährt. Andere Verfahren zielen darauf ab, die Komponenten der biologischen Herzklappen, die offensichtlich für die Verkalkung der Herzklappen verantwortlich sind, vom Zellverband zu entfernen. Dabei wurde der Versuch unternommen, durch eine komplexe chemische Reaktion die Fibroblasten aus einem nicht behandelten Gewebe zu entfernen, ohne die restlichen Zell- und Bindegewebskomponenten zu denaturieren. Diese Methode wurde zur Herstellung einer biologischen Klappe X-Cell-Biovalve® der Firma SJM verwendet. Diese Methode führt jedoch zu einer Freilegung der Komponente der extrazellulären Matrix, wie Laminin etc., die ihrerseits eine Reihe pathologischer Prozesse in Gang setzt, wie die Aktivierung der Monozyten, Bindung der Thrombozyten an das Endothel etc.. Letztendlich wurde diese Methode aufgrund dieser biologischen Nebenwirkungen verlassen. Somit wird als Standardmethode die Fixation mit Glutaraldehyd in gepufferter Form eingesetzt (Glutaraldehyd, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid, Kaliumphosphat und Natriumphosphat). Diese Behandlung führt jedoch zu einer Versteifung des Gewebes. Das optimale Verhältnis zwischen der erwünschten Versteifung des Gewebes und noch ausreichender Fixierung des Kollagens sowie ausreichender Elastizität des Gewebes als Garant für die einwandfreie Schließbewegung der Klappensegel wurde durch Reduzierung der Konzentration des Fixationsmittels durch Streß-Elastizitätstests ermittelt. Die gängige Konzentration des Glutaraldehyds zur Fixation des Klappengewebes beträgt 0,25%. Die routinemäßig einzusetzenden Fixationsmittel sind für Menschen hochtoxisch, sodaß gewährleistet sein muß, daß sich die Substanzen unter dem Blutfluß nicht von dem Kollagen trennen, so genannter Wash-out-effect. Durch den Wash-out-effect geht die primäre Bindung des Fixationsmittels an das Kollagen und damit die gewünschte Fixation des Gewebes verloren.
B. Fixationsbedingungen:
Neben dem Fixationsmittel spielen die Fixationsbedingungen eine große Rolle in der Herstellung biologisch kompatibler Herzklappen. Unter diesen Bedingungen sind die Druckverhältnisse während des Fixationsverfahrens hervorzuheben. Es werden dabei drei Formen unterschieden:
  • 1. Fixation unter Nulldruck,
  • 2. Fixation unter Niedrigdruck und
  • 3. Fixation unter Hochdruck.
Die Aortenklappe befindet sich in dem Ausflußtrakt des linken Ventrikels. Somit wird eine Klappe an beiden Seiten an der Fixationseinrichtung befestigt. Grundsätzlich können die Klappen entweder in eine Richtung unidirektional, d. h. von dem linken Ventrikel zur Herzklappe hin vorwärts oder bidirektional, d. h. von dem linken Ventrikel zur Herzklappe hin und von der Aorta zur Herzklappe hin mit der Fixationslösung durchgespült werden. Bei der bidirektionalen Form können die Druckverhältnisse so gewählt werden, daß lediglich zum Schluß der Klappensegel kommt: Nulldruck- Fixierung. Es kann aber auch ein Überdruck nach dem Klappenschluß erzeugt werden: Niedrig-Druck-Fixierung. Eine Hochdruck-Fixierung wird nicht mehr verwendet. Bewährt hat sich eine bidirektionale Fixierung mit Nulldruck.
C. Länge der Fixation:
Da bislang Untersuchungen über die Zeitabläufe der Fixation des Kollagens fehlen, wurde die Fixationszeit empirisch nach den Ergebnissen der tierexperimentiellen Versuche ermittelt. In der Regel wird eine Fixationszeit zwischen 5 bis 7 Tagen gewählt. Eine Kurzzeitfixierung führt zu einer erhöhten Verkalkung des Gewebes. Das Glutaraldehyd selbst begünstigt ebenfalls die Verkalkung, so daß zusätzlich zu den Fixationsverfahren Methoden zur Verringerung der Verkalkung biologischer Klappen Verwendung finden. Es sind aber auch grundsätzlich porcine Herzklappen im Gebrauch, die einem solchen Verfahren nicht unterzogen wurden, wie SPV-Toronto-Klappen® der Firma SJM.
Zu den Antikalzifizierungsverfahren:
Als erste Antikalzifizierungsmittel wurden verschiedene metallische Ionen, wie Fe3+-, Al3+-, Mg2+-, Cu2+-, Au2+- und Sn2+-Ionen, eingesetzt. Durch erhebliche Versteifung des Gewebes fanden diese Substanzen keinen Eingang in die weitere Herzklappenproduktion. Als weitere Substanzen kamen oberflächenaktive Komponenten, wie Triton, X-100, Natrium-dodecyl-sulphat, Polysorbat-80 und N- Lauryl Sarcosine, zur Verwendung. Wegen erheblicher biologischer Unverträglichkeit wurden bis auf Natrium-dodecyl-sulphat in der Hancock-II-Klappe® alle anderen Substanzen verlassen. In der Carpentier-Edwards-Bioprothese® der Firma Baxter wird als Antikalzifizierungsagens HEPES-Puffer eingesetzt. Bei der Intact-Prothese® der Firma Medtronic kommt Toluidin-Blau zur Anwendung. Wenig Beachtung fand der Einsatz der Aminosäuren, wie Lysin, Glutamat etc. Eine der effektivsten Methoden zur Verhinderung der Kalzifizierung der biologischen Herzklappen scheint nach bisherigen Ergebnissen die Behandlung mit 2-Amino-Oleic-Säure (AOA-treatment) zu sein, die in den Klappen Freestyle® und Mosaic® der Firma Medtronic zur Anwendung kommt.
Zur Sterilisation der biologischen Klappen:
Eine Indikation zur Sterilisation der Herzklappen mit antibiotischen Lösungen besteht lediglich bei kryokonservierten Homografts. Es handelt sich dabei um Aorten- und Pulmonalklappen, die frisch von explantierten Menschenherzen gewonnen werden. Da hierbei eine Fixation des Gewebes mit gängigen Mitteln nicht erfolgt, werden diese Herzklappen mit Antibiotika vorbehandelt.
Die Fixation des porcinen Klappengewebes mit Glutaraldehyd in einer Konzentration von 0,25% über 5 bis 7 Tage gewährleistet eine vollständige Sterilisation des Gewebes.
Zur Aufbewahrung der biologischen Klappen in einer biokompatiblen Lösung:
Die vom Schwein entnommenen Klappen durchlaufen bis zu ihrem Einsatz im menschlichen Körper das Fixationsverfahren sowie gegebenenfalls die Behandlung mit Antikalzifizierungsverfahren. Nach endgültiger Herstellung der Herzklappen werden diese unter steriler Kautelen in einer 0,025- bis 0,06%igen Glutaraldehydlösung aufbewahrt. Daher müssen die so hergestellten Herzklappen kurz vor ihrer Implantation nach einem vorgegebenen Schema mit 0,9%iger NaCl-Lösung gespült werden, damit die freie Glutaraldehyd-Lösung nicht in den menschlichen Körper gelangt. Dabei werden die biologischen Klappen in 3 verschiedenen Behältern mit jeweils 250 ml 0,9%iger NaCl- Lösung jeweils 2 bis 3 Minuten gespült, also insgesamt 6 bis 9 Minuten. Dieser Waschvorgang ist obligat und wird in der Ischämiezeit der klappenersetzenden Operation durchgeführt. Der Ausgang der klappenersetzenden Operation hängt in hohem Maße von dieser Ischämiezeit ab. Je kürzer diese Zeitspanne ist, um so besser kann sich das Herz von seiner Ischämie erholen.
Bislang sind wenige Versuche unternommen worden, eine biologisch kompatible Lösung zur Aufbewahrung biologischer Herzklappen herzustellen. Lediglich die Aufbewahrung in einer 0,9%igen NaCl-Lösung fand Einzug in den klinischen Gebrauch. Nach wie vor werden die biologischen Klappen in einer Glutaraldehyd-Lösung aufbewahrt.
In den Offenlegungsschriften DE 43 31 711 A1 und DE 41 38 040 A1 werden Perfusionslösungen für die Aufbewahrung von Organen zur Transplantation vorgeschlagen, die unter anderem Basen und Säuren sowie Elektrolyte wie Kalium, Natrium, Calcium, Magnesium enthalten.
Die Lebensdauer einer biologischen Herzklappe wird in erster Linie durch ihre Verkalkung nach der Implantation bestimmt. Das mit Glutaraldehyd behandelte artfremde Gewebe neigt zur starken Verkalkung, die durch weitere Bearbeitung des artfremden Gewebes mit Antikalzifizierungsverfahren nur teilweise verringert werden kann. Das in Glutaraldehyd aufbewahrte artfremde Gewebe muß vor der Implantation drei Waschschritten unterzogen werden, die zu einer unerwünschten Verlängerung der klappenersetzenden Operation führt. Außerdem besteht die Gefahr, daß der Organismus, auf den implantiert wird, mit den Resten von ihn schädigenden-3-3 Glutaraldehyds kontaminiert wird.
Die Erfindung hat sich deshalb zur Aufgabe gestellt, sowohl eine nicht toxische Lösung zur Aufbewahrung eines tierischen, insbesondere eines artfremden Gewebes zu entwickeln, das für einen Organismus, auf den das Gewebe implantiert wird, biokompatibel sein soll, als auch ein Verfahren zur Aufbewahrung des Gewebes aufzufinden.
Die Aufgabe wird durch eine wäßrige Lösung mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 und 6 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Merkmale der Unteransprüche definiert.
Erfindungsgemäß enthält die wässrige Lösung zur Aufbewahrung des tierischen Gewebes mindestens folgende Komponenten:
  • a) NaHCO3 mit einem Anteil von 12 bis 35 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • b) Glucose mit einem Anteil von 1 bis 20 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit einem Anteil von 0,1 bis 3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • d) KH2PO4 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,8 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • e) CaCl2 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • f) NaCl mit einem Anteil von 90 bis 135 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • g) KCl mit einem Anteil von 1,5 bis 7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit einem Anteil von 0,0051 bis 0,05 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung.
Diese Lösung soll als MM-Lösung bezeichnet werden.
Der Begriff tierisches Gewebe schließt naturgemäß auch menschliches Gewebe ein. Es können ein oder mehrere Chelatbildner eingesetzt werden. Als Chelatbildner kommen beispielsweise Triplex III (Dinatrium-Salz der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Titriplex®)), wie das Calcium-Dinatriumsalz der Ethylendiaminessigsäure (Natrium- Calciumedetat), das Calcium-Trinatrium-Salz der Diethylentetraminpentaessigsäure (Calcium-Trinatrium-Pentetat), die aus Actinomyceten gewonnene Base Deferoxamin und andere in Frage. Bevorzugt sind die Salze der EDTA.
Überraschenderweise wurde auch gefunden, daß durch die Aufbewahrung des tierischen Gewebes in der erfindungsgemäßen MM-Lösung zusätzlich auch der Kalziumgehalt des implantierten artfremden Gewebes deutlich reduziert wird, nach drei Monaten beispielsweise um bis zu zwei Drittel, wenn das Gewebe vor der Implantation in der wäßrigen MM-Lösung aufbewahrt wird.
Als besonders geeignet hat sich eine wäßrige Lösung erwiesen, die die Komponenten mit den folgenden Anteilen an der gesamten MM-Lösung enthält:
  • a) NaHCO3 mit 25 . 10-3 mol/l,
  • b) Glucose mit 11,1 . 10-3 mol/l,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • d) KH2PO4 mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • e) CaCl2 mit 1,9 . 10-3 mol/l,
  • f) NaCl mit 118,2 . 10-3 mol/l,
  • g) KCl mit 4,7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit 0,026 . 10-3 mol/l.
Besonders bevorzugt ist das Triplex III als Chelatbildner.
Die erfindungsgemäße wäßrige Lösung (MM-Lösung) ist besonders für die Aufbewahrung von Herzklappen als tierisches Gewebe geeignet. Sie ist vorzugsweise für die Aufbewahrung porciner Herzklappen geeignet.
Weder die einzelnen Komponenten noch die MM-Lösung insgesamt sind für Menschen in den angewandten Konzentrationsbereichen toxisch. Von Vorteil ist ferner, daß die MM-Lösung aufgrund ihrer oberflächenaktiven Eigenschaften in der Lage ist, das Endothel zu überziehen. Der MM-Lösung müssen keinerlei antibiotisch wirkende Stoffe hinzugefügt werden. Sie hat sich selbst nach mehr als 6 Monaten als steril erwiesen. Durch die Aufbewahrung artfremden Gewebes in der MM-Lösung vor seiner Implantation wird ein Waschvorgang des Gewebes überflüssig, wodurch sich die Ischämiezeit der klappenersetzenden Operation deutlich reduziert. Durch die mögliche Reduktion der Ischämiezeit der Operation werden die Ergebnisse der Herzklappen­ ersetzenden Operationen entscheidend verbessert.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Aufbewahrung eines durch Fixation, Antikalzifizierung, Sterilisation und Waschung vorbehandelten tierischen Gewebes, wird das so vorbehandelte Gewebe anschließend in eine wäßrige Lösung (MM-Lösung) gegeben und dort über eine Dauer von ungefähr 0,5 bis zu ungefähr 18 Monaten, vorzugsweise von ungefähr einem bis ungefähr 12 Monaten und besonders bevorzugt von ungefähr 6 Monaten bei Temperaturen von etwa 1 bis etwa 24°C, vorzugsweise von etwa 3 bis etwa 9°C, besonders bevorzugt von etwa 6°C belassen. Die MM-Lösung enthält mindestens folgende Komponenten:
  • a) NaHCO3 mit einem Anteil von 12 bis 35 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • b) Glucose mit einem Anteil von 1 bis 20 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit einem Anteil von 0,1 bis 3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • d) KH2PO4 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,8 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • e) CaCl2 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • f) NaCl mit einem Anteil von 90 bis 135 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • g) KCl mit einem Anteil von 1,5 bis 7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit einem Anteil von 0,0051 bis 0,05 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung.
Bevorzugt wird ein Verfahren, bei dem die MM-Lösung Komponenten mit den folgenden Anteilen enthält:
  • a) NaHCO3 mit 25 . 10-3 mol/l,
  • b) Glucose mit 11,1 . 10-3 mol/l,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • d) KH2PO4 mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • e) CaCl2 mit 1,9 . 10-3 mol/l,
  • f) NaCl mit 118,2 . 10-3 mol/l,
  • g) KCl mit 4,7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit 0,026 . 10-3 mol/l.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer vorteilhaften Ausführungsform durchgeführt, indem als chelatbildende Komponente h) die Salze der EDTA in der MM- Lösung verwendet werden, wobei die Verwendung von Triplex III besonders bevorzugt wird.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Aufbewahrung tierischer Herzklappen, insbesondere porciner Herzklappen, eingesetzt.
Die Erfindung wird nun anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Beispiel Entwicklung und Überprüfung der MM-Lösung:
Die aus 8 Komponenten bestehende wässrige Lösung weist einzeln und zusammengesetzt keine Toxizität auf. Komponenten wie Alkalimetalle in Sulfat- und Phosphatbindung entsprechen in ihrer Zusammensetzung chemisch dem Serum des Menschen. Diese Zusammensetzung besitzt oberflächenaktive Eigenschaften, die zu einer Überdeckung des Endothels führt. Die Überprüfung der MM-Lösung wurde in 5 Phasen durchgeführt:
  • 1. Waschvorgang der konventionell hergestellten biologischen Klappen mit unterschiedlichen Fixationsverfahren, entsprechend den Vorgaben der einzelnen Firmen,
  • 2. Aufbewahrung der so für die Implantation fertigen Klappen in der MM-Lösung für 6 Monate bei etwa 6°C,
  • 3. Sterilisationstest der MM-Lösung nach 6 Monaten,
  • 4. Implantation der Klappensegel und Aortenwand dieser Klappen in einem Tierversuch zur Bestimmung des Kalzifizierungsindex und
  • 5. Implantation der Klappensegel und Aortenwand der herkömmlich hergestellten und in Glutaraldehyd aufbewahrten Klappen als Vergleichsstudie.
Zur Phase 1:
Als Versuchsklappen wurden solche, die in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt sind, verwendet, die am häufigsten implantiert werden:
Tabelle 1
Von jeder Herzklappe wurden 5 Stück eingesetzt. Von jeder Gruppe wurden 3 Klappen nach dem vorgegeben Schema gespült.
Unter strikter Beachtung steriler Kautelen wurden die Herzklappen ausgepackt und in einen Behälter mit 250 ml 0,9%ige NaCl-Lösung gegeben. Nach 3 Minuten wurden die Klappen in einen weiteren Behälter mit 250 ml 0,9%iger NaCl-Lösung gegeben. Dieser Vorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt. Obwohl die angegebenen Zeiten für den Waschvorgang zwischen 2 bis 3 Minuten pro Behälter differieren, wurde, um konstante Versuchsbedingungen zu erreichen, die Methode mit dem längsten Waschvorgang für alle Klappen ausgesucht.
Zur Phase 2:
Die so gespülten und somit für die Implantation fertigen Klappen wurden unter Beachtung steriler Kautelen in einem verschlußdichten Behälter mit der erfindungsgemäßen MM-Lösung eingelegt. Die Aufbewahrung erfolgte für 6 Monate bei 6°C.
Zur Phase 3:
Nach Ablauf von 6 Monaten wurde der Verschluß geöffnet und 2 Proben aus der Lösung für die bakteriologisch-mikrobiologischen Untersuchungen entnommen. Diese Untersuchungen wurden in dem Hygiene-Institut der Universitätskliniken Göttingen durchgeführt. Durch diese Tests werden Infektionen durch Bakterien und Pilze erkannt. Alle Proben waren steril.
Zu den Phasen 4 und 5:
  • 1. 4.1. und 5.1.: Gruppenbildung, Versuchsbedingungen und Operationstechnik:
  • 2. 4.1.1. und 5.1.1.: Gruppenbildung:
Von jeder Herzklappe wurden 5 Stück in dem Versuch eingesetzt. In jeder Gruppe wurden alle Herzklappen gespült, 3 von jeweils 5 Klappen wurden für 6 Monate in der erfindungsgemäßen MM-Lösung aufbewahrt. Die übrigen 2 Herzklappen wurden bis zur Implantation in der Standard-Lösung aufbewahrt.
Gruppenbildung anhand des Beispiels SPV-Toronto-I-®Klappe:
5 SPV-Toronto-I-®Klappen
4.1.2. und 5.1.2.: Versuchsbedingungen und Operationstechnik:
Als Standardmethode zur Abschätzung der Verkalkungsneigung biologischer Herzklappen gilt nach wie vor ein Tierversuchsmodell mit Ratten.
Versuchsaufbau:
Die Versuche wurden an 36 Ratten, Rasse Wistar, 3 Wochen alt, nur weibliche Tiere, in den Tierexperimentiellen Einrichtungen der Universitätskliniken Göttingen durchgeführt. Alle Eingriffe wurden in Narkose, intraperitoneal mit Rampun und Ketanest, durchgeführt. Es wurden Proben aus den Segeln der Klappen von 1 cm2 Größe entnommen und diese am Rücken der Ratten in eine subkutane Tasche implantiert. Die Haut wurde mit einem resorbierbaren Faden genäht.
4.1.3. und 5.1.3.: Explantation der Proben, Bestimmung des Kalziumgehaltes des Gewebes:
Nach 3 Monaten wurden alle Proben in Narkose explantiert. Diese wurden sofort tiefgefroren und bei -80°C zwischengelagert. Das Probenmaterial wurde gefrierge­ trocknet, ausgewogen und mit 1 ml 70%iger Salpetersäure zur Analyse versetzt. Nachdem 2 Stunden keine Reaktion mehr zu beobachten war, erfolgte das Auffüllen der Aufschlußlösung mit 4,3%iger Salpetersäure auf ein Endvolumen von 100 ml. Analog wurde eine Blindlösung aus den Reagenzien hergestellt. Die Bestimmung des Kalziumgehaltes in der Aufschlußlösung erfolgte mittels induktiv gekoppelten Plasmas (ICP-OES) durch Immissionsmessung bei den Wellenlängen 184,006 nm und 210,324 nm mit einem Tracescan ICP-Gerät mit vorheriger Kalibrierung mit einer Standardlösung. Das Ergebnis wurde als Mittelwert einer Dreifachbestimmung angegeben.
4.1.4 und 5.1.4.: Ergebnisse:
In der nachstehenden Tabelle 2 ist der Gehalt an Kalzium in mg/g Trockensubstanz wiedergegeben.
Tabelle 2
Wie aus den Ergebnissen eindeutig hervorgeht, ist die erfindungsgemäße MM-Lösung in der Lage, die Kalzifizierung biologischer Klappen effektiv und signifikant zu senken.

Claims (9)

1. Wäßrige Konservierungslösung mit den Bestandteilen K, Na, Ca sowie Mg zur Aufbewahrung tierischen Gewebes, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens folgende Komponenten enthält:
  • a) NaHCO3 mit einem Anteil von 12 bis 35 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • b) Glucose mit einem Anteil von 1 bis 20 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit einem Anteil von 0,1 bis 3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • d) KH2PO4 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,8 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • e) CaCl2 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • f) NaCl mit einem Anteil von 90 bis 135 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • g) KCl mit einem Anteil von 1,5 bis 7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit einem Anteil von 0,0051 bis 0,05 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
2. Wäßrige Konservierungslösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Komponenten mit den folgenden Anteilen an der gesamten Lösung enthält:
  • a) NaHCO3 mit 25 . 10-3 mol/l,
  • b) Glucose mit 11,1 . 10-3 mol/l,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • d) KH2PO4 mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • e) CaCl2 mit 1,9 . 10-3 mol/l,
  • f) NaCl mit 118,2 . 10-3 mol/l,
  • g) KCl mit 4,7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit 0,026 . 10-3 mol/l.
3. Wäßrige Konservierungslösung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner das Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure, vorzugsweise das Calcium-Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure ist.
4. Verfahren zur Aufbewahrung eines durch Fixation, Antikalzifizierung, Sterilisation und Waschung vorbehandelten tierischen Gewebes, in einer wässrigen Konservierungslösung mit den Bestandteilen K, Na, Ca sowie Mg, dadurch gekennzeichnet, daß das vorbehandelte Gewebe anschließend in eine wäßrige Lösung gegeben und dort bis zu ungefähr 18 Monaten bei Temperaturen von etwa 1 bis etwa 24°C belassen wird, wobei die Lösung mindestens folgende Komponenten enthält:
  • a) NaHCO3 mit einem Anteil von 12 bis 35 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • b) Glucose mit einem Anteil von 1 bis 20 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit einem Anteil von 0,1 bis 3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • d) KH2PO4 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,8 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • e) CaCl2 mit einem Anteil von 0,1 bis 2,3 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • f) NaCl mit einem Anteil von 90 bis 135 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung,
  • g) KCl mit einem Anteil von 1,5 bis 7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit einem Anteil von 0,0051 bis 0,05 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens folgende Anteile enthalten sind:
  • a) NaHCO3 mit 25 . 10-3 mol/l,
  • b) Glucose mit 11,1 . 10-3 mol/l,
  • c) MgSO4 . 7 H2O mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • d) KH2PO4 mit 1,2 . 10-3 mol/l,
  • e) CaCl2 mit 1,9 . 10-3 mol/l,
  • f) NaCl mit 118,2 . 10-3 mol/l,
  • g) KCl mit 4,7 . 10-3 mol/l an der Gesamtlösung und
  • h) Chelatbildner mit 0,026 . 10-3 mol/l.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner das Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure, vorzugsweise das Calcium-Dinatriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure, in der Konservierungslösung verwendet wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das vorbehandelte Gewebe von 1 bis zu 12 Monaten, vorzugsweise ungefähr 6 Monate, in der Konservierungslösung belassen wird.
8. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das vorbehandelte Gewebe bei Temperaturen von etwa 3 bis etwa 9°C, vorzugsweise bei etwa 6°C, in der Konservierungslösung belassen wird.
9. Verfahren nach Ansprüchen 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als vorbehandeltes tierisches Gewebe Herzklappen, vorzugsweise porcine Herzklappen, verwendet werden.
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