DE19828732A1

DE19828732A1 - Antivirale Radioimmunpharmaka auf der Basis von Alpha-Strahlern

Info

Publication number: DE19828732A1
Application number: DE1998128732
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Bergter; W H Knapp; Ingrid-Corina Bergter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-03-08
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2000-01-05

Abstract

Problem DOLLAR A Weltweit sind mehr als 100 Millionen Menschen mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV), dem Hepatitis-C-Virus (HCV), dem humanen Immundefizienvirus (HIV) und anderen Viren chronisch infiziert. Die Therapie dieser Virusinfektionen ist bis heute nicht befriedigend gelöst. Aus diesem Grund sind völlig neue Strategien für eine potentiell kurative Therapie erforderlich. DOLLAR A Lösung DOLLAR A Die vorliegende Patentanmeldung ist ein Zusatzantrag zum Hauptantrag vom 08.03.1998 (AZ 19809785.9-41). Während im Hauptantrag Radioimmunkonjugate beschrieben wurden, die als radioaktive Komponente einen Beta-Strahler enthalten, handelt es sich in diesem Zusatzantrag um eine Reihe andersartiger Radioimmunkonjugate, die einen Alpha-Strahler als radioaktive Komponente enthalten. Alpha-Strahler bieten gegenüber Beta-Strahlern eine Reihe therapeutischer Vorteile. DOLLAR A Anwendungsgebiet DOLLAR A Unter Verwendung von Alpha-Strahlern sollen jeweils spezifische Radioimmunkonjugate für die Therapie von Infektionen mit HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2, HBV, HCV, HHV-8 und andere Viren entwickelt werden. Ziel ist es, alle infizierten Körperzellen gezielt zu eliminieren. Mit diesen neuartigen antiviralen Präparaten besteht die Hoffnung, eine Heilung bislang nicht ausreichend therapierbarer viraler Infektionen herbeiführen zu können.

Description

Anwendungsgebiet

Der vorliegende Zusatzantrag betrifft weitere Radioimmunkonjugate, die mit therapeu tischem Ziel in der Virologie eingesetzt werden sollen.

Stand der Technik

Die Behandlung der meisten viralen Infektionen - besonders der HIV-, HCV- und HBV- Infektionen - ist bis heute nicht befriedigend gelöst. Im Hauptantrag vom 07.03.1998 (Az Nr. 198 09 785.9-41), sowie in den Zusatzanträgen vom 15.04.1998 (Az Nr. 198 26 307.4) und 28.04.1998 (Az Nr. 198 18 843.9) wurde die Bedeutung dieser Infektio nen, der jeweilige Stand der Technik, d. h. die gängigen Therapien, sowie deren Grenzen und Probleme detailliert dargelegt. Den genannten Infektionen ist gemeinsam, daß sie chronisch verlaufen und mit einer hohen Morbidität und Mortalität verknüpft sind. Die Virusreplikation läßt sich inzwischen mit antiviralen bzw. antiretroviralen Pharmaka mehr oder weniger gut supprimieren. Eine Heilung wird derzeit aber bei der Hepatitis B und C nur in einem begrenzten Teil der Fälle erreicht und eine HIV-Infektion kann durch Hemmung der Virusreplikation allein vermutlich überhaupt nicht eliminiert werden.

Ziel einer effektiven antiviralen bzw. antiretroviralen Therapie muß daher die infizierte Zelle selbst sein. Eine solche gezielte Elimination Virus-infizierter Zellen ist gemäß o.g. Patentanträgen mit Radioimmunpharmaka möglich, die als radioaktive Komponente einen β-Strahler enthalten. Die Reichweite der β-Strahlung liegt allerdings im Bereich von mehreren Millimetern. Das Problem besteht somit darin, daß eine Schädigung umlie gender, nicht infizierter Zellen nicht auszuschließen ist. Günstiger wäre daher der Einsatz von Radioisotopen, die einen höheren linearen Energietransfer bewirken und deren Strahlung eine noch geringere Reichweite als die der β-Strahler aufweisen.

Lösung

Das beschriebene Problem wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß immunologisch wirksame Moleküle wie monoklonale Antikörper (mAk) oder zelluläre Rezeptoren für die Virusbindung mit einem Alpha-Strahler konjugiert werden.

Für die erfindungsgemäßen Radioimmunkonjugate können Verbindungen folgender allgemeiner Formel eingesetzt werden:

a) Bindungsmolekül - Alpha-Strahler.

Bevorzugt werden im Rahmen der o.g. Formel insbesondere Verbindungen der Formel

a) mAk - Alpha-Strahler
b) mAk-Fragment - Alpha-Strahler
c) Virusrezeptor - Alpha-Strahler
d) Virusrezeptor-Fragment - Alpha-Strahler.

Die Spezifität der mAk soll sich insbesondere gegen Epitope richten auf virale, in die Plasmamembran infizierter Zellen integrierte Proteine, wie

a) Oberflächen- oder Transmembranglykoproteine des HIV-1 oder -2,
b) Oberflächenglykoproteine des HBV,
c) Oberflächenglykoproteine des HCV,
d) Oberflächenglykoproteine des HHV8,
e) Oberflächen- oder Transmembranglykoproteine anderer Retroviren, wie beispielsweise HTLV-1 oder -2,

oder gegen in die Plasmamembran infizierter Zellen integrierte spezifische, virusindu zierte Proteine.

Als monoklonale Antikörper kommen in Betracht:

a) murine monoklonale Antikörper,
b) humane bzw. humanisierte monoklonale Antikörper,
c) Antigen-bindende Fragmente (Fab, Fab' oder F(ab)₂) muriner oder humaner bzw. humanisierter monoklonaler Antikörper.

Als Virusrezeptoren konnten verschiedene Moleküle identifiziert werden. Derartige Moleküle sollen daher Verwendung finden, unter anderem:

a) CD4-Rezeptoren (bei der HIV-Infektion)
b) LDL-Rczeptoren (bei der HCV-Infektion)
c) ASGPR und andere (bei der HBV-Infektion).

Weitere Rezeptoren sollen bei anderen viralen Infektionen identifiziert werden und in gleicher Weise therapeutisch eingesetzt werden. Gegebenenfalls sollen auch geeignete Antigen-bindende Fragmente (Peptide) der Bindungsproteine mit verbesserten pharma kodynamischen und pharmakokinetischen Eigenschaften hergestellt werden und das jeweilige Bindungsmolekül (oder ein Fragment davon) durch ungezielte oder gezielte Mutagenese so modifiziert werden, daß verbesserte Bindungseigenschaften für das Radioimmunpharmakon resultieren.

Mehr als 100 Radionuklide emittieren Alpha-Teilchen. Als Alpha-Teilchen-Emitter sollen unter anderem folgende Radionuklide eingesetzt werden:

a) Wismut-213 (²¹³Bi),
b) Astatin-211 (²¹¹At),
c) und andere.

Rationale einer Radioimmuntherapie viraler Infektionen 1. Rationale der Verwendung von Alpha-Emittern

Alpha-Strahlung ist eine Korpuskularstrahlung. Durch Emission eines Alpha-Teilchens verliert der Kern eines Alpha-Strahlers eine positive Ladung von +2e und eine Masse von etwa 4 amu. Die emittierten Alpha-Teilchen besitzen eine mit weniger als 100 µm deutlich geringere Reichweite als Elektronen von Beta-Strahlern. Sie weisen aber eine höhere Energie auf und bewirken eine wesentlich dichtere Ionisation als Beta-Strahler (Zalutzky und Bigner 1996). Dies führt zu einer intensiveren Schädigung der Plasma membranen infizierter Zellen und einer deutlich gesteigerten Zytotoxizität, während nicht-infizierte Zellen einer geringeren unspezifischen Strahlenwirkung ausgesetzt sind. Dies ist wichtig, wenn sich beispielsweise HIV-infizierte Zellen disseminiert im gesamten Körper des Patienten verteilen.

Von den über 100 Radionukliden, die Alpha-Teilchen emittieren eignen sich die meisten wegen ihrer langen Halbwertszeit nicht für eine Radioimmuntherapie. Viele können zudem nur schwer und in zu geringer Quantität hergestellt werden, so daß bislang nur wenige Alpha-Strahler für die klinische Erprobung in Betracht gezogen worden sind. Die meisten Erfahrungen liegen mit der Anwendung von Astatin-211 (²¹¹At) und Wismut-212 (²¹²Bi) vor (Zweit 1996).

Astatin-211 erscheint für therapeutische Zwecke geeignet, weil es auf zwei Wegen zerfällt, die beide zur Emission von Alpha-Teilchen führen und weil es Röntgenstrahlung aussendet, die eine ausreichende Intensität aufweist, um Blut- oder Gewebsproben mit einem Gamma-Zähler zu untersuchen, oder um das therapeutische Verfahren mit bildge bende Verfahren wie der Single-Photon-Emissions-Comutertomographie (SPECT) zu analysieren (Turkington et al. 1993).

Wismut-212 wurde bereits mit monoklonalen Antikörpern konjugiert und im Tiermodell erfolgreich zur Elimination maligner Zellen eingesetzt (Kozak et a. 1986, Macklis et al. 1988).

Ein anderer Alpha-Strahler mit einer Halbwertszeit von 46 Minuten, Wismut-213 (²¹³BI), kann von den Erfindern vor Ort im Generator aus dem Mutternuklid Actinium (²²⁵Ac) erzeugt werden und soll daher in erster Linie als Komponente antiviral wirksamer Radioimmunkonjugate verwendet werden.

Die Wirkungen radioaktiver Strahlung auf Zellen und genetisches Material sind hinrei chend belegt (Übersichten in: Kauffmann et al. 1996, Sauer 1998). Die Grundlage der strahlenbiologischen Wirkungen stellt die strukturelle Schädigung der genetischen Infor mation (DNA) Virus-infizierter Zellen dar. Derart veränderte zelluläre DNA kodiert fehlerhafte Proteine, die ihre Funktion einbüßen. So verlieren nicht nur Enzyme, die für die Virus-Replikation unentbehrlich sind, ihre Funktion, sondern es kommt darüber hinaus auch zu Stoffwechselveränderungen in der Virus-infizierten Zelle. Dies rührt zur Eliminierung der Virus-infizierten Zellen durch reproduktiven Zelltod oder Apoptose. Darüber hinaus können Viren durch ionisierende Strahlung auch direkt inaktiviert werden (Follea et al. 1996).

Die Behandlung mit Radioisotopen ist in Deutschland bereits seit über 50 Jahren als Radiojodtherapie aus der Behandlung benigner und maligner Schilddrüsenerkrankungen bekannt. Diese stellt das bedeutendste Verfahren der nuklearmedizinischen Therapie dar und hat sich als überraschend nebenwirkungsarm erwiesen. Spätkomplikationen, insbe sondere eine Malignominduktion, konnten bis heute nicht nachgewiesen werden (Moser 1996, Reiners 1997).

Neuere Therapiemöglichkeiten mit Radioisotopen ergeben sich inzwischen außerdem mit ¹³¹J-markiertem Meta-Iodo-Benzyl-Guanidin (MIBG) bei der Behandlung metastasierter Phäochromozytome und Neuroblastome, durch die Radiosynoviorthese bei der rheumati schen Arthritis, durch intrakavitäre Instillation von ⁹⁰Y-Silikat bei Pleura- oder Perito nealkarzinose, bei der palliativen Schmerztherapie von Skelettmetastasen mit knochen affinen Substanzen wie ⁸⁹Sr, oder durch die Radiophosphorbehandlung der Polycythae mia vera (Moser 1996).

In der klinischen Prüfung befindet sich derzeit eine Therapie mit ¹³¹J-markiertem anti- CEA IgG beim kolorektalen Karzinom (Blumenthal et al. 1992, Blumenthal 1994), beim B-Zell-Lymphom (Kaminski et al 1993, Press et al. 1993, Press et al. 1995, Press et al. 1995).

Unter onkologischen Gesichtspunkten wird Bestrahlung auch erfolgreich zur Therapie des AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkoms eingesetzt, das durch das Humane Herpes-Virus 8 (HHV 8) induziert wird (Conill et al. 1997).

Der gezielte Einsatz von freien Radioisotopen zur Behandlung von Infektionen ist hinge gen bislang nicht erprobt worden. Er findet seine Legitimation aber in der Therapie solcher Infektionskrankheiten, die durch ihren chronischen Verlauf, die Häufigkeit und Schwere ihrer Folgeerkrankungen und eine mangelhafte konventionelle Therapierbarkeit charakterisiert sind.

2. Radioimmunpharmaka auf der Basis von Immunglobulinen

Grundlage einer Radioimmuntherapie von viralen Infektionen mit Immunglobulin-Konju gaten ist, daß virale Antigene oder Virus-induzierte Antigene in die äußere Membran infizierter Zellen integriert werden. Dies ist eine Eigenschaft, die für viele Viren bereits belegt wurde, so für die Flaviviren (Westaway und Goodman 1987, Ng et al. 1992), HSV (Schlehofer et al. 1979), Influenza-Viren (Boulan et al. 1980, Ciampor et al. 1981, Kohama et al. 1981, Hughey et al. 1992), Rabies-Viren (Revilla-Monsalve et al. 1985), EBV (Liebowitz et al. 1986), HBV (Saito et al. 1992, Gerber et al. 1988, Chu et al. 1997) und HIV (Timar et al. 1986, Rusche et al. 1987, Feremans et al. 1988, Desportes et al. 1989, Ikuta ct a1. 1989, Dennin et al. 1991, Dudhane et al. 1996).

Für Radioirnmunpharmaka auf der Basis von Immunglobulinen sollen daher als immu nologisch wirksame Komponenten der Radioimmunkonjugate monoklonale Antikörper oder deren Antigen-bindende Fragmente, die jeweils ein Epitop der viralen bzw. virusin duzierten Antigene auf der Plasmamembran infizierter Zellen erkennen und binden, Einsatz finden. Besonders geeignet erscheinen monoklonale Antikörper gegen ein möglichst stark konserviertes Epitop eines viralen Antigens. Der an den monoklonalen Antikörper bzw. dessen Antigen-bindendes Fragment konjugierte Alpha-Strahler schädigt dann gezielt die Virus-replizierende Zelle.

3. Radioimmunpharmaka auf der Basis von Rezeptormolekülen der Wirtszelle

Hintergrund einer Radioimmuntherapie viraler Infektionen mit Zellrezeptor-Konjugaten ist neben der Exprimierung viraler Proteine auf der Oberfläche infizierter Zeilen auch, daß die Adsorption der Viren an die Wirtszellen gezielt über einen Rezeptor auf der Zellmembran vermittelt wird. Eine derartige Rezeptor-vermittelte Adsorption wurde bereits für zahlreiche Viren belegt, beispielsweise für HIV (Dalgleish et al. 1984), EBV (Fingeroth et al. 1984), Polioviren (Leon-Monzon et al. 1995), Rabiesviren (Lentz et al. 1986), Influenza-C-Viren (Nishlmura et al. 1988), Masern-Viren (Dorig et al. 1993) HAV (Kaplan et al. 1996), HSV (Whitbeck et al. 1997), HBV (Treichel et al. 1997), HCV (Seipp et al. 1997), Coxsackie B3 (Shafren et al. 1997) und Adenoviren (Bergelson et al. 1998), um nur einige zu nennen.

Entsprechende rekombinante Rezeptormoleküle würden an die auf der Oberfläche infizierter Zellen exprimierten viralen Antigene binden und in der oben geschilderten Weise Radioisotope an die infizierte Zelle koppeln.

Herstellungsverfahren 1. Radioimmunpharmaka auf der Basis von monoklonalen Antikörpern

Die Entwicklung virusspezifischer monoklonaler Antikörper und die Überprüfung ihrer Kreuzreagibilitäten sind Grundlagen virologischer Forschungsarbeiten (Bergter 1990).

Identifizierung und Reinigung zellmembrangebundener viraler Proteine oder Peptide sind Stand der Technik (Eckert und Kartenbeck 1997). Ebenso sind die Methoden zur Herstellung muriner, humanisierter und humaner monoklonaler Antikörper sowie die Präparation Antigen-bindender mAk-Fragmente sind bekannt (Peters und Baumgarten 1990, Lidell und Weeks 1996).

Identifizierung und Isolierung viraler und virusinduzierter Antigene aus der Plasmamem bran infizierter Zellen und die Erzeugung monoklonaler Antikörper sollen im Beispiel 1 skizziert werden.

Beispiel 1

Durch immunhistologische und elektronenmikroskopische Voruntersuchungen kann zunächst geklärt werden, ob prinzipiell virale Proteine in die Zellmembran infizierter Zellen integriert sind, die einer Radioimmuntherapie zugänglich wären. Dazu wird beispielsweise die Bindung von virusspezifischen Antikörpern an infizierten Zellen durch Inkubation mit markierten murinen monoklonalen Antikörpern fluoreszenzmikioskopisch oder elektronenmikroskopisch nachgewiesen (Payne et al. 1990, Stirling 1990, Kaito et al. 1994, Sabri et al. 1997).

Lassen sich derartige Antigene in der Zytoplasmamembran nachweisen, muß geklärt werden, um welche Antigene es sich im einzelnen handelt. Hierzu können Virus-infizierte Zellen lysiert und die Membranproteine gelelektrophoretisch aufgetrennt werden. Auf Nitrozellulose geblottet können sie dann mit Antiseren oder murinen monoldonalen Antikörpern analysiert werden.

Für die Immunisierung und Gewinnung monoklonaler Antikörper ist die Reinigung der gefundenen, in die Zellmembran integrierten, viralen oder virusinduzierten Antigene erforderlich. Dazu können Viren in geeigneten Zellkultursystemen , beispielsweise HIV in H9-Zellen, MT-4-Zellen, MOLT-4-Zellen, HUT-78-Zellen u. a. (Bergter 1990) und HCV in DAUDI-Zellen (Nakajima et al. 1996), kultiviert und aus dem Zellkulturüber stand isoliert werden. Zunächst werden die Zellen und Zelltrümmer abzentrifugiert. Anschließend kann das Virus aus dem gereinigten Überstand durch Zentrifugation bei 27 000 × g sedimentiert werden. Das Viruspellet kann dann in Probenpuffer resuspen diert und gelelektrophoretisch aufgetrennt werden. Schließlich kann die Antigenfraktion isoliert werden, die dem gesuchten Antigen auf der Plasmamembran entspricht. Dieses Antigen kann zur Immunisierung von Mäusen und Herstellung monoklonaler Antikörper verwendet werden.

Die erzeugten monoklonalen Antikörper sollten im ELISA, Immunoblot und RIPA auf Kreuzreaktivitäten mit verschiedenen Virus-Isolaten überprüft werden. Der geeignete monoklonale Antikörper besitzt idealerweise eine breite Kreuzreaktivität und erfaßt dadurch die gesamte Quasispezies eines Infizierten.

Kann kein monoklonaler Antikörper gewonnen werden, der alle Virusisolate erkennt, so müssen Isolat-spezifische monoklonale Antikörper hergestellt werden, die dann gezielt zur Therapie des im Einzelfall nachgewiesenen Isolats eingesetzt werden könnten.

Für die Radioimmuntherapie kommen wie bereits dargelegt sowohl murine, als auch humane bzw. humanisierte monoklonale Antikörper und ggf. deren Antigen-bindende Fragmente in Frage.

2. Herstellung von Radioimmunpharmaka auf der Basis von Wirtsrezeptormolekülen

Wie ebenfalls bereits oben belegt, wurden inzwischen für eine ganze Reihe von Viren zelluläre Rezeptormoleküle identifiziert, die die Adsorption der Viren an die Oberfläche von Wirtszellen vermitteln. Die Methoden zur Identifizierung und Gewinnung solcher Rezeptormoloküle gehört zum Stand der Technik. Das Vorgehen soll im Beispiel 2 beschrieben werden.

Beispiel 2

Das betreffende Virus wird gelelektrophoretisch aufgetrennt, so daß die viralen Antigene isoliert werden können. An Gewebeproben und Zellkultursystemen können dann Bindungsstudien durchgeführt werden und der gesuchte, für die Adsorption des Virus verantwortliche zelluläre Rezeptor identifiziert werden (Dorig et al. 1993, Treichel et al. 1997). Dieser Rezeptor kann mit etablierten Methoden isoliert (Suzuki et al. 1983) und das Bindungsepitop eingehender analysiert werden, indem die Bindung des Antigens an einzelnen Spaltprodukten analysiert wird. Das Rezeptormolekül kann schließlich kloniert werden (Bergelson et al. 1998) und so in großem Maßstab für die Konjugation mit einem Radioisotop und den therapeutischen Einsatz weiter verarbeitet werden.

3. Konjugation geeigneter Radionuklide

Die monoklonalen Antikörper oder Wirtsrezeptormoleküle sollen mit einem Alpha- Emitter konjugiert werden. Die Konjugation von Radionukliden an Proteine ist hinrei chend beschrieben und Stand der Technik (Übersicht in: Eckert und Kartenbeck 1996).

Das Vorgehen soll im Beispiel 3 exemplarisch dargestellt werden, wenngleich verschie dene Methoden (z. B. Zalutzky et al. 1989) für bestimmte Konjugatkonstrukte mehr oder weniger geeignet sein können, so daß die methodischen Vorgehensweisen dem Einzelfall angepaßt und optimiert werden sollen.

Beispiel 3

Geeignete monoklonale Antikörper oder Rezeptormoleküle können zu therapeutischen Zwecken mit Hilfe der Chloramin T-Methode (Hunter und Greenwood 1962) nach der Anleitung von Eckert und Kartenbeck 1997 radioaktiv konjugiert werden. Hierzu wird ein Radioisotop kurzzeitig durch das von Chloramin T (N-Chlor-p-Toluen-4-sulfonamid, Na-Salz) in wässrigem Medium freigesetzte Hypochlorit oxidiert wird. Das stark elektrophile Radioisotop bindet dann in diesem Zustand vorzugsweise an die Benzolringe des im Protein enthaltenen Tyrosins. Zur Schonung der monoklonalen Antikörper bzw. Rezeptormolekule wird diese Reaktion nach kurzer Inkubationszeit mit einem Überschuß an Bisulfit beendet, wobei sowohl das restliche Chloramin T als auch oxidierte, aber noch ungebundene Radioisotope reduziert und damit inaktiviert werden. Gelelektrophoretisch kann das mAk-Radioisotop-Konjugat schließlich isoliert und zur intravenösen Verwen dung mit entsprechenden Hilfsstoffen weiter aufgearbeitet werden. Weitere Verfahren stehen ebenfalls zur Verfügung (Harrison und Royle 1984, Zalutsky et al. 1989).

Präklinische Untersuchungen

Zunächst sollen in-vitro-Untersuchungen zeigen, ob und mit welcher Affinität die Radioimmunkonjugate über die Antigenbindungsstelle der monoklonalen Antikörper oder Wirtsrezeptormoleküle an die entsprechenden Epitope viraler, in die Zellmembran integrierter Proteine Virus-infizierter Zellen binden und ob die Zellen durch die Radio isotop-vermitteite Bestrahlung geschädigt werden. Diese Untersuchungen können in geeigneten Zellkultursystemen durchgeführt werden.

An Nacktmäusen und anderen Tiermodellen könnten in den folgenden Schritten praklinische in-vivo-Untersuchungen zur Wirksamkeit der Radioimmuntherapie erfolgen, bevor die klinische Anwendung bei infizierten Patienten geprüft wird.

Anwendung am Patienten: Therapeutische Voraussetzungen

In verschiedenen Phase-I-Studien (Dosiseskalationsstudien) sollen die maximal tolerier baren Dosen (MTD) hinsichtlich Nebeneffekten, Pharmakokinetik und Immunogenität bestimmt werden. Durch die nachfolgenden klinische Untersuchungen (Phase-II- und -III-Studien) soll schließlich der Effekt einzelner Radioimmunpharmaka an kleinen Patientenkollektiven mit fortgeschrittener Erkrankung und an randomisierten Patienten kollektiven geprüft werden (Fiebig 1995).

Die kurze Halbwertszeit der Radionuklide macht eine zentrumsnahe Präparation bzw. schnellen Transport des Radioimmunkonjugats zum Therapeuten erforderlich. Voraus setzung für die Therapie von Patienten mit HIV, viralen Hepatitiden und ggf. anderen viralen Infektionen mit Hilfe von kurzlebigen Radionukliden ist daher die Einrichtung spezialisierter interdisziplinärer Zentren, in denen neben einer fachgerechten Therapie der Infizierten auch die zeitgerechte Applikation des Radioimmunkonjugates unter strahlen schutzrechtlichen Aspekten gewährleistet ist.

Mögliche Voraussetzung einer erfolgreichen Therapie kann auch die prätherapeutische Verminderung der Viruslast sein, die durch Vorbehandlung des Patienten mit antiviralen bzw. antiretroviralen Präparaten erzielt werden kann. Dadurch gelangt eine höhere Dosis des Radioimmunpharmakons an die Virus-replizierenden Zellen, wodurch der therapeuti sche Effekt verbessert wird. Anderenfalls würde das Radioimmunpharmakon möglicher weise von freien Viruspartikeln abgefangen und die zytotoxische Wirkung vermindert werden.

Für die Radioimmuntherapie ist voraussichtlich eine mehrtägige stationäre Unterbringung erforderlich, um den Patienten bis zum Abklingen der Strahlung von der Umgebung abzuschirmen. Das Radioimmunpharmakon kann peripher- oder zentralvenös als Bolus, Kurzinfusion oder Dauertherapie über mehrerer Tage mit einer Dosis von voraussichtlich 25-300 mCi appliziert werden. Die Gabe erfolgt einmalig oder in Form von Zyklen im mehrwöchigen Abstand. Gegebenenfalls ist bei bestehender Überempfindlichkeit gegen über dem monoklonalen Antikörper oder gegenüber dem Rezeptormolekül unmittelbar vor Applikation des Präparates eine Vorbehandlung mit einem Glukokortikoid, einem Antihistaminikum und einem H₂-Antagonisten erforderlich (Lorenz 1994).

Nach Applikation des Radioimmunpharmakons muß vorübergehend theoretisch mit hepatischen und hämatologischen Nebenwirkungen sowie einem erhöhtem Risiko für opportunistische Infektionen gerechnet werden. Gegebenenfalls ist aus diesem Grund die in diesem Patentantrag beschriebene Radioimmuntherapie mit einer Stammzelltransplan tation zu verbinden.

Die mit diesen Radioimmunkonjugaten erzielte Vorteile

Gegenüber dem Einsatz der in den o.g. Patentanträgen von dem Erfinder Dr. W. Bergter beschriebenen Radioimmunpharmaka besteht der Vorteil des Einsatzes von Alpha- Strahlern im höheren linearen Energietransfer (LET) und der geringeren Reichweite der emittierten Alpha-Teilchen.

Ein weiterer Vorteil ist, daß die Virus-infizierten Zellen noch selektiver geschädigt werden, als durch Beta-Strahler. Die Radioimmunkonjugate binden spezifisch mit Hilfe des mAk-Anteils an ein auf der infizierten Zelle exponiertes virales Protein und geben ihre Strahlung direkt an die Zelle ab, ohne umliegende gesunde Zellen wesentlich zu schädigen.

Der bedeutendste Vorteil einer Therapie schwerer chronischer Infektionskrankheiten mit den hier beschriebenen Radioimmunkonjugaten gegenüber derzeitigen antiviralen und antiretroviralen Therapien besteht darin, daß Virus-infizierte Zellen direkt geschädigt und eliminiert werden, wodurch die Möglichkeit einer komplette Heilung besteht.

Zudem ist es als Vorteil zu betrachten, daß die hier beschriebenen Pharmaka durch die Spezifität der monoklonalen Antikörper für bestimmte, jeweils die Infektiosität determi nierende, hoch konservierte Epitope verschiedener Viren zur Behandlung eines breiten Spektrums von Isolaten eines Virus geeignet sind. Dies ist angesichts der starken Muta tionsfreudigkeit verschiedener Viren sehr wichtig. Das gleiche gilt für den Einsatz von zellulären Rezeptormolekülen.

Ein großer Vorteil liegt außerdem in der zur üblichen antiviralen Therapie vergleichs weise guten subjektiven Verträglichkeit und der bekannten Nebenwirkungsarmut radioimmunologischer Therapien begründet.

Als vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung kann sich die Verwendung humanisierter bzw. humaner monoklonaler Antikörper erweisen, wodurch die Immunogenität muriner mAk-Konjugate umgangen werden kann. Diese kann sich andererseits aber auch als sinnvoll erweisen, wenn es gilt, das Immunsystem zusätzlich gegenüber der HCV-Infek tion zu sensibilisieren.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung betrifft die Verwendung von Fragmente mono klonaler Antikörper oder Zellrezeptoren als immunologisch wirksame Komponente der Radioimmunkonjugate, da durch die geringere Molekülgröße eine bessere Gewebe gängigkeit und Penetrationsfähigkeit durch die Blut-Hirn-Schranke erzielt werden kann.

Eine enorme präventivmedizinische Bedeutung kommt der Radioimmuntherapie viraler Infektionen insbesondere in den Fällen zu, in denen es darum geht, durch eine präventive Viruseliminierung onkologische Erkrankungen zu verhindern, wie sie beispielsweise als Folge von HIV-, HTLV-1, HTLV-2, HHV8-, HCV- und HBV-Infektionen bekannt sind.

Kriterien des Erfindungswerts

Neuartig im Sinne der im Hauptantrag beschriebenen Erfindung sind der Einsatz von Radioisotopen und die Herstellung von Radioimmunpharmaka durch Konjugation mit Virus-spezifischen monoklonalen Antikörpern zur Identifizierung und selektiven Elimi nation infizierter Zellen bei der chronischen Virus-Infektionen. Mit diesem Zusatzantrag werden die in den o.g. Patentanträgen beschriebenen Erfindungen um den Einsatz von Alpha-Strahlern als Komponente verschiedener Radioimmunpharmaka zur Therapie viraler Infektionen erweitert.

Wenngleich Beta- und Alpha-Strahler bereits in die Radioimmuntherapie maligner Erkrankungen Eingang gefunden haben, so handelt es im Gegensatz dazu hier nicht nur um eine völlig neue Indikation für Radioimmunpharmaka allgemein, sondern um einen grundsätzlich anderen therapeutischen Ansatz und Anspruch für sehr spezifisch konstru ierte antivirale Präparate mit einem jeweils sehr genau definierten Einsatzgebiet. Während bei der Radioimmuntherapie maligner Erkrankungen monoklonale Antikörper gegen zelleigene, tumorspezifische Proteine verwendet werden, wurden bei den hier beschriebenen Radioimmunkonjugaten monoklonale Antikörper bzw. deren Fragmente oder andere Proteine bzw. Peptide mit therapeutischer Zielsetzung speziell gegen virale (d. h. nicht zelleigene!) und virusinduzierte (d. h. nicht Zelltyp-spezifische) Proteine beschrieben.

Der Gegenstand dieses Patentantrags beruht auch insofern auf einer erfinderischen Tätigkeit, als nach bester Kenntnis der Erfinder ein therapeutischer Einsatz von Radioimmunpharmaka, insbesondere als Konjugate mit Alpha-Strahlern, in der gesamten Virologie bisher nicht beschrieben wurde. Dies bedeutet insbesondere auch, daß sich die Idee zu dieser Erfindung keineswegs in naheliegender Weise aus dem Stand der Technik ergibt. Der Nutzen einer nuklearmedizinischen Therapie viraler Infektionen ergibt sich immer dann, wenn es sich um eine chronische, mit schwerwiegenden Folgeschäden verbundene virale Infektion handelt, die eine nicht unbeträchtlichen Mortalität zur Folge hat. Da sich durch antivirale und antiretrovirale Präparate in den vergangenen Jahren keine Verbesserung der Heilungsraten chronischer Virusinfektionen, wie HIV-Infektion, Hepatitis C und Hepatitis B erzielen ließen, sind grundsätzlich neuartige Therapie konzepte von größter Bedeutung.

Der Gegenstand des Patents ist als Pharmazeutikum gewerblich anwendbar. Die Konju gate lassen sich mit den in diesem Patentantrag beschriebenen Verfahren herstellen und nach in-vitro Untersuchung an Virus-replizierenden Zellkulturen und erfolgreicher tierex perimenteller Überprüfung an Tiermodellen (z. B. Nacktmäusen) in absehbarer Zeit für die Therapie von Infizierten zum Einsatz bringen. Dadurch könnte den weltweit schät zungsweise 100 Millionen HIV-, HBV- und HCV-Infizierten eine zusätzliche Chance auf Heilung geboten werden.

Literatur

1. Bergelson JM, Krithivas A, Celi L, et al.: The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie B viruses and adenoviruses. J Virol 1998; 72 (1): 415-419.
2. Bergter W: Herstellung zehn monoklonaler Antikörper gegen das Affen-Immundefi zienzvirus SIVagmTYO-7 aus der Familie der Retroviren. Dissertation, Hannover 1990.
3. Blumenthal RD, Sharkey RM, Haywood L, et al.: Targeted therapy of athymic mice bearing GW-39 human colonic cancer micrometastases with ¹³¹J-labeled monoclonal antibodies. Cancer Res 1992; 52: 6036-6044.
4. Blumenthal RD, Sharkey RM, Natale AM, et al.: Comparison of equitoxic radioim munotherapy and chemotherapy in the treatment of human colonic cancer xenografts. CancerRes 1994; 54: 142-151.
5. Boulan ER, Pendergast M: Polarized distribution of viral envelope proteins in the plasma membrane of infected epitheiial cells. Cell 1980; 20 (1): 45-54.
6. Ciampor F, Sidorenko EV, Taikova NV: UItrastructural localization by immunoper oxidase techniques of influenza virus antigens in abortive infection of L cells. Acta Virol 1981; 25 (6): 381-389.
7. Conill C, Alsina M, Verger E, et al.: Radiation therapy in AIDS-related cutaneous Kaposi's sarcoma. Dermatology 1997; 195 (1): 40-42.
8. Chu CM, Liaw YF: Natural history of chronic hepatitis B virus infection: an immuno pathological study. J Gastroenterol Hepatol 1997; 12 (9-10): 5218-222.
9. Dalgleish AG, Beverly PC, Clapham PR et al.: The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AJDS retrovirus. Nature 1984; 312 (5996): 763-767.
10. Dennin RH, Beyer A: Application of scanning electron microscopy (SEM) and microbead techniques to study the localization of p24 and p18 antigens of HIV-1 on the surface of HIV-1-infected H9-lymphocytes. J Microsc 1991; 164 (Pt 1): 53-60.
11. Dorig RE, Marcil A, Chopra A, et al.: The human CD46 molecule is a receptor for measles virus (Edmonstron strain). Cell 1993; 75 (2): 295-305.
12. Desportes I, Bonnet D, Nicol I, et al.: Expression of HIV antigens at the surface of infected T4 cells: irnmunoelectron microscopic evidence of an immunogenic phase prior to the viral release. AIDS Res Hum Retroviruses 1989; 5 (1): 107-114.
13. Dudhane A, Wang ZQ, Orlikowsky T, et al.: AIDS patient monocytes target CD4 T cells for cellular conjugate formation and deletion through the membrane expression of HIV-1 envelope molecules. AIDS Res Hum Retroviruses 1996; 12 (10): 893-899.
14. Eckert WA und Kartenberg J: Proteine: Standardmethoden der Molekular- und Zell biologie. Springer, Heidelberg 1997: 237-240.
15. Feremans WW, Huygen K, Menu R, et al.: Fifty cases of human immunodeficiency virus (HIV) infection: immunoultrastructural study of circulating lymphocytes. J Clin Pathol 1988; 41(1): 62-71.
16. Fiebig HH: Durchführung von klinischen Studien. In Zeller WJ, Zur Hausen H (Hrsg): Onkologie, Grundlagen, Diagnostik, Therapie, Entwicklungen. Ecomed, Landsberg/Lech 1995; W-2: 1-5.
17. Fingeroth JD; Weis JJ; Tedder TF et al.: Epstein-Barr virus receptor of human B lymphocytes is the C3d receptor CR2. Proc Natl Acad Sci U S A 1984; 81 (14): 4510-4514.
18. Follea G, Herve P, Andreu G, et al.: Viral attenuation of labile blood products. Transfus Clin Biol 1996; 3 (2): 113-123.
19. Gerber MA, Sells MA, Chen ML, et al.: Morphologic, immunohistochemical, and ultrastructural studies of the production of hepatitis B virus in vitro. Lab Invest 1988; 59 (2): 173-180.
20. Harrison A, Royle L: Preparation of a 211At-IgG conjugate which is table in vivo. Int J Appl Radiot Isot 1984; 35 (11): 1005-1008.
21. Hughey PG, Compans RW, Zebedee SL, et al.: Expression of the influenza A virus M2 protein is restricted to apical surfaces of polarized epithelial cells. J Virol 1992; 66 (9): 5542-5552.
22. Hunter WM, Greenwood FC: Preparation of iodine-131 labeled human growth hormone of high specific activity. Nature 1962; 194: 495-496.
23. Ikuta K, Morita C, Miyake S, et al.: Expression of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gag antigens on the surface of a cell line persistently infected with HIV-1 that highly expresses HIV-1 antigens. Virology 1989; 170 (2): 408-417.
24. Kaito M, Watanabe S, Tsukiyama-Kohara K, et al.: Hepatitis C virus particle detected by immunoelectron microscopic study. J Gen Virol 1994; 75 (Pt 7): 1755-1760.
25. Kaminski MS, Zasadny KR, Francis IR, et al.: Radioimmunotherapy of B-cell lymphoma with [¹³¹J]anti-B1 (anti-CD20) antibody. N Engl J Med 1993; 329: 459-465.
26. Kaplan G, Totsuka A, Thompson P, et al.: Identification of a surface glycoprotein on Alrican green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus. EMBO J 1996; 15 (16): 4282-4296.
27. Kauffmann G, Moser E, Sauer R: Radiologie. Grundlagen der Radiodiagnostik, Radiotherapie und Nuklearmedizin. Urban und Schwarzenberg München 1996.
28. Kohama MT, Cardenas JM, Seto JT: Immunoelectron microscopic study of the detection of the glycoproteins of infiuenza and Sendai viruses in infected cells by the immunoperoxidase method. J Virol Methods 1981;3 (5): 293-301.
29. Kozak RW, Atcher RW, Gansow OA; et al.: Bismuth-212-labeled anti-Tac mono clonal antibody: alpha-particle-emitting radionuclides as modalities for radioimmu notherapy. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83 (2): 474-478.
30. Lentz TL, Benson RJ, Klimowicz D, et al.: Binding of rabies virus to purified Torpedo acetylcholine receptor. Brain Res. 1986; 387 (3): 211-219.
31. Leon-Monzon ME, I11a I, Dalakas MC: Expression of poliovirus receptor in human spinal cord and muscle. Ann N Y Acad Sci 1995; 753: 48-57.
32. Liddell E und Weeks I: Antikörper-Techniken. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1996.
33. Liebowitz D, Wang D, Kieff E: Orientation and patching of the latent infection membrane protein encoded by Epstein-Barr Virus. J Virol 1986; 58 (1): 233-237.
34. Lorenz R: Bildgebende Verfahren. In: Classen M, Diehl V, Kochsiek K: Innere Medizin. Urban & Schwarzenbeck München 1994 (3. Auflage): 39-63.
35. Macklis RM, Kinsey BM, Kassis AI, et al.: Radioimmuntotherapy with alpha-particle emitting immunoconjugates. Science 1988; 240 (4855): 1024-1026.
36. Moser E: Nuklearmedizin. In Kauffmann G, Moser E und Sauer R: Radiologie. Urban und Schwarzenberg, München 1996.
37. Nakajima A, Hijikata M, Yoshlkura H, et al.: Charakterization of long-term cultures of hepatitis C virus. J Virol 1996; 70: 3325-3329.
38. Ng Ml, Choo Wk, Ho Yl: Detection of flavivirus antigens in purified infected Vero cell plasma membranes. J Virol Methods 1992; 39 (1-2): 125-138.
39. Nishimura H, Sugawara K, Kitame F, et al.: Attachinent of influenza C virus to human erythrocytes. J Gen Virol 1988; 69 (Pt 10): 2545-2553.
40. Payne HR; Storz J; Henk WG: Bovine coronavirus antigen in the host cell plasma lemma. Exp Mol Pathol 1990; 53 (2): 152-159.
41. Peters JH und Baumgarten H: Monoklonale Antikörper. Herstellung und Charakteri sierung. Springer, Berlin 1990 (2. Auflage).
42. Press OW, Eary JF, Appelbaum FR, et al.: Radiolabeled-antibody therapy of B-cell lymphoma with autologous bone marrow support. N Engl J Med 1993; 329: 1219-1224.
43. Press OW, Eary JF, Appelbaum FR, et al.: Phase II trial of ¹³¹J-B1(anti-CD20) anti body therapy with autologous stem cell transplantation for relapsed B-cell lymphoma. Lancet 1995; 346: 336-340.
44. Press OW, Eary JF, Appelbaum FR, et al.: Treatment of relapsed B-cell lymphomas with high dose radioimmunotherapy and bone marrow transplantation. In Goldenberg DM (ed.): Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies. Boca Raton, CRC Press 1995: pp 229-237.
45. Reiners C: Zum Krebs- und genetischen Risiko nach Radioiodtherapie der Hyperthy reose. Der Nuklearmediziner 1997; 5 (20): 331-334.
46. Revilla-Monsalve C, Hernandez-Jauregui P, Silva-Lemoine E: Immunoperoxidase cell surface localization of rabies virus antigen in tissue cultures at a low viral multiplicity. Arch Invest Med (Mex) 1985; 16 (1): 11-17.
47. Rusche JR, Lynn DL, Robert-GuroffM, et al.: Humoral immune response to the entire human immunodeficiency Virus envelope glycoprotein made in insect cells. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84 (19): 6924-6928.
48. Sabri S, Richelme F, Pierres A et al.: Interest of image processing in cell biology and immunology. J Immunol Methods 1997; 208 (1): 1-27.
49. Saito T, Kamimura T, Ishibashi M, et al.: Electron microscopic study of hepatitis B virus-associated antigens on the infected liver cell membrane in relation to analysis of immune target antigens in chronic hepatitis B. Gastroenterol Jpn 1992; 27 (6): 734-744.
50. Sauer R: Strahlenbiologie. In: Kauffmann G, Moser E und Sauer R: Radiologie. Urban und Schwarzenberg, München 1996: 31-62.
51. Sauer R: Strahlentherapie und Onkologie für MTA-R. Urban und Schwarzenberg, München 1998.
52. Seipp S, Mueller HM, Pfaff E, et al.: Establishment of persistent hepatitis C virus infection and replication in vitro. J Gen Virol. 1997; 78 (Pt10): 2467-2476.
53. Schlehofer JR, Hampl H, Habermehl KO: Differences in the morphology of herpes simplex virus infected cells: I. Comparative scanning and transmission electron micro scopic studies on HSV-1 infected HEp-2 and chick embryo fibroblast cells. J Gen Virol 1979; 44 (2): 433-442.
54. Shafren DR, Williams DT, Barry RD: A decay-accelerating factor-binding strain of coxsackievirus B3 requires the coxsackievirus-adenovirus receptor protein to mediate lytic infection of rhabdomyosarcoma cells. J Virol 1997; 71(12): 9844-9848.
55. Stirling JW: Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labe ling and preparation techniques. J Histochem Cytochem 1990; 38 (2): 145-157.
56. Suzuki Y, Suzuki T, Matsumoto M: Isolation and charaeterizationof receptor sialo glycoprotein for hemaggiutinating Virus of Japan (Sendai virus) from bovine erythrocyte membrane. J Biochem (Tokyo) 1983; 93 (6): 1621-1633.
57. Timar J, Nagy K, Lapis K: Morphologic and immunoelectronmicroscopic identifica tion of human T-cell lymphotropic virus type III (HTLV-III). Histol Histopathol 1986; 1 (1): 43-47.
58. Treichel U, Meyer zum Büschenfelde, Dienes H-P et al.: Receptor-mediated entry of hepatitis B virus particles into liver cells. Arch Virol 1997; 142: 493-498.
59. Turkington TG, Zalutzky MR, Jaszczak RJ, Garg P, Vaidynathan G, Coleman RE. Measuring astatine-211 distributions with SPECT. Phys Med Biol 1993; 38: 1121-1130.
60. Westaway EG, Goodman MR: Variation in distribution of the three flavivirus-specific glycoproteins detected by immunofluorescence in infected Vero cells. Arch Virol 1987; 94 (3-4): 215-228.
61. Whitbeck JC, Peng C, Lou H, et al.: Glycoprotein D of herpes simplex virus (HSV) binds directly to HVEM, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily and a mediator of HSV entry. J Virol 1997; 71 (8): 6083-6093.
62. Zalutzky MR und Bigner DD: Radioimmunotherapy with α-particle emitting radioimmunoconjugates. Acta Oncol 1996; 35(3): 373-379.
63. Zalutzky MR, Garg PK, Friedmann HS et al.: Labeling monoclonal antibodies and F(ab')2 fragments with the alpha-particle emitting nuclide astatine-211: preservation of immunoreactivity and in vivo localizing capacity. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86 (18): 7149-7153. 64. Zweit J: Radionuclides and carrier moiecules for therapy. Phys Med Biol 1996; 41: 1905-1914.

Claims

1. Radioimmunkonjugate zur in-vivo-Elimination virus-replizierender Zellen bei HIV-1-, HIV-2-, HTLV-1-, HTLV-2-, HBV-, HCV-, HDV-, HHV8- und anderen chronischen Virus-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als immunologisch wirksame Komponente

a) einen monoklonalen Antikörper bzw. dessen Antigen-bindendes Fragment gegen ein auf der Plasmamembran Virus-infizierter Zellen exprimiertes virales oder Virus-induziertes Antigen, oder
b) ein Rezeptorrnolekül bzw. ein Fragment des Rezeptormoleküls mit Affinität zu einem Epitop der auf der Plasmamembran infizierter Zellen exprimierten viralen Strukturproteine, oder
c) ein durch zufällige bzw. gezielte Mutagenese modifiziertes Fragment des zellulären Rezeptormoleküls mit Affinität zu einem Epitop der auf der Zellmembran infizierter Zellen exprimierten viralen Strukturproteine,
und daß sie als radioaktive Komponente einen Alpha-Strahler vorzugsweise mit kurzer Halbwertszeit und geringer Reichweite, wie beispielsweise
d) Wismut-213 (²¹³Bi),
e) Astatin-211 (²¹¹At),
f) oder andere
zusammen mit pharmazeutischen Trägern und / oder Hilfsstoffen enthalten.

2. Verfahren zur Herstellung des Radioimmunkonjugats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

a) murine oder humanisierte bzw. humane monoklonale Antikörper hergestellt werden und in therapeutischer Absicht mit Radioisotopen konjugiert werden,
b) Fragmente dieser monoklonalen Antikörper hergestellt werden und in therapeutischer Absicht mit Radioisotopen konjugiert werden,
c) zelluläre Rezeptormolekule bzw. deren Fragmente zur Expression in Zellkultursystemen gebracht werden, um sie anschließend mit Radioisotopen in therapeutischer Absicht zu konjugieren, und
d) gegebenenfalls gezielten Verbesserung der Antigenaffinität, Pharmako dynamik, Pharmakokinetik und Verträglichkeit am Rezeptormolekül oder dessen synthetische Fragmente unter Verwendung rechnergestützten Moleküldesigns und molekularbiologischen Techniken vorgenommen werden.

3. Verwendung des Radioimmunkonjugats nach Ansprüchen 1 und 2 zur Therapie verschiedener viraler Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das für das jeweilige Virusisolat spezifische Radioimmunkonjugat intravenös unter ein- bis mehrtägiger stationärer Strahlenabschirmung mit einer Gesamtkörperdosis vorzugsweise zwischen 50 bis 300 mCi einmalig oder in mehreren Zyklen appliziert wird.

4. Verwendung des Radioimmunkonjugats nach Ansprüchen 1, 2 und 3 zur Therapie, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Behandlung einer HIV-Infektion gegebenenfalls im Anschluß an oder während einer antiretroviralen Standardtherapie erfolgt, oder
b) die Behandlung einer HCV, HBV, oder HDV gegebenenfalls im Anschluß an oder während einer antiviralen Therapie mit IFN-α, ggf. in Kombination mit einer anderen antiviralen Substanz, wie Ribavirin erfolgt, und/oder
c) daß die Behandlung vor, während oder nach einem operativen Eingriff (z. B. Transplantation einer infolge viraler Hepatitis zirrhotisch umgebauten Leber, Resektion eines durch eine virale Hepatitis induzierten hepatozellulären Karzinoms, oder ähnliche Eingriffe) erfolgt und/oder
d) unter dem Schutz einer Stammzelltransplantation erfolgt.