DE19825509A1 - Biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure und deren Modifikation - Google Patents
Biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure und deren ModifikationInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, enthaltend wenigstens ein Gen mit einer für die Enzym-Synthese von wenigstens einer Polyasparaginsäure, Modifikation hiervon und/oder Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen kodierenden Nukleotidsequenz sowie Organismen, enthaltend diesen Vektor. Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung der Organismen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Polyasparaginsäure und Modifikation hiervon.
Description
Die Erfindung betrifft die biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure, deren
Modifikationen und Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen mittels
gentechnisch veränderter ein- oder mehrzelliger Organismen.
Kristallisations- und Agglomerationsvorgänge gehören als biologische Mineralisation
zu den grundlegenden Prozessen in der belebten Natur. So sind sie beispielsweise
am Skelett- oder Schalenaufbau in lebenden Organismen beteiligt. In der Natur
werden diese Mineralisationsvorgänge durch natürlich vorkommende Proteine und
Polysaccharide reguliert. (S. Weiner, Biochem. 22, (1983), 4139-45; C. S. Sikes, A.
P. Wheeler, in Chemical Aspects of Regulation of Mineralisation., Eds. C. S. Sikes,
A. P. Wheeler University of South Alabama Publ. Services (1988), 15-20).
Unglücklicherweise treten sowohl in der Natur als auch im industriellen Bereich auch
nicht erwünschte Mineralisationsvorgänge auf und führen zu hartnäckigen störenden
Niederschlägen und Verkrustungen wie beispielsweise Zahn Plaque Organ Steinen
oder im technischen Bereich Verkrustungen an Wärmetauscheroberflächen oder
Kühltürmen Partikelagglomerationen in Pigmentdispersionen, Verkrustungen auf
harten (z. B. Glas Metall) und weichen (Textil) Oberflächen.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Vorschläge zur Verhinderung oder
Beseitigung dieser Ablagerungen gemacht. So beschreiben die Patente US 4 534
881, US 4 585 560, US 4 587 021 die Inhibierung von Calciumcarbonat-
Niederschlägen durch Proteinfraktionen, Polysaccharidfraktionen oder
Polyaminosäurefraktionen aus Calciumcarbonat bildenden Organismen wie
Crustaceen etc..
Weiterhin wird in der Literatur die Inhibierung mineralischer Niederschläge durch
polyanionische hydrophobe Polypeptide mit Block-Copolymer Struktur und
verwandte phosphorylierte Polypeptide (US 4 868 287) geschildert. Die
verwendeten Polypeptide werden durch peptidchemische Methoden hergestellt (WO
92/17194).
Da die genannten Polypeptide ihren polyanionischen Charakter durch ihren
Aspaginsäuregehalt erhalten, wird Homo- und Copolymere der Asparaginsäure
vorgeschlagen. Diese bislang bekannten Polyasparaginsäuren werden durch
chemische Synthese erhalten (Kovacs et al. J. Org. Chem, 26 (1961) 1084-1091;
Neri et al J. med. Chem., 16 (1973), 893; US 4 839 461; US 5 057 597).
Biotechnische Methoden werden für die Herstellung bisher nicht eingesetzt.
Derartige Verfahren zur Herstellung von Homo- und Copolymeren der
Asparaginsäure sind aber aufgrund des schonenderen Syntheseprocesses sowie
der Verwendung nachwachsender Rohstoffe eine interessante Alternative.
Bislang wurden in der Natur drei unterschiedliche Polyaminosäuren, nämlich Poly-γ-
Glutamat, Poly-ε-Lysin und Poly-α-Arginylaspartat (Cyanophycin) gefunden. Poly-γ-
Glutamat wird von verschiedenen Gram-positiven Bakterien wie z. B. Bacillus
licheniformis, Bacillus subtilis natto, oder Bacillus anthracis produziert. Poly-ε-Lysin
wird von Streptomyces albulus hergestellt. Poly-α-Arginylaspartat wird von vielen
Cyanobakterien wie beispielsweise Spirulina platensis, Aphanocapsa PCC 6308
oder Anabena cylindrica produziert. Die Synthese erfolgt auf einem non
ribosomalem Weg, wobei ein Polypeptid mit polydisperser
Molekulargewichtsverteilung erhalten und in Form von Cyanophycin-Granalien im
Zellinneren gelagert wird.
Bisher ist lediglich die biotechnische Herstellung von Poly-γ-Glutamat unter
Verwendung von Bacillus subtilis bzw. Bacillus licheniformis bekannt. (JP 1-174397
(1989), JP 43-24472 (1969) und US 2 895 882). Die Produktion Polyasparaginsäure
auf biotechnischem Weg ist jedoch bisher nicht möglich.
Ein Multiarginylpolyaspartat-Polypeptid folgender Struktur (Cyanophycin)
R1: ∼ OH, oder Arginyl
n: 5-400
wird zwar von den verschiedenen Cyanobakterien produziert. Das Cyanophycin wird bei den bisher untersuchten Organismen aber nicht in einer für eine technische Umsetzung ausreichenden Menge produziert.
n: 5-400
wird zwar von den verschiedenen Cyanobakterien produziert. Das Cyanophycin wird bei den bisher untersuchten Organismen aber nicht in einer für eine technische Umsetzung ausreichenden Menge produziert.
Das Cyanophycin wird von den Zellen während der frühen stationären
Wachstumsphase synthetisiert und fungiert als Stickstoff-, Kohlenstoff- und
Energiereserve (Simon, R. D. 1976. Biochim. Biophys. Acta. 422: 407-418;
Makkeras, A. H., R. C. Youens, R. C. Weir und G. D. Smith. 1990. J. Gen. Microbiol.
136: 2049-2056). Die Biosynthese wird stimuliert durch bestimmte
Kulturbedingungen (Überschuß an Stickstoff oder Kohlenstoff, Limitierung durch
Phosphor oder Schwefel, geringe Lichtintensität, geringe Temperatur). Bei vielen
Heterocysten-bildenden Cyanobakterien wird die Cyanophycin-Synthese durch die
Supplementierung mit Ammonium angeregt nicht jedoch durch Nitrat. Bei diesen
Cyanobakterien ist die Biosynthese von Cyanophycin auf die Heterocysten
konzentriert (Liotenberg, S., D. Campell, R. Rippka, J. Houmard, N. T. Demarsac.
1996. Microbiol. UK. 142: 611-622; Gypta, M., N. G. Car. 1981. J. Gen. Microbiol.
125: 12-23). Cyanophycin akkumuliert intrazellulär in Form konfluenter Areale.
Die Molekulargewichte von gereinigtem Cyanophycin liegen im Bereich von 25 000
bis 100 000 Da, was einem Polymerisationsgrad von 100 bis 400 entspricht
(Makkeras, H., N. M. Dew Chazal, and G. D. Smith. 1990. J. Gen. Microbiol.
136: 2057-2065). Isoliertes Cyanophycin wird durch keine bekannte Protease
abgebaut. Jedoch werden aus Cyanophycin durch Zellextrakt von Anabaena
cylindrica Arginin-Aspartat-Dipeptide freigesetzt, und der Zellextrakt von
Aphanocapsa PCC6308 katalysiert die Freisetzung von Argininmolekülen aus dem
Polymer (Allen, M. M., F. Hutchison und P. J. Wether. 1980 J. Bacteriol. 141: 687-
693; Allen, M. M., R. Morris und W. Zimmermann. 1984. Arch. Microbiol. 138: 119-
123).
Nur wenig ist bekannt über die Biosynthese von Cyanophycin. Durch die
Unempfindlichkeit der Biosynthese gegenüber Translationshemmern wie
Chloramphenicol wurde klar gezeigt, daß das Polymer über einen nicht-ribosomalen
Weg synthetisiert wird (Simon, R. D. 1973. Arch. Mikrobiol. 92: 115-122; Simon, R.
D. 1976. Biochim. Biophys. Acta. 422: 407-418). Der vorliegenden Erfindung liegt
nunmehr die Aufgabe zugrunde die biotechnische Herstellung von
Polyasparaginsäure, Modifikationen und/oder Polyasparaginsäure Verbindungen
zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch einen Vektor bzw. Vektoren enthaltend wenigstens ein
Gen mit einer für die Enzym-Synthese von wenigstens einer Polyasparaginsäure,
Modifikationen hiervon und/oder Polyasparaginsäure enthaltenenden Verbindungen
kodierenden Nukleotidsequenz gelöst.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Cyanophycin - Synthetase - Gen. Besonders
bevorzugt ist ein Cyanophycin-Synthetase-Gen mit der für die in Fig. 1
angegebenen Aminosäuresequenz oder deren Allelvarianten kodierenden
Nukleotidsequenz. Ein Beispiel für einen erfindungsgemäß einsetzbaren Vektor ist
der Fig. 3 zu entnehmen.
Die Erfindung schließt auch Teilsequenzen dieser DNA sowie funktionelle
Äquivalente ein. Unter funktionellen Äquivalenten sind solche Derivate zu verstehen,
bei denen Nucleobasen ausgetauscht wurden (Wobbelaustausche), ohne die
Funktion zu ändern. Auch auf Proteinebene können Aminosäuren ausgetauscht
werden, ohne daß es eine Veränderung der Funktion zur Folge hat.
Voraussetzung für die Einsetzbarkeit der erfindungsgemäßen Vektoren ist weiterhin,
daß sie in den jeweiligen Organismen bzw. Zellen replizierbar sind.
Der erfindungsgemäße Vektor kann bzw. Vektoren können in ein- oder mehrzellige
Organismen eingebracht werden. Vorzugsweise werden Mikroorganismen
verwendet. Besonders bevorzugt ist hierbei wiederum, daß der Vektor in Bakterien
eingeschleust wird bzw. Vektoren eingeschleust werden.
Grundsätzlich können beliebige Bakterien zum Einsatz kommen. Demgemäß kann
der erfindungsgemäße Vektor bzw. können die erfindungsgemäßen Vektoren auch
in Cyanobakterien eingebracht werden. Das heißt, es kommen beispielsweise
Aphanocapsa-Stämme in Betracht. In einer erfindungsgemäß besonders
bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor bzw. werden die erfindungsgemäßen
Vektoren in das Bakterium Escherichia coli eingeschleust. Erfindungsgemäß
bevorzugt sind demgemäß auch Vektoren, die in Escherichia coli replizierbar sind.
Durch den Einsatz der so geänderten Organismen kann überraschend in
ausreichender Menge Polyasparaginsäure erzeugt werden. Je nach Ausgestaltung
der Nukleotidsequenz wird eine Enzymsynthese ermöglicht, die den Organismus zur
Produktion von Modifikationen der Polyasparaginsäure befähigt. Insbesondere
können verschiedene Polyasparaginsäure enthaltende Verbindungen, also auch die
Homo- und Polymeren der Asparaginsäure erzeugt werden.
Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz von ein- und
mehrzelligen Organismen, in die ein Vektor eingeschleust worden ist bzw. Vektoren
eingeschleust worden sind, der(die) ein Cyaninphycin-Synthetase-Gen mit der für
die in Fig. 1 angegebenen Aminosäuresequenz oder deren Allelvarianten
kodierenden Nukleotidsequenz enthält (enthalten).
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Enzym, das durch den beschriebenen
Organismen synthetisiert wird, das heißt, Enzyme zur Synthese von
Polyasparaginsäure, Modifikationen hiervon und/oder Polyasparaginsäure
enthaltenden Verbindungen. Besonders bevorzugter Gegenstand der vorliegenden
Erfindung ist ein Cyanophycin-Synthetase-Gen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von
Polyasparaginsäure, deren Modifikationen oder Polyasparaginsäure enthaltenden
Verbindungen. Die Herstellung dieser Stoffe erfolgt mittels der oberen
beschriebenen transformierten Organismen. Vorzugsweise werden hier wiederum
Mikroorganismen verwendet. Besonders bevorzugt sind Bakterien. Ganz besonders
bevorzugt ist Aphanocapsa. Höchst bevorzugt sind Bakterien der Spezies
Escherichia coli.
Zur Herstellung einsetzbar sind erfindungsgemäß auch die Synthese-Enzyme, das
heißt, Syntheseenzyme für die Herstellung von Polyasparaginsäure, Modifikationen
hiervon und/oder Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen. Besonders
bevorzugt sind erfindungsgemäß Cyanophycin-Synthetase-Gene.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß auch die Herstellung von Enzymen, die
zur Synthese von Polyasparaginsäure, Modifikationen hiervon und/oder
Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen geeignet sind. Insbesondere betrifft
die Erfindung die Herstellung von Cyanophycin-Synthetase-Genen.
Außerdem betrifft die Erfindung auch die Herstellung eines ein- oder mehrzelligen
transformierten Organismus. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
oben beschriebene Vektoren in diese eingebracht werden. D. h., es wird
erfindungsgemäß ein Vektor bzw. werden Vektoren enthaltend wenigstens ein Gen
mit einer für die Enzym-Synthese von wenigstens einer Polyasparaginsäure,
Modifikationen hiervon und/oder Polyasparaginsäure enthaltende Verbindungen
rotierende Nukleotidsequenz eingesetzt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das
Cyanophycin-Synthetase-Gen. Hierbei handelt es sich um das Gen mit der für die in
Fig. 1 angegebenen Aminosäuresequenz oder deren Allelvarianten kodierenden
Nukleotidsequenz.
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung der beschriebenen
Organismen und Enzyme zur Herstellung von Polyasparaginsäure, deren
Modifikationen und/oder Polyasparaginsäure enthaltende Verbindungen. Ebenso ist
die Verwendung des beschriebenen Vektors zur Herstellung von Organismen, die
für die biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure, Modifikationen hiervon
und/oder Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen eingesetzt werden
können.
Im folgenden wird Erfindung unter Bezugnahme auf spezielle Beispiele näher
beschrieben. Zur Erläuterung sei in diesem Zusammenhang auch auf die anliegende
Fig. 4 hingewiesen.
Isolierung der Gesamt-DNA: Ein Liter einer 10 Tage gewachsenen Kultur von
Synechocystis PCC6803 [Kulturbedingungen: bei 30°C und einer
Beleuchtungsstärke von 1000 lux im Photobioreaktor unter Rühren und unter
Begasung mit 5% CO2/95% (vol/vol) Luft (200 ml/min) in BG11-Medium; Rippka,
R., J. Deruelles, J. B. Waterbury, M. Herdman und R. Y. Stanier. 1979. J. Gen.
Microbiol. 111: 1-61] wurde geerntet, zweimal mit SE-Puffer (100 mM Tris, 100 mM
EDTA, 150 mM NaCl, pH 8) gewaschen, gut durchmischt, zweimal mit TE-Puffer (10
mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) gewaschen und in 10 ml Lysis-Puffer (25% wt/vol
Saccharose, 50 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 8) resuspendiert. Nach Zusatz von 1,5
ml Lysozym (30 mg/ml in 50fach TE-Puffer) wurde der Ansatz für 45 min bei 37°C
inkubiert und nach Zusatz von 0,5 ml RNase-Lösung (DNase freie Pankreas RNase
10 mg/ml in 50 mM Phosphat-Puffer, pH 6,7) für weitere 10 min bei 37°C inkubiert.
Nach Zusatz von 1 ml 25% (wt/vol) Laurylsarcosin wurde eine weitere Stunde bei
37°C inkubiert. Danach erfolgte sukzessive der Zusatz von 2,5 ml Proteinase K (10
mg/ml in TE-Puffer für 2 h bei 37°C), weiteren 0,5 ml Proteinase K (16 h bei 37°C)
und 0,25 ml 5 M NaCl (15 min bei Raumtemperatur unter Schütteln). Eine
Deproteinierung erfolgte durch Zugabe von 1/2 Volumen Tris-gesättigtem Phenol
und 1/2 Volumen Chloroform/lsoamylalkohol (24/1 vol/vol) und Schwenken. Nach
einer Zentrifugation für 5 min bei 3500 × g bei Raumtemperatur wurde der Überstand
entnommen und 15 h gegen TE-Puffer + 100 mM NaCl dialysiert. Aus dem Dialysat
wurde die DNA durch Zugabe von Ethanol (70% vol/vol) und einer Inkubation für
30 min bei 4°C gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 3500 × g für 30 min bei 4°C
wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 70% (vol/vol) Ethanol aufgenommen
und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde im Vakuum bei 100 mbar und
Raumtemperatur getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert. Die Ausbeute betrug
100 µg DNA.
Verdauung der Gesamt-DNA mit EcoRV: Da der den ORF 2002 (Fig. 1) umfassende
Bereich über keine Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRV besitzt, wurde die
Gesamt-DNA mit diesem Enzym verdaut, um die anschließende Polymerase-Ketten-
Reaktion (PCR) zu erleichtern. Dazu wurden 100 µg DNA aus Synechocystis
PCC6803 mit 100 Units EcoRV (Fa. LIFE TECHNOLOGIES GmbH, Eggenstein,
Deutschland) für 4 h bei 37°C in 50 mM Tris/HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2 und 50 mM
NaCl inkubiert. Das Volumen des Ansatzes betrug 20 µl. Die Reaktion wurde
durch 10 min Inkubation bei 75°C beendet.
Amplifizierung des Offenen Leserahmens (ORF) slr2002 mit Hilfe der Polymerase-
Ketten-Reaktion-(PCR): Mit Hilfe der synthetisierten Primer "up2002" (25b) und -
"down2002" (25b), die den direkt stromauf- und -abwärts gelegenen
Sequenzbereichen von slr2002 entsprechen und zusätzlich über Schnittstellen für
die Restriktionsendonucleasen Ndel und Xbal verfügen (Fig. 2), wurde der slr2002
enthaltene DNA-Abschnitt mit Hilfe der PCR vermehrt. Da die Sequenz von slr2002
im stromaufwärts gelegenen Teil keine geeigneten eigenen Sequenzmotive enthält,
die für eine erfolgreiche Expression in E. coli geeignet erscheinen, wurden die
Primer so konstruiert, daß nach Verdau mit Ndel und Xbal exakt ein DNA-Bereich für
slr2002 freigesetzt wird, der genau in die für eine Expression in E. coli optimierte
Stelle des Vektors pMa/c5-914 (Fig. 3) paßt.
Reaktionsansatz zur Durchführung der Polymerase Ketten Reaktion (PCR) zur
Amplifizierung [Der Ansatz enthielt Chemikalien (Thermopol-Puffer, MgSO4, dNTPs)
und VentR-DNA-Polymerase der Fa. New England Biolabs GmbH, Schwalbach,
Deutschland]:
81 µl H2Obidestilliert
1 µl EcoRV-linearisierte DNA aus Synechocystis
1 µl EcoRV-linearisierte DNA aus Synechocystis
PCC6803
2,5 µl Primer UP2002 (40 µM)
2,5 µl Primer Down2002 (40 µM)
10 µl Thermopol-Puffer
2 µl MgSO4 (100 mM)
1 µl VentR-DNA-Polymerase
1 µl dNTPs (25 mM)
2,5 µl Primer UP2002 (40 µM)
2,5 µl Primer Down2002 (40 µM)
10 µl Thermopol-Puffer
2 µl MgSO4 (100 mM)
1 µl VentR-DNA-Polymerase
1 µl dNTPs (25 mM)
Reaktionsbedingungen der PCR: Nach Zugabe der dNTP-Lösung wurde der Ansatz
für 2 min bei 95°C inkubiert. Danach wurde 30mal folgender Temperaturzyklus
durchlaufen: 30 sec. 95°C, 30 sec. 50°C, 3 min 72°C. Danach wurde der Ansatz bis
zur Entnahme auf konstant 4°C gehalten.
Das PCR-Produkt wurde folgendermaßen aufgearbeitet: Nach Zugabe von 50 µl
Tris-gesättigtem Phenol und 50 µl Chloroform : lsoamylalkohol (24/1, vol/vol) erfolgte
eine Zentrifugation für 1 min bei 10000 × g. Der Überstand wurde entnommen und
mit NaCl (Endkonzentration 200 mM) versetzt, mit dem 2,4fachen Volumen Ethanol
(98% wt/vol) versetzt und durchmischt. Nach 30 min Inkubation bei 4°C wurde der
Ansatz erneut zentrifugiert (20 min 10 000 × g bei 4°C) und der Überstand
verworfen. Das Pellet wurde in 200 µl 70% (vol/vol) Ethanol aufgenommen und
erneut zentrifugiert. Nach Verwerten des Überstandes wurde das Pellet bei
Raumtemperatur im Vakuum bei 100 mbar Druck getrocknet.
Da die VentR-DNA-Polymerase bis zu ca. 70% stumpfe Enden erzeugt (Angabe der
Bezugsfirma New England Biolabs GmbH, Schwalbach, Deutschland), konnte das
PCR-Produkt zunächst in den Smal restringierten Vektor pBluescriptSK⁻ (Fa.
Stratagene Cloning Systems, San Diego, USA) ligiert werden:
Ligationsansatz (T4-Ligase und Ligationspuffer wurden von der Fa. LIFE
TECHNOLOGIES GmbH, Eggenstein, Deutschland bezogen):
getrocknetes PCR-Produkt
+2 µl Ligationspuffer 5fach konz.
+2 µl Smal-restringierter pBluescriptSK- (200 ng/µl)
+5,5 µl H2Obidestilliert
+0,5 µl T4-Ligase
+2 µl Ligationspuffer 5fach konz.
+2 µl Smal-restringierter pBluescriptSK- (200 ng/µl)
+5,5 µl H2Obidestilliert
+0,5 µl T4-Ligase
Der Ligationsansatz wurde für 5 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Ligationsansatz wurde sodann in kompetente Zellen des Stammes E. coli
TOP10 (Fa. Stratagene GmBH, Heidelberg, Deutschland) transformiert. Die
Transformation erfolgte nach der Calciumchlorid-Methode (Hanahan, D. 1983. J.
Mol. Biol. 166: 557-580). Zur Erkennung der Transformanden, die rekombinierte
Plasmide enthielten (pBluescriptSK⁻ mit Insert aus dem PCR-Produkt), wurden die
transformierten Zellen auf X-Gal/IPTG Festmedium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt,
10 g/l, NaCl, 15 g/l Agar-Agar, 0,2 mM Isoprypyl β-D-Thiogalacto-pyranosid, IPTG,
0,004% wt/vol 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid, 100 µg/ml
Ampicillin-Na-Salz, pH 7,5) plattiert, auf dem sich die gewünschten Klone als
ungefärbte Kolonien und die unerwünschten Klone mit religiertem Plasmid als
blaugefärbte Kolonien erkennbar machten. Nach 24 h Inkubation bei 37°C wurden
100 ungefärbte Kolonien entnommen und deren Plasmide isoliert. Die
Plasmidisolierung erfolgte aus 10 ml LB-Flüssigkulturen (10 g/l Trypton, 5 g/l
Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, pH 7,5, + 100 µg/ml Ampicillin-Na-Salz), die für 16 h bei
37°C unter Schütteln (200 Upm) inkubiert worden waren. Die Plasmidisolierung
erfolgte im analytischen Maßstab nach der Alkalischen-Lysis-Methode (Current
Protocols in Molecular Biology; Ausubel, Brent, Kingston, Moore, Seidman, Smith
und Struhl, Hrsg.; John Wiley & Sons, Inc. USA, 1996).
Von den isolierten Plasmiden entsprachen zwei den Anforderungen, die sich aus
dem Restriktionsschnittmuster der bekannten Sequenz (Abb. 1) ergaben (1
Schnittstelle für Clal, je zwei Schnittstellen für BamHl, EcoRI, je 1 Schnittstelle für
Ndel und Xbal im Primerbereich). Die rekombinierten Plasmide erhielten die
Bezeichnung pBluescriptSK-: slr2002.
Heterologe Expression der Cyanophycin-Synthetase in E. coli: Für die Expression
des auf slr2002 befindlichen Gens in E. coli wurde pBluescriptSK-: slr2002 mit Ndel
und Xbal restringiert (Restriktionsansatz: 10 µg pBluescriptSK-: slr2002, 50 Units
Ndel, 50 Units Xbal, 15 h bei 37°C in 50 mM Tris/HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2 und
50 mM NaCl; das Volumen des Ansatzes betrug 100 µl). Das freigesetzte slr2002-
enthaltende Fragment (2,6 kb) wurde nach Auftrennung im 0,8% (wt/vol) Maxi-
Agarosegel mit Hilfe eines GeneClean-Kits (Fa. Bio 101, LaJolla, USA) isoliert und
in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.
Das isolierte Fragment wurde danach in den Ndel/Xbal-restringierten Vektor
pMa/c5-914 ligiert.
Doppelverdauung von pMa/c5-914 mit Ndel und Xbal (beide: Fa. LIFE
TECHNOLOGIES GmbH, Eggenstein, Deutschland): 10 µg pMa/c5-914, 50 Units
Ndel, 50 Units Xbal wurden für 15 h bei 37°C in 50 mM Tris/HCl (pH 8.0), 10 mM
MgCl2 und 50 mM NaCl inkubiert. Das Volumen des Ansatzes betrug 100 µl. Die
Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion beendet. Der restringierte
Vektor wurde aus dem Überstand mit Ethanol gefällt, mit 70% (vol/vol) gewaschen,
getrocknet und in 20 µl TE-Puffer aufgenommen.
Ligation des isolierten slr2002-haltigen Fragments mit dem Ndel/Xbal-restringierten
pMa/c5-914 (T4-Ligase und Ligationspuffer wurden von der Fa. LIFE
TECHNOLOGIES GmbH, Eggenstein, Deutschland bezogen):
3 µl isoliertes Ndel/XbaI-restringiertes slr2002-
haltiges PCR-Produkt
+1 µl Ndel/Xbal-restringierter pMa/c5-914
+2 µl Ligationspuffer 5fach konz.
+3 µl H2Obidestilliert
+1,0 µl T4-Ligase
+1 µl Ndel/Xbal-restringierter pMa/c5-914
+2 µl Ligationspuffer 5fach konz.
+3 µl H2Obidestilliert
+1,0 µl T4-Ligase
Der Ligationsansatz wurde für 15 h bei 14°C inkubiert.
Der Ligationsansatz wurde in kompetente Zellen des Stammes E. coliTOP10 (Fa.
Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland) transformiert (Methode: siehe oben in
diesem Beispiel). Die transformierten Zellen wurden auf LB-Festmedium (mit 100
µg/ml Ampicillin-Natriumsalz und 100 µg/ml Chloramphenicol) ausplattiert. Nach 24 h
Inkubation bei 30°C wurden 24 Kolonien entnommen und deren Plasmide isoliert
(Methode: siehe oben in diesem Beispiel). Die erhaltenen pMa/c5-914: slr2002-
haltigen positiven Klone (Bestätigung durch Kontrollverdauung mit Ndel/Xbal)
erhielten die Bezeichnung E. coli pMa/c5-914: slr2002.
Die Aktivität der Cyanophycin-Synthetase wurde in der löslichen Zellfraktion von
Zellen von E. coli pMa/c5-914: slr2002 bestimmt, die unter folgenden Bedingungen
angezogen und induziert worden waren (als Kontrolle war eine Kultur mit E. coli-
Zellen, die nur den Vektor enthielten, mitgeführt worden).
Mit einer Einzelkolonie E. coli pMa/c5-914: slr2002 wurden 40 ml LB-Flüssigmedium
(+Ampicillin +Chloramphenicol) angeimpft und für 15 h bei 30°C unter Schütteln
(200 Upm) inkubiert. Mit der Vorkultur wurden 750 ml Terrific Broth (TB)-
Flüssigmedium (+Ampicillin + Chloramphenicol) (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T.
Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, USA) in 2 l-Schikanekolben beimpft. Die
Hauptkulturen wurden bis zum Erreichen einer Optischen Dichte bei 578 nm von 1.0
unter Schütteln (100 Upm) bei 30°C inkubiert. Durch einen schnell durchgeführten
Wechsel auf eine Inkubationstemperatur von 42°C wurde die Synthese des slr2002-
Genproduktes dereprimiert (Hitzeinaktivierung des Repressors). Nach 3 h Inkubation
bei 42°C unter Schütteln (100 Upm) erfolgte die Zellernte (15 min Zentrifugation bei
3500 × g und 4°C). Der Zellaufschluß erfolgte durch Ultrabeschallung mit einer
Beschallungssonde MS73 für 2 min./ml mit 50% Beschallungsdauer in einem
Sonoplus Homogenisators HD200 (beide Fa. BANDELIN electronic, Berlin, D). Die
lösliche Zellfraktion entstammte dem Überstand nach einer 50 min. Zentrifugation
bei 100 000 × g und 4°C.
Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte mittels eines radioaktiven Tests auf
Einbau von L-[U-14]-Arginin in vorgelegtes Cyanophycin aus Aphanocapsa
PCC6308 (modifiziert nach Simon, R. D. 1976. Biochim. Biophys. Acta. 422: 407-
418). Der Reaktionsansatz enthielt die in Tabelle 3 aufgeführten Komponenten. Die
Enzymreaktion wurde für 60 min. unter Schütteln in Eppendorf-Reaktionsgefäßen
bei 28°C durchgeführt. Danach wurden zwei Aliqots à 60 µl entnommen und auf je
einen runden Whatman-Filter (Durchmesser: 2.3 cm) pipettiert. Die Filter wurden
folgendermaßen weiter inkubiert: 3 min in 5% (wt/vol) Trichloressigsäure/1 mM L-
Arginin; 3 min in 5% (wt/vol) Trichloressigsäure; 3 min. in 50 mM Kaliumphosphat-
Puffer (pH 7.0); 10 min. in 75% (vol/vol) Ethanol. Danach wurden die Filter in 95 %
(vol/vol) Ethanol, 100% Ethanol, Ethanol : Diethylether (50 : 50, vol : vol) und
getrocknetem Diethylether getrocknet. Das radioaktiv markierte Produkt wurde in
einem Szintillationszähler in Gegenwart von 2 ml Szintillationsflüssigkeit gemessen.
Die Klone E. coli pMa/c5-914: slr2002 wiesen Cyanophycin-Synthetase-Aktivität auf,
wohingegen in den Extrakten der Kontrollkultur keine Aktivität nachweisbar war.
Somit ist das Gen für die Cyanophycin-Synthetase aus Synechocystis PCC6803
durch den ORF2002 kodiert und liegt in den genannten Klonen in exprimierbarer
Form vor.
Anreicherungsprozedur zur für die Cyanophycin-Synthetase aus Aphanocapsa
PCC6308:
30 g Zellfeuchtmasse wurden mittels Ultrabeschallung mit einer Beschallungssonde MS73 für 14 min. mit 25% Beschallungsdauer in einem Sonoplus Homogenisators HD200 (beide Fa. BANDELIN electronic, Berlin, D) und zweimaliger Passage durch eine French-Press-Zelle bei 96 MPa aufgeschlossen. Zelitrümmer wurden durch eine einstündige Zentrifugation bei 80 000xg und 4°C entfernt. Die lösliche Zellfraktion (Lösl. Fr.) wurde als Überstand einer einstündigen Zentrifugation bei 100 000xg und 4°C gewonnen. Der Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung in Portionen à 10 ml bei -70°C aufbewahrt.
30 g Zellfeuchtmasse wurden mittels Ultrabeschallung mit einer Beschallungssonde MS73 für 14 min. mit 25% Beschallungsdauer in einem Sonoplus Homogenisators HD200 (beide Fa. BANDELIN electronic, Berlin, D) und zweimaliger Passage durch eine French-Press-Zelle bei 96 MPa aufgeschlossen. Zelitrümmer wurden durch eine einstündige Zentrifugation bei 80 000xg und 4°C entfernt. Die lösliche Zellfraktion (Lösl. Fr.) wurde als Überstand einer einstündigen Zentrifugation bei 100 000xg und 4°C gewonnen. Der Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung in Portionen à 10 ml bei -70°C aufbewahrt.
Ein Aliqot der löslichen Fraktion (7.2 ml) wurde auf eine Cyanophycin-Sepharose
4B-Säule (3.5 ml Bettvolumen, BV) aufgetragen; ungebundenes Protein wurde
aufgefangen (Bezeichnung: Ungeb. Pr.). (Zur Herstellung der Cyanophycin-
Sepharose 4B-Säule siehe unten.) Die Säule wurde mit 3 BV Puffer A (siehe unten,
Herstellung der Cyanophycin-Sepharose 4B-Säule) gewaschen (Bezeichnung:
Waschen). Die Elution der an die Cyanophycin-Matrix gebundenen Proteine erfolgte
durch Erhöhung der Ionenstärke mit 3 BV Puffer + 2 M NaCl; das Eluat wurde in vier
Fraktionen aufgefangen (Bezeichnung: Eluat 1, Eluat 2, Eluat 3 und Eluat 4). Eine
Applikation von 2 M NaCl + 2 M Harnstoff führte zur Elution sehr fest gebundener
Proteine (Bezeichnung: Urea). Die aufgefangenen salzhaltigen Fraktionen wurden
entsalzt, lyophilisiert in wenig Puffer resuspendiert und die Aktivität der
Cyanophycin-Synthetase bestimmt (Tabelle 4).
Tabelle 4. Aktivitäten in den Fraktionen der Anreicherung der Cyanophycin-
Synthetase aus Aphanocapsa PCC6308. Die Cyanophycin-Synthetase-Aktivität im
Zellaufschluß und in der löslichen Zellfraktion (Lösl. Fr.) ist stets geringer als nach
dem ersten Reinigungsschritt (möglicherweise liegt das Enzym im unbehandelten
Zellextrakt durch die Präsenz eines abtrennbaren negativen Effektors in gehemmter
Form vor); die erhöhten Zahlenwerte von Anreicherung und Ausbeute in den
folgenden Schritten bzw. Fraktionen sind daher unter diesem Gesichtspunkt zu
sehen. Die Abkürzungen sind im Text erklärt.
Nach den Aktivitätsmessungen war die Cyanophycin-Synthetase im Eluat 2 am
stärksten angereichert (Tabelle 4). In dieser Fraktion lag nach der Analyse im SDS-
Polyacrylamidgel ein Protein mit einem relativen Molekulargewicht (Mr) von 90 000
im stark angereicherten Zustand vor. Zwischen dem Vorhandensein dieser
Proteinbande in den Fraktionen der Anreicherung und der Enzymaktivität war eine
gute Korrelation gegeben. Es wurde daher davon ausgegangen, daß das
hochangereicherte Protein mit einem Mr von 90 000 der gesuchten Cyanophycin-
Synthetase entsprach.
Herstellung der Cyanophycin-Sepharose 4B-Säule: 2 g CNBr-Sepharose 4B (Fa.
Fluka, Deutschland) wurde für 15 min. in 1 mM HCl gequollen und mit 400 ml der
gleichen Lösung gewaschen. Das Gel wurde dann zweimal mit je 17.5 ml
Kopplungspuffer (0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3) gewaschen. Diese
Gelsuspension wurde mit Cyanophycin aus Aphanocapsa PCC6308 (28 mg),
welches vorher in 6 ml Kopplungspuffer suspendiert worden war, vermischt und das
Volumen auf 80 ml mit Kopplungspuffer aufgefüllt (Cyanophycin wurde isoliert).
Diese Mischung wurde für 3 h bei Raumtemperatur leicht geschwenkt (50 Upm).
Danach wurde nach Sedimentieren des Gels der Kopplungspuffer dekantiert und
das Gel in einem Endvolumen von 20 ml Blocking-Puffer (0.1 M L-Asparaginsäure,
pH 8.0) suspendiert. Der Blocking-Puffer wurde nach sedimentieren des Gels
dekantiert und das Gelvolumen erneut mit Blocking-Puffer auf 20 ml aufgefüllt. Diese
Suspension wurde erneut für 3 h bei Raumtemperatur geschwenkt. Sedimentiertes
Gel wurde in einen Säulenkörper überführt (Bettvolumen, BV: 3.5 ml). Die
Säulenmatrix wurde sukzessive zweimal mit je 10 ml Kopplungspuffer, zweimal mit je
10 ml 50 mM Acetatpuffer (pH 4.0), der 0.5 M NaCl enthielt, und zweimal mit je 10 ml
Kopplungspuffer gewaschen. Vor Gebrauch wurde die Säule mit 20 ml Puffer A (20
mM Tris/HCl, pH 8.2, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM
KCl, 5 mM ATP, 10 µM L-Asparaginsäure, 10 µM LArginin) äquilibriert.
Elektrotransfer des Proteins und Bestimmung des N-Terminus:
Der Transfer des Proteins aus dem Polyacrylamidgel auf eine Immobilon- PVDF
(Polyvinylidendifluorid)-Membranen (Fa. WATERS-MILLIPORE, Bedford, USA)
erfolgte durch Semidry-Blotting mit Hilfe eines Semidry-Fastblot Gerätes B 32/33
sowie des dazugehörigen Netzgerätes (beide Fa. BIOMETRA, Göttingen). Das
Polyacrylamidgel wurde nach Beendigung der Elektrophorese für 10 min in
Transferpuffer (25 mM TRIS, 192 mM Glycin, 10% v/v Methanol, pH 8,2-8,6)
äquilibriert, bevor im Transferpuffer das Blottingsandwich aus drei Lagen Whatman
3 mm Filterpapier, einer zuvor in Methanol getränkte PVDF-Membranen, das
Polyacrylamidgel sowie drei Lagen Whatman 3 MM Filterpapier hergestellt worden
war. Das Blotting-Sandwich wurde auf die mit H2Obidestilliert gesättigte
Anodenseite des Fastblot-Gerätes gelegt. Einer Erwärmung des Sandwiches
während des Transfers wurde durch Wasserkühlung der Anodenseite und durch
Auflegen einer mit Eiswasser gefüllten Färbeschale auf die Kathodenseite
entgegengewirkt.
Stromstärke: 5 mA/cm2
Gelfläche (konstant)
Dauer: 120 min
Dauer: 120 min
Die Membran wurde für 10 min. im Färbebad mit folgender Zusammensetzung
inkubiert: 4 g Serva Blau R, 908 ml Methanol, 908 ml Essigsäure, 92 ml
H2Obidestilliert. Die Membran wurde in Entfärbelösung (2% vol/vol Essigsäure, 90
% vol/vol Methanol, 8% vol/vol Wasser) differenziert.
Die Bestimmung des N-Terminus des auf die Membran transferierten Proteins mit
dem Mr von 90 000 erfolgte mittels automatisierten Edman-Abbau durch die Fa.
Bayer AG (ZF-D Strukturforschung, Biomolekülanalytik, Leverkusen).
Aus der ermittelten N-terminalen Sequenz wurde die zugrunde liegende DNA-
Sequenz rückübersetzt, wobei bei Aminosäuren mit mehreren möglichen Tripletts
keine Gewichtung vorgenommen wurde. Es wurde ein DNA-Molekül von 17 b-Länge
als DNA-Probe verwendet (hergestellt im Auftrag durch Fa. LIFE TECHNOLOGIES
GmbH, Eggenstein, Deutschland).
Koloniehybridisierung mit der DNA-Probe: Die DNA-Probe wurde zunächst nach
einem Standardverfahren (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989.
Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, USA) mit T4 Polynucleotidkinase (Fa. LIFE TECHNOLOGIES
GmbH, Eggenstein, Deutschland) und [-32P]ATP radioaktiv markiert.
Aphanocapsa PCC6308 Gesamt-DNA (die Isolierung der DNA erfolgte, wie
angegeben in Beispiel 1) wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen vollständig
restringiert und in einem 0.8% (wt/vol) Agarosegel aufgetrennt. Die Southernblot-
Analyse mit der DNA-Probe erfolgte bei 35°C in 6xSSC (1xSSC: 150 mM NaCl + 15 mM
Natriumcitrat) (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular
cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, USA). Nach der Hybridisierung wurde die Nitrocellulosemembran bei 40°C
in 2xSSC+1% (wt/vol) SDS gewaschen. Chromosomale Fragmente aus den durch
die Hybridisierung kenntlich gemachten Größenbereichen wurden aus
entsprechenden Tris-Acetat-Agarose-Gelen mit Hilfe eines GeneClean-Kits (Fa. Bio
101, LaJolla, USA) isoliert und in entsprechend restringierte pBluescriptSK⁻
Vektoren ligiert (Methode: siehe diese Patentanmeldung Beispiel 1). Die
Ligationsansätze wurden in kompetente Zellen von E. coli TOP10 transformiert
(Methode: siehe diese Patentanmeldung Beispiel 1) und diese auf X-Gal/IPTG
Festmedium (Zusammensetzung: siehe diese Patentanmeldung Beispiel 1) plattiert.
Ungefärbte (weiße Kolonien) wurden auf eine auf LB-Festmedium gelegte
Nitrocellulosemembran übertragen und erneut mit der radioaktiv markierten DNA-
Sonde hybridisiert (Grunstein, M. und D. S. Hognes 1975. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 72: 3961-3965).
Von ca. 100 Klonen reagierten zwei positiv; sie erhielten die Bezeichnung E. coli
pBluescriptSK-: cps.
Expression der Cyanophycin-Synthetase in E. coli pBluescriptSK-: cps: Die Aktivität
der Cyanophycin-Synthetase wurde in der löslichen Zellfraktion von Zellen von
E. coli pBluescriptSK-: cps bestimmt, die für 10 h in LB-Medium in Gegenwart von 1,0
mM IPTG und 100 µg/ml Ampicillin-Natriumsalz bei 37°C und 200 Upm kultiviert
worden waren. Als Kontrolle wurde eine Kultur mit E. coli-Zellen, die nur den Vektor
enthielten, mitgeführt. Der Zellaufschluß erfolgte durch Ultrabeschallung (Methode:
s. o. in Beispiele 1); die lösliche Zellfraktion entstammte dem Überstand nach einer
50 min. Zentrifugation bei 100 000 × g und 4°C. Die Bestimmung der Enzymaktivität
erfolgte mittels eines radiaoktiven Tests auf Einbau von radioaktiv markiertem
Arginin in vorgelegtes Cyanophycin (Methode: siehe hierzu die Angaben in Beispiel
1).
Beide Klone wiesen Cyanophycin-Synthetase-Aktivität auf, wohingegen in den
Extrakten der Kontrollkultur keine Aktivität nachweisbar war. Somit liegt das Gen für
die Cyanophycin-Synthese in dem Klon E. coli pBluescriptSK-: cps in klonierter und
exprimierbarer Form vor.
Die verwendeten Methoden sind, wenn nicht anders angegeben, Standardmethoden
(Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA). Gesamt-
DNA von Synechocystis PCC6803 wurde partiell mit Sau3Al verdaut und in das
BamHl restringierte, dephosphorylierte Cosmid pHC79 ligiert. Die Ligationsprodukte
wurden mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Verpackungskits (Fa. Boehringer,
Deutschland) in Lampda-Phagen verpackt und zur Infektion von E. coli S17-1
eingesetzt. Auf diese Weise wurde eine Genbank von ca. 1000 Klonen erzeugt.
Zelimaterial dieser Klone wurde auf LB-Festmedium (+60 µg/ml Ampicillin) und auf
Biodyne A Transfer-Membranen (Fa. Pall, Portsmouth, U. K.), die sich auf dem
gleichen Medium + 10 µg/ml Arginin befanden, übertragen. Nach 24 h Inkubation bei
37°C wurden diese Membranen auf die Oberfläche von LB-Festmedium übertragen,
das zusätzlich zu den bereits erwähnten Komponenten 5 µg/ml Chloramphenicol
enthielt und für weitere 24 h inkubiert. Die Kolonien wurden immunologisch auf
Reaktion gegen anti-Cyanophycin-IgGs (s.o.) analysiert.
Zwei Klone der Genbank zeigten eine deutliche immunologische Reaktion, so daß
davon ausgegangen werden kann, daß in diesen Klonen das oder die Gene für die
Cyanophycin-Synthese aus Synechocystis PCC6803 in klonierter und exprimierbarer
Form vorliegen.
E. coli SM10 (pir), der das Plasmid pUT::miniTn5-Cm enthält (De Lorenzo, V., M.
Herrero, U. Jakubzik und K. N. Timmis. 1990. J. Bacteriol. 172: 6568-6572), wurde
über Nacht bei 37°C in LB-Medium (+25 µg/ml Chloramphenicol) angezogen. 0.25 ml
der Kultur wurden verwendet, um 10 ml LB-Medium (+25 µg/ml Chloramphenicol)
anzuimpfen. Nach 2.5 h Wachstum war eine Optische Dichte bei 600 nm von 0.45
erreicht, und die Kultur wurde in 0.75 ml Portionen geerntet (2 min 10 000xg,
Raumtemperatur). Die Zellpellets wurden mit Medium gewaschen und in je 60 µl
Medium resuspendiert.
Aphanocapsa PCC6308 wurde in 50 ml BG11-Medium unter Bedingungen kultiviert,
wie sie in Beispiel 1 aufgeführt sind. Die Kultur wurde geerntet, 20fach konzentriert
und damit auf eine Zelldichte von 109 Zellen/ml eingestellt.
Für die Transposonmutagenese wurden 60 µl E. coli SM10 (pir)- zu 60 µl
Aphanocapsa PCC6308-Zellsuspension gegeben, gut durchmischt und auf BG11-
Festmedium plattiert. Diese Konjugationsplatten wurden für 48 h unter Beleuchtung
bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden dann in BG11-Medium aufgeschwemmt und
in Reagenzgläser überführt. Von dieser Suspension wurden unterschiedliche
Verdünnungen mit BG11-Medium hergestellt. Je 0.5 ml aus diesen Verdünnungen
wurden mit 5 ml flüssigen 0.5% % (wt/vol) Agar vermischt und diese Mischung auf
BG11-Festmedium (+25 µg/ml Chloramphenicol) ausplattiert.
Die Platten wurden unter Beleuchtung bei 30°C inkubiert, bis eindeutiges
Koloniewachstum eingetreten war.
Die erhaltenen Chloramphenicol-resistenten Aphanocapsa PCC6308-Mutanten,
wurden, wie unter Beispiel 3 aufgeführt, immunologisch auf Reaktion gegenüber
anti-Cyanophycin-lgGs überprüft.
Einige Mutanten zeigten eine deutliche abgeschwächte immunologische Reaktion im
Vergleich zum Wildtyp, so daß davon ausgegangen werden kann, daß in diesen
Klonen die DNA-Bereiche, die für die Cyanophycin-Synthese aus Aphanocapsa
PCC6308 kodieren, durch Transposoninsertion außer Funktion gesetzt und damit für
die sich anschließende Klonierung eindeutig markiert worden waren.
Zur Identifizierung und Klonierung des nativen DNA-Bereichs wird zunächst der
durch Transposoninsertion markierte DNA-Bereich mittels einer Gensonde, die aus
dem Transposon abgeleitet wird, in der Gesamt-DNA durch Hybridisierung kenntlich
gemacht, sodann der entsprechende Größenberich aus der Gesamt-DNA isoliert
und das Transposon-haltige Fragment der Mutanten in E. coli überführt und durch
erneute Hybridisierung in einer Genbank identifiziert. Das klonierte Transposon
haltige Fragment wird sodann als Quelle für eine homologe Gensonde zur
Identifizierung und Klonierung des nativen DNA-Bereichs aus einer Genbank des
Wildtyps von Aphanocapsa PCC6308 dienen.
Claims (13)
1. Vektoren enthaltend wenigstens ein Gen mit einer für die Enzym-Synthese von
wenigstens einer Polyasparaginsäure, Modifikationen hiervon und/oder
Polyasparaginsäure enthaltenenden Verbindungen kodierenden Nukleotidsequenz.
2. Vektoren nach Anspruch 1 enthaltend wenigstens ein Cyanophycin-Synthetase-
Gen.
3. Vektoren nach Anspruch 2 enthaltend ein Cyanophycin-Synthetase-Gen mit einer
für die in Fig. 1 angegebenen Aminosäuresequenz oder deren Allelvarianten
kodierenden Nukleotidsequenz.
4. Transformierter ein-oder mehrzelliger Organismus enthaltend wenigstens einen
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Transformierter Organismus nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß er
ein Mikroorganismus, vorzugsweise ein Bakterium ist.
6. Transformierter Organismus nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß er
ein Bakterium der Spezies Escherichia coli ist.
7. Transformierter Organismus nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß er
ein Bakterium der Spezies Aphanocapsa ist.
8. Enzym zur Herstellung von Polyasparaginsäure, deren Modifikationen oder
Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen dadurch gekennzeichnet, daß es
unter Einsatz der Organismen nach einem der Ansprüche 4 bis 7 herstellbar ist.
9. Verfahren zur Herstellung von Polyasparaginsäure, deren Modifikationen oder
Polyasparaginsäure enthaltenden Verbindungen dadurch gekennzeichnet, daß ein
Organismus nach einem der Ansprüche 4-7 eingesetzt wird.
10. Verfahren zur Herstellung eines transformierten Organismus dadurch
gekennzeichnet, daß wenigstens ein Vektor nach einem der Ansprüche 1-3 in den
Organismus eingebracht wird.
11. Verwendung der Organismen nach einem der Ansprüche 4-7 zur Herstellung
Polyasparaginsäure, deren Modifikationen und/ oder Polyasparaginsäure
enthaltenden Verbindungen.
12. Verwendung des Enzyms nach Anspruch 8 zur Herstellung von
Polyasparaginsäure, deren Modifikationen und/oder Polyasparaginsäure
enthaltenden Verbindungen.
13. Verwendung des Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung
eines transformierten ein- oder mehrzelligen Organismus.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19825509A DE19825509A1 (de) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | Biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure und deren Modifikation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19825509A DE19825509A1 (de) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | Biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure und deren Modifikation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19825509A1 true DE19825509A1 (de) | 1999-12-09 |
Family
ID=7870252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19825509A Ceased DE19825509A1 (de) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | Biotechnische Herstellung von Polyasparaginsäure und deren Modifikation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19825509A1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002012459A3 (de) * | 2000-08-09 | 2002-06-20 | Bayer Ag | Verfahren zur verbesserten herstellung von cyanophycin und dessen folgeprodukte |
-
1998
- 1998-06-02 DE DE19825509A patent/DE19825509A1/de not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002012459A3 (de) * | 2000-08-09 | 2002-06-20 | Bayer Ag | Verfahren zur verbesserten herstellung von cyanophycin und dessen folgeprodukte |
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