DE19814861A1

DE19814861A1 - New protein variant of the NET1 locus

Info

Publication number: DE19814861A1
Application number: DE19814861A
Authority: DE
Inventors: Harald Von Melchner; Frank Wempe; Sylvia Nigro
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 1999-10-07
Also published as: WO1999051739A1; CA2324656A1; AU3703999A; EP1066379A1

Abstract

The invention relates to a novel protein product of the NET1 locus. The novel protein has transforming activity in the NIH3T3 focus-forming assay and is suitable as a point of attack for influencing carcinogenesis and treating cancer by therapy, as well as for influencing apoptosis. The cloned DNA also provides a possibility for diagnosing cancer since transcripts of the transforming protein can be detected in patient samples.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein, eine Variante von NET1, sowie die Nukleinsäure, die für das neue Protein kodiert. Ferner betrifft die vor liegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das neue Protein und ein Verfahren zur Diagnose, bei dem das neue Proteine nach gewiesen wird, sowie Screening-Verfahren zur Identifizierung von Molekülen mit antineoplastischer Wirkung und/oder mit Wirkung auf Apoptosevorgänge.The present invention relates to a new protein, a variant of NET1, as well as the nucleic acid that codes for the new protein. Furthermore, the concerns above lying invention a pharmaceutical composition containing the new protein and a method of diagnosis in which the new protein after is shown, as well as screening methods for the identification of molecules with antineoplastic effect and / or with effect on apoptosis processes.

NET1 (Neuroepithelioma-transformierendes Gen 1) ist ein Onkogen, das aus Neuroepitheliomzellen durch cDNA-Expressionsklonierung isoliert wurde. Bei diesen Untersuchungen wurde ein cDNA-Klon isoliert, der für ein 54 kDa-Protein kodiert. Die nähere Analyse des cDNA-Klons zeigte, daß der Klon ein unvoll ständiges 5'-Ende enthielt. Mit Hilfe des trunkierten cDNA-Klons wurde die voll ständige kodierende Sequenz des entsprechenden Gens isoliert. Die Sequenza nalyse ergab, daß der vollständige Klon für zusätzliche 145 Aminosäuren am 5'- Termius kodierte. Der vollständige cDNA-Klon zeigte keine transformierende Ak tivität im NIH3T3-Assay, bei dem die Induktion der Fokusbildung als Indikator für die transformierende Aktivität eines Proteins gewertet wird. Der am 5'-Ende ver kürzte cDNA-Klon zeigte transformierende Aktivität im NIH3T3-Assay. Da der verkürzte cDNA-Klon jedoch ein Klonierungsartefakt darstellte und nicht ein in vivo tatsächlich vorkommendes Transkript repräsentiert, bleibt die biologische Bedeutung des Genprodukts des NET1-Locus unklar (Vgl. Chan et al. 1996).NET1 (Neuroepithelioma-transforming gene 1) is an oncogene that consists of Neuroepithelioma cells were isolated by cDNA expression cloning. At These investigations isolated a cDNA clone, which is for a 54 kDa protein encoded. Closer analysis of the cDNA clone showed that the clone was incomplete contained constant 5 'end. With the help of the truncated cDNA clone, the was full permanent coding sequence of the corresponding gene isolated. The sequence Analysis showed that the complete clone for an additional 145 amino acids at the 5'- Termius encoded. The complete cDNA clone showed no transforming Ak activity in the NIH3T3 assay, in which the induction of focus formation as an indicator of the transforming activity of a protein is evaluated. The ver at the 5 'end shortened cDNA clone showed transforming activity in the NIH3T3 assay. Since the however, the truncated cDNA clone was a cloning artifact and not an in represents the actually occurring transcript in vivo, the biological remains Significance of the gene product of the NET1 locus is unclear (see Chan et al. 1996).

Sequenzvergleiche des NET1-Produkts mit bekannten Proteinen zeigt eine Strukturhomologie zu den Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF) für GTPasen der Rho-Familie. Bereits in den achtziger Jahren wurde mit den huma nen dbl-Protoonkogenen eine neue Klasse von Genen entdeckt, die in einer N- terminal trunkierten Form Säugerzellen transformieren (Eva A. und Aaronson S., 1985; Eva et al., 1988; Ron et al. 1988). Zu den bekannten Vertretern dieser Klasse gehören dbl, IBCR, vav, ect2, ost, tim, Tiam-1 sowie NET1. Sämtliche Ge ne kodieren für Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die über den Aus tausch von GDP durch GTP eine oder mehrere GTPasen der Rho-Familie (Rho- A, -B, -C, Rac1 und Cdc42Hs) aktivieren (Chan et al., 1994; Chan et al., 1996; Habets et al., 1994; Horii et al., 1994; Katzav et al., 1989; Miki et al., 1993). Ob wohl die Funktionen der Rho-Familienmitglieder noch nicht ausreichend definiert sind, wird neben deren Einfluß auf das Aktincytoskelett vor allem eine Partizipie rung bei der Regulation des Zellzyklus vermutet (Hall 1998). Darüber hinaus ha ben Überexpressionsversuche in Säugerzellen gezeigt, daß Rho-Proteine sowohl Apoptose stimulieren als auch inhibieren können (Brenner et al., 1997; Crespo et al., 1996; Na et al., 1996; Perona et al., 1997 bzw. Bobak et al., 1997; Esteve et al., 1995, Henning et al., 1997; Jiménez et al., 1995). Die GEF-Faktoren spielen hierbei als Aktivatoren der Rho-Familienmitglieder eine besondere Rolle. GEF- Faktoren enthalten neben der charakteristischen DH-Domäne eine weitere Do mäne (Pleckstrin Homology Domain; PH), die Produkte der Phosphatidyl-Inositol- 3-Kinase (PI3K) bindet (Han et al., 1998). Auf diese Weise werden zwei unter schiedliche Signaltransduktionswege (Rho und PI3K) miteinander verbunden.Sequence comparisons of the NET1 product with known proteins shows one Structural homology to the guanine nucleotide exchange factors (GEF) for Rho family GTPases. Already in the eighties the huma a new class of genes discovered in a dbl proto-oncogene that transform terminally truncated form mammalian cells (Eva A. and Aaronson S., 1985; Eva et al., 1988; Ron et al. 1988). To the well-known representatives of this Class include dbl, IBCR, vav, ect2, ost, tim, Tiam-1 as well as NET1. All Ge ne code for guanine nucleotide exchange factors (GEF), which have the Aus exchange of GDP for GTP one or more GTPases of the Rho family (Rho- A, -B, -C, Rac1 and Cdc42Hs) activate (Chan et al., 1994; Chan et al., 1996; Habets et al., 1994; Horii et al., 1994; Katzav et al., 1989; Miki et al., 1993). Whether the functions of the Rho family members have not yet been sufficiently defined are, besides their influence on the actin cytoskeleton, a participle regulation in the regulation of the cell cycle (Hall 1998). In addition ha Ben overexpression experiments in mammalian cells showed that Rho proteins both Stimulate and inhibit apoptosis (Brenner et al., 1997; Crespo et al., 1996; Na et al., 1996; Perona et al., 1997 and Bobak et al., 1997; Esteve et al., 1995, Henning et al., 1997; Jiménez et al., 1995). The GEF factors play here as activators of the Rho family members play a special role. GEF- In addition to the characteristic DH domain, factors contain another Do. mäne (Pleckstrin Homology Domain; PH), the products of the phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K) binds (Han et al., 1998). This way, two are below different signal transduction pathways (Rho and PI3K) connected.

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, weitere Gene und Genprodukte zu identifizieren, die an der Regulation der Zellproliferation und/oder Apoptose beteiligt sind. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Proteinvariante von NET1, umfassend die Aminosäuren 1 bis 30 der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 und davon abgeleitete, durch Substitution, Additi on, Insertion und/oder Deletion erhaltene Derivate, sowie durch eine Nukleinsäu re kodierend hierfür.The present invention was based on the technical problem, further genes and identify gene products involved in the regulation of cell proliferation and / or apoptosis are involved. This object is achieved according to the invention by a protein variant of NET1, comprising amino acids 1 to 30 of Sequence according to SEQ ID No. 1 and derived therefrom, by substitution, Additi derivatives obtained on, insertion and / or deletion, and by a nucleic acid re coding for this.

Ein weiteres Problem bestand darin, Mittel und Wege aufzuzeigen, mit denen eine Krebsfrüherkennung und deregulierte Apoptosevorgänge erkannt werden können. Dieses Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch das oben angege bene Protein und die entsprechende Nukleinsäure sowie durch ein Oligonukleo tid, das spezifisch mit einer oben angegebenen Nukleinsäure hybridisiert, sowie einem Antikörper, der spezifisch für ein oben angegebenes Protein ist. Ferner wird dieses Problem gelöst durch ein Diagnoseverfahren, bei dem ein oben an gegebenes Protein oder eine oben angegebene Nukleinsäure in einer Patienten probe nachgewiesen wird.Another problem was to show ways and means by which early cancer detection and deregulated apoptosis processes can be detected can. According to the invention, this problem is solved by the above bene protein and the corresponding nucleic acid as well as by an oligonucleo tid that hybridizes specifically with a nucleic acid specified above, and an antibody specific for a protein mentioned above. Further This problem is solved by a diagnostic procedure in which an above given protein or nucleic acid given above in a patient sample is detected.

Schließlich lag der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Verfahren anzugeben, mit denen Moleküle mit antineoplastischer Wirkung bzw. mit Apoptose-beeinflussender Wirkung identifiziert werden können.Finally, the present invention was based on the technical problem Specify methods with which molecules with antineoplastic activity or with apoptosis-influencing effects can be identified.

Dieses Problem wird erfindungsgemäß gelöst, indem die zu untersuchenden Moleküle mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, die ein oben genanntes Protein bzw. eine entsprechende Nukleinsäure enthält.This problem is solved according to the invention by the ones to be examined Molecules are brought into contact with a sample that has an above Contains protein or a corresponding nucleic acid.

Fig. 1 zeigt die schematische Darstellung der Genfallenintegration in ein alter natives Exon von NET1. Fig. 1 shows the schematic representation of the gene trap integration in an old native exon of NET1.

Fig. 2 zeigt die Induktion des erfindungsgemäßen NET1A in IL3 entzogenen FDCP1-Zellen. Fig. 2 shows the induction of the NET1A invention in IL3 withdrawn shows FDCP1 cells.

Fig. 3 zeigt die Induktion von NET1A in differenzierenden embryonalen Stamm zellen. Fig. 3 shows the induction of NET1A in differentiating embryonic stem cells.

Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte verschiedener Expressionsvektoren mit NET1 bzw. dem erfindungsgemäßen NET1A. Fig. 4 shows the restriction map of different expression vectors with NET1 or the NET1A invention.

Das erfindungsgemäße Protein ist ein transformierendes Protein, das sich von dem nicht-transformierenden Protoonkogenprodukt NET1-cl24, dem vorbekann ten Protein des NET1-Locus dadurch unterscheidet, daß es einen alternativen N- Terminus aufweist. Das erfindungsgemäße Protein NET1A repräsentiert das Pro dukt eines alternativen Transkripts des NET1-Locus und ist als solches, d. h. oh ne weitere Trunkierungen transformierend im NlH3T3-Assay. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, daß das neue Onkogenprodukt seine transformierende Eigenschaft dadurch ausübt, daß es zu einer Aktivierung des Rho-Signaltransduktionsweges führt (vgl. auch Hart et al., 1994). Das erfin dungsgemäße Protein betrifft somit ein neues transformierendes Genprodukt, das entweder direkt oder indirekt zur Krebsentstehung führen kann. Darüber hin aus wurde auch gefunden, daß das NET1A während der Apoptose in hämato poetischen Zellen induziert wird. Es ist daher davon auszugehen, daß es direkt oder indirekt an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt ist. Die In duktion des Genprodukts in hämatopoetischen Zellen während der Apoptose führte schließlich auch zur Identifizierung und Klonierung des Genprodukts. Die Indentifizierung des alternativen NET1-Genprodukts erfolgte mit Hilfe der Genfal lenintegration, die zur Identifizierung transient exprimierter Gene konzipiert wor den ist (vgl. PCT/EP97/06816; Russ et al., 1996). Es ist davon auszugehen, daß das erfindungsgemäße Protein eine zentrale Rolle in der Regulation des Zellzy klus einnimmt, wobei einerseits eine Deregulierung des Zellzyklus zur unkontrol lierten Zellproliferation und damit letztendlich zur Tumorentstehung, und ande rerseits zum gesteigerten Zelltod führen kann. Dies bedeutet, daß die Bereitstel lung der erfindungsgemäßen Proteinvariante die Möglichkeit eröffnet, durch Be einflussung der Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins die deregulierte Zell proliferation wieder so zu regulieren, daß die gesteigerte Zellproliferation und/oder der gesteigerte Zelltod wieder rückgängig gemacht werden kann.The protein according to the invention is a transforming protein which is derived from the non-transforming proto-oncogene product NET1-cl24, which previously distinguishes the protein of the NET1 locus in that it has an alternative N- Has terminus. The protein NET1A according to the invention represents the Pro product of an alternative transcript of the NET1 locus and as such, i.e. H. oh ne further truncations transforming in the NIH3T3 assay. Without one Theory is believed to be the new oncogene product exerts its transforming property by activating it of the Rho signal transduction pathway (see also Hart et al., 1994). That invented protein according to the invention thus relates to a new transforming gene product, that can lead to cancer either directly or indirectly. Beyond that It was also found that the NET1A in hematoma during apoptosis poetic cells is induced. It can therefore be assumed that it is direct or indirectly involved in the regulation of programmed cell death. The In Production of the gene product in hematopoietic cells during apoptosis eventually led to the identification and cloning of the gene product. The The alternative NET1 gene product was identified with the help of Genevaal lenintegration designed to identify transiently expressed genes that is (see PCT / EP97 / 06816; Russ et al., 1996). It is assumed that the protein according to the invention plays a central role in the regulation of the cell cycle takes on, on the one hand deregulation of the cell cycle to uncontrolled cell proliferation and thus ultimately to tumor development, and others on the other hand can lead to increased cell death. This means that the ready development of the protein variant according to the invention opens up the possibility of Be influence the activity of the protein according to the invention the deregulated cell regulate proliferation again so that the increased cell proliferation and / or the increased cell death can be reversed.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Protein umfaßt die ersten 30 Aminosäuren von M bis Q in der Sequenz von SEQ ID Nr. 1. Diese Aminosäuren werden durch das bisher nicht bekannte alternative Exon des NET1-Lokus kodiert. Mit umfaßt sind Varianten dieses Proteins, die sich durch Substitution, Addition, Insertion und/oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren herleiten, wobei durch die ses Veränderung in der Proteinsequenz die biologische Aktivität weniger als Faktor 5, vorzugsweise weniger als Faktor 2 gegenüber dem Protein mit der Se quenz nach SEQ ID Nr. 1 verändert wird. Als biologische Aktivität wird dabei die Aktivität verstanden, wie sie in dem NIH3T3-fokusbildenden Assay, wie in Baas ner et al. (1996) beschrieben, erhalten wird. Die Herstellung der weiteren Pro teinderivate ist dem Fachmann ohne weiteres geläufig. Hierzu können beispiels weise Verfahren eingesetzt werden, wie ausführlich beschrieben in Maniatis et al. (1989). Ein weiteres bevorzugtes Protein umfaßt die ersten 30 Aminosäuren von M bis Q gemäß der SEQ ID Nr. 2. Weitere bevorzugte Proteine sind solche, die die Sequenz nach SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 umfassen. Eine Inversion von Proteinabschnitten wird ebenfalls erfaßt, wobei Inversionen letztlich auch als Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an den entsprechenden Positio nen angesehen werden kann.A preferred protein according to the invention comprises the first 30 amino acids from M to Q in the sequence of SEQ ID No. 1. These amino acids are identified by encodes the previously unknown alternative exon of the NET1 locus. Includes are variants of this protein that are characterized by substitution, addition, insertion and / or deletion of one or more amino acids ses change in protein sequence less than biological activity Factor 5, preferably less than factor 2 compared to the protein with the Se sequence is changed according to SEQ ID No. 1. The biological activity is the Activity understood as in the NIH3T3 focus-forming assay as in Baas ner et al. (1996). The production of the further Pro The person skilled in the art is readily familiar with small derivatives. For example wise methods are used, as described in detail in Maniatis et al. (1989). Another preferred protein comprises the first 30 amino acids of M to Q according to SEQ ID No. 2. Further preferred proteins are those which comprise the sequence according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 2. An inversion of Protein segments are also recorded, with inversions ultimately also as Substitution of one or more amino acids at the corresponding position can be viewed.

Als erfindungsgemäße Nukleinsäuren werden solche angesehen, die eine Se quenz umfassen, die für ein Protein der oben beschriebenen Art kodieren. Ebenfalls umfaßt sind hierzu komplementäre Nukleinsäuren. Die erfindungsge mäße Nukleinsäure wird vorzugsweise ausgewählt aus a) Nukleinsäuremolekü len, die für ein Protein mit der SEQ ID Nr. 1 kodiert, b) Nukleinsäuremolekülen, die für ein oben angegebenes Proteinderivat kodieren, c) Nukleinsäuremolekü len, die mit den Molekülen nach a) und/oder b) hybridisieren, d) Nukleinsäuremo lekülen, deren Sequenz aufgrund des genetischen Codes degeneriert ist im Ver gleich zu den Sequenzen der unter a), b) oder c) genannten Nukleinsäuremolekü le und e) Fragmenten, Derivaten oder allelischen Varianten der unter a) bis d) genannten Nukleinsäuremoleküle.The nucleic acids according to the invention are those which have a Se include sequence encoding a protein of the type described above. Complementary nucleic acids are also included. The fiction moderate nucleic acid is preferably selected from a) nucleic acid molecule len which codes for a protein with SEQ ID No. 1, b) nucleic acid molecules, which code for a protein derivative indicated above, c) nucleic acid molecule len that hybridize with the molecules according to a) and / or b), d) nucleic acid mo lekülen whose sequence is degenerate due to the genetic code in Ver identical to the sequences of the nucleic acid molecules mentioned under a), b) or c) le and e) fragments, derivatives or allelic variants of those under a) to d) called nucleic acid molecules.

Eine bevorzugte Gruppe an Nukleinsäuremolekülen sind solche, die mit der Se quenz gemäß SEQ ID Nr. 3 hybridisieren und vorzugsweise für ein Protein mit der biologischen Aktivität von NET1A kodieren. Besonders bevorzugt sind spezi fisch mit der Sequenz ID Nr. 3 hybridisierende Nukleinsäuren und dazu komple mentäre Sequenzen. In diesem Zusammenhang bedeutet spezifisch, daß der Fachmann die Hybridisierungsbedingungen so einstellen kann, daß die hybridi sierende Sequenz nur mit der Target-DNA gemäß SEQ ID Nr. 3 ein sich von dem Hintergrund abzeichnendes Signal ergibt.A preferred group of nucleic acid molecules are those with the Se hybridize sequence according to SEQ ID No. 3 and preferably for a protein with encode the biological activity of NET1A. Speci are particularly preferred fish with sequence ID No. 3 hybridizing nucleic acids and complete mental sequences. In this context specifically means that the Expert can set the hybridization conditions so that the hybridi sequence with only the target DNA according to SEQ ID No. 3 is different from that Background signal.

Das erfindungsgemäße Oligonukleotid umfaßt mindestens 6, vorzugsweise min destens 12 und besonders bevorzugt mindestens 18 Nukleotide und hybridisiert spezifisch mit einer der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle. Besonders bevorzugt ist ein Oligonukleotid der genannten Art, das spezifisch mit einer Nu kleinsäure hybridisiert, die für die SEQ ID Nr. 1 oder 2 kodiert. Ferner sind solche Oligonukleotide bevorzugt, die mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 und/oder Nr. 4 spezifisch hybridisieren, sowie die hierzu komplementären Oligonukleotide. Ein besonderer Anwendungsbereich der erfindungsgemäßen Oligonukleotide liegt in dem Nachweis von Nukleinsäure in Patientenmaterial, die für das erfin dungsgemäße NET1A-Protein kodiert. Die Wahl der Hybridisierungsbedingungen zum spezifischen Nachweis der Nukleinsäure in dem Patientenmaterial liegt im fachmännischen Können. So kann er beispielsweise durch Auswahl der Oligonu kleotidsequenz, Oligonukleotidlänge und/oder der Hybridisierungsbedingungen, wie Temperatur und Pufferzusammensetzung, die Bedingungen so wählen, daß lediglich bei Vorhandensein der nachzuweisenden Nukleinsäure in dem Patien tenmaterial mit der Oligonukleotidprobe ein Signal erhalten wird. Die jeweiligen Bedingungen, wie sie beispielsweise zum Durchführen der Southern-Blot- Analyse angewendet werden, sind beispielsweise ausführlich in Maniatis et al. (1989) beschrieben. Bei einem alternativen Ansatz dient das erfindungsgemäße Oligonukleotid als Primer zum Nachweis der Nukleinsäure mittels PCR. Auch die hierfür zu wählenden Hybridisierungs- und Reaktionsbedingungen sind dem Fachmann geläufig. Die Wahl der geeigneten Oligonukleotide ist dem Fachmann ohne weiteres auf Basis der hierin beschriebenen Sequenzen möglich.The oligonucleotide according to the invention comprises at least 6, preferably min at least 12 and particularly preferably at least 18 nucleotides and hybridized specifically with one of the nucleic acid molecules described above. Especially an oligonucleotide of the type mentioned which is specific with a nu hybridized small acid, which codes for SEQ ID No. 1 or 2. Furthermore, there are Oligonucleotides preferred that have the sequence according to SEQ ID No. 3 and / or No. 4 hybridize specifically, as well as the complementary oligonucleotides. A particular area of application of the oligonucleotides according to the invention lies in the detection of nucleic acid in patient material that is responsible for the inventions encoded according to NET1A protein. The choice of hybridization conditions for specific detection of the nucleic acid in the patient material is in the professional skills. For example, by selecting the Oligonu Kleotide sequence, oligonucleotide length and / or the hybridization conditions, such as temperature and buffer composition, choose conditions such that only if the nucleic acid to be detected is present in the patient a signal is obtained with the oligonucleotide sample. The respective Conditions such as those used to perform Southern blot Analysis are used, for example, in Maniatis et al. (1989). In an alternative approach, the invention serves Oligonucleotide as a primer for the detection of nucleic acid by means of PCR. Also the the hybridization and reaction conditions to be selected for this are the Expert familiar. The choice of the suitable oligonucleotides is known to the skilled worker readily possible based on the sequences described herein.

Die erfindungsgemäße rekombinante Nukleinsäure enthält eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid, wie oben beschrieben. Vorzugsweise handelt es sich sowohl bei der rekombinanten Nukleinsäure wie auch bei der erfindungsgemäßen Nu kleinsäure sowie dem erfindungsgemäßen Oligonukleotid um eine DNA. Als re kombinate Nukleinsäuremoleküle kommen die üblichen Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren in Betracht. Dabei wird als rekombinate Nukleinsäure eine jede Nukleinsäure angesehen, bei der eine Nukleinsäure bzw. ein Oligonukleotid wie oben beschrieben mit einer weiteren Nukleinsäure verbunden ist, wobei die weitere Nukleinsäure in der natürlichen Umgebung der erfindungsgemäßen Nu kleinsäure üblicherweise nicht vorliegt. Geeignete Vektorsysteme zum Kombinie ren mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. dem Oligonukleotid sind ebenfalls in Maniatis et al. (1989) beschrieben.The recombinant nucleic acid according to the invention contains a nucleic acid or an oligonucleotide as described above. It is preferably both in the recombinant nucleic acid as well as in the Nu according to the invention small acid and the oligonucleotide according to the invention around a DNA. As right Combined nucleic acid molecules come with the usual cloning and / or Expression vectors into consideration. A recombinant nucleic acid is used viewed any nucleic acid in which a nucleic acid or an oligonucleotide is linked to another nucleic acid as described above, the further nucleic acid in the natural environment of the nu invention Small acid is usually not present. Suitable vector systems for the combination ren with the nucleic acid according to the invention or the oligonucleotide also in Maniatis et al. (1989).

Der erfindungsgemäße Kit enthält die Materialien, die notwendig sind zum Nach weis des erfindungsgemäßen Proteins und/oder der dafür kodierenden Nuklein säure in einem vorgegebenen Probenmaterial. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Probenmaterial um Patientenmaterial, in dem das Protein bzw. die entspre chende Nukleinsäure, insbesondere das NET1A-Transkript, beispielsweise zum Erstellen einer Diagnose nachgewiesen werden soll. Bei einer besonders bevor zugten Ausführungsform enthält der Kit Oligonukleotide, die als Primer geeignet sind zum Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mittels PCR. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Kit auch einen Antikörper ent halten, der spezifisch ist für das erfindungsgemäße Protein. Der Kit ist dann bei spielsweise geeignet zum Nachweis von NET1A in Patientenmaterial durch We stern-Blotting.The kit according to the invention contains the materials that are necessary for the night of the protein according to the invention and / or the nucleotides coding for it acid in a given sample material. It is preferably the sample material around patient material in which the protein or the correspond nucleic acid, in particular the NET1A transcript, for example for Establishing a diagnosis should be proven. With one especially before Preferred embodiment contains the kit oligonucleotides which are suitable as primers are for the detection of the nucleic acid according to the invention by means of PCR. At a In another preferred embodiment, the kit can also contain an antibody hold that is specific for the protein of the invention. The kit is then with suitable for example for the detection of NET1A in patient material by We star blotting.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers liegt im fachmännischen Können. Einerseits kann ein polyklonales Antiserum hergestellt werden durch Verabreichen des erfindungsgemäßen Proteins an einen Säuger. Bevorzugt sind jedoch monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Protein. Diese An tikörper lassen sich beispielsweise nach dem von Köhler und Milstein entwickel ten Verfahren herstellen.The production of the antibody according to the invention lies in the technical field Can. On the one hand, a polyclonal antiserum can be produced by Administration of the protein of the invention to a mammal. Are preferred however, monoclonal antibodies against the protein according to the invention. This to Antibodies can be developed, for example, by Köhler and Milstein Establish the process.

Bei einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform richtet sich der An tikörper gegen einen Proteinabschnitt aus dem Aminoterminus des erfindungs gemäßen Proteins. Bei einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform reagiert der Antikörper mit dem Proteinabschnitt von Position 1 bis 30 in der Se quenz nach SEQ ID Nr. 1.In a further, particularly preferred embodiment, the An is directed antibodies against a protein segment from the amino terminus of the invention protein. In a further, particularly preferred embodiment the antibody reacts with the protein portion from position 1 to 30 in the Se sequence according to SEQ ID No. 1.

Die erfindungsgemäßen Proteine, Nukleinsäuren bzw. Antikörper finden vor zugsweise Einsatz als Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Falls es die Indikation anzeigt, den körpereigenen NET1A-Proteinspiegel anzu heben, so kann das erfindungsgemäße Protein im Rahmen einer pharmazeuti schen Zusammensetzung direkt verabreicht werden. Alternativ kann auch durch gentherapeutische Maßnahmen der Spiegel an NET1-Transkript gesteigert wer den. Hierzu kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter der Kontrolle eines starken Promotors an den Patienten verabreicht werden.The proteins, nucleic acids or antibodies according to the invention are found preferably used as an active ingredient in a pharmaceutical composition. If it indicates the indication, the body's own NET1A protein level raise, the protein according to the invention can be used in the context of a pharmaceutical The direct composition can be administered. Alternatively, you can go through gene therapy measures the level of NET1 transcript increased the. For this purpose, the nucleic acid according to the invention can be controlled by a strong promoter to be administered to the patient.

Schließlich eröffnet die vorliegende Erfindung auch die Möglichkeit, die Expres sionsspiegel des Proteins und/oder dessen biologische Wirkung zu erniedrigen. Hierzu kann beispielsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die in An tisinn-Orientierung unter der Kontrolle eines starken Promotors steht, in den Or ganismus eingebracht werden. Die Expression der erfindungsgemäßen Nuklein säure in Antisinn-Orientierung führt dazu, daß in vivo die Translation des NET1A- Transkripts blockiert und somit weniger erfindungsgemäßes Protein hergestellt wird. Alternativ kann die biologische Wirkung des Proteins durch Verabreichen eines Antikörpers, der spezifisch gegen das Protein gerichtet ist, erniedrigt wer den.Finally, the present invention also opens up the possibility of expresses sion level of the protein and / or to lower its biological effect. For this purpose, for example, a nucleic acid according to the invention which is described in An tisinn orientation is under the control of a strong promoter, in the Or can be introduced. The expression of the nuclein according to the invention acid in antisense orientation leads to the translation of NET1A- Blocked transcripts and thus produced less protein according to the invention becomes. Alternatively, the biological effect of the protein can be administered of an antibody that is specifically directed against the protein the.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Diagnose einer Prä disposition für Krebs oder der Diagnose von Krebs bereit. Wie oben ausgeführt, besitzt das erfindungsgemäße Protein transformierende Aktivität im NIH3T3- Fokusbildungstest. Wie ebenfalls oben ausgeführt, wird davon ausgegangen, daß das Protein maßgeblich an der Deregulation des Zellzyklus beteiligt ist. Da nach kann die (Über-)expression von NET1A zu einer unkontrollierten Zellprolife ration führen, wobei letztere schließlich zum Auftreten von Krebs führen kann. Im Rahmen dieser Diagnose kann der Nachweis der Menge an erfindungsgemäßem Protein in einer Patientenprobe einen Hinweis auf das Risiko und/oder die Schwere einer Krebserkrankung geben. Neben dem erfindungsgemäßen Protein kann auch die hierfür kodierende Nukleinsäure als diagnostischer Marker einge setzt werden. Dabei kann insbesondere die Menge an Transkript, die für ein Protein mit der Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 kodiert, ein Maß dafür sein, wie hoch das Risiko bzw. wieweit fortgeschritten eine Krebserkrankung ist. The present invention further provides a method for diagnosing a pre disposition for cancer or the diagnosis of cancer ready. As stated above has the protein-transforming activity according to the invention in NIH3T3- Focus formation test. As also stated above, it is assumed that the protein is significantly involved in the deregulation of the cell cycle. There the (over) expression of NET1A can lead to an uncontrolled cell proliferation ration, the latter eventually leading to the appearance of cancer. in the The detection of the amount of the invention can be used as part of this diagnosis Protein in a patient sample is an indication of the risk and / or the Severity of cancer. In addition to the protein according to the invention the nucleic acid coding for this can also be used as a diagnostic marker be set. In particular, the amount of transcript required for a Protein encoded with the sequence according to SEQ ID No. 1, a measure of how high the risk or how advanced a cancer is.

Der diagnostische Marker NET1A-Protein bzw. allelische Varianten hiervon läßt sich beispielsweise mit Hilfe immunologischer Nachweisreaktionen ermitteln. Zu diesem Zweck können beispielsweise die Proteine des Patientenmaterials elek trophoretisch aufgetrennt und auf einen festen Träger übertragen werden. Der Nachweis des diagnostischen Markers NET1A erfolgt dann beispielsweise durch Zugabe des erfindungsgemäßen Antikörpers, wie beim Western-Blot-Verfahren. Bei einem alternativen Diagnoseverfahren dient die erfindungsgemäße Nuklein säure als diagnostischer Marker. Dabei kann beispielsweise das Transkript, das für das erfindungsgemäße Protein kodiert, im Rahmen von Southern-Blot- Analysen nachgewiesen werden. Dabei läßt sich beispielsweise das erfindungs gemäße Transkript neben weiteren, gegebenenfalls auch vom NET1-Locus stammenden Transkripten nachweisen, indem eine Probe eingesetzt wird, die spezifisch ist für den die ersten 30 Aminosäuren kodierenden Abschnitt. Dieser Nukleinsäureabschnitt entspricht dem ersten alternativen Exon, wie schematisch in Fig. 1 angegeben. Das erfindungsgemäße Transkript für NET1A läßt sich auch über die Größe von dem nicht-transformierenden NET1-Transkript unter scheiden. Das erfindungsgemäße Transkript ist ca. 150 Nukleotide kürzer als das nicht-transformierende NET1-Transkript. Letzteres kodiert für ein Proteinprodukt, das ca. 53 Aminosäuren länger ist als NET1A.The diagnostic marker NET1A protein or allelic variants thereof can be determined, for example, with the aid of immunological detection reactions. For this purpose, for example, the proteins of the patient material can be separated electrophoretically and transferred to a solid support. The diagnostic marker NET1A is then detected, for example, by adding the antibody according to the invention, as in the Western blot method. In an alternative diagnostic method, the nucleic acid according to the invention serves as a diagnostic marker. For example, the transcript that codes for the protein according to the invention can be detected in the course of Southern blot analyzes. Here, for example, the transcript according to the invention can be detected in addition to other transcripts which may also originate from the NET1 locus by using a sample which is specific for the section coding the first 30 amino acids. This nucleic acid segment corresponds to the first alternative exon, as indicated schematically in FIG. 1. The transcript for NET1A according to the invention can also be distinguished by the size of the non-transforming NET1 transcript. The transcript according to the invention is approximately 150 nucleotides shorter than the non-transforming NET1 transcript. The latter codes for a protein product that is approximately 53 amino acids longer than NET1A.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure als diagnostischer Marker läßt sich auch spezifisch durch PCR nachweisen. Zu diesem Zweck kann beispielsweise ein Primer eingesetzt werden, der spezifisch ist für die das alternative Exon umfas sende Nukleinsäure, während der zweite Primer beliebig innerhalb der Ge samtsequenz wählbar ist. Bei dieser Primerkombination wird lediglich das das alternative Exon enthaltende Transkript amplifiziert und somit nachgewiesen. Ein Nachweis des erfindungsgemäßen Transkripts über seine geänderte Transkript länge ist auf diesem Wege ebenfalls möglich. Schließlich bietet die zusätzliche Spaltung der amplifizierten Nukleinsäure mit Restriktionsenzymen eine weitere Möglichkeit zwischen dem erfindungsgemäßen Transkript und den weiteren Transkripten der Zelle zu unterscheiden. The nucleic acid according to the invention as a diagnostic marker can also be used detect specifically by PCR. For example, a Primer is used, which is specific for which the alternative exon comprises send nucleic acid while the second primer is arbitrary within the Ge entire sequence is selectable. With this primer combination, this is just that alternative transcript containing exon amplified and thus detected. A Evidence of the transcript according to the invention via its modified transcript length is also possible in this way. Finally, the additional one offers Another cleavage of the amplified nucleic acid with restriction enzymes Possibility between the transcript according to the invention and the others Distinguish cell transcripts.

Des weiteren eröffnet die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, Moleküle mit an tineoplastischer Wirkung zu identifizieren. Dabei kann das zu untersuchende Molekül mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, die das erfindungsgemäße Protein und/oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält. Wie oben ausge führt, spielt das erfindungsgemäße Protein eine Rolle bei der neoplastischen Transformation, wobei davon auszugehen ist, daß das Risiko einer neoplasti schen Transformation zunimmt mit der gesteigerten Expression des Proteins. In dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren lassen sich somit also beispiels weise Moleküle austesten, die einen Einfluß auf die Expressionsspiegel des er findungsgemäßen Proteins zeigen. Im einfachsten Fall wird die Expressionsrate des erfindungsgemäßen Proteins einer nicht behandelten Zelle verglichen mit der Expressionsrate einer Zelle nach Kontakt mit dem zu testen den Molekül.Furthermore, the present invention opens up the possibility of including molecules identify tineoplastic effects. The thing to be examined Molecule can be brought into contact with a sample that the inventive Contains protein and / or the nucleic acid according to the invention. As stated above leads, the protein according to the invention plays a role in the neoplastic Transformation, assuming that the risk of neoplastic transformation increases with the increased expression of the protein. In The screening method according to the invention can thus be exemplified test wise molecules that influence the expression level of the er show protein according to the invention. In the simplest case, the expression rate of the protein according to the invention of an untreated cell compared with that Expression rate of a cell after contact with the molecule to be tested.

Auf ähnliche Weise können auch Moleküle identifiziert werden, die die Apoptose vorgänge in Zellen beeinflussen. Wie oben ausgeführt, wird NET1A während der Apoptose in hämatopoetischen Zellen induziert und ist an der Regulation des programmierten Zelltods beteiligt. Demzufolge können im Rahmen der vorliegen den Erfindung Substanzen auf ihren möglichen Einfluß auf Apoptosevorgänge getestet werden, indem untersucht wird, inwieweit die Moleküle zu einer verän derten Expression des erfindungsgemäßen Proteins oder zu einer veränderten biologischen Aktivität des Proteins führen.Similarly, molecules that identify apoptosis can also be identified influence processes in cells. As stated above, NET1A is used during the Apoptosis is induced in hematopoietic cells and is involved in the regulation of the programmed cell death involved. Accordingly, within the scope of the the invention substances on their possible influence on apoptosis processes be tested by examining to what extent the molecules change to one derten expression of the protein according to the invention or to an altered biological activity of the protein.

Schließlich ermöglicht die vorliegende Erfindung auch die Bereitstellung des er findungsgemäßen Proteins in großen Mengen, indem die für die rekombinante Herstellung erforderlichen Mittel bereitgestellt werden. Zu diesem Zweck wird eine rekombinante Nukleinsäure, die für das gewünschte Protein kodiert, in einer Wirtszelle exprimiert. Hierfür kommen die üblichen prokaryontischen sowie eu karyontischen Wirtsorganismen und Expressionssysteme in Betracht. Die einzel nen Maßnahmen zur rekombinanten Herstellung eines Proteins sind dem Fach mann geläufig und finden sich beispielsweise in Maniatis et al. (1989).Finally, the present invention also makes it possible to provide the Protein according to the invention in large quantities by the for the recombinant Manufacturing necessary resources are provided. For this purpose a recombinant nucleic acid encoding the desired protein in one Host cell expressed. The usual prokaryotic and eu come for this caryotic host organisms and expression systems. The single Measures for recombinant production of a protein are the subject man familiar and can be found for example in Maniatis et al. (1989).

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung: The following examples illustrate the invention:

Cloning of the protein according to the invention using gene trap integration in an alternative exon from NET1

Das Prinzip der Genfallenintegration ist ausführlich in PCT/EP97/06816 sowie Russ et al. (1996) beschrieben. Bei den hierin durchgeführten Untersuchungen mit hämatopoetischen Zellen wurde ein Transkript identifiziert, das ein neues 5'- Exon enthält. Dieser Vorgang ist schematisch in Fig. 1 dargestellt. Das bekann te Produkt des NET1-Locus unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen Produkt durch den 5'-Terminus, indem beim vorbekannten Produkt dieser 5'- Terminus durch ein anderes Exon kodiert wird. Die Genfallenintegration zeigt weiterhin, daß das identifizierte alternative Transkript tatsächlich in Zellen, d. h. in vivo, vorliegt und nicht das Ergebnis eines Klonierungsartefakts ist.The principle of gene trap integration is described in detail in PCT / EP97 / 06816 and Russ et al. (1996). In the investigations with hematopoietic cells carried out herein, a transcript was identified which contains a new 5'-exon. This process is shown schematically in FIG. 1. The known product of the NET1 locus differs from the product according to the invention by the 5'-terminus in that this 5'-terminus is encoded by another exon in the previously known product. Gene trap integration further shows that the identified alternative transcript is actually in cells, ie in vivo, and is not the result of a cloning artifact.

Induction of NET1A in IL3-extracted FDCP1 cells

Zur Untersuchung der Induzierbarkeit von NET1A-Transkripten während der Apoptose wurden zwei zelluläre Modelle eingesetzt. Zum einen wurde FDCP1 - Zellen, der Wachstumsfaktor IL3 für 0,5 bis 12 Stunden entzogen, und ausge wählte mRNAs mittels RT-PCR nachgewiesen. Zum anderen wurden embryonale Stammzellen der Maus (ES-Zellen) zum Differenzieren induziert und mRNAs nach 1 bis 7 Tagen auf Northern-Blots mit der alternativen NET1A-Exonsequenz hybridisiert. In beiden Modellen wird unter den oben angegebenen Bedingungen Apoptose induziert. Fig. 2 zeigt, daß schon nach 0,5 Stunden nach IL3-Entzug NET1A induziert wird. Dies wird aus Fig. 2 ersichtlich, bei der GAPDH-PCR mit 21 Zyklen und die NET1- und NET1A-PCRs jeweils mit 33 Zyklen durchgeführt wurden. Die Primer für die Spleißvarianten NET1 und NET1A waren für die alter nativen Exons spezifisch. Die PCR-Reaktionsansätze von GAPDH, NET1 und NET1A wurden für die jeweiligen Zeitpunkte miteinander zu gleichen Teilen ge poolt und in 2% Agarosegelen aufgetrennt. Im Gegensatz zu dem Ergebnis für NET1A wird die bekannte NET1-Variante nicht induziert. Dies zeigt, daß NET1A, nicht hingegen NET1, eine direkte oder indirekte Rolle bei der Regulation der Apoptose spielt. Dieses Ergebnis wurde in einem weiteren Versuch mit differen zierenden ES-Zellen bestätigt. Diese Versuche zeigten, daß NET1A im Stadium der "embryoid body"-Bildung (Tag 7) (vgl. auch Dötschmann et al., 1985) indu ziert wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Bei diesen Versuchen wurde eine Northern-Blot-Hybridisierung mit P³²-markierten NET1A- (oben) und L32- (unten) Sonden durchgeführt. Die NET1A-Sonde enthielt nur das alternative Exon 1. In dem genannten Differenzierungsstadium von ES-Zellen findet be kanntlich vermehrte Apoptose statt.Two cellular models were used to investigate the inducibility of NET1A transcripts during apoptosis. On the one hand, FDCP1 cells, the growth factor IL3 were withdrawn for 0.5 to 12 hours, and selected mRNAs were detected using RT-PCR. On the other hand, mouse embryonic stem cells (ES cells) were induced to differentiate and mRNAs were hybridized with the alternative NET1A exon sequence after 1 to 7 days on Northern blots. In both models, apoptosis is induced under the conditions specified above. FIG. 2 shows that NET1A is induced after only 0.5 hours after IL3 withdrawal. This can be seen from FIG. 2, in which the GAPDH-PCR was carried out with 21 cycles and the NET1 and NET1A-PCRs were each carried out with 33 cycles. The primers for the NET1 and NET1A splice variants were specific for the old native exons. The PCR reaction mixtures of GAPDH, NET1 and NET1A were pooled in equal parts for the respective times and separated in 2% agarose gels. In contrast to the result for NET1A, the known NET1 variant is not induced. This shows that NET1A, but not NET1, plays a direct or indirect role in the regulation of apoptosis. This result was confirmed in a further experiment with differentiating ES cells. These experiments showed that NET1A is induced at the stage of "embryoid body" formation (day 7) (cf. also Dötschmann et al., 1985). The results are shown in FIG. 3. In these experiments, Northern blot hybridization was carried out with P ³² -labeled NET1A (above) and L32 (below) probes. The NET1A probe contained only the alternative exon 1. In the stated differentiation stage of ES cells, there is a known increase in apoptosis.

Transformation of NIH3T3 cells to overexpress NET1A

NET1- und NET1A-kodierende Regionen wurden mit Exon-1-spezifischen und gemeinsamen 3'-Primern aus differenzierenden ES-Zellen amplifiziert und in den retroviralen Expressionsvektor MLDelSM401 (vgl. Hildinger et al., 1998) kloniert. Die spezifischen Primer waren wie folgt:
Regions coding for NET1 and NET1A were amplified with exon-1-specific and common 3 'primers from differentiating ES cells and cloned into the retroviral expression vector MLDelSM401 (cf. Hildinger et al., 1998). The specific primers were as follows:

Die Amplifikation der NET1-Varianten erfolgte mit der pfu-Polymerase (Strata gene) nach Anleitung des Herstellers. Die Konstrukte pMLdelAstop1 (enthält NET1A; vgl. Fig. 4A) und pMLdelBstop4 (enthält NET1; vgl. Fig. 4B) wurden in ekotrope Φnx-Verpackungszellen transfiziert (vgl. Pear et al., 1993). Nach 24- stündiger Inkubation wurden die NIH3T3-Zellen mit Φnx-Virusüberständen infi ziert. Stabile NET1A- und NET1-exprimierende Klone wurden über "limiting dilution" isoliert und expandiert. Zur Untersuchung der transformierenden Wir kung der beiden Spleißvarianten wurden mit den einzelnen Klonen Kontaktinhibi tionsversuche ("focus forming assays") durchgeführt (Baasner et al., 1996). Den oben angegebenen retroviralen Expressionsvektoren liegt das Plasmid pUC19 zugrunde.The NET1 variants were amplified with pfu polymerase (Strata gene) according to the manufacturer's instructions. The constructs pMLdelAstop1 (contains NET1A; see Fig. 4A) and pMLdelBstop4 (contains NET1; see Fig. 4B) were transfected into ecotropic Φnx packaging cells (see Pear et al., 1993). After 24 hours of incubation, the NIH3T3 cells were infected with Φnx virus supernatants. Stable NET1A and NET1 expressing clones were isolated and expanded via "limiting dilution". To investigate the transforming effect of the two splice variants, contact inhibition tests ("focus forming assays") were carried out with the individual clones (Baasner et al., 1996). The above-mentioned retroviral expression vectors are based on the plasmid pUC19.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßtThe results are summarized in the following table

TABELLE 1 TABLE 1

Fokusbildung durch NET1A- und NET1-exprimierende Klone Focus formation by clones expressing NET1A and NET1

Cell culture

Die FDCP1-Zellen wurden bei Konzentrationen von 1 × 10⁶ Zellen pro ml in Dul becco's modifiziertem Eagles Medium (DMEM, Gibco) ergänzt mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (Hyclone, Utah, USA) und 5 ng/ml rekombinaten Mäuse-IL3 (Novartis) gezüchtet. Zur Apoptoseinduktion wurden die Zellen unter gleichen Bedingungen ohne IL3 inkubiert.The FDCP1 cells were recombined at concentrations of 1 × 10 ⁶ cells per ml in Dul becco's modified Eagles Medium (DMEM, Gibco) with 10% (v / v) fetal calf serum (Hyclone, Utah, USA) and 5 ng / ml Mouse IL3 (Novartis) bred. To induce apoptosis, the cells were incubated under the same conditions without IL3.

D3 ES-Zellen (von Melchner et al., 1992) wurden auf bestrahlten (32Gy) Feeder- Zellen in DMEM, 15% FKS (Linaris, Bettingen), 100 mM nicht-essentielle Ami nosäuren (GibcoBRL), 0,1 mM f3-Mercaptoethanol (Sigma), 1000 U/ml LIF (Esgro®; GibcoBRL) gezüchtet. Differenzierung wurde in DMEM, 20% FCS, 0,3 mM β-Mercaptoethanol und 100 mM nicht-essentielle Aminosäuren in Abwesen heit von LIF und Feeder-Zellen in bakteriellen Petrischalen induziert. Unter die sen Bedingungen bilden sich sogenannte "embryoid bodies" (Doetschman et. al, 1985).D3 ES cells (from Melchner et al., 1992) were exposed to irradiated (32Gy) feeder Cells in DMEM, 15% FCS (Linaris, Bettingen), 100 mM non-essential amino noacids (GibcoBRL), 0.1 mM f3-mercaptoethanol (Sigma), 1000 U / ml LIF (Esgro®; GibcoBRL) bred. Differentiation was made in DMEM, 20% FCS, 0.3 mM β-mercaptoethanol and 100 mM non-essential amino acids in absentia induced by LIF and feeder cells in bacterial petri dishes. Among the conditions form so-called "embryoid bodies" (Doetschman et. al, 1985).

RT-PCR

Gesamt-RNA wurde nach der Methode von Chirgwin et al. (1979) isoliert. Semi quantitative RT-PCR: Je 1 µg Gesamt-RNA wurde durch reverse Transkription (RT) in cDNA umgeschrieben. Als Primer wurden randomisierte Oligonukleotid- Hexamere (rHex) benutzt.
Reaktionsansatz A:
1 µl rHex (0,2 µg/µl)
1 µl RNA (1 µg/µl)
9 µl H₂O (RNase-frei)
Reaktionsansatz B:
6 µl 5 × RT-Puffer (GibcoBRL)
3 µl 100 mM DTT
3 µl dNTP (je 10 mM)
1 µl RNasin (Pharmacia, RNAguard, 40 U/µl)
0,4 µl Superscript II (GibcoBRL)
4,6 µl H₂O (Rnase-frei). Total RNA was determined using the Chirgwin et al. (1979) isolated. Semi quantitative RT-PCR: 1 µg total RNA was transcribed into cDNA by reverse transcription (RT). Randomized oligonucleotide hexamers (rHex) were used as primers.
Reaction Approach A:
1 µl rHex (0.2 µg / µl)
1 µl RNA (1 µg / µl)
9 µl H ₂ O (RNase free)
Reaction approach B:
6 µl 5 × RT buffer (GibcoBRL)
3 µl 100 mM DTT
3 µl dNTP (10 mM each)
1 µl RNasin (Pharmacia, RNAguard, 40 U / µl)
0.4 µl Superscript II (GibcoBRL)
4.6 µl H ₂ O (nose free).

Reaktionsansatz A wurde 10 min auf 65°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und dann zu Reaktionsansatz B gegeben. Danach wurde das Reaktionsgemisch über 15 Mi nuten von 30°C auf 45°C erhitzt und bei dieser Temperatur für weitere 1,5 Stun den inkubiert. Nach Inaktivierung bei 65°C für 30 min wurden jeweils 1 µl des re versen Transkriptionsproduktes für die PCR eingesetzt. Die PCR wurde mit Gibco-Taq-Polymerase nach Anleitung des Herstellers in einem Perkin Elmer Thermocycler wie folgt durchgeführt: 5 min 94°C; 33 Zyklen (1 min 94°C, 1 min 61°C, 1 min 72°C) und 15 min 72°C. Die spezifischen Primer waren wie folgt:
Reaction batch A was heated to 65 ° C. for 10 min, cooled on ice and then added to reaction batch B. The reaction mixture was then heated for 15 minutes from 30 ° C. to 45 ° C. and incubated at this temperature for a further 1.5 hours. After inactivation at 65 ° C for 30 min, 1 ul of the reverse transcription product was used for the PCR. The PCR was carried out with Gibco-Taq polymerase according to the manufacturer's instructions in a Perkin Elmer thermal cycler as follows: 5 min 94 ° C; 33 cycles (1 min 94 ° C, 1 min 61 ° C, 1 min 72 ° C) and 15 min 72 ° C. The specific primers were as follows:

Northern-Blot-Hybridisierungen wurden nach Standardmethoden mit dem ³²P- markierten alternativen Exon 1 (NET1A) und L32 (Neznanov et al., 1993) Sonden durchgeführt.Northern blot hybridizations were carried out according to standard methods with the ³² P-labeled alternative exon 1 (NET1A) and L32 (Neznanov et al., 1993) probes.

SEQUENCE LOG

Die SEQ ID Nr. 1 stellt das Humanprotein dar.SEQ ID No. 1 represents the human protein.

Die SEQ ID Nr. 2 stellt das Mausprotein dar.SEQ ID No. 2 represents the mouse protein.

Die SEQ ID Nr. 3 stellt die humane cDNA dar.SEQ ID No. 3 represents the human cDNA.

Die SEQ ID Nr. 4 stellt die Maus-cDNA dar. SEQ ID No. 4 represents the mouse cDNA.

REFERENCES

Baasner, S., H. von Melchner, T. Klenner, P. Hilgard, and T. Reckers. 1996. Reversible tumorigenesis in mice by conditional expression of HEk2/c-erbB2 recep tor tyrosine kinase. Oncogene 13: 901-911.
Bobak, D., J. Moorman, A. Guanzon, L. Gilmer, and C. Hahn. 1997. Inactivation of the small GTPase Rho disrupts cellular attachment and induces adhe sion-ctependent and adhesion-independent apoptosis. Oncogene 15: 2179-2189. Brenner, B., U. Koppenhoefer, C. Weinstock, O. Linderkamp, F. Lang, and E. Gulbins. 1997. Fas- or ceramide-induced apoptosis is mediated by a rac1-regulated activation of Jun X-terminal kinase/p38 kinases and GADD153. J. Biol. Chem. 272: 22173-22181.
Chan, A., E. McGovern, G. Catalano, T. Fleming, and T. Miki. 1994. Expression cDNA cioning of a novel oncogene with sequence similarity to regulators of small GTP-binding proteins. Oncogene 9: 1057-1063.
Chan, A., S. Takai, K. Yamada, and T. Miki. 1996. Isolation of a novel onco gene, NETI, from neuroepithelioma cells by expression cDNA cloning. Oncogene 12: 1259-1266.
Chirgwin J.J., Przbyla A.E., MacDonald R.J., Rufter W.J (1979). Isolation of biologically active nbonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Bio chemistry 18: 5294-5299.
Crespo, F., X. Bustelo, D. Aaronson, O. Coso, M. Lopez-Barahona, M. Barbacid, and J. Gutkind. 19 96. Rac-1 dependent stimulation of the JNK/SAPK si gnaling pathway by vav. Oncogene 13: 455-460.
Doetschman, T. C., H. Fistetter, M. Katz, W. Schmidt, and R. Kemler. 1985. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic Stern cell lines: formation of-visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-
Esteve, P., L. del Peso, and J. Lacai. 1995. Induction of apoptosis by rho in NIH 3T3 cells requires two complementary signals. Ceramides function as a progression factor for apoptosis. Oncogene 11: 2657-2665.
Eva, A., and S. Aaronson. 1985. Isolation of a new hurnan oncogene from a diffuse B-cell lymphoma. Nature 316: 273-275.
Eva, A., G. Vecchio, C. Rao, S. Tronick, and S. Aaronson. 1988. The predicted DBL oncogene product defines a distinct class of transforming proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2061-2065.
Habets, G., E. Scholtes, D. Zuydgeest, R. van der Kammen, J. Stam, A. Berns, and J. Collard. 1994. Identification of an invasion-indudng gene, Tiam-1, that enco des a protein with homology to GDF-GTP exchangers for Rho-like proteins. Cell 77: 537-549.
Hall, A. 1998. kho GTPases and the actin cytoskeleton. Science 279: 509-514.
Han, J., K. Luby-Phelps, B. Das, X. Shu, Y. Xia, R. Mosteller, U. Krishna, J. Falck, M. Whjte, and D. Broek. 1998. Pole of substrates and products of Pl 3-kinase in regulating activation of rac-related guanosine triphosphatases by vav. Science 279: 558-560.
Hart, M., A. Eva, D. Zangrilii, S. Aaronson, T. Evans, R. Cerione, and Y. Zheng. 1994. Cellular transformation and guanine nucleotide exchange activity are catalyzed by a common domain on the dbl oncogene product. J. Bio. Chem. 269: 62- 65.
Henning, S., R. Galandrini, A. Hall, and D. Cantrell. 1997. The GTPase Rho has a critical regulatory rote in thymus development. Embo J. 16: 2397-2407.
Hildinger, M., B. Fehse, S. Hegewisch-Becker, J. John, J. R. Rafferty, W. Ostertag, and C. Baum. 1998. Dominant selection of hematopoietic progenitor cells with retroviral MDR1 co-expression vectors. Hum. Gene Therap. 9: 33-42.
Horii, Y., J. Beeler, K. Sakaguchi, M. Tachibana, and T. Miki. 1994. A novel oncogene, ost, encodes a guanine nucleotide exchange factor that potentially tinks Rho and Rac signaling pathways. Embo J. 13: 4776-4786.
Jiménez, B., M. Arends, P. Esteve, R. Perona, R. Sánchez, S. Ramón y Cajal, A. Wyllie, and J. Lacal. 1995. Induction of apoptosis in NIH3T3 cells after Serum de privation by overexpression of rho-p21, a GTPase protein of the ras superfamily. Oncogene 1995: 811-816.
Katzav, S., D. Martin-Zanca, and M. Barbacid. 1989. vav, a novel human on cogene derived from a locus ubiquitously expressed in hematopoietic cells. Ernbo J. 8: 2283-2290.
Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1989). Molecular cloning: A labora tory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Miki, T., C. Smjth, J. Long, A. Eva, and T. FIeming. 1993. Oncogene ect2 is related to reguiators of small GTP-binding proteins. Nature 362: 462-465.
Na, S., T. Chuang, A. Cunningham, T. Turi, J. Hanke, G. Bokoch, and D. Danley. 1996. D4-GDI, a substrate of CPP32, is proteolyzed during Fas-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 271: 11209-11213.
Neznanov, N., I. S. Thorey, G. Cecena, and R. G. Oshima. 1993. Transcriptional insuiation of the human keratin 18 gene in transgenic rnlce. Mol. Cell. Biol. 13: 2214-2223.
Pear, W. S., G. P. Nolan, M. L. Scott, and D. Baltimore. 1993. Production of high-titer hetper-free retroviruses by transient transfection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8392-8396.
Perona, R., S. Montaner, L. Saniger, I. Sanchez-Perez, R. Bravo, and J. Lacal. 1997. Activation of the nuclear factor-kappaB by Rho, CDC42, and Rac-1 proteins. Genes Dev. 11: 463-475.
Ron, D., S. Tronjck, S. Aaronson, and A. Eva. 1988. Molecular cioning and characterization of the human dbl proto-oncogene: evidence that its overexpression is sufficient to transform MH/3T3 cetls. Embo J. 7: 2465-2473.
Russ, A. P., C. Friedel, K. Ballas, U. Kalina, D. Zahn, K. Strebhard, and H. von Melchner. 1996. Identification of genes induced by factor deprivation in hematopoietic cells undergoing apoptosis using gene-trap mutagenesis and site-specific recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15279-15284.
Von Melchner H., DeGregori J.V., Rayburn H., Reddy S., Friedel C., Earl Ruley H. (1992). SeIective disruption of genes expressed in totipotent embryonal stem cells. Genes & Dev. 6: 919-927.Baasner, S., H. von Melchner, T. Klenner, P. Hilgard, and T. Reckers. 1996. Reversible tumorigenesis in mice by conditional expression of HEk2 / c-erbB2 recep tor tyrosine kinase. Oncogene 13: 901-911.
Bobak, D., J. Moorman, A. Guanzon, L. Gilmer, and C. Hahn. 1997. Inactivation of the small GTPase Rho disrupts cellular attachment and induces adhe sion-ctependent and adhesion-independent apoptosis. Oncogene 15: 2179-2189. Brenner, B., U. Koppenhoefer, C. Weinstock, O. Linderkamp, F. Lang, and E. Gulbins. 1997. Fas- or ceramide-induced apoptosis is mediated by a rac1-regulated activation of Jun X-terminal kinase / p38 kinases and GADD153. J. Biol. Chem. 272: 22173-22181.
Chan, A., E. McGovern, G. Catalano, T. Fleming, and T. Miki. 1994. Expression cDNA cioning of a novel oncogene with sequence similarity to regulators of small GTP-binding proteins. Oncogene 9: 1057-1063.
Chan, A., S. Takai, K. Yamada, and T. Miki. 1996. Isolation of a novel onco gene, NETI, from neuroepithelioma cells by expression cDNA cloning. Oncogene 12: 1259-1266.
Chirgwin JJ, Przbyla AE, MacDonald RJ, Rufter WJ (1979). Isolation of biologically active nbonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Bio chemistry 18: 5294-5299.
Crespo, F., X. Bustelo, D. Aaronson, O. Coso, M. Lopez-Barahona, M. Barbacid, and J. Gutkind. 19 96. Rac-1 dependent stimulation of the JNK / SAPK signaling pathway by vav. Oncogene 13: 455-460.
Doetschman, TC, H. Fistetter, M. Katz, W. Schmidt, and R. Kemler. 1985. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic Stern cell lines: formation of-visceral yolk sac, blood islands and myocardium. J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-
Esteve, P., L. del Peso, and J. Lacai. 1995. Induction of apoptosis by rho in NIH 3T3 cells requires two complementary signals. Ceramides function as a progression factor for apoptosis. Oncogene 11: 2657-2665.
Eva, A., and S. Aaronson. 1985. Isolation of a new hurnan oncogene from a diffuse B-cell lymphoma. Nature 316: 273-275.
Eva, A., G. Vecchio, C. Rao, S. Tronick, and S. Aaronson. 1988. The predicted DBL oncogene product defines a distinct class of transforming proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2061-2065.
Habets, G., E. Scholtes, D. Zuydgeest, R. van der Kammen, J. Stam, A. Berns, and J. Collard. 1994. Identification of an invasion-induction gene, Tiam-1, that enco des a protein with homology to GDF-GTP exchangers for Rho-like proteins. Cell 77: 537-549.
Hall, A. 1998. kho GTPases and the actin cytoskeleton. Science 279: 509-514.
Han, J., K. Luby-Phelps, B. Das, X. Shu, Y. Xia, R. Mosteller, U. Krishna, J. Falck, M. Whjte, and D. Broek. 1998. Pole of substrates and products of Pl 3-kinase in regulating activation of rac-related guanosine triphosphatases by vav. Science 279: 558-560.
Hart, M., A. Eva, D. Zangrilii, S. Aaronson, T. Evans, R. Cerione, and Y. Zheng. 1994. Cellular transformation and guanine nucleotide exchange activity are catalyzed by a common domain on the dbl oncogene product. J. Bio. Chem. 269: 62-65.
Henning, S., R. Galandrini, A. Hall, and D. Cantrell. 1997. The GTPase Rho has a critical regulatory red in thymus development. Embo J. 16: 2397-2407.
Hildinger, M., B. Fehse, S. Hegewisch-Becker, J. John, JR Rafferty, W. Ostertag, and C. Baum. 1998. Dominant selection of hematopoietic progenitor cells with retroviral MDR1 co-expression vectors. Hum. Gene Therap. 9: 33-42.
Horii, Y., J. Beeler, K. Sakaguchi, M. Tachibana, and T. Miki. 1994. A novel oncogene, east, encodes a guanine nucleotide exchange factor that potentially tinks Rho and Rac signaling pathways. Embo J. 13: 4776-4786.
Jiménez, B., M. Arends, P. Esteve, R. Perona, R. Sánchez, S. Ramón y Cajal, A. Wyllie, and J. Lacal. 1995. Induction of apoptosis in NIH3T3 cells after serum de privation by overexpression of rho-p21, a GTPase protein of the ras superfamily. Oncogene 1995: 811-816.
Katzav, S., D. Martin-Zanca, and M. Barbacid. 1989. vav, a novel human on cogene derived from a locus ubiquitously expressed in hematopoietic cells. Ernbo J. 8: 2283-2290.
Maniatis T., Fritsch EF, Sambrook J. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Miki, T., C. Smjth, J. Long, A. Eva, and T. FIeming. 1993. Oncogene ect2 is related to reguiators of small GTP-binding proteins. Nature 362: 462-465.
Na, S., T. Chuang, A. Cunningham, T. Turi, J. Hanke, G. Bokoch, and D. Danley. 1996. D4-GDI, a substrate of CPP32, is proteolyzed during Fas-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 271: 11209-11213.
Neznanov, N., IS Thorey, G. Cecena, and RG Oshima. 1993. Transcriptional insuiation of the human keratin 18 genes in transgenic rnlce. Mol. Cell. Biol. 13: 2214-2223.
Pear, WS, GP Nolan, ML Scott, and D. Baltimore. 1993. Production of high-titer hetper-free retroviruses by transient transfection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8392-8396.
Perona, R., S. Montaner, L. Saniger, I. Sanchez-Perez, R. Bravo, and J. Lacal. 1997. Activation of the nuclear factor-kappaB by Rho, CDC42, and Rac-1 proteins. Genes Dev. 11: 463-475.
Ron, D., S. Tronjck, S. Aaronson, and A. Eva. 1988. Molecular cioning and characterization of the human dbl proto-oncogene: evidence that its overexpression is sufficient to transform MH / 3T3 cetls. Embo J. 7: 2465-2473.
Russ, AP, C. Friedel, K. Ballas, U. Kalina, D. Zahn, K. Strebhard, and H. von Melchner. 1996. Identification of genes induced by factor deprivation in hematopoietic cells undergoing apoptosis using gene-trap mutagenesis and site-specific recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15279-15284.
By Melchner H., DeGregori JV, Rayburn H., Reddy S., Friedel C., Earl Ruley H. (1992). Selective disruption of genes expressed in totipotent embryonic stem cells. Genes & Dev. 6: 919-927.

Claims

1. Protein variant of NET1 (NET1A), comprising the sequence A to Q at Posi tion 1-30 according to SEQ ID. No. 1 and thereof by substitution, addition, insertion and / or deletion derived derivatives.

2. Protein according to claim 1, characterized in that it is a sequence , selected from SEQ ID. No. 1 and SEQ ID. No. 2.

3. Protein according to one of claims 1 or 2, characterized in that it the sequence according to SEQ ID. No. 1 includes or thereof by substitution, Additi Derivatives derived on and / or deletion.

4. Nucleic acid comprising a sequence which is a protein according to one of the Coded claims 1 to 3, or complementary nucleic acid.

5. Nucleic acid according to claim 4, characterized in that it is a Se sequence includes that for the protein sequence according to SEQ ID. No. 1 or SEQ ID. No. 2 coded.

6. oligonucleotide which is specific with a nucleic acid according to one of the claims che 4 to 5 hybridized.

7. The oligonucleotide of claim 6, which is specific with a nucleic acid for the SEQ ID. No. 1 or 2 coded, or with the sequence according to SEQ ID No. 3 or No. 4 hybridized or complementary oligonucleotide.

8. Recombinant nucleic acid containing a nucleic acid according to one of the Claims 4 or 5 and / or an oligonucleotide according to one of claims 6 or 7.

9. Kit for the detection of NET1A and / or nucleic acid coding therefor, ent holding a protein according to any one of claims 1 to 3 and / or a nucleic acid re and / or an oligonucleotide according to any one of claims 4 to 8.

10. Antibody specific for a protein according to any one of claims 1 to 3rd

11. Pharmaceutical composition containing a protein according to one of the Claims 1 to 3 and / or a nucleic acid according to any one of claims 4 to 8 and / or an antibody according to claim 10.

12. A method for diagnosing a predisposition to and / or cancer, comprising the step

- Detection of a protein according to one of claims 1 to 3 and / or a nucleic acid according to one of claims 5 or 6 in a patient sample.

13. The method according to claim 12, characterized in that the nucleic acid by specific hybridization with a nucleic acid and / or an oligo nucleotide is detected.

14. The method according to claim 12, characterized in that the nucleic acid by PCR and, if necessary, subsequent restriction enzyme cleavage is pointed.

15. The method according to claim 11, characterized in that the protein is detected by immunological detection reactions.

16. A screening method for identifying molecules with antineoplastic activity, comprising the step

- bringing the molecules to be examined into contact with a sample containing a protein according to one of claims 1 to 3 and / or a nucleic acid according to one of claims 4 to 5.

17. A screening method for identifying molecules having an effect on apoptosis processes, comprising the step

18. A method for producing a protein according to any one of claims 1 to 3, comprising the step

- Expressing a recombinant nucleic acid according to claim 8 in a host cell.

19. Use of a protein according to any one of claims 1 to 3 and / or one Nucleic acid according to one of claims 4 or 5 as a target in cancer diagnosis se, cancer therapy and / or to influence apoptosis.