DE19808969A1 - Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen - Google Patents
Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder ReinkulturenInfo
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Classifications
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Description
Eine Voraussetzung für die biochemische und physiologische Untersuchung von
Prokaryoten wie auch für ihre technische Verwendung ist die Isolierung und die
Handhabung von Reinkulturen. Besonders ökologisch orientierte Mikrobiologen,
aber auch Hygieniker oder medizinische Mikrobiologen sind oft mit dem Problem
konfrontiert, Reinkulturen aus komplexen Mischungen zu erhalten. Weiterhin ist es
für manche Fragestellungen von Interesse, aus einer Reinkultur eine Einzelzelle zu
entnehmen. Die Isolierung über konventionelle Plattierungstechniken ist oft schwie
rig und zeitaufwendig. In vielen Fällen können auch keine Verdünnungstechniken
angewendet werden, da andere Prokaryoten als der interessierende in der Mehrzahl
sind. Im allgemeinen sind die prinzipiellen Verfahren zur Isolierung von Prokaryoten
seit Robert Koch nicht wesentlich verbessert worden (Gerhardt et al., 1994). Einer
neuerer Ansatz für die Isolierung von Einzellern stellt die Verwendung von optischen
Laserpinzetten dar (Huber et al., 1995), für das aber sehr große Aufwendungen not
wendig sind.
Aufgabe der Erfindung soll ein einfach handhabbares Verfahren zur Isolierung von
prokaryotischen Einzelzellen aus Mischkulturen oder einzelnen Zellklonen aus einer
Kultur sein.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Mikromanipulator mit Kapillare eingesetzt
wird. Um die Isolierung von Reinkulturen von Prokaryoten (Bacteria, Archaea) aus
komplexen natürlichen Populationen und gemischten Laborkulturen sowie das Klo
nieren von Einzelzellen aus Reinkulturen zu erleichtern, wurde ein Verfahren ent
wickelt, mit dem ein einzelner Zellklon aus einer Mischkultur oder Reinkultur direkt
zu entnehmen ist. Die Zelle kann dann kultiviert oder kann in einer Single Cell PCR
eingesetzt werden.
Die Isolierung wird mit Hilfe eines Mikromanipulators, der in der Regel für intrazyto
plasmatische Spermieninjektion (ICSI), Transfer von embryonalen Stammzellen (ES-
Cells) in Plastozysten, Transfer von Spermien, Halten von suspendierten Zellen
(Oozyten), Mikroinjektion in adhärente Zellen eingesetzt wird, ausgerüstet mit einer
Kapillare (z. B. Bactotip, siehe Fig. 2), durchgeführt. Diese Methode kann auch zur
Isolierung von anderen Mikroorganismen wie z. B. Protozoen, Hefen, Pilzsporen und
anderen eukaryotischen Einzelzellen sowie Zellkernen angewandt werden. Für die
Isolierung von prokaryotischen Zellen wird der Mikromanipulator weiter mit einem
Transjektor oder einer Handpumpe ausgerüstet.
Das Verfahren wird in folgenden Verfahrensschritten durchgeführt:
- - Die Probe mit den Prokaryoten wird in sterilem Puffer bzw. in einer anderen Flüs sigkeit suspendiert.
- - Dann wird mit demselben Puffer bzw. Flüssigkeit eine geeignete Verdünnung her gestellt.
- - Die Bakteriensuspension wird auf einem Deckglas als dünner Film ausgestrichen.
- - Das Deckglas wird an der Luft getrocknet.
- - Die Kapillare (z. B. Bactotip) wird vor der Bakterienaufnahme teilweise mit sterilem Puffer bzw. Flüssigkeit befüllt.
- - Die Spitze der Kapillare vorzugsweise mit Anschliff wird so nahe an die zu iso lierende prokaryotische Zelle gebracht, bis ein Tropfen aus der Spitze austritt und die Prokaryotenzelle benetzt.
- - Die in dem Tropfen suspendierte Prokaryotenzelle wird in die Kapillare einge saugt.
- - Die Einzelzelle wird dann in ein steriles Kulturgefäß mit geeignetem Kulturmedium überführt oder auf die Oberfläche eines sterilen festen Nährmediums aufgebracht und inkubiert.
- - Die Probe mit den Prokaryoten wird in sterilem anaerobem Puffer bzw. Flüssigkeit suspendiert.
- - Dann wird unter anaeroben Bedingungen mit demselben Puffer bzw. Flüssigkeit eine geeignete Verdünnung hergestellt.
- - Mit einer Spritze mit Kanüle wird anaerobes Kulturmedium z. B. Hungate-Kultur röhrchen entnommen.
- - Ein Aliquot der Prokaryotenkultur wird unter anaeroben Bedingungen z. B. in einer speziellen Kammer (Fig. 3) unter Inertgasatmosphäre (z. B. Stickstoff oder Argon) auf einem Deckglas als dünner Film verteilt.
- - Das Deckglas wird unter anaeroben Bedingungen z. B. in der Kammer unter Inertgasatmosphäre getrocknet.
- - Die Kapillare (z. B. Bactotip) wird vor der Bakterienaufnahme teilweise mit steri lem anaerobem Puffer bzw. Flüssigkeit befüllt.
- - Die Spitze der Kapillare vorzugsweise mit einem Anschliff wird so nahe an die zu isolierende prokaryotische Zelle gebracht, bis ein Tropfen aus der Spitze austritt und die Prokaryotenzelle benetzt.
- - Die Einzelzelle wird dann z. B. in ein Hungate-Kulturröhrchen mit anaerobem Kulturmedium überführt und inkubiert.
Die Bakterien werden mit einer Kapillare, (z. B. Bactotip) transferiert. Das andere
Ende des Bactotips wird mit einem sterilen Öltropfen verschlossen. Bei Bedarf kann
die Innenfläche der Kapillare mit Dichlordimethylsilan behandelt werden.
Fig. 1 und 2 zeigen sowohl die Verfahrensschritte als auch das Gerät am Bei
spiel der Benutzung der Kapillare "Bactotip". Die Kapillare hat vorzugsweise einen
Anschliff und hat in Abhängigkeit von der Größe der zu entnehmenden Zelle eine
Öffnung bis ca. 100 µm, vorzugsweise von ca. 5 µm-10 µm.
Die Anwendung der Erfindung bringt beispielsweise folgende Vorteile:
- - Direkte selektive Auswahl einzelner prokaryotischer Zellen aus Mischpopulationen oder Reinkulturen für die Kultur unter dem Mikroskop.
- - Große Zeitersparnis gegenüber Plattierungstechniken und Verdünnungstechniken zur Isolierung von bestimmten Prokaryoten aus Mischkulturen.
- - Möglichkeit der Vereinzelung langsamwachsender Prokaryoten, ohne daß diese überwachsen werden können.
- - Möglichkeit der selektiven Kultivierung von einzelnen, in der Minderheit vorhandener Prokaryoten.
- - Möglichkeit des direkten Einsatzes von mikroskopisch sichtbaren Prokaryoten- Zellen in der PCR.
Eppendorf, Hamburg (1997) Katalog: Produkte und Systeme für das Labor, S. 66-71.
Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Wood, W. A., Krieg, N. R. (1994) Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington D.C. Huber, R., Burggraf, S., Mayer, T., Barns, S. M., Rossnagel, P., Stetter, K.O. (1995) Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis. Nature 376, 57-58.
Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Wood, W. A., Krieg, N. R. (1994) Methods for General and Molecular Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington D.C. Huber, R., Burggraf, S., Mayer, T., Barns, S. M., Rossnagel, P., Stetter, K.O. (1995) Isolation of a hyperthermophilic archaeum predicted by in situ RNA analysis. Nature 376, 57-58.
1
Markierungszeichen
2
Schrägschliff
3
Silylierte Glasoberfläche
4
Steriles Mineralöl
5
Spannkopf
6
Kondensorlinse
7
Variable Abdeckung
8
Gaseinlaß
9
Aussparung für Manipulator
10
Kammerverschluß
11
Kammerboden
12
Aussparung für Deckglas
Claims (3)
1. Verfahren zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzel
zellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen einschließlich aus natürlichen
und künstlichen Mischpopulationen gekennzeichnet durch folgende Verfahrens
schritte:
Aerobe Prokaryoten
Aerobe Prokaryoten
- - Die Probe mit den Prokaryoten wird in sterilem Puffer bzw. in einer anderen Flüs sigkeit suspendiert.
- - Danach wird mit demselben Puffer bzw. mit derselben Flüssigkeit eine geeignete Verdünnung hergestellt.
- - Die Bakteriensuspension wird auf einem Deckglas als dünner Film ausgestrichen.
- - Das Deckglas wird an der Luft getrocknet.
- - Die Kapillare (z. B. Bactotip) wird vor der Bakterienaufnahme teilweise mit sterilem Puffer bzw. steriler Flüssigkeit befüllt.
- - Die Spitze der Kapillare vorzugsweise mit Anschliff wird so nahe an die zu iso lierende prokaryotische Zelle gebracht, bis ein Tropfen aus der Spitze austritt und die Prokaryotenzelle benetzt.
- - Die in dem Tropfen suspendierte Prokaryotenzelle wird in die Kapillare einge saugt.
- - Die Einzelzelle wird dann in ein steriles Kulturgefäß mit geeignetem Kulturmedium überführt oder auf die Oberfläche eines sterilen festen Nährmediums aufgebracht und inkubiert.
- - Die Probe mit den Prokaryoten wird in sterilem anaerobem Puffer bzw. in steriler Flüssigkeit suspendiert.
- - Danach wird unter anaeroben Bedingungen mit demselben Puffer bzw. derselben Flüssigkeit eine geeignete Verdünnung hergestellt.
- - Mit einer Spritze mit Kanüle wird anaerobes Kulturmedium z. B. Hungate-Kultur röhrchen entnommen.
- - Ein Aliquot der Prokaryotenkultur wird unter anaeroben Bedingungen z. B. in einer speziellen Kammer (Fig. 3) unter Inertgasatmosphäre (z. B. Stickstoff oder Argon) auf einem Deckglas als dünner Film verteilt.
- - Das Deckglas wird unter anaeroben Bedingungen z. B. in der Kammer unter Inertgasatmosphäre getrocknet.
- - Die Kapillare (z. B. Bactotip) wird vor der Bakterienaufnahme teilweise mit steri lem anaerobem Puffer bzw. steriler Flüssigkeit befüllt.
- - Die Spitze der Kapillare vorzugsweise mit einem Anschliff wird so nahe an die zu isolierende prokaryotische Zelle gebracht, bis ein Tropfen aus der Spitze austritt und die Prokaryotenzelle benetzt.
- - Die Einzelzelle wird dann z. B. in ein Hungate-Kulturröhrchen mit anaerobem Kulturmedium überführt und inkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß es außer für aerobe
und anaerobe Prokaryoten auch zur Isolierung von anderen Mikroorganismen wie
z. B. Protozoen, Hefen, Pilzsporen und anderen eukaryotischen Einzelzellen
sowie Zellkernen angewendet werden kann.
3. Gerät zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet
dadurch, daß die verwendete Kapillare vorzugsweise einen Anschliff und eine
Öffnung bis ca. 100 µm, vorzugsweise zwischen 5 und 10 µm besitzt, am anderen
Ende mit einem sterilen Öltropfen verschlossen und die Innenfläche bei Bedarf
mit Dichlordimethylsilan behandelt ist.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998108969 DE19808969C2 (de) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998108969 DE19808969C2 (de) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19808969A1 true DE19808969A1 (de) | 1999-09-09 |
| DE19808969C2 DE19808969C2 (de) | 2003-07-03 |
Family
ID=7859524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1998108969 Expired - Lifetime DE19808969C2 (de) | 1998-03-04 | 1998-03-04 | Verfahren und Gerät zur Isolierung von aeroben und anaeroben prokaryotischen Einzelzellen bzw. Klonen aus Misch- oder Reinkulturen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19808969C2 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10202892A1 (de) * | 2002-01-25 | 2003-08-07 | Joerg Martin Dormann | Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen |
| EP2308992A4 (de) * | 2008-03-17 | 2011-07-13 | Tsuji Takashi | Screening-verfahren zur effizienten gewinnung geeigneter mikrobenstämme aus einer der natürlichen umwelt entnommenen mikrobiellen probe sowie dabei zu verwendendes reagens und screening-kit |
-
1998
- 1998-03-04 DE DE1998108969 patent/DE19808969C2/de not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10202892A1 (de) * | 2002-01-25 | 2003-08-07 | Joerg Martin Dormann | Verfahren zur simultanen, quantifizierbaren Bestimmung von infektologisch relevanten Keimen |
| EP2308992A4 (de) * | 2008-03-17 | 2011-07-13 | Tsuji Takashi | Screening-verfahren zur effizienten gewinnung geeigneter mikrobenstämme aus einer der natürlichen umwelt entnommenen mikrobiellen probe sowie dabei zu verwendendes reagens und screening-kit |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19808969C2 (de) | 2003-07-03 |
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Legal Events
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