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DE19807339A1 - Sensitive Oberfläche für Biosensor - Systeme - Google Patents

Sensitive Oberfläche für Biosensor - Systeme

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DE19807339A1
DE19807339A1 DE1998107339 DE19807339A DE19807339A1 DE 19807339 A1 DE19807339 A1 DE 19807339A1 DE 1998107339 DE1998107339 DE 1998107339 DE 19807339 A DE19807339 A DE 19807339A DE 19807339 A1 DE19807339 A1 DE 19807339A1
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DE
Germany
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sensitive surface
electrode
monolayer
alloy
active surface
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE1998107339
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English (en)
Inventor
Vladimir M Mirsky
Michael Riepl
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MIRSKY
WOLFBEIS
Original Assignee
MIRSKY
WOLFBEIS
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Publication date
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Priority to EP99915484A priority patent/EP1055004A2/de
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine sensitive Oberfläche, welche in Biosensoren eingesetzt werden kann.
Im Vergleich mit bereits bestehenden Sensorenoberflächen besitzt die Erfindung den Vorteil, daß sie einerseits mit den derzeit modernen Technologien der Mikroelektronik kompatibel ist und andererseits kostengünstig zu realisieren ist.
Die sensitive Oberfläche hat die allgemeine Struktur Metall(Legierung)- Monoschicht oder Metall(Legierung)-Monoschicht-Rezeptor. Änderungen auf oder innerhalb dieser sensitiven Oberfläche können u. a. durch die kapazitive Meßmethode, Schwingquarzmikrowaage, SAW, Ellipsometrie, Amperometrie Fluoreszenz, AFM, SPR, STM oder andere optische, elektrische oder mechano-akustische Methoden detektiert werden.
In den Bildern sind Ausführungsbeispiele der Erfindung sowie typische Meßdaten dargestellt. Sie sind im folgenden näher beschrieben. Es zeigt
Bild 1 einen Schritt zum Aufbau einer sensitiven Oberfläche. Dabei wird ein Protein kovalent auf eine Palladiumelektrode, welche mit Mercaptohexadecansäure beschichtet ist, immobilisiert. Die Immobilisierungstufe wird durch kapazitive Messung verfolgt.
Bild 2 die Detektion der DNA-Fragmenten mit Hilfe einer sensitiven Oberfläche. Die sensitive Oberfläche wird erzeugt, indem man eine komplementäre Oligonukleotidsequenz kovalent an eine ω-funktionalisierte Alkylthiolschicht auf einer Goldlegierung gebunden hat. Die Kapazitätsänderung bei Zugabe unterschiedlicher DNA-Konzentrationen zeigt den Grad der DNA-Hybridisierung an.
Beispiel Aufbau der sensitiven Oberfläche Vorbereitung der Elektroden
Silizium-Wafer Stückchen mit einer Größe von 3,2 mm × 10,0 mm und einer Stärke von 450 µm werden in einem allgemein üblichen Sputterprozeß oder Bedampfungsprozeß mit einer Elektrode der Größe 1,56 mm × 1,56 mm (reaktive Oberfläche) und einer Zuleitung von 10 µm Breite und 6,65 mm Länge versehen. Die Elektrode wurde aus Titan- und Palladiumschichten (Haftvermittler, jeweils 50 nm dick) und einer deckenden Schicht aus Goldlegierung (200 nm) oder Palladium aufgebaut. Als Kontaktstelle für das Meßsystem wird am oberen Ende der Zuleitungen ein versilberter Draht angelötet. Die Reinigung erfolgte in mehreren Schritten. Zuerst wurden die Wafer 30 min vollständig in Chloroform getaucht. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom wurden die Wafer in eine 1 : 1 (v/v) Mischung aus Chloroform und Methanol getaucht und 10 min im Ultraschallbad behandelt. Analog zu dem verwendeten Chloroform kann man bei diesen Reinigungsschritten auch Ethanol (99%) und eine 1 : 1 (v/v) Mischung aus Ethanol und Methanol benutzen. Die Wafer mit Goldlegierung wurden zusätzlich für 5 min in eine heiße 3 : 1 (v/v) Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid getaucht. Die Elektroden wurden gründlich mit Reinstwasser (Millipore: Mili-QPlus-185; 18,2 MΩ. cm-1) gespült und getrocknet. Alle Glas- und Teflongeräte wurden vor ihrer Verwendung in analoger Weise gereinigt, um eine Kontaminierung mit möglichen Adsorbat-Molekülen zu verhindern.
Beschichtung der Elektroden
Zur Beschichtung wurde eine Chloroform-Lösung verwendet, welche 5 mM Mercaptohexadecansäure enthalten hat. Durch 15stündiges Eintauchen des Wafers bei Raumtemperatur in die ungerührte Beschichtungslösung wurde die Oberfläche der Elektrode mit dem Alkylthiol beschichtet. Zum Entfernen überschüssiger, auf der Oberfläche haftender Moleküle spülte man die Elektrode 15 Sekunden mit Chloroform. Nach dem Trocknen im Stickstoffstrom und mehrmaligem Waschen mit Reinstwasser wurde die Elektrode in die Meßzelle eingebaut.
Durchführung der Messung
Die Waferplatte mit der alkylthiolbeschichteten Elektrode wurde gemeinsam mit einer Ag/AgCl Referenzelektrode (Oberfläche ca. 1 cm2) an einem Teflonhalter befestigt, der als Deckel für die Meßzelle (Eppendorf-Cup 1,5 ml) dient und eine Öffnung für die Zugabe und Entnahme von Flüssigkeiten besitzt. Die Zelle wird mit Elektrolyt (100 mM KCl; pH 5,1; ca. 350 µl) soweit gefüllt, daß die reaktive Oberfläche der Goldelektrode und die Referenzelektrode (Ag/AgCl) vollständig eintauchen. Für eine gleichmäßige Durchmischung sorgt ein Magnetrührer. Ein Lock-in-Verstärker mit integriertem Sinusgenerator erzeugt ein konstantes Sinussignal mit einer Frequenz von 20 Hz und einer Amplitude von 10 mV. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (22°C) durchgeführt. Der Lock-in- Verstärker wird auch zur Registrierung des kapazitiven Stroms verwendet. Zusätzlich zu der Wechselspannung wird eine Gleichspannung über einen Spannungsgeber zugegeben. Erfolgt die Adsorption von Molekülen auf die Elektrodenoberfläche, wurde dieses als Kapazitätsänderung gemessen. Das Meßsignal wurde auf einen x-t Schreiber aufgezeichnet und über einen 16 bit A-D Umwandler in den Rechner übertragen. Zu Beginn der Messung wurde die absolute Kapazität der beschichteten Elektroden bei einem elektrischen Potential von +300 mV bestimmt. Man erhielt Anfangswerte von ca. 1,8 µF/cm2 für Elektroden aus Goldlegierung und ca. 4 µF/cm2 für Palladiumelektroden.
Immobilisierung
Die Immobilisierung von Proteinen erfolgt in 2 Schritten. Zuerst wird die endständige COOH-Gruppe der Mercaptohexadecansäure aktiviert. Die Aktivierung kann u. a. durch N-Hydroxysuccinimid erfolgen. Dazu werden die beschichteten Elektroden in 5 ml Dioxan getaucht und die Lösung wird 10 Minuten lang gerührt. Nach Zugabe von 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid and 25 mg of N-Hydroxysuccinimid wird die Lösung weitere 4 Stunden gerührt. Nach der Reinigung der aktivierten Elektrode mit Dioxan und Methanol wird sie in die Meßzelle gegeben. Die Kapazitätsänderung bei Zugabe eines Proteins (Bild 1) oder einer aminofunktionalisierten DNA-Sequenz gibt die Immobilisierungsrate an. Verwendet man das wasserlösliche Carbodiimid EDC als Reagenz, so kann die Immobilisierung direkt in der Meßzelle ohne externe Aktivierung erfolgen. Als weitere Alternative zum Aufbau der sensitiven Oberfläche kann das Rezeptormolekül mit alkylthiolhaltigen oder thiolhaltigen Gruppen funktionalisiert werden und dadurch direkt an das Metall oder die Legierung gebunden werden. Die verbleibenden Lücken in der monomolekularen Schicht können anschließend mit einem anderen Thiol geschlossen werden.
DNA-Detektion
Die Detektion von DNA erfordert den Aufbau einer sensitiven Oberfläche, wie sie in der Beschreibung der Beschichtungs- und Immobilisierungsschritte beschrieben sind. Die Messung erfolgt in einem Eppendorf-Cup, der 350 µl Puffer (pH 7,1; 100 mM NaCl, 5 mM Imidazol) enthält. Zu einem Biosensor mit der Struktur Au(Legierung)-S-(CH2)15-CO-N H-DNA werden unterschiedliche Konzentrationen an komplementärer DNA gegeben und die Hybridisierung wird als Kapazitätsänderung verfolgt (Bild 2). Die Zugabe von nichtkomplementärer DNA und RNA zeigt keine oder geringere Kapazitätsänderungen an.

Claims (2)

1. Eine aktive Oberfläche, gekennzeichnet durch eine abschließende Schicht aus Metall oder einer Legierung, die mit einer Monoschicht organischer Moleküle eines Typs oder einer Mischung mehrerer Typen beschichtet ist, wobei die Monoschicht eine spezifische und detektierbare Wechselwirkung mit der zu bestimmenden Größe eingeht.
2. Verwendung der aktiven Oberfläche nach Anspruch 1 zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von chemischen und biologischen Substanzen, biologischen Zellen und Mikroorganismen, Viren, Phagen und Prionen.
DE1998107339 1998-02-20 1998-02-20 Sensitive Oberfläche für Biosensor - Systeme Withdrawn DE19807339A1 (de)

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