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DE19806872A1 - Production of biotin by expressing S-adenosyl-methionine synthase and second biotin synthesis gene in host cells - Google Patents

Production of biotin by expressing S-adenosyl-methionine synthase and second biotin synthesis gene in host cells

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Publication number
DE19806872A1
DE19806872A1 DE19806872A DE19806872A DE19806872A1 DE 19806872 A1 DE19806872 A1 DE 19806872A1 DE 19806872 A DE19806872 A DE 19806872A DE 19806872 A DE19806872 A DE 19806872A DE 19806872 A1 DE19806872 A1 DE 19806872A1
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DE
Germany
Prior art keywords
seq
biotin
gene
sequences
genes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19806872A
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German (de)
Inventor
Hartwig Schroeder
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
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Priority to PCT/EP1999/001052 priority patent/WO1999042591A1/en
Priority to CA002321264A priority patent/CA2321264A1/en
Priority to EP99908923A priority patent/EP1054977A1/en
Priority to JP2000532531A priority patent/JP2002504338A/en
Priority to KR1020007009100A priority patent/KR20010041062A/en
Priority to IL13731099A priority patent/IL137310A0/en
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Abstract

Preparation of biotin (I) comprises expressing, in a prokaryotic or eukaryotic host capable of producing (I): (a) an S-adenosyl-methionine synthase sequence (1), of 1155 bp (reproduced); and (b) at least one of the other biotin biosynthesis genes bioS1, 2 or 3 (sequences of 1206 (3), 1215 (5) and 1221 (7) bp, respectively, reproduced). Preparation of biotin (I) comprises expressing, in a prokaryotic or eukaryotic host capable of producing (I): (a) an S-adenosyl-methionine synthase sequence (1), of 1155 bp (reproduced); and (b) at least one of the other biotin biosynthesis genes bioS1, 2 or 3 (sequences of 1206 (3), 1215 (5) and 1221 (7) bp, respectively, reproduced). The transformed cells are cultured and synthesized (I) used directly, after removal of biomass, or after purification. Independent claims are also included for the following: (1) a gene construct containing (1) and at least one of (3), (5) or (7), or their functional variants, analogs or derivatives, linked to either one or more regulatory signals for increased gene and/or protein expression, and/or to their native regulators; (2) organisms containing the construct of (a); and (3) use of the bioS3 gene (7), or its variants, analogs and derivatives, alone or in combination with other biotin synthesis genes, for production of (I).

Description

Die Erfindung betrifft ein Genkonstrukt, enthaltend ein S-Adeno­ syl-Methionin-Synthasegen, mit der Sequenz SEQ ID No. 1 und ein Biotin-Biosynthesegen bioS1, bioS2 und/oder bioS3 mit den Sequen­ zen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 bzw. SEQ ID No. 7 und gegebenenfalls mindestens einer weiteren Biotinsynthesegensequenz ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR. Die Erfindung betrifft weiterhin Organismen, die dieses Genkonstrukt enthalten und die Verwendung des Genkon­ strukts zur Herstellung von Biotin, sowie ein Verfahren zur Her­ stellung von Biotin.The invention relates to a gene construct containing an S-adeno syl-methionine synthase gene, with the sequence SEQ ID No. 1 and one Biotin biosynthesis genes bioS1, bioS2 and / or bioS3 with the sequences zen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 7 and if necessary at least one further biotin synthesis gene sequence selected from the group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY or bioR. The invention further relates to organisms that contain this gene construct and the use of the gene con strukts for the production of biotin, and a process for the production position of biotin.

Als Coenzym spielt Biotin (Vitamin H) eine essentielle Rolle bei enzymkatalysierten Carboxylierungs- und Decarboxylierungsreaktio­ nen. Biotin ist damit ein essentieller Faktor in lebenden Zellen. Biotin muß von fast allen Tieren und einigen Mikroorganismen von außen aufgenommen werden, da sie Biotin nicht selber synthetisie­ ren können. Es ist damit für diese Organismen ein essentielles Vitamin. Bakterien, Hefen und Pflanzen hingegen können Biotin aus Vorstufen selbst synthetisieren (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991: 295-326, DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996: 704-708, ISBN 1-55581-084-5).As a coenzyme, biotin (vitamin H) plays an essential role enzyme-catalyzed carboxylation and decarboxylation reaction nen. Biotin is therefore an essential factor in living cells. Biotin must be used by almost all animals and some microorganisms be included outside because they do not synthesize biotin themselves can. It is therefore essential for these organisms Vitamin. Bacteria, yeasts and plants, on the other hand, can produce biotin Synthesize precursors themselves (Brown et al. Biotechnol. Genet. Closely. Rev. 9, 1991: 295-326, DeMoll, E., Escherichia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F.C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996: 704-708, ISBN 1-55581-084-5).

Die Biotinsynthese wurde in bakteriellen Organismen speziell im gramnegativen Bakterium Escherichia coli und im grampositiven Bakterium Bacillus sphaericus untersucht (Brown et al. Biotech­ nol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991: 295-326). Als erstes bisher be­ kanntes Intermediat in E. coli wird Pimelyl-CoA (PmCoA) angese­ hen, das aus der Fettsäuresynthese stammt (DeMoll, E., Escheri­ chia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996: 704-708, ISBN 1-55581-084-5 1996). Der Syntheseweg dieser Biotin-Vorstufe in E. coli ist bisher weitgehend unbekannt (Lemoine et al., Mol. Microbiol. 19, 1996: 645-647). Es wurden mit bioC und bioH zwei Gene identifiziert, deren korrespondierende Proteine für die Synthese von Pm-CoA ver­ antwortlich sind. Die enzymatische Funktion der Genprodukte BioH und BioC ist bisher nicht bekannt (Lemoine et al., Mol. Micro­ biol. 19, 1996: 645-647, DeMoll, E., Escherichia coli and Sal­ monella, eds. Neidhardt, F. C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996: 704-708, ISBN 1-55581-084-5). Pm-CoA wird in vier weiteren enzymatischen Schritten zum Biotin umgewandelt. Ausge­ hend vom Pm-CoA findet zuerst die Kondensation mit Alanin zu 7-Keto-8-Amino-Pelargonsäure (KAPA) durch BioF statt. Es folgt die Umsetzung von KAPA zu 7,8 Diamino-Pelargonsäure (DAPA) durch BioA. Der nächste Schritt führt nach einer ATP-abhängigen Carbo­ xylierungsreaktion zum Dethiobiotin (DTB) und wird durch BioD ka­ talysiert. Im letzten Schritt findet die Umsetzung von DTB zu Biotin statt. Dieser Schritt wird durch BioB katalysiert. Der chemische und enzymatische Mechanismus der Umwandlung von DTB zu Biotin ist bisher nur unvollständig verstanden und aufgeklärt.Biotin synthesis has been especially developed in bacterial organisms gram-negative bacterium Escherichia coli and gram-positive Bacillus sphaericus bacterium examined (Brown et al. Biotech nol. Genet. Closely. Rev. 9, 1991: 295-326). First of all, be known intermediate in E. coli is Pimelyl-CoA (PmCoA) hen, which comes from the fatty acid synthesis (DeMoll, E., Escheri chia coli and Salmonella, eds. Neidhardt, F.C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996: 704-708, ISBN 1-55581-084-5 1996). The pathway of this biotin precursor in E. coli has so far been largely unknown (Lemoine et al., Mol. Microbiol. 19, 1996: 645-647). Two genes were identified with bioC and bioH, their corresponding proteins for the synthesis of Pm-CoA ver are answerable. The enzymatic function of the BioH gene products and BioC is not yet known (Lemoine et al., Mol. Micro biol. 19, 1996: 645-647, DeMoll, E., Escherichia coli and Sal monella, eds. Neidhardt, F.C. et al. ASM Press, Washington DC, USA, 1996: 704-708, ISBN 1-55581-084-5). Pm-CoA is in four further enzymatic steps converted to biotin. Except Starting with the Pm-CoA, the condensation with alanine first takes place  7-Keto-8-Amino-Pelargonic Acid (KAPA) held by BioF. It follows the conversion of KAPA to 7.8 diamino-pelargonic acid (DAPA) BioA. The next step is after an ATP-dependent carbo xylation reaction to dethiobiotin (DTB) and is by BioD ka talysed. The final step is the implementation of DTB Biotin instead. This step is catalyzed by BioB. Of the chemical and enzymatic mechanism of conversion of DTB to So far, biotin has only been incompletely understood and elucidated.

Eine Charakterisierung der Umwandlung von DTB zu Biotin wurde bisher ausschließlich in bakteriellen bzw. pflanzlichen Zellex­ trakten durchgeführt (WO94/8023, EP-B-0 449 724, Sanyal et al. Arch. Biochem. Biophys., Vol. 326, No. 1, 1996: 48-56 und Bio­ chemistry 33, 1994: 3625-3631, Baldet et al. Europ. J. Biochem. 217, 1, 1993: 479-485, Méjean et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 217, No. 3, 1995: 1231 - 1237, Ohshiro et al., Bio­ sci. Biotechnol. Biochem., 58, 9, 1994: 1738-1741).A characterization of the conversion from DTB to biotin was made so far only in bacterial or plant cells tracts carried out (WO94 / 8023, EP-B-0 449 724, Sanyal et al. Arch. Biochem. Biophys., Vol. 326, No. 1, 1996: 48-56 and Bio chemistry 33, 1994: 3625-3631, Baldet et al. Europ. J. Biochem. 217, 1, 1993: 479-485, Méjean et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 217, No. 3, 1995: 1231-1237, Ohshiro et al., Bio sci. Biotechnol. Biochem., 58, 9, 1994: 1738-1741).

In vitro Studien haben gezeigt, daß niedermolekulare Faktoren wie NADPH, Cystein, Thiamin, Fe2+, Asparagin, Serin, Fruktose 1-6-bisphosphat und S-Adenosylmethionin die Synthese von Biotin stimulieren können (Ohshiro et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 9, 1994: 1738-1741, Birch et al., J. Biol. Chem. 270, 32, 1995: 19158-19165, Ifuku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2, 1995: 185-189, Sanyal et al. Arch. Biochem. Biophys. 326, 1, 1996: 48-56).In vitro studies have shown that low molecular weight factors such as NADPH, cysteine, thiamine, Fe 2+ , asparagine, serine, fructose 1-6-bisphosphate and S-adenosylmethionine can stimulate the synthesis of biotin (Ohshiro et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 9, 1994: 1738-1741, Birch et al., J. Biol. Chem. 270, 32, 1995: 19158-19165, Ifuku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2, 1995: 185-189, Sanyal et al. Arch. Biochem. Biophys. 326, 1, 1996: 48-56).

Neben diesen niedermolekularen Faktoren wurden weitere Proteine identifiziert, die die Synthese von Biotin aus DTB in Gegenwart von BioB stimulieren. Dabei handelt es sich um Flavodoxin und Flavodoxin-NADPH-Reduktase (Birch et al., J. Biol. Chem. 270, 32, 1995: 19158-19165, Ifuk et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2, 1995: 185-189, Sanyal et al., Arch. Biochem. Biophys. 326, 1, 1996: 48-56). Weitere Proteine, die eine Stimulation der Biotinsynthese bewirken, sind die in der deutschen Anmeldung mit der Anmeldenummer 197.31274.8 (Priorität 22.7.97) beschriebe­ nen Gene bioS1 und bioS2.In addition to these low molecular weight factors, other proteins identified the synthesis of biotin from DTB in the presence stimulate from BioB. It is Flavodoxin and Flavodoxin NADPH reductase (Birch et al., J. Biol. Chem. 270, 32, 1995: 19158-19165, Ifuk et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2, 1995: 185-189, Sanyal et al., Arch. Biochem. Biophys. 326, 1, 1996: 48-56). Other proteins that stimulate of biotin synthesis are those in the German application with the application number 197.31274.8 (priority 22.7.97) genes bioS1 and bioS2.

Über die Herkunft des Schwefels im Biotinmolekül existieren un­ terschiedliche Ergebnisse. Bei Untersuchungen der Biotinsynthese in Gesamtzellextrakten wurde gezeigt, daß in Gegenwart von35S- markiertem Cystein Radioaktivität in Biotin inkorporiert wurde; weder mit 35S-markiertem Methionin noch mit S-Adenosyl-Methionin konnte ein Schwefel-Einbau ins Biotinmolekül nachgewiesen werden (Ifuku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 2, 1995: 184-189, Birch et al., J. Biol. Chem. 270, 32, 1995: 19158-19165).There are different results regarding the origin of the sulfur in the biotin molecule. In studies of biotin synthesis in whole cell extracts, it was shown that radioactivity was incorporated into biotin in the presence of 35 S-labeled cysteine; incorporation of sulfur into the biotin molecule was not detected either with 35 S-labeled methionine or with S-adenosyl-methionine (Ifuku et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 2, 1995: 184-189, Birch et al., J. Biol. Chem. 270, 32, 1995: 19158-19165).

Die für die beschriebenen Proteine kodierenden Gene bioF, bioA, bioD, und bioB sind in E. coli auf einem bidirektionalem Operon kodiert. Dieses Operon liegt zwischen der λ-attachement-site und dem uvrB Gen Locus bei ca. 17 Minuten auf dem E. coli Chromosom (Berlyn et al. 1996: 1715-1902). Auf diesem Operon sind zusätz­ lich noch zwei weitere Gene kodiert, von denen das eine, bioC, bereits beschriebene Funktionen in der Synthese von Pm-CoA hat, während einem offenen Leseraster hinter bioA bisher keine Funk­ tion zugeordnet werden konnte (WO94/8023, Otsuka et al., J. Biol. Chem. 263, 1988: 19577-85). Hoch konservierte Homologe zu den E. coli Proteinen BioF, A, D, B wurden in B. sphaericus, B. sub­ tilis, Syneccocystis sp. (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991: 295- 26, Bower et al., J. Bacteriol. 175, 1996: 4122-4130, Kaneko et al., DNA Res. 3, 3, 1996: 109-136), Ar­ chaebakterien wie Methanococcus janaschi, Hefen wie Saccharomyces cerevisiae (Zhang et al., Arch. Biochem. Biophys. 309, 1, 1994: 29-35) oder in Pflanzen wie Arabidopsis thaliana (Baldet et al., C. R. Acad. Sci. 111, Sci. Vie. 319, 2, 1996: 99-106)) ge­ funden.The genes coding for the described proteins bioF, bioA,  bioD, and bioB are in E. coli on a bidirectional operon encoded. This operon lies between the λ attachment site and the uvrB gene locus at about 17 minutes on the E. coli chromosome (Berlyn et al. 1996: 1715-1902). On this operon are additional encoded two more genes, one of which, bioC, has already described functions in the synthesis of Pm-CoA, so far no radio during an open reading grid behind bioA tion could be assigned (WO94 / 8023, Otsuka et al., J. Biol. Chem. 263, 1988: 19577-85). Highly conserved homologues to the E. coli proteins BioF, A, D, B were found in B. sphaericus, B. sub tilis, Syneccocystis sp. (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991: 295-26, Bower et al., J. Bacteriol. 175, 1996: 4122-4130, Kaneko et al., DNA Res. 3, 3, 1996: 109-136), Ar chaebacteria such as Methanococcus janaschi, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae (Zhang et al., Arch. Biochem. Biophys. 309, 1, 1994: 29-35) or in plants such as Arabidopsis thaliana (Baldet et al., C.R. Acad. Sci. 111, Sci. Vie. 319, 2, 1996: 99-106)) ge find.

Die Synthese von Pm-CoA scheint in den beiden bisher untersuchten gram-positiven Mikroorganismen anders zu verlaufen als in E.The synthesis of Pm-CoA appears to have been investigated in the two previously examined Gram-positive microorganisms run differently than in E.

coli. Es konnten keine Homologen von bioH und bioC gefunden wer­ den (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991: 295-326).coli. No homologs of bioH and bioC were found den (Brown et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 9, 1991: 295-326).

Biotin ist eine optisch aktive Substanz mit drei Chiralitätszen­ tren. Es wird bisher wirtschaftlich nur über eine vielstufige, teure chemische Synthese hergestellt werden.Biotin is an optically active substance with three chirality cycles tren. So far, it has only been economically expensive chemical synthesis.

Alternativ zu dieser chemischen Synthese wurde eine Vielzahl von Versuchen unternommen, ein fermentatives Verfahren zur Herstel­ lung von Biotin mit Mikroorganismen aufzubauen. Durch Klonierung des Biotin-Operons auf multi-copy-Plasmide konnte die Biotinsynt­ hese in den mit diesen Genen transformierten Mikroorganismen er­ höht werden. Eine weitere Erhöhung der Biotinsynthese wurde durch die Deregulierung der Biotingenexpression über die Selektion von birA-Mutanten erreicht (Pai C. H., J. Bacteriol. 112, 1972: 1280-1287). Die Kombination beider Ansätze, das heißt die Expression der Plasmid-kodierten Biosynthesegene in einem regulationsdefi­ zienten Stamm (EP-B-0 236 429), brachte eine weitere Steigerung der Produktivität. Das Biotin-Operon kann dabei entweder unter Kontrolle seines nativen bidirektionalem Promotors verbleiben (EP-B-0 236 429), oder seine Gene können unter die Kontrolle ei­ nes extern regulierbaren Promotors gebracht werden (WO94/08023).As an alternative to this chemical synthesis, a variety of Tried to produce a fermentative process build up biotin with microorganisms. By cloning of the biotin operon on multi-copy plasmids, the biotin synt he said in the microorganisms transformed with these genes be raised. A further increase in biotin synthesis was achieved by deregulation of biotin expression via the selection of birA mutants achieved (Pai C.H. J. Bacteriol. 112, 1972: 1280-1287). The combination of both approaches, that is, expression the plasmid-encoded biosynthesis genes in a regulations defi cient strain (EP-B-0 236 429), brought a further increase of productivity. The biotin operon can either be under Control of its native bidirectional promoter remains (EP-B-0 236 429), or its genes can be controlled an externally adjustable promoter can be brought (WO94 / 08023).

Durch die bisher verfolgten Ansätze zur fermentativen Herstellung von Biotin in E. coli konnte keine wirtschaftlich ausreichende Produktivität erreicht werden.Through the approaches pursued so far for fermentative production of biotin in E. coli could not be economically sufficient  Productivity can be achieved.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein technisches, fer­ mentatives Verfahren zur Herstellung von Biotin zu entwickeln, daß eine möglichst hohe Biotinsynthese zeigt.The object of the present invention was to provide a technical, fer develop a mental process for the production of biotin, that shows the highest possible biotin synthesis.

Diese Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Her­ stellung von Biotin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein S-Adeno­ syl-Methionin-Synthase(SAM-Synthase)-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 und mindestens ein weiteres Biotin Biosynthesegen bioS1, bioS2 oder bioS3 mit den Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 sowie ihre funktionellen Varianten, Analoge oder De­ rivate in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorga­ nismus, der in der Lage ist Biotin zu synthetisieren, exprimiert, diesen züchtet und das synthetisierte Biotin direkt, nach Abtren­ nung der Biomasse oder nach Reinigung des Biotins verwendet, ge­ löst.This object was achieved by the method according to the invention position of biotin, characterized in that an S-adeno syl methionine synthase (SAM synthase) gene with the sequence SEQ ID No. 1 and at least one other biotin biosynthetic gene bioS1, bioS2 or bioS3 with the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 and their functional variants, analogs or De derivatives in a prokaryotic or eukaryotic host organ expression that is able to synthesize biotin, this breeds and the synthesized biotin directly after removal used biomass or after purification of the biotin, ge solves.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Gene, das SAM-Syn­ thase-Gen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 und die Biotin-Biosynthe­ segene bioS1, bioS2 und bioS3 mit den Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 werden in der SwissProt-Datenbank unter den "Accession"-Nummern P04384 (metK), U29581 (bioS1), P39171 (bioS2) und D90811 (bioS3) geführt. In der Datenbank sind eine Reihe von Homologen zu MetK aus E. coli beschrieben. Diese Homologe umfassen Organismen wie weitere Eubakterien (z. B. H. in­ fluenza, B. subtilis), wie auch Eukaryonten (z. B. Hefen: S. cere­ visiae, Planta: P. deltoides, Arthropoda D. melanogaster, und Mammalia: R. norvegicus).The genes used in the method according to the invention, the SAM syn thase gene with the sequence SEQ ID No. 1 and the biotin biosynthesis blessing bioS1, bioS2 and bioS3 with the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 are in the SwissProt database under the "Accession" numbers P04384 (metK), U29581 (bioS1), P39171 (bioS2) and D90811 (bioS3). Are in the database described a series of homologs to MetK from E. coli. This Homologs include organisms such as other eubacteria (e.g. H. in fluenza, B. subtilis), as well as eukaryotes (e.g. yeasts: S. cere visiae, Planta: P. deltoides, Arthropoda D. melanogaster, and Mammalia: R. norvegicus).

Durch Expression einer oder mehrerer des SAM-Synthase-Gens mit der Sequenz SEQ ID No. 1, seiner funktionellen Varianten, Analoge oder Derivate in Kombination mit mindestens einem der Biotinsy­ thesegene bioS1, bioS2 oder bioS3 mit den Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 sowie deren funktionelle Varianten, Analoge oder Derivate in einem prokaryontischen oder eukaryonti­ schen Wirtsorganismus läßt sich die Produktivität der Biotinbio­ synthese deutlich steigern. Bevorzugt wird wird eine Kombination von SAM-Synthase-Gen und bios1 zur Expression verwendet. Vorteil­ hafterweise wird für eine gesteigerte Biotinsynthese gleichzeitig mindestens ein weiteres Biotingen ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, biow, bioX, bioY oder bioR mit exprimiert. Durch die Expression der Gene wird die Synthese von Biotin um mindestens den Faktor 2 gegenüber der Kontrolle ohne diese Gene, bevorzugt um einen Faktor größer 3, gesteigert. By expressing one or more of the SAM synthase gene with of the sequence SEQ ID No. 1, its functional variants, analogs or derivatives in combination with at least one of the Biotinsy thesegene bioS1, bioS2 or bioS3 with the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 and their functional variants, Analogs or derivatives in a prokaryotic or eukaryotic The host organism can be the productivity of biotin bio significantly increase synthesis. A combination is preferred of SAM synthase gene and bios1 used for expression. Advantage fortunately, for an increased biotin synthesis at the same time at least one further bio-gene selected from the group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, biow, bioX, bioY or bioR with expressed. The expression of the genes is the synthesis of biotin by at least a factor of 2 compared to the control without these genes, preferably increased by a factor greater than 3.  

Nach Isolierung und Sequenzierung sind die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Gene, das SAM-Synthase-Gen mit der Nukleo­ tidsequenz SEQ ID No. 1, das bioS1 Gen mit der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 3, das bioS2 Gen mit der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 5 und das bioS3 Gen mit der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 7 erhält­ lich, die für die in SEQ ID NO: 2, respektive SEQ ID No. 4, re­ spektive SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8 angegebenen Aminosäurese­ quenzen oder deren Allelvariationen kodieren. Unter Varianten sind SEQ ID No. 1-, SEQ ID No. 3- bzw. SEQ ID No. 5, respektive SEQ ID No. 7-Varianten zu verstehen, die 30 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene, bevorzugt 50 bis 100%, ganz besonders bevorzugt 80 bis 100% aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Sub­ stitution von Nukleotiden aus den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 dargestellten Sequenzen erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität aber erhalten bleibt.After isolation and sequencing, the are in the invention Methods used genes, the SAM synthase gene with the nucleo tide sequence SEQ ID No. 1, the bioS1 gene with the nucleotide sequence SEQ ID No. 3, the bioS2 gene with the nucleotide sequence SEQ ID No. 5 and the bioS3 gene with the nucleotide sequence SEQ ID No. 7 receives Lich for those in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID No. 4, right spotting scopes SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 8 indicated amino acid sequences or encode their allelic variations. Under variants are SEQ ID No. 1-, SEQ ID No. 3- or SEQ ID No. 5, or SEQ ID No. 7 variants to understand the 30 to 100% homology Amino acid level, preferably 50 to 100%, very particularly preferred Have 80 to 100%. Allelic variants include in particular functional variants that are created by deletion, insertion or sub substitution of nucleotides from the in SEQ ID NO: 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 sequences shown available are, but the enzymatic activity is retained.

Weiterhin sind unter Varianten auch funktionelle Äquivalente der Gene wie die O-Acetyl-serinsulfohydrolase A, die O-Acetyl-serin­ sulfohydrolase B, die β-Cystathionase (siehe Flint et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, 1996: 16053- 16067) oder nifS und seine prokaryontischen und eukaryontischen Homologen beispielsweise aus Klebsiella, Candida, Hefen oder aus Caenorhabditis zu verstehen, die in der Lage sind die enzymatische Aktivität von bioS1, bioS2 oder bioS3 in der Biotinsynthese zu übernehmen.Functional equivalents of the are also among variants Genes like O-acetyl-serine sulfohydrolase A, O-acetyl-serine sulfohydrolase B, the β-cystathionase (see Flint et al., J. Biol. Chem., Vol. 271, 1996: 16053-16067) or nifS and its prokaryotic and eukaryotic homologues, for example To understand Klebsiella, Candida, yeast or from Caenorhabditis, which are capable of the enzymatic activity of bioS1, bioS2 or to adopt bioS3 in biotin synthesis.

Unter funktionellen Analogen von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID No. 7 sind beispielsweise ihre prokaryon­ tischen oder eukaryontischen Homologen wie bakterielle, pilzli­ che, pflanzliche, tierische oder menschliche Homologen zu verste­ hen. Unter Analogen sind weiterhin auch verkürzte Sequenzen, Ein­ zelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA- Sequenz zu verstehen.Among functional analogs of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID No. 7 are for example their prokaryon table or eukaryotic homologues such as bacterial, fungal to understand vegetable, animal or human homologues hen. Shortened sequences, Ein, are also among analogues cell strand DNA or RNA of the coding and non-coding DNA Understand sequence.

Derivate sind beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt wird. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksa­ mere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.Derivatives are understood to mean, for example, promoter variants. The Promoters that precede the specified nucleotide sequences through one or more nucleotide exchanges Insertion (s) and / or deletion (s) can be changed without the functionality or effectiveness of the promoters is impaired becomes. Furthermore, the promoters can by changing their Sequence increased in effectiveness or completely by effective Promoters of other organisms can also be exchanged.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo­ tidsequenz im Bereich von -1 bis -30 vor dem Startkodon so verän­ dert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression erhöht wird. Vorteilhafterweise geschieht dies durch eine verän­ derte Shine-Dalgarno-Sequenz.Derivatives are also to be understood as variants whose nucleos tid sequence in the range from -1 to -30 before the start codon were changed that the gene expression and / or the protein expression  is increased. This is advantageously done by a change last Shine-Dalgarno sequence.

Als prokaryontische Wirtsorganismen des erfindungsgemäßen Verfah­ rens kommen prinzipiell alle Biotin synthetisierenden gram-nega­ tiven oder gram-positiven Bakterien in Frage. Als gram-negative Bakterien seien beispielhaft Enterobacteriaceae wie die Gattungen Escherichia, Aerobacter, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Klebsiella, Serratia, Erwinia oder Salmonella, Pseudomonadaceae wie die Gattungen Pseudomonas, Xanthomonas, Burkholderia, Gluco­ nobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Methanomonas, Comamonas, Cellulomonas oder Acetobacter, Azotobacteraceae wie die Gattungen Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia oder Derxia, Neisseriaceae wie die Gattungen Moraxella, Acinetobacter, Kingella, Neisseria oder Branhamella, die Rhizobiaceae wie die Gattungen Rhizobium oder Agrobacterium oder die gram-negativen Gattungen Zymomonas, Chromobacterium oder Flavobacterium, genannt. Als gram-positive Bakterien seien beispielhaft die Endosporen-bildenden gram-posi­ tiven aeroben oder anaeroben Bakterien wie die Gattungen Bacil­ lus, Sporolactobacillus oder Clostridium, die coryneformen Bakte­ rien wie die Gattungen Arthrobacter, Cellulomonas, Curtobacte­ rium, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium oder Kurt­ hia, die Actinomycetales wie die Gattungen Mycobacterium, Rhodo­ coccus, Streptomyces oder Nocardia, die Lactobacillaceae wie die Gattungen Lactobacillus oder Lactococcus, die gram-positiven Kok­ ken wie die Gattungen Micrococcus oder Staphylococcus, genannt.As prokaryotic host organisms of the process according to the invention In principle, all gram-nega synthesizing biotin come positive or gram-positive bacteria. As grief-negative Bacteria are exemplary Enterobacteriaceae like the genera Escherichia, Aerobacter, Enterobacter, Citrobacter, Shigella, Klebsiella, Serratia, Erwinia or Salmonella, Pseudomonadaceae like the genera Pseudomonas, Xanthomonas, Burkholderia, Gluco nobacter, Nitrosomonas, Nitrobacter, Methanomonas, Comamonas, Cellulomonas or Acetobacter, Azotobacteraceae like the genera Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia or Derxia, Neisseriaceae like the genera Moraxella, Acinetobacter, Kingella, Neisseria or Branhamella, the Rhizobiaceae like the genera Rhizobium or Agrobacterium or the gram-negative genera Zymomonas, Chromobacterium or Flavobacterium. As grief-positive Bacteria are the gram-posi that form endospores active aerobic or anaerobic bacteria such as the genera Bacil lus, Sporolactobacillus or Clostridium, the coryneform bacteria like the genera Arthrobacter, Cellulomonas, Curtobacte rium, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium or Kurt hia, the Actinomycetales such as the genera Mycobacterium, Rhodo coccus, Streptomyces or Nocardia, the Lactobacillaceae like that Genera Lactobacillus or Lactococcus, the gram-positive Kok like the genera Micrococcus or Staphylococcus.

Bevorzugt werden Bakterien der Gattungen Escherichia, Citrobac­ ter, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Azotobacter, Chromobacterium, Bacillus, Clostri­ dium, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptomyces, Rhizobium, Agrobacterium oder Sta­ phylococcus im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Besonders bevorzugt werden Gattungen und Arten wie Escherichia coli, Citro­ bacter freundii, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas muta­ bilis, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Comamo­ nas acidovorans, Comamonas testosteroni, Acinetobacter calcoace­ ticus, Azotobacter vinelandii, Chromobacterium violaceum, Bacil­ lus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefa­ ciens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringien­ sis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter paraffineus, Corynebacte­ rium glutamicum, Corynebacterium primorioxydans, Corynebacterium sp., Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium linens, Brevi­ bacterium sp., Streptomyces lividans, Rhizobium leguminosarum oder Agrobacterium tumefaciens. Vorteilhafterweise werden Bakte­ rien verwendet, die schon eine erhöhte natürliche Biotinproduk­ tion besitzen.Bacteria of the genera Escherichia, Citrobac are preferred ter, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Azotobacter, Chromobacterium, Bacillus, Clostri dium, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptomyces, Rhizobium, Agrobacterium or Sta phylococcus used in the method according to the invention. Especially genera and species such as Escherichia coli and Citro are preferred bacter freundii, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas muta bilis, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Comamo nas acidovorans, Comamonas testosteroni, Acinetobacter calcoace ticus, Azotobacter vinelandii, Chromobacterium violaceum, Bacil lus subtilis, Bacillus sphaericus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefa ciens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus thuringien sis, Arthrobacter citreus, Arthrobacter paraffineus, Corynebacte rium glutamicum, Corynebacterium primorioxydans, Corynebacterium sp., Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium linens, Brevi bacterium sp., Streptomyces lividans, Rhizobium leguminosarum or Agrobacterium tumefaciens. Bacts are advantageous used that already has an increased natural biotin product  own.

Die taxonomische Stellung der aufgeführten Gattungen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wandel und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs- und Artnamen korrigiert wer­ den. Aufgrund dieser in der Vergangenheit häufig erforderlichen taxonomischen Umgruppierungen der genannten Gattungen innerhalb der bakteriellen Systematik sind auch andere als die oben genann­ ten Familien, Gattungen und Arten für das erfindungsgemäße Ver­ fahren geeignet.The taxonomic position of the genera listed was subject to a great change in recent years and is still always in the river, because wrong genus and species names are corrected the. Because of this often required in the past taxonomic regrouping of the genera mentioned within The bacterial system is also different from that mentioned above families, genera and species for the ver invention drive suitable.

Als eukaryontische Wirtsorganismen des erfindungsgemäßen Verfah­ rens kommen prinzipiell alle Biotin synthetisierenden Organismen in Frage wie Pilze, Hefen, Pflanzen oder pflanzliche Zellen. Als Hefen seien die Gattungen Rhodotorula, Yarrowia, Sporobolomyces, Saccharomyces oder Schizosaccharomyces bevorzugt genannt. Beson­ ders bevorzugt sind die Gattungen und Arten Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Yarrowia lipolytica, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces shibatanus oder Sac­ charomyces cerevisiae.As eukaryotic host organisms of the process according to the invention In principle, all biotin synthesizing organisms come like mushrooms, yeasts, plants or plant cells. As Yeasts are the genera Rhodotorula, Yarrowia, Sporobolomyces, Saccharomyces or Schizosaccharomyces are preferred. Especially the genera and species Rhodotorula rubra are preferred, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Yarrowia lipolytica, Sporobolomyces salmonicolor, Sporobolomyces shibatanus or Sac charomyces cerevisiae.

Als Wirtsorganismus können prinzipiell alle Pflanzen verwendet werden, bevorzugt werden Pflanzen, die in der Tierernährung oder in der humanen Ernährung eine Rolle spielen wie Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Kartoffeln, Erbsen, Bohnen, Sonnenblumen, Palmen, Hirse, Sesam, Kopra oder Raps. Auch Pflanzen wie Arabidopsis tha­ liana oder Lavendula vera sind geeignet. Besonders bevorzugt wer­ den pflanzliche Zellkulturen, Protoplasten aus Pflanzen oder Ka­ luskulturen.In principle, all plants can be used as the host organism Plants that are used in animal nutrition or play a role in human nutrition like corn, wheat, Barley, rye, potatoes, peas, beans, sunflowers, palm trees, Millet, sesame, copra or rapeseed. Plants such as Arabidopsis tha liana or lavendula vera are suitable. Particularly preferred who the plant cell cultures, protoplasts from plants or Ka cultures.

Vorteilhafterweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren Mikroor­ ganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen oder pflanzliche Zellen ver­ wendet, die in der Lage sind Biotin in das Anzuchtsmedium auszu­ scheiden und die gegebenenfalls zusätzlich schon eine erhöhte na­ türliche Biotinsynthese haben. Vorteilhafterweise können diese Organismen noch bezüglich der Regulation ihrer Biotinbiosynthese defekt sein, das heißt es findet keine oder nur eine sehr verrin­ gerte Regulation der Synthese statt. Dieser Regulationsdefekt hat zur Folge, daß diese Organismen schon eine wesentlich höhere Bio­ tinproduktivität besitzen. Ein solcher Regulationsdefekt ist bei­ spielsweise von Escherichia coli als birA-Defektmutanten bekannt und sollte vorzugsweise in Form eines durch äußere Einflüsse in­ duzierbaren Defektes, beispielsweise temperaturinduzierbar, in den Zellen vorhanden sein. Es können im Prinzip auch Organismen verwendet werden, die keine natürliche Biotinproduktion aufwei­ sen, nachdem sie mit den Biotingenen transformiert wurden. Microor are advantageously used in the method according to the invention ganisms such as bacteria, fungi, yeast or plant cells uses that are able to release biotin into the growth medium divorce and which may also have an increased na natural biotin synthesis. These can advantageously Organisms still regulate their biotin biosynthesis be defective, that is, it finds none or only a very small one Regulation of synthesis takes place. This regulatory defect has the consequence that these organisms already have a much higher bio possess tin productivity. Such a regulatory defect is in known for example from Escherichia coli as birA defect mutants and should preferably be in the form of external influences inducible defect, for example temperature inducible, in be present in the cells. In principle, organisms can also be used that have no natural biotin production after being transformed with the biotin genes.  

Um die Biotinproduktivität insgesamt weiter zu steigern sollten die Organismen im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhafterweise zusätzlich mindesten ein weiteres Biotingen ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, biow, bioX, bioY oder bioR enthalten. Vorteilhafterweise können auch solche Gene in Kombination mit der Sequenz SEQ ID No. 1 , der SEQ ID NO: 3, der SEQ ID No. 5 oder der SEQ ID NO. 7 und ihrer Kombinationen in der Zelle vorhanden sein, die die Biotinsynthese stimulieren. Gene die die Biotinsynthese stimmulieren sind z. B. das Flavore­ doxin-Gen, die Flavoredoxin-Reduktase-Gen. Dieses zusätzliche Gen oder diese zusätzlichen Gene können wie auch die Gene mit der Se­ quenz SEQ ID No. 1 , der SEQ ID NO. 3, SEQ ID No. 5 oder der SEQ ID NO. 7 oder deren Kombinationen in ein oder mehreren Kopien in der Zelle vorhanden sein. Sie können auf dem gleichen Vektor wie die Sequenz SEQ ID No. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7 lokalisiert sein oder auf getrennten Vektoren oder aber chromosomal integriert worden sein. Auch die Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7 können zu­ sammen auf einem Vektor oder auf getrennten Vektoren sein oder ins Genom inseriert werden.To further increase overall biotin productivity the organisms in the process according to the invention advantageously additionally at least one other bio gene selected from the Group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, biow, bioX, bioY or contain bioR. Such genes can also advantageously be used in combination with the sequence SEQ ID No. 1, the SEQ ID NO: 3, the SEQ ID No. 5 or SEQ ID NO. 7 and their combinations in of the cell that stimulate biotin synthesis. Genes that stimulate biotin synthesis are e.g. B. the Flavore doxin gene, the flavoredoxin reductase gene. This additional gene or these additional genes, like the genes with the Se quenz SEQ ID No. 1, the SEQ ID NO. 3, SEQ ID No. 5 or the SEQ ID NO. 7 or their combinations in one or more copies in the Cell. You can use the same vector as that Sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID NO. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7 be localized or on separate vectors or have been integrated chromosomally. The sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7 can too be together on one vector or on separate vectors or be inserted into the genome.

Unter dem erfindungsgemäßen Genkonstrukt sind die Gensequenzen des SAM-Synthase-Gens SEQ ID No. 1 und der Biotinsynthegene SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7, sowie deren funktio­ nelle Varianten, Analoge oder Derivate zu verstehen, die mit ei­ nem oder mehreren Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpres­ sion funktionell verknüpft wurden. Zusätzlich zu diesen neuen Re­ gulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequen­ zen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natür­ liche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7 inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulations­ sequenz so mutiert, daß keine Regulation durch Biotin mehr er­ folgt und die Genexpression gesteigert wird. Die Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7 können unter der Regulation eines Promotors oder unter der Regulation getrenn­ ter Promotoren liegen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatorische Elemente inseriert wer­ den. Die Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.The gene sequences are under the gene construct according to the invention of the SAM synthase gene SEQ ID No. 1 and the biotin synthetic gene SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7, as well as their function nelle variants to understand analogs or derivatives that with ei nem or more regulatory signals to increase gene expression sion were functionally linked. In addition to these new re gulationsequences can the natural regulation of these sequences zen are still present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation switched off and the expression of the genes increased has been. The gene construct can, however, also have a simpler structure, that means there are no additional regulatory signals in front of the Sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7 inserted and the natural promoter with its regulation will not be removed. Instead, the natural regulation sequence mutated so that he no longer regulates by biotin follows and gene expression is increased. The sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7 can under under the regulation of a promoter or under the regulation promoters. Also at the 3 'end of the DNA sequences who advertises additional advantageous regulatory elements the. The genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 7 can be copied in one or more copies Gene construct may be included.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver­ fahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, Ipp-lac-, lacIq- T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefepromotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder im Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor enthalten.Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, Ipp-lac, lacI q - T7, T5, T3 -, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P R - or contained in the λ-P L promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria. Further advantageous regulatory sequences are, for example, in the gram-positive promoters amy and SPO2, in the yeast promoters ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH or in the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33 , nos or contained in the ubiquitin or phaseolin promoter.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula­ tionssequenzen wie die oben genannten für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Darüberhinaus können auch syntheti­ sche Promotoren vorteilhaft verwendet werden.In principle, all natural promoters can use their regulations tion sequences like those mentioned above for the invention Procedures are used. In addition, syntheti cal promoters can be used advantageously.

Im Genkonstrukt können weitere Biotingene ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR in einer oder mehreren Kopien enthalten sein, die einen eigenen Promotor haben können oder aber unter der Regulation des Promotors einer der Sequenzen oder unter der Regulation des Pro­ motors der gesamten Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 liegen können.In the gene construct, further biotin genes can be selected from the Group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY or bioR can be contained in one or more copies, one can have their own promoter or under the regulation of Promoter of one of the sequences or under the regulation of the Pro motors of the entire sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 7 can lie.

Das Genkonstrukt wird zur Expression in den oben genannten Wirts­ organismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermög­ licht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können bei­ spielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Pha­ gen, Viren, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.The gene construct is used for expression in the above-mentioned hosts organism advantageously into a host-specific vector inserted, which enables optimal expression of the genes in the host light. Vectors are well known to those skilled in the art and can be found in for example from the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) be removed. In addition to plasmids, all vectors are also included other vectors known to the person skilled in the art such as Pha genes, viruses, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, linear or to understand circular DNA. These vectors can be autonomous in the Host organism can be replicated or chromosomally replicated.

Unter Expressionssysteme sind die Kombination aus den oben bei­ spielhaft genannten Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren wie Plasmide, Viren oder Phagen wie beispiels­ weise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter System, die Phagen λ, Mu oder andere temperänte Phagen oder Transposons und/oder wei­ teren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen zu verstehen.The expression systems are the combination of the above at host organisms and the organisms matching vectors such as plasmids, viruses or phages such as wise plasmids with the RNA polymerase / promoter system, the phages λ, Mu or other temperate phages or transposons and / or white understand other advantageous regulatory sequences.

Bevorzugt sind unter dem Begriff Expressionssysteme die Kombina­ tion aus Escherichia coli und seinen Plasmiden und Phagen und den dazugehörenden Promotoren sowie Bacillus und seine Plasmide und Promotoren zu verstehen. Combinations are preferred under the term expression systems tion from Escherichia coli and its plasmids and phages and the associated promoters as well as Bacillus and its plasmids and Understand promoters.  

Für die vorteilhafte erfindungsgemäße Expression der SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7 sind außerdem wei­ tere 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen geeignet.For the advantageous expression according to the invention of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7 are also white Other 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences are suitable.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Biotingene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.These regulatory sequences are designed to target expression enable biotin genes and protein expression. This can for example depending on the host organism mean that the gene is first is expressed or overexpressed after induction, or that it is is immediately expressed and / or overexpressed.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs­ weise die Biotingenexpression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.The regulatory sequences or factors can be preferred have a positive influence on biotin expression and thereby increase. This can reinforce the regulatory elements advantageously at the transcription level by strong transcription signals such as promoters and / or enhancers be used. But there is also a reinforcement of the Translation possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.

Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Biotingenexpression bewirken.“Enhancers” are understood to mean, for example, DNA sequences which have an improved interaction between RNA polymerase and DNA cause an increased expression of biotin.

Eine Steigerung der von der Sequenz SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 abgeleiteten Proteinen (siehe SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 8) und ihrer Enzy­ maktivität läßt sich zum Beispiel gegenüber den Ausgangsenzymen durch Veränderung der entsprechenden Gensequenzen oder der Se­ quenzen seiner Homologen durch klassische Mutagenese wie UV-Be­ strahlung oder Behandlung mit chemischen Mutagentien und/oder durch gezielte Mutagenese wie site directed mutagenesis, Dele­ tion(en), Insertion(en) und/oder Substitution(en) erzielen. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität neben der beschriebenen Genam­ plifikation durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzymbio­ synthese reprimieren und/oder durch Synthese aktiver statt inak­ tiver Enzyme erreicht werden.An increase in the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 derived proteins (see SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 8) and their Enzy For example, activity can be compared to the parent enzymes by changing the corresponding gene sequences or the Se sequence of its homologues through classic mutagenesis such as UV-Be radiation or treatment with chemical mutants and / or through targeted mutagenesis such as site directed mutagenesis, Dele tion (s), insertion (s) and / or substitution (s). Also may have increased enzyme activity in addition to the genam described plification by eliminating factors that the Enzymbio Repress synthesis and / or by synthesis more active than inac tive enzymes can be achieved.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Umwandlung von DTB in Biotin und damit die Biotinproduktivität insgesamt über die in die Organismen über Vektoren und/oder chromosomal klonierten ein­ gebrachten Biotingene mit der Sequenz SEQ ID No. 1, der SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und der SEQ ID No. 7 und der Kombinationen der Gene der Sequenz SEQ ID No. 1 und der SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 1 und der SEQ ID No. 7, bevorzugterweise die Kombination der Gene der Sequenz SEQ ID No. 1 und der SEQ ID No. 3 vorteilhaft gestei­ gert.The process of the invention converts DTB in biotin and thus overall biotin productivity over the in the organisms were cloned in via vectors and / or chromosomally brought biotin genes with the sequence SEQ ID No. 1, the SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 and the combinations of Genes of the sequence SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 1 and the SEQ ID No. 7, preferably the combination of the genes of the sequence SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3 advantageous climbs  device.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und/oder SEQ ID No. 7 enthaltenen Mikroorganis­ men in einem Medium, das das Wachstum dieser Organismen ermög­ licht, angezüchtet. Dieses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien verwendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die verwendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.In the method according to the invention, SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and / or SEQ ID No. 7 contained microorganism in a medium that enables the growth of these organisms light, grown. This medium can be a synthetic or a be a natural medium. Depending on the organism, the specialist known media used. For the growth of the microorganisms the media used contain a carbon source, one Nitrogen source, inorganic salts and possibly minor Amounts of vitamins and trace elements.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker­ quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bisphosp­ hat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronensäure, Milch­ säure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die auch gleichzeitig als stickstoffquelle verwendet werden können.Examples of advantageous carbon sources are sugars such as Mono-, di- or polysaccharides such as glucose, fructose, mannose, Xylose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, Sucrose, raffinose, starch or cellulose, complex sugars swell like molasses, sugar phosphates like fructose-1,6-bisphosph has, sugar alcohols such as mannitol, polyols such as glycerin, alcohols such as methanol or ethanol, carboxylic acids such as citric acid, milk acid or acetic acid, fats such as soybean oil or rapeseed oil, amino acids like glutamic acid or aspartic acid or aminosugar, which too can also be used as a nitrogen source.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH4Cl oder (NH4)2SO4, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquell­ wasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeex­ trakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelpro­ tein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen können.Advantageous nitrogen sources are organic or inorganic nitrogen compounds or materials that contain these compounds. Examples are ammonium salts such as NH 4 Cl or (NH 4 ) 2 SO 4 , nitrates, urea, or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, beer yeast autolysate, soybean meal, wheat gluten, yeast extract, meat extract, casein hydrolyzate, yeast or potato protein, which are often also used simultaneously Nitrogen source can serve.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Ma­ gnesium, Natrium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als An­ ion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phospha­ tion zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produkti­ vität im erfindungsgemäßen Verfahren ist der Zusatz von Fe2+- oder Fe3+-Salzen und/oder Kaliumsalzen zum Produktionsmedium.Examples of inorganic salts are the salts of calcium, magnesium, sodium, manganese, potassium, zinc, copper and iron. The chlorine, sulfate and phosphate ion are particularly worth mentioning as the ion of these salts. An important factor to increase in productivity to the novel process is the addition of Fe 2+ - or Fe 3+ salts and / or potassium salts to the production medium.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Py­ ridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Asparagin, Asparagin­ säure, Glutamin, Serin, Methonin oder Lysin, Carbonsäuren wie Ci­ tronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure, oder Substanzen wie Dithiothreitol. If necessary, further growth factors become the nutrient medium added, such as vitamins or growth promoters such as Riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, pantothenate or Py ridoxin, amino acids such as alanine, cysteine, asparagine, asparagine acid, glutamine, serine, methonine or lysine, carboxylic acids such as Ci tronic acid, formic acid, pimelic acid or lactic acid, or Substances such as dithiothreitol.  

Zur Stabilisierung der Vektoren mit den Biotingenen in den Zellen können gegebenenfalls Antibiotika dem Medium zugesetzt werden.To stabilize the vectors with the biotin genes in the cells antibiotics can optionally be added to the medium.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorge­ legt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf wäh­ rend der Fermentation nachgegeben werden.The mixing ratio of the nutrients mentioned depends on the Type of fermentation and is determined in individual cases. The Medium components can all be pre-selected at the start of the fermentation after being sterilized separately if necessary or have been sterilized together, or selected as required be given during the fermentation.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht wer­ den. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 fest­ gehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 8 bis 240 Stunden bevorzugt von 8 bis 120 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Biotin im Medium an und/oder ist nach Aufschluß der Zellen verfügbar.The breeding conditions are determined so that the organisms grow optimally and that the best possible yields are achieved the. Preferred cultivation temperatures are 15 ° C to 40 ° C. Temperatures between 25 ° C and 37 ° C are particularly advantageous. The pH value is preferably fixed in a range from 3 to 9 held. PH values between 5 and 8 are particularly advantageous. Generally the incubation period is 8 to 240 hours preferably sufficient from 8 to 120 hours. Within that time the maximum amount of biotin accumulates in the medium and / or is available after the cells are disrupted.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Biotin kann kontinuierlich oder batch- oder fed-batch-weise durchgeführt wer­ den. Werden aus den mit den Biotingenen transformierten Pflanzen­ zellen ganze Pflanzen regeneriert, so können diese nach dem er­ findungsgemäßen Verfahren ganz normal angezüchtet und vermehrt werden.The method according to the invention for the production of biotin can who is carried out continuously or batch or fed-batch-wise the. Become from the plants transformed with the biotin genes cells whole plants regenerated, so they can after the Processes according to the invention are grown and propagated as normal become.

BeispieleExamples 1. Klonierung des S-Adenosyl-Methionin-Synthase-Gens (SEQ ID No. 1)1. Cloning of the S-adenosyl methionine synthase gene (SEQ ID No. 1)

Das Gen, das für SAM-Synthase (metK) kodiert, wurde aus dem Chro­ mosom von E. coli durch eine Polymerase-Kettenreaktion mit Hilfe zweier spezifischer Oligonukleotide ausgehend von genomischer E. coli DNA amplifiziert. Die derart amplifizierte DNA wurde aufge­ reinigt, mit dem Restriktionsenzym Acc65I verdaut und in einen mit dem gleichen Enzym geschnittenen Vektor inseriert, der eine Überexpression des Gens in E. coli Stämmen ermöglicht. Durch ei­ nes der beiden Oligonukleotide wurde das Genkonstrukt mit oti­ mierten Translationssignalen versehenThe gene encoding SAM synthase (metK) was extracted from the chro E. coli mosome by using a polymerase chain reaction two specific oligonucleotides based on genomic E. coli DNA amplified. The DNA amplified in this way was loaded purifies, digested with the restriction enzyme Acc65I and into one inserted with the same enzyme cut vector, the one Enables overexpression of the gene in E. coli strains. By egg nes of the two oligonucleotides was the gene construct with oti mated translation signals

a.) Entwicklung von Oligonukleotiden zur Amplifizierung des metK Gens aus dem E. coli Chromosoma.) Development of oligonucleotides to amplify the metK E. coli chromosome gene

metK soll als Expressionskassette bestehend aus einer ribosomalen Bindungstelle, dem Startkodon der kodierenden Sequenz und dem Stopkodon zwischen zwei Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme amplifiziert werden. Für beide Restriktionsschnittstellen wurde die Erkennungssequenz von Acc65I gewählt. Das metK Gen wurde mit Hilfe der Oligonucleotide PmetK1 (5,-GCGGTACCAGGTGATATTAAATATG­ GCAAAAC-3') und PmetK2 (5'-CGGGTACCGATTACTTCAGACCGGCAGC-3') am­ plifiziert und kloniert.metK is said to be an expression cassette consisting of a ribosomal Binding site, the start codon of the coding sequence and the Stop codon between two restriction enzyme recognition sites be amplified. For both restriction sites selected the Acc65I recognition sequence. The metK gene was created with Using the oligonucleotides PmetK1 (5, -GCGGTACCAGGTGATATTAAATATG GCAAAAC-3 ') and PmetK2 (5'-CGGGTACCGATTACTTCAGACCGGCAGC-3') on plicated and cloned.

b.) Durchführung der PCRb.) Carrying out the PCR Bedingungenconditions

Als Matrize wurden 0,5 µg chromosomale DNA von E. coli W3110 ver­ wendet. Die Oligonukleotide PmetK1 und PmetK2 wurden in einer Konzentration von je 15 pMol eingesetzt. Die Konzentration an dNTP's betrug 200 µM. Als Polymerase wurden 2,5 U Pwo DNA-Polyme­ rase (Boehringer Mannheim) im Reaktionspuffer des Herstellers eingesetzt. Das Volumen der PCR-Reaktion betrug 100 µl.0.5 µg of chromosomal DNA from E. coli W3110 were used as the template turns. The oligonucleotides PmetK1 and PmetK2 were in one Concentration of 15 pmoles used. The concentration on dNTP's was 200 µM. 2.5 U Pwo DNA polymer were used as polymerase rase (Boehringer Mannheim) in the manufacturer's reaction buffer used. The volume of the PCR reaction was 100 µl.

AmplifikationsbedingungenAmplification conditions

Die Denaturierung der DNA erfolgte für 2 min bei 94°C. Anschlie­ ßend wurden die Oligonukleotide für 30 sec bei 55°C angelagert. Die Elongation erfolgte für 75 sec bei 72°C. Die PCR-Reaktion wurde über 30 Zyklen durchgeführt.The DNA was denatured at 94 ° C. for 2 min. Then The oligonucleotides were attached at 55 ° C. for 30 seconds. The elongation was carried out for 75 seconds at 72 ° C. The PCR reaction was performed over 30 cycles.

Das erhaltene DNA-Produkt mit einer Größe von ca. 1145 bp wurde aufgereinigt und durch Acc65I im geeigneten Puffer verdaut.The DNA product obtained was approximately 1145 bp in size purified and digested in a suitable buffer by Acc65I.

c.) Klonierung von metK in Expressionsvektorc.) Cloning of metK in expression vector

2 µg des Vektors pHS1 (Konstruktion wurde in DE 197.31274.8, Priorität 22.7.97, Beispiele 1. Seite 14 bis 17 beschrieben) wur­ den durch Acc65I verdaut und durch Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Nach Denaturierung der SAP wurden Vektor und Fragment in einem molaren Verhältnis von 1 : 3 durch den Rapid-DNA-Ligation Kit nach der Vorschrift des Herstellers ligiert. Die Transformation des Ligationsansatzes er­ folgte in den Stamm E. coli XL-1-blue. Positive Klone wurden durch Plasmidpräparation und Restriktionsanalyse identifiziert. Die richtige Orientierung des MetK-Fragments in pHS1 wurde durch Re­ striktionsverdau und Sequenzierung bestimmt. Das erhaltene Kon­ strukt wurde pHS1 metK (Fig. 1) genannt. Die Sequenz von pHS1 metK ist SEQ ID No. 9 zu entnehmen. SEQ ID No. 10 zeigt die abge­ leitete Aminosäuresequenz der codierenden Region für metK. 2 µg of the vector pHS1 (construction was described in DE 197.31274.8, priority 22.7.97, examples 1. page 14 to 17) were digested by Acc65I and dephosphorylated by Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (Boehringer Mannheim). After the SAP had been denatured, the vector and fragment were ligated in a molar ratio of 1: 3 using the Rapid DNA ligation kit according to the manufacturer's instructions. The transformation of the ligation approach he followed into the strain E. coli XL-1-blue. Positive clones were identified by plasmid preparation and restriction analysis. The correct orientation of the MetK fragment in pHS1 was determined by restriction digestion and sequencing. The resulting construct was called pHS1 metK ( Fig. 1). The sequence of pHS1 metK is SEQ ID No. 9 can be seen. SEQ ID No. Figure 10 shows the deduced amino acid sequence of the coding region for metK.

2. Konstruktion der Plasmide pHBbio14 und pHS1 bioS12. Construction of the plasmids pHBbio14 and pHS1 bioS1

Die Konstruktion der Plasmide pHBbio14 und pHS1 bioS1 wurde be­ reits beschrieben (DE 197.31274.8, Priorität 22.7.97, Beispiele 1, 2 und 5).The plasmids pHBbio14 and pHS1 bioS1 were constructed already described (DE 197.31274.8, priority 22.7.97, examples 1, 2 and 5).

3. Konstruktion von pHS1 metK bioS13. Construction of pHS1 metK bioS1

Die Plasmide pHS1 bioS1 [SEQ ID No. 11, (DE 197.31274.8, Priorität 22.7.97), SEQ ID No. 12 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz der codierenden Region für bioS1] und pHS1 metK SEQ ID No. 9 wur­ den durch einen Plasmid-Präparationsmethode (Boehringer) aufge­ reinigt. Aus pHS1 metK wurde das metK-Gen tragende Fragment durch einen Acc65I-Verdau isoliert. pHS1 bioS1 wurde durch Acc65I ver­ daut, und durch Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP) (Boehringer Mannheim) dephosphoryliert. Nach Denaturierung der SAP nach Vor­ schrift des Herstellers wurden Vektor und das metK Fragment in einem molaren Verhältnis von 1 : 3 durch den Rapid-DNA-Ligation Kit nach der Vorschrift des Herstellers ligiert. Die Transformation des Ligationsansatzes erfolgte in den Stamm E. coli XL-1-blue. Po­ sitive Klone wurden durch Plasmidpräparation und Restriktionsana­ lyse identifiziert. Die richtige Orientierung des metK-Fragments in pHS1 bioS1 wurde durch Restriktionsverdau und Sequenzierung bestimmt. Das erhaltene Konstrukt wurde pHS1 metK bioS1 (Fig. 2) genannt. Die Sequenz von pHS1 metK bioS1 ist SEQ ID No. 13 zu ent­ nehmen. SEQ ID No. 14 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz der codierenden Region für metK, SEQ ID No. 15 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz der codierenden Region für bioS1.The plasmids pHS1 bioS1 [SEQ ID No. 11, (DE 197.31274.8, priority 22.7.97), SEQ ID No. 12 shows the deduced amino acid sequence of the coding region for bioS1] and pHS1 metK SEQ ID No. 9 were cleaned up by a plasmid preparation method (Boehringer). The fragment bearing metK gene was isolated from pHS1 metK by Acc65I digestion. pHS1 bioS1 was digested by Acc65I and dephosphorylated by Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (Boehringer Mannheim). After denaturing the SAP according to the manufacturer's instructions, the vector and the metK fragment were ligated in a molar ratio of 1: 3 using the rapid DNA ligation kit according to the manufacturer's instructions. The ligation mixture was transformed into the strain E. coli XL-1-blue. Positive clones were identified by plasmid preparation and restriction analysis. The correct orientation of the metK fragment in pHS1 bioS1 was determined by restriction digestion and sequencing. The construct obtained was called pHS1 metK bioS1 ( Fig. 2). The sequence of pHS1 metK bioS1 is SEQ ID No. 13 to remove. SEQ ID No. 14 shows the deduced amino acid sequence of the coding region for metK, SEQ ID No. Figure 15 shows the deduced amino acid sequence of the coding region for bioS1.

4. Erhöhung der Biotin-Produktivität durch Überexpression von metK, bioS1 und metK in Kombination mit bioS1.4. Increasing biotin productivity by overexpressing metK, bioS1 and metK in combination with bioS1.

Vom Stamm BM4086 (Ketner und Campbell J. Molec. Biology 1975 96 : 13) wurde durch Plattieren auf Rifampycin-Platten spontan-Ri­ fampycin-resistente Kolonien isoliert. Von einem dieser resisten­ ten Stämme wurde ein P1-Lysat erzeugt. Mit diesem P1-Lysat wurde der Stamm W3110 transduziert und anschließend Klone durch Rifam­ pycin selektioniert. Der erhaltene Stamm mit dem Plasmid pHBbio14 nach der CaCl2-Methode transformiert (Maniatis et al. Molecular Cloning Cols Spring Harbour Laboratory Press 1989) und auf LB-Am­ pizillin 100 µg/ml angezogen. Der isolierte transformierte Stamm (LU5560), wurde jeweils mit dem Plasmiden pHS1, pHS1 metK, pHS1 bioS1 oder pHS1 metK bioS1 nach der CaCl2-Methode transformiert und auf LB-Agar mit Ampizillin 100 µg/ml und Kanamyzin 25 µg/ml selektioniert. From the BM4086 strain (Ketner and Campbell J. Molec. Biology 1975 96:13), spontaneously rifampycin-resistant colonies were isolated by plating on rifampycin plates. A P1 lysate was generated from one of these resistant strains. The strain W3110 was transduced with this P1 lysate and then clones were selected by Rifam pycin. The strain obtained was transformed with the plasmid pHBbio14 by the CaCl 2 method (Maniatis et al. Molecular Cloning Cols Spring Harbor Laboratory Press 1989) and grown on LB-Am pizillin 100 µg / ml. The isolated transformed strain (LU5560) was transformed with the plasmids pHS1, pHS1 metK, pHS1 bioS1 or pHS1 metK bioS1 according to the CaCl 2 method and selected on LB agar with ampicillin 100 µg / ml and kanamycin 25 µg / ml.

Je eine Kolonie der jeweiligen Transformanden wurde in einer DYT- Kultur mit dem entsprechendem Antibiotika angeimpft und für 12 h inkubiert. Die Übernachtkultur (= ÜNK) wurde eingesetzt um eine 10 ml Kultur in TB-Medium(Sambrook, J. Fritsch, E F. Maniatis, T. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989 ISBN 0-87969-373-8), das 30g/l Glycerol enthält, mit den entspre­ chenden Antibiotika anzuimpfen. Im Fall der Gegenwart der Plas­ mide pHS1, pHS1 rnetK, pHS1bioS1 und pHS1 metK bioS1 erfolgte gleich­ zeitig der Zusatz von 1mM IPTG und 0,5% Arabinose zur Induktion der Genexpression von metK und bioS1 bzw. der Kombination beider Gene. Nach 24h Stunden wurden die Zellen vom Kulturüberstand durch Zentrifugation abgetrennt und die Biotin-Konzentration durch einen kompetitiven ELISA mit Streptavidin im Überstand be­ stimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind Tabelle I zu ent­ nehmen.One colony each of the respective transformants was in a DYT Culture inoculated with the appropriate antibiotics and for 12 h incubated. The overnight culture (= ÜNK) was used for one 10 ml culture in TB medium (Sambrook, J. Fritsch, E F. Maniatis, T. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989 ISBN 0-87969-373-8), which contains 30g / l glycerol, with the corresponding vaccinating antibiotics. In the case of the presence of the Plas mide pHS1, pHS1 rnetK, pHS1bioS1 and pHS1 metK bioS1 were the same early addition of 1mM IPTG and 0.5% arabinose for induction the gene expression of metK and bioS1 or the combination of both Genes. After 24 hours, the cells were removed from the culture supernatant separated by centrifugation and the biotin concentration by a competitive ELISA with streptavidin in the supernatant Right. The results of this determination are shown in Table I. to take.

Tabelle I Table I

Bestimmung der Biotinkonzentration Determination of the biotin concentration

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung von Biotin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein S-Adenosyl-Methionin-Synthasegen mit der Sequenz SEQ ID No. 1 und mindestens ein weiteres Biotin-Biosynthese­ gen bioS1, bioS2 oder bioS3 mit den Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 oder SEQ ID No. 7 sowie ihre funktionellen Va­ rianten, Analoge oder Derivate in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus, der in der Lage ist Biotin zu synthetisieren, exprimiert, diesen züchtet und das synthe­ tisierte Biotin direkt, nach Abtrennung der Biomasse oder nach Reinigung des Biotins verwendet.1. A process for the preparation of biotin, characterized in that an S-adenosyl-methionine synthase gene with the sequence SEQ ID No. 1 and at least one other biotin biosynthesis gene bioS1, bioS2 or bioS3 with the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 or SEQ ID No. 7 as well as their functional variants, analogs or derivatives in a prokaryotic or eukaryotic host organism that is able to synthesize biotin, expresses it, cultivates it and uses the synthesized biotin directly, after separation of the biomass or after purification of the biotin. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Varianten der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 um Gene handelt, die auf der von den Sequenzen nach Anspruch 1 abge­ leiteten Aminosäureebene eine Homologie von 30 bis 100% auf­ weisen und eine gesteigerte Biotinsynthese ermöglichen.2. The method according to claim 1, characterized in that it the variants of the genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 um genes acts on the abge of the sequences of claim 1 derived amino acid level homology from 30 to 100% point and enable an increased biotin synthesis. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirtsorganismus ein Organismus ausgewählt aus der Gruppe der Gattungen Escherichia, Citrobacter, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Azotobac­ ter, Chromobacterium, Bacillus, Chlostridium, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptomyces, Rhizobium, Agrobacterium, Staphylococcus, Rho­ dotorula, Sprorobolomyces, Yarrowia, Schizosaccharomyces oder Saccharomyces verwendet wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that an organism selected from the group as the host organism of the genera Escherichia, Citrobacter, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pseudomonas, Comamonas, Acinetobacter, Azotobac ter, Chromobacterium, Bacillus, Chlostridium, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Streptomyces, Rhizobium, Agrobacterium, Staphylococcus, Rho dotorula, Sprorobolomyces, Yarrowia, Schizosaccharomyces or Saccharomyces is used. 4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß als Wirtsorganismus eine regulationsdefekte Biotin­ mutante verwendet wird.4. The method according to claims 1 to 3, characterized in net that as a host organism a defective biotin mutant is used. 5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die Expression mindestens einer Kopie der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 nach Anspruch 1 allein oder mit einer oder mehreren Kopien mindestens eines weiteren Biotingens ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR in einem prokaryontischen oder eukaryon­ tischen Wirtsorganismus erfolgt. 5. The method according to claims 1 to 4, characterized in net that the expression with at least one copy of the genes the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 according to claim 1 alone or with one or more Copies of at least one other bioting gene selected from the group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY or bioR in a prokaryotic or eukaryon table host organism takes place.   6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die Expression mindestens einer Kopie der Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 nach Anspruch 1 allein oder mit einer oder mehreren Kopien mindestens eines weiteren Biotingens ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR in einem prokaryontischen oder eukaryon­ tischen Wirtsorganismus auf einem gemeinsamen oder aufge­ trennten Vektoren erfolgt.6. The method according to claims 1 to 5, characterized in net that the expression with at least one copy of the genes the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 according to claim 1 alone or with one or more Copies of at least one other bioting gene selected from the group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY or bioR in a prokaryotic or eukaryon table host organism on a common or up separated vectors. 7. Genkonstrukt enthaltend ein S-Adenosyl-Methionin-Synthasegen mit der SEQ ID No. 1 und mindestens ein weiteres Biotin-Bio­ synthesegen bioS1, bioS2 oder bioS3 mit den Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 sowie ihre funktionellen Varianten, Analoge oder Derivate, das mit einem oder mehreren Regulationssignalen zur Erhöhung der Genexpression und/oder Proteinexpression funktionell verknüpft ist und/oder dessen natürliche Regulation ausgeschaltet wurde.7. Gene construct containing an S-adenosyl methionine synthase gene with the SEQ ID No. 1 and at least one other biotin bio synthesis gene bioS1, bioS2 or bioS3 with the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 as well as their functional Variants, analogs or derivatives that work with one or more Regulation signals to increase gene expression and / or Protein expression is functionally linked and / or its natural regulation has been switched off. 8. Genkonstrukt nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem Vektor inseriert wurde, der für die Expression des Gens in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtsor­ ganismus geeignet ist.8. gene construct according to claim 7, characterized in that it was inserted in a vector which was used for the expression of the Gene in a prokaryotic or eukaryotic host ganism is suitable. 9. Genkonstrukt nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene mit den Sequenzen SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 sowie ihre funktionellen Va­ rianten, Analoge oder Derivate in mehreren Kopien im Genkon­ strukt vorliegen.9. gene construct according to claim 7 or 8, characterized in that the genes with the sequences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 and their functional Va Rianten, analogs or derivatives in multiple copies in the gene con are available. 10. Genkonstrukt nach Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das S-Adenosyl-Methionin-Synthasegen SEQ ID No. 1 und mindestens ein weiteres Biotin-Biosynthesegen bioS1, bioS2 oder bioS3 mit den Sequenzen SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 7 sowie ihre funktionellen Varianten, Analoge oder Derivate nach Anspruch 7 zusammen mit einer oder mehreren Ko­ pien mindestens eines weiteren Gens ausgewählt aus der Gruppe bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR im Genkonstrukt oder Vektor vorliegt.10. gene construct according to claims 7 to 9, characterized in that the S-adenosyl-methionine synthase gene SEQ ID No. 1 and at least one other biotin biosynthetic gene bioS1, bioS2 or bioS3 with the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 7 and their functional variants, analogs or Derivatives according to claim 7 together with one or more Ko pien at least one other gene selected from the group bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY or bioR is present in the gene construct or vector. 11. Organismen enthaltend ein Genkonstrukt gemäß den Ansprüchen 7 bis 10.11. organisms containing a gene construct according to claims 7 until 10. 12. Verwendung der Sequenzen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Biotin. 12. Use of the sequences according to claim 1 for the production of Biotin.   13. Verwendung des bioS3-Gens mit der Sequenz SEQ ID No. 7 seiner funktionellen Varianten, Analoge oder Derivate allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Gen ausgewählt aus der Gruppe S-Adenosyl-Methionin-Synthasegen, bioS1, bioS2, bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY oder bioR zur Herstellung von Biotin.13. Use of the bioS3 gene with the sequence SEQ ID No. 7 of his functional variants, analogs or derivatives alone or in Combination with at least one other gene selected from the group S-adenosyl methionine synthase gene, bioS1, bioS2, bioA, bioB, bioF, bioC, bioD, bioH, bioP, bioW, bioX, bioY or bioR for the production of biotin. 14. Verwendung eines Genkonstrukts gemäß den Ansprüchen 7 bis 10 zur Herstellung von Biotin.14. Use of a gene construct according to claims 7 to 10 for the production of biotin.
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