DE19804583A1

DE19804583A1 - Mehrkomponentensystem zum Verändern, Abbau oder Bleichen von Lignin, ligninhaltigen Materialien sowie Verfahren zu seiner Anwendung

Info

Publication number: DE19804583A1
Application number: DE19804583A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr Amann; Michael Wohlschlaeger; Johannes Dr Freudenreich; Juergen Dr Stohrer; Elke Dr Fritz-Langhals
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 1999-04-01
Also published as: ZA988728B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mehrkomponentensystem zum Verändern, Abbau oder Bleichen von Lignin, ligninhaltigen Mate rialien sowie Verfahren zu seiner Anwendung.

Das Hauptziel aller Verfahren zur Herstellung von Zellstoff ist die Entfernung des Lignins aus dem pflanzlichen Ausgangsmaterial. Typischerweise wird dieses Ziel dadurch erreicht, daß geeignete oxidative oder reduktive chemische Prozeßschritte angewendet wer den, welche das Lignin letztendlich in einer Weise modifizieren, in welcher es sich leicht aus dem Zellstoffprodukt extrahieren läßt. Traditionellerweise werden in den chemischen Prozeßschrit ten Chlor oder chlorhaltige Chemikalien, wie Hypochlorit oder Chlordioxid, verwendet.

In jüngerer Zeit werden anstelle dieser oder in Ergänzung zu die sen chlorhaltigen Verbindungen chlorfreie Chemikalien eingesetzt. Diese umfassen z. B. Sauerstoff, Wasserstoffperoxid, Peroxisäuren oder Ozon. Typischerweise wird der zu bearbeitende Zellstoff zwi schen den verschiedenen chemischen Behandlungen einem Extrak tionsschritt unterworfen, welcher Alkali, z. B. NaOH, enthält.

Als zusätzlicher chlorfreier Verfahrensschritt in den chemischen Verfahren zur Entfernung von Lignin sind enzymatische Verfahren bekannt, die die chemische Entfernung des Lignins in einer viel stufigen Delignifizier- und Bleichsequenz erleichtern sollen. Dieser Verfahrensschritt kann einstufig oder mehrstufig in se quentieller Kombination mit chemischen Verfahrensschritten durch geführt werden (WO 91/11553). Als Vorteile dieses Verfahrens schritts werden die Verbesserung der erzielbaren Weißegrade oder die Reduktion des Chemikalienbedarfs, speziell der eingesetzten Chlormenge, genannt.

Aus EP 0 487 557 ist ferner bekannt, bei chemischen Delignifizie rungsverfahren mit Hilfe von Sauerstoff zusätzlich einzelne Enzy me oder Mischungen von Enzymen aus verwandten Klassen einzuset zen. Dies sind z. B. Enzympräparationen, welche verschiedene Hemi zellulasen enthalten.

Aus US 5,374,555 ist ein chemisches Verfahren mit zusätzlicher enzymatischer Zellstoffbehandlung unter Verwendung von Enzymen aus der Gruppe der Proteasen bekannt. Auch hier wird die Behand lung als ein separater Verfahrensschritt durchgeführt, welcher in sequentieller Kombination mit chemischen Verfahrensschritten zu Vorteilen führt.

WO 91/11552 beschreibt die Verwendung von oxidierenden und hydro lytischen Enzymen in einem Verfahren zur mechanischen Herstellung von Holzstoff. Zusätze wie z. B. Ascorbinsäure sollen dabei dazu dienen, das Redoxpotential auf Werte < 200 mV einzustellen.

Neben den beschriebenen enzymatischen Verfahren, welche zusätz lich zu chemischen Verfahren zur Behandlung des Zellstoffs einge setzt werden, sind auch enzymatische Verfahren zur Behandlung des Zellstoffs beschrieben.

Solche Verfahren nutzen phenol-oxydierende Enzyme. Beispiele für solche Enzyme sind Enzyme aus der Gruppe der Peroxidasen (E.C. 1.11.1) und Oxidasen (E.C. 1.10.3). Die Enzyme verwenden entweder Wasserstoffperoxid oder molekularen Sauerstoff als Elektronakzep tor. Der Einsatz dieser oxidativen Enzyme in der Bleiche ist be schrieben (z. B. Paice, M.G., 1995). Verwendung finden z. B. Man gan Peroxidase (MnP), Lignin Peroxidase (LiP) oder Laccase (E.C. 1.10.3.2). Während LiP und MnP als Cosubstrat typischerweise Wasserstoffperoxid benötigen, arbeitet Laccase mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor.

Der erfolgreiche Einsatz von Peroxidasen in der Bleiche konnte noch nicht überzeugend geführt werden, da das Problem der Peroxi dase-Inaktivierung durch Wasserstoffperoxid bzw. die geeignete Dosierungstechnik für Wasserstoffperoxid in einem nicht kontinu ierlichen technischen Verfahren bisher nicht möglich ist.

Während der alleinige Einsatz von Laccase das Lignin nicht in die gewünschte extrahierbare Form überführt, konnte durch Zugabe ge eigneter Mediatorsubstanzen zu Laccase ein technisches Verfahren entwickelt werden, welches Zellstoff jeglicher Art erfolgreich delignifizieren kann. Ein solches enzymatische Delignifiziersy stem, das aus den Komponenten Laccase, Mediator und Sauerstoff besteht, ist in WO 94/29510 beschrieben. Diese Anmeldung gibt zudem ausführlich den Stand der Technik wieder.

Weitere Mediatoren für enzymatischen Delignifizierungen unter Verwendung von Laccase sind in WO 97/06244 beschrieben.

WO 94/01538 beschreibt die Verwendung von Cellobiose-Oxidase in Kombination mit einer Endoglycanase, beispielsweise Xylanase und/oder Oxidoreduktase, beispielsweise Laccase. In dem Verfahren wird darüber hinaus noch ein Bleichverstärker zugegeben. Die an gegebenen Bedingungen nennen unter anderem einen alkalischen pH-Wert. Die Wirksamkeit eines solchen Systems ist sehr gering, da bei dem genannten pH-Wert die beschriebene Laccase weitgehend in aktiv ist. Zudem wird Laccase in Gegenwart von Wasserstoffperoxid inaktiviert. Hinzu kommt, daß die als Bleichverstärker genannten Verbindungen keine Verstärkeraktivität zeigen. Dies ist aus WO 96/12846 ersichtlich, wo eine der Zellstoffbleiche analoge An wendung, die Bleiche von gefärbten Textilfasern, beschrieben wird:

WO 96/12846 beschreibt im Beispiel 1 die Wirksamkeit unterschied licher Mediatoren. Wie in diesem Beispiel aus Tabelle 2 ersicht lich, zeigen die dort genannten exemplarischen Verbindungen keine Mediatoraktivität.

WO 94/29510 beschreibt die vorteilhafte Kombination eines enzyma tischen Delignifiziersystems bestehend aus einer Laccase und ei nem aktiven Mediator. Dieses Verfahren ist das gegenwärtig einzi ge bekannte enzymatische Verfahren, welches zu einem effektiven Abbau von Lignin führte. Als Mediator wird dabei N-OH-Benzotriazol (HBT) verwendet. In dem beschriebenen Verfahren wird unter ande rem auch der Zusatz weiterer enzymatischer Komponenten, wie z. B. Proteasen, erwähnt.

Wie von Oksanen et al. 1997 gezeigt, weist eine kombinierte An wendung von Xylanase/Laccase/HBT nur eine sehr geringe Verbesse rung gegenüber einer xylanasefreien Anwendung auf. Vorteile erga ben sich erst, nachdem die Xylanasebehandlung von der Lacca se/HBT-Behandlung abgetrennt wurde und als eigener Verfahrens schritt durchgeführt wurde.

Es ist daher wünschenswert, ein Mehrkomponentensystem zum Verän dern, Abbau oder Bleichen von Lignin und ligninhaltigen Materia lien zur Verfügung zu haben, welches bessere Ergebnisse in der Delignifizierung erreicht als bekannte enzymatische Delignifizie rungssysteme und nicht mit den Nachteilen von chemischen Deligni fizierungssystemen behaftet ist.

Neben der schlechten Performance der einzelnen enzymatischen Ver fahren zur Zellstoffdelignifizierung stellt die aufgrund der oben geschilderten Probleme notwendige Vereinzelung von enzymatischen Delignifizierstufen und das daraus resultierende schrittweise Vorgehen bei der Delignifizierung von Zellstoff einen be trächtlichen Nachteil dieser Verfahren dar. Durch die Notwendigkeit von Wasch- und Extraktionsschritten zwischen den unterschiedlichen Enzymbehandlungen lassen sich die Verfahren nicht wirtschaftlich in die bestehenden Delignifizier- und Bleichsequenzen integrieren.

Es ist daher ebenfalls wünschenswert, enzymatische Verfahren zur Behandlung von Lignin und ligninhaltigen Materialien bereit zu stellen, die mehrere enzymatische Verfahrensschritte in einer einzigen Verfahrensstufe vereinigen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mehrkomponentensystem zum Verändern, Abbau oder Bleichen von Lignin, ligninhaltigen Mate rialien oder ähnlichen Stoffen, enthaltend eine Oxidoreduktase, ein für die Oxidoreduktase geeignetes Oxidationsmittel, einen Me diator und mindestens ein enzymatisch wirksames Additiv, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator die Oxidoreduktase und das en zymatisch wirksame Additiv nicht inaktiviert und das enzymatisch wirksame Additiv aus der Gruppe der Hydrolasen der Enzymklasse 3.2.1. ausgewählt ist.

Die Benennung der Enzymklassen erfolgt in der vorliegenden Anmel dung gemäß Internationaler Enzym-Nomenklature, Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., 1992, S. 24-154).

Im Sinne der Erfindung inaktiviert ein Mediator ein Enzym, wenn er einen Verlust von < 70% der Enzymaktivität dieses Enzyms in nerhalb einer Inkubationszeit von 30 min. in einem Testsystem be wirkt, welches in einem Gesamtvolumen von 50 ml bei 45°C 60 IU Oxidoreduktase, beispielsweise Laccase und 400 IU Hydrolase der Enzymklasse 3.2.1, beispielsweise Xylanase, Zellulase oder eine entsprechende Menge eines anderen Enzyms, sowie 7,5 mmol/l Media tor enthält.

Das erfindungsgemäße Mehrkomponentensystem weist folgende Vortei le gegenüber dem Stand der Technik auf:

- Es besitzt eine hohe Selektivität für Lignin
- Es beeinträchtigt die Faserqualität nicht negativ
- Es ermöglicht in Kombination mit chemischen Delignifizierungs verfahren eine Chemikalieneinsparung in der Gesamtdelignifizie rung und Bleiche
- Es stellt eine Verbesserung der bisherigen Einzelverfahren von Xylanase-Behandlung und Laccase-Mediator-System dar. Die Ver besserung ist größer als die Summe der Einzelverfahren.

Der Einsatz von Zellulase in Verfahren zur Herstellung von Zell stoff ist bisher unbekannt. Da Zellulasen bekanntermaßen Zellulo se abbauen und damit nach bisheriger Meinung Zellstoff immer schädigen, ist ihr Einsatz im Verfahren zur Herstellung von Zell stoff für den Fachmann völlig unerwartet und überraschend.

Als Oxidoreduktasen können im erfindungsgemäßen Mehrkomponenten system Oxidoreduktasen der Klassen 1.1.1 bis 1.97 gemäß Interna tionaler Enzym-Nomenklature, Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Enzyme Nomenclature, Aca demic Press, Inc., 1992, S. 24-154) eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden Oxidoreduktasen der im Folgenden genannten Klassen eingesetzt:

Enzyme der Klasse 1.1, die alle Dehydrogenasen, die auf primäre, sekundäre Alkohole und Semiacetale wirken, umfassen, und die als Akzeptoren NAD⁺ oder NADP⁺ (Subklasse 1.1.1), Cytochrome (1.1.2), Sauerstoff (O₂) (1.1.3), Disulfide (1.1.4), Chinone (1.1.5) oder andere Akzeptoren haben (1.1.99).

Aus dieser Klasse sind besonders bevorzugt die Enzyme der Klasse 1.1.5 mit Chinonen als Akzeptoren und die Enzyme der Klasse 1.1.3 mit Sauerstoff als Akzeptor.

Insbesondere bevorzugt in dieser Klasse ist Cellobiose: quinone-1-oxidoreduktase (1.1.5.1).

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.2. Diese Enzymklasse umfaßt solche Enzyme, die Aldehyde zu den korrespondierenden Säu ren oder Oxo-Gruppen oxidieren. Die Akzeptoren können NAD⁺, NADP⁺ (1.2.1), Cytochrome (1.2.2), Sauerstoff (1.2.3), Sulfide (1.2.4), Eisen-Schwefel-Proteine (1.2.5) oder andere Akzeptoren (1.2.99) sein.

Besonders bevorzugt sind hier die Enzyme der Gruppe (1.2.3) mit Sauerstoff als Akzeptor.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.3.

In dieser Klasse sind Enzyme zusammengefaßt, die auf CH-CH-Grup pen des Donors wirken.

Die entsprechenden Akzeptoren sind NAD⁺, NADP⁺ (1.3.1), Cytochro me (1.3.2), Sauerstoff (1.3.3), Chinone oder verwandte Verbindun gen (1.3.5), Eisen-Schwefel-Proteine (1.3.7) oder andere Akzepto ren (1.3.99).

Besonders bevorzugt ist die Bilirubinoxidase (1.3.3.5).

Hier sind ebenfalls die Enzyme der Klasse (1.3.3) mit Sauerstoff als Akzeptor und (1.3.5) mit Chinonen etc. als Akzeptor besonders bevorzugt.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.4, die auf CH-NH₂-Gruppen des Donors wirken.

Die entsprechenden Akzeptoren sind NAD⁺, NADP⁺ (1.4.1), Cytochro me (1.4.2), Sauerstoff (1.4.3), Disulfide (1.4.4), Eisen-Schwe fel-Proteine (1.4.7) oder andere Akzeptoren (1.4.99).

Besonders bevorzugt sind auch hier Enzyme der Klasse 1.4.3 mit Sauerstoff als Akzeptor.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.5, die auf CH-NH-Grup pen des Donors wirken. Die entsprechenden Akzeptoren sind NAD⁺, NADP⁺ (1.5.1), Sauerstoff (1.5.3), Disulfide (1.5.4), Chinone (1.5.5) oder andere Akzeptoren (1.5.99).

Auch hier sind Enzyme mit Sauerstoff (O₂) (1.5.3) und mit Chino nen (1.5.5) als Akzeptoren besonders bevorzugt.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.6, die auf NADH oder NADPH wirken.

Die Akzeptoren sind hier NADP⁺ (1.6.1), Hämproteine (1.6.2), Di sulfide (1.6.4), Chinone (1.6.5), NO₂-Gruppen (1.6.6) und ein Flavin (1.6.8) oder einige andere Akzeptoren (1.6.99).

Besonders bevorzugt sind hier Enzyme der Klasse 1.6.5 mit Chino nen als Akzeptoren.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.7, die auf andere NO₂-Verbindungen als Donatoren wirken und als Akzeptoren Cyto chrome (1.7.2), Sauerstoff (O₂) (1.7.3), Eisen-Schwefel-Proteine (1.7.7) oder andere (1.7.99) haben.

Hier ist besonders bevorzugt die Klasse 1.7.3 mit Sauerstoff als Akzeptor.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.8, die auf Schwefel gruppen als Donatoren wirken und als Akzeptoren NAD⁺, NADP⁺ (1.8.1), Cytochrome (1.8.2), Sauerstoff (O₂) (1.8.3), Disulfide (1.8.4), Chinone (1.8.5), Eisen-Schwefel-Proteine (1.8.7) oder andere (1.8.99) haben.

Besonders bevorzugt ist die Klasse 1.8.3 mit Sauerstoff (O₂) und (1.8.5) mit Chinonen als Akzeptoren.

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.9, die auf Hämgrup pen als Donatoren wirken und als Akzeptoren Sauerstoff (O₂) (1.9.3), NO₂-Verbindungen (1.9.6) und andere (1.9.99) haben.

Besonders bevorzugt ist hier die Gruppe 1.9.3 mit Sauerstoff (O₂) als Akzeptor (Cytochromoxidasen).

Weiterhin bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.12, die auf Wasser stoff als Donor wirken.

Die Akzeptoren sind NAD⁺ oder NADP⁺ (1.12.1) oder andere (1.12.99).

Des weiteren bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.13 und 1.14 (Oxi genasen).

Weiterhin sind bevorzugte Enzyme die der Klasse 1.15, die auf Superoxid-Radikale als Akzeptoren wirken.

Besonders bevorzugt ist hier die Superoxid-Dismutase (1.15.1.1).

Weiterhin sind bevorzugt Enzyme der Klasse 1.16.

Als Akzeptoren wirken NAD⁺ oder NADP⁺ (1.16.1) oder Sauerstoff (O₂) (1.16.3).

Besonders bevorzugt sind hier Enzyme der Klasse 1.16.3.1 (Ferroxidase, z. B. Ceruloplasmin).

Weiterhin bevorzugte Enzyme sind diejenigen, die der Gruppe 1.17 (Wirkung auf CH₂-Gruppen, die zu -CHOH- oxidiert werden), 1.18 (Wirkung auf reduziertes Ferredoxin als Donor), 1.19 (Wirkung auf reduziertes Flavodoxin als Donor) und 1.97 (andere Oxidoredukta sen) angehören.

Weiterhin besonders bevorzugt sind die Enzyme der Gruppe 1.11., die auf ein Peroxid als Akzeptor wirken. Diese einzige Subklasse (1.11.1) enthält die Peroxidasen.

Besonders bevorzugt sind hier die Cytochrom-C-Peroxidasen (1.11.1.5), Catalase (1.11.1.6), die Peroxydase (1.11.1.6), die Iodid-Peroxidase (1.11.1.8), die Glutathione-Peroxidase (1.11.1.9), die Chlorid-Peroxidase (1.11.1.10), die L-Ascorbat- Peroxidase (1.11.1.11), die Phospholipid-Hydroperoxid-Glutathio ne-Peroxidase (1.11.1.12), die Mangan-Peroxidase (1.11.1.13), die Diarylpropan-Peroxidase (Ligninase, Lignin-Peroxidase) (1.11.1.14).

Ganz besonders bevorzugt sind Enzyme der Klasse 1.10, die auf Bi phenole und verwandten Verbindungen wirken. Sie katalysieren die Oxidation von Biphenolen und Ascorbaten. Als Akzeptoren fungieren NAD⁺, NADP⁺ (1.10.1), Cytochrome (1.10.2), Sauerstoff (1.10.3) oder andere (1.10.99).

Von diesen wiederum sind Enzyme der Klasse 1.10.3 mit Sauerstoff (O₂) als Akzeptor besonders bevorzugt.

Von den Enzymen dieser Klasse sind die Enzyme Catechol Oxidase (Tyrosinase) (1.10.3.1), L-Ascorbate Oxidase (1.10.3.3), o-Amino phenol Oxidase (1.10.3.4) und Laccase (Benzoldiol: Oxigen Oxido reduktase) (1.10.3.2) bevorzugt, wobei die Laccasen (Benzoldiol: Oxigen Oxidoreduktase) (1.10.3.2) insbesondere bevorzugt sind.

Die genannten Oxidoreduktasen sind käuflich erhältlich oder las sen sich nach Standardverfahren gewinnen. Als Organismen zur Pro duktion der Enzyme kommen beispielsweise Pflanzen, tierische Zel len, Bakterien und Pilze in Betracht. Grundsätzlich können sowohl natürlich vorkommende als auch gentechnisch veränderte Organismen Enzymproduzenten sein. Ebenso sind Teile von einzelligen oder mehrzelligen Organismen als Enzymproduzenten denkbar, vor allem Zellkulturen.

Für die insbesondere bevorzugten Oxidoreduktasen, wie die aus der Gruppe 1.11.1, vor allem aber 1.10.3, und insbesondere zur Pro duktion von Laccasen werden beispielsweise Weißfäulepilze, wie Pleurotus, Phlebia und Trametes, verwendet.

Das erfindungsgemäße Mehrkomponentensystem umfaßt mindestens ein Oxidationsmittel. Als Oxidationsmittel können beispielsweise Luft, Sauerstoff, Ozon, H₂O₂, organische Peroxide, Persäuren wie die Peressigsäure, Perameisensäure, Perschwefelsäure, Persalpe tersäure, Metachlorperoxibenzosäure, Perchlorsäure, Perborate, Peracetate, Persulfate, Peroxide oder Sauerstoffspezies und deren Radikale wie OH, OOH, Singulettsauerstoff, Superoxid (O₂⁻), Ozo nid, Dioxygenyl-Kation (O₂⁺), Dioxirane, Dioxetane oder Fremy Ra dikale eingesetzt werden.

Vorzugsweise werden solche Oxidationsmittel eingesetzt, die ent weder durch die entsprechenden Oxidoreduktasen generiert werden können, z. B. Dioxirane aus Laccasen plus Carbonylen, oder die chemisch den Mediator regenerieren oder diesen direkt umsetzen können.

Beispielsweise benötigen Peroxidasen als Cosubstrat Wasserstoff peroxid. Diese Verbindung kann entweder direkt in das System ge geben werden oder aus einer Vorläuferverbindung freigesetzt wer den. Schließlich kann Wasserstoffperoxid auch in situ durch eine Hilfsreaktion gebildet werden, z. B. durch den enzymatischen Um satz von Glucose mit Glucoseoxidase (E.C. 1.1.3.4).

Beispielsweise verwenden Oxidasen als Elektronenakzeptor Sauer stoff. Sauerstoff ist üblicherweise in ausreichender Menge in wäßrigen Lösungen gelöst. Sauerstoff kann aber auch durch geeig nete Maßnahmen, wie Rühren, Verwendung von Sauerstoffgas oder das Anlegen von Druck, in die Reaktionslösung eingebracht werden. Dies ist besonders dann nötig, wenn das Verfahren bei erhöhter Temperatur betrieben werden soll, da die Löslichkeit von Sauer stoff in wäßrigen Lösungen mit Zunahme der Temperatur abnimmt.

Das erfindungsgemäße Mehrkomponentensystem umfaßt mindestens ei nen Mediator, der die Oxidoreduktase und das enzymatisch wirksame Additiv nicht inaktiviert.

Als Mediator wird vorzugsweise mindestens eine Verbindung aus der Gruppe der aliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Verbindungen ausgewählt, die mindestens eine N-Hxdroxy-, Oxim-, Nitroso-, N-Oxyl- oder N-Oxi Funktion enthält, wobei substituierte oder nichtsubstituierte 1-Hydroxy-1-benzotriazole, 3H-Benzotriazol-1-oxide und 2H-Benzotriazol-1-oxide ausgenommen sind.

Beispiele für solche Verbindungen sind die im Folgenden genannten Verbindungen der Formel I, II, oder III, wobei die Verbindungen der Formeln II und III bevorzugt sind.

Verbindungen der allgemeinen Formel I sind:

wobei X für eine der folgenden Gruppen steht:
(-N=CR⁴-)_p, (-CR⁴=N-)_p, (-CR⁵=CR⁶)_p
und p gleich 1 oder 2 ist,
wobei die Reste R¹ bis R⁶ gleich oder verschieden sein können und unabhängig voneinander eine der folgenden Gruppen darstellen kön nen: Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Formyl, Carboxy sowie Salze und Ester davon, Amino, Nitro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, Phenyl, Sulfono, Ester und Salze davon, Sulfamoyl, Carbamoyl, Phospho, Phosphono, Phosphonooxy und deren Salze und Ester, wobei die Amino-, Carbamoyl- und Sulfamoyl-Grup pen der Reste R¹ bis R⁶ weiterhin unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit Hydroxy, C₁-C₃-alkyl, C₁-C₃-alkoxy substituiert sein können,
und wobei die Reste R² und R³ eine gemeinsame Gruppe -A- bilden können und -A- dabei eine der folgenden Gruppen repräsentiert:
(-CR⁷-CR⁸-CR⁹=CR¹⁰-) oder (-CR¹⁰=CR⁹-CR⁸=CR⁷-).

Die Reste R⁷ bis R¹⁰ können gleich oder ungleich sein und unab hängig voneinander eine der folgenden Gruppen darstellen: Wasser stoff, Halogen, Hydroxy, Formyl, Carboxy sowie Salze und Ester davon, amino, nitro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, phenyl, sulfono, Ester und Salze davon, sulfamoyl, carbamoyl, phospho, phosphono, phosphonooxy und deren Salze und Ester, wobei die Amino-, Carbamoyl- und Sulfamoyl-Grup pen der Reste R⁷ bis R¹⁰ weiterhin unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit Hydroxy, C₁-C₃-alkyl, C₁-C₃-alkoxy substituiert sein können und wobei die C₁-C₁₂-alkyl-, C₁-C₆-alkyloxy-, carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, phenyl-, aryl-Gruppen der Reste R⁷ bis R¹⁰ unsubstituiert oder weiterhin ein- oder mehrfach mit dem Rest R¹¹ substituiert sein können und wobei der Rest R¹¹ eine der folgen den Gruppen darstellen kann: Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, For myl, Carboxy sowie deren Salze und Ester, amino, nitro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, phenyl, aryl, sowie deren Ester und Salze, wobei die Carbamoyl, Sulfamoyl, Ami no-Gruppen des Restes R¹¹ unsubstituiert oder weiterhin ein- oder zweifach mit dem Rest R¹² substituiert sein können und wobei der Rest R¹² eine der folgenden Gruppen darstellen kann: Wasserstoff, Hydroxy, Formyl, Carboxy sowie deren Salze und Ester, amino, ni tro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, phenyl, aryl.

Verbindungen der allgemeinen Formel II sind:

wobei X für eine der folgenden Gruppen steht:
(-N=CR⁴-)_p, (-CR⁴=N-)_p, (-CR⁵=CR⁶)_p
und p gleich 1 oder 2 ist.

Die Reste R¹ und R⁴ bis R¹⁰ können gleich oder ungleich sein und unabhängig voneinander eine der folgenden Gruppen darstellen:
Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Formyl, Carboxy sowie Salze und Ester davon, amino, nitro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, phenyl, aryl, sulfono, Ester und Salze da von, sulfamoyl, carbamoyl, phospho, phosphono, phosphonooxy und deren Salze und Ester, wobei die Amino-, Carbamoyl- und Sulfa moyl-Gruppen der Reste R¹ und R⁴ bis R¹⁰ weiterhin unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit Hydroxy, C₁-C₃-alkyl, C₁-C₃-alkoxy substituiert sein können
und wobei die C₁-C₁₂-alkyl-, C₁-C₆-alkyloxy-, carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, phenyl-, aryl-, aryl-C₁-C₆-alkyl-Gruppen der Reste R¹ und R⁴ bis R¹⁰ unsubstituiert oder weiterhin ein- oder mehrfach mit dem Rest R¹² substituiert sein können und wobei der Rest R¹² eine der folgenden Gruppen darstellen kann: Wasser stoff, Halogen, Hydroxy, Formyl, Carboxy sowie deren Salze und Ester, amino, nitro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, phenyl, aryl, sulfono, sulfeno, sulfino und deren Ester und Salze
und wobei die carbamoyl-, sulfamoyl-, amino-Gruppen des Restes R¹² unsubstituiert oder weiterhin ein- oder zweifach mit dem Rest R¹³ substituiert sein können und wobei der Rest R¹³ eine der fol genden Gruppen darstellen kann: Wasserstoff, Hydroxy, Formyl, Carboxy sowie deren Salze und Ester, amino, nitro, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl, phenyl, aryl.

Beispiele für die genannten Verbindungen sind:

1-Hydroxy-benzimidazole

1-Hydroxybenzimidazol-2-carbonsäure
1-Hydroxybenzimidazol
2-Methyl-1-hydroxybenzimidazol
2-Phenyl-1-hydroxybenzimidazol.

1-Hydroxyindole

2-Phenyl-1-hydroxyindol.

Substanzen der allgemeinen Formel III sind:

wobei X für eine der folgenden Gruppen steht:
(-N=CR⁴-)_m, (-CR⁴=N-)_m, (-CR⁵=CR⁶-)_m
und m gleich 1 oder 2 ist.

Für die Reste R⁷ bis R¹⁰ und R⁴ bis R⁶ gilt das oben gesagte.

R¹⁴ kann sein: Wasserstoff, C₁-C₁₀-alkyl, C₁-C₁₀-alkylcarbonyl, deren C₁-C₁₀-alkyl und C₁-C₁₀-alkylcarbonyl unsubstituiert oder mit einem Rest R¹⁵ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei R¹⁵ eine der folgenden Gruppen darstellen kann: Wasser stoff, Halogen, Hydroxy-, Formyl-, Carboxy- sowie Salze und Ester davon, amino-, nitro-, C₁-C₁₂-alkyl, C₁-C₆-alkyloxy, carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, phenyl-, sulfono-, deren Ester und Salze, sulfamoyl-, carbamoyl-, phospho-, phosphono-, phosphonooxy- und deren Salze und Ester, wobei die amino-, carbamoyl- und sulfamoyl-Gruppen des Restes R¹⁵ weiterhin unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit Hydroxy-, C₁-C₃-alkyl-, C₁-C₃-alkoxy- substituiert sein können.

Der Mediator kann vorzugsweise ferner ausgewählt sein aus der Gruppe cyclischer N-Hydroxyverbindungen mit mindestens einem ggf. substituierten fünf oder sechsgliedrigen Ring, enthaltend die in Formel IV genannte Struktur

sowie deren Salze, Ether oder Ester, wobei
B und D gleich oder verschieden sind und O, S, oder NR¹⁶ bedeu ten, wobei
R¹⁶ Wasserstoff-, Hydroxy-, Formyl-, Carbamoyl-, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphonooxyrest, Ester oder Salz des Phosphonooxyrests bedeutet, wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino- und Phenylreste unsubstitu iert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R¹⁷ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder unge sättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R¹⁷ ein- oder mehrfach substituiert sein können wobei R¹⁷ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Carboxy rest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfono- Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest bedeutet.

Vorzugsweise ist der Mediator ausgewählt aus der Gruppe der Ver bindungen der allgemeinen Formel V, VI, VII oder VIII,

wobei B, D die bereits genannten Bedeutungen haben und
die Reste R¹⁸-R³³ gleich oder verschieden sind und Halogenrest, Carboxyrest, Salz oder Ester eines Carboxyrests oder die für R¹⁶ genannten Bedeutungen haben,
wobei R²⁴ und R²⁵ bzw. R²⁶ und R²⁷ nicht gleichzeitig Hydroxy- oder Aminorest bedeuten dürfen und
ggf. je zwei der Substituenten R¹⁸-R²¹, R²²-R²³, R²⁴-R²⁷, R²⁸-R³³ zu einem Ring -E- verknüpft sein können, wobei -E- eine der fol genden Bedeutungen hat:
(-CH=CH)-_n mit n = 1 bis 3, -CH=CH-CH=N- oder

und wobei ggf. die Reste R²⁴-R²⁷ auch untereinander durch ein oder zwei Brückenelemente -F- verbunden sein können, wobei -F- gleich oder verschieden ist und eine der folgende Bedeutungen hat: -O-, -S, -CH₂-, -CR³⁴=CR³⁵-;
wobei R³⁴ und R³⁵ gleich oder verschieden sind und die Bedeutung von R¹⁸ haben.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind Verbindungen der allge meinen Formeln V, VI, VII oder VIII, bei denen B und D, O oder S bedeuten.

Beispiele für solche Verbindungen sind N-Hydroxy-phthalimid sowie ggf. substituierte N-Hydroxy-phthalimid-Derivate, N-Hydroxymalei mid sowie ggf. substituierte N-Hydroxymaleimid-Derivate, N-Hydroxy-Naphthalsäureimid sowie ggf. substituierte N-Hydroxy- Naphthalsäureimid-Derivate, N-Hydroxysuccinimid und ggf. substituierte N-Hydroxysuccinimid-Derivate, vorzugsweise sol che, bei denen die Reste R²⁴-R²⁷ polycyclisch verbunden sind.

Als Mediator insbesondere bevorzugt sind N-Hydroxyphthalimid, 4-Amino-N-Hydroxyphthalimid und 3-Amino-N-Hydroxyphthalimid.

Als Mediator geeignete Verbindungen der Formel V sind beispiels weise:
N-Hydroxyphthalimid,
4-Amino-N-Hydroxyphthalimid,
3-Amino-N-Hydroxyphthalimid,
N-Hydroxy-benzol-1,2,4-tricarbonsäureimid,
N,N'-Dihydroxy-pyromellitsäurediimid,
N,N'-Dihydroxy-benzophenon-3,3',4,4'-tetracarbonsäurediimid.

Als Mediator geeignete Verbindungen der Formel VI sind beispiels weise:
N-Hydroxymaleimid,
Pyridin-2,3-dicarbonsäure-N-hydroxyimid.

Als Mediator geeignete Verbindungen der Formel VII sind bei spielsweise:
N-Hydroxysuccinimid,
N-Hydroxyweinsäureimid,
N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarbonsäureimid,
exo-N-Hydroxy-7-oxabicyclo[2.2.1]-hept-5-en-2,3-dicarboximid,
N-Hydroxy-cis-cyclohexan-1,2-dicarboximid,
N-Hydroxy-cis-4-cyclohexen-1,2-dicarbonsäureimid.

Als Mediator geeignete Verbindung der Formel VIII ist beispiels weise:
N-Hydroxynapthalsäureimid-Natrium-Salz.

Als Mediator geeignete Verbindung mit einem sechsgliedrigen Ring enthaltend die in Formel IV genannte Struktur ist beispielsweise:
N-Hydroxyglutarimid.

Die beispielhaft genannten Verbindungen eignen sich auch in Form ihrer Salze oder Ester als Mediator.

Als Mediator ebenfalls geeignet sind Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe der N-Aryl-N-Hydroxy-Amide.

Von diesen werden bevorzugt als Mediatoren eingesetzt Verbindun gen der allgemeinen Formel IX, X oder XI

sowie deren Salze, Ether oder Ester, wobei
G einbindiger homo- oder heteroaromatischer ein- oder zweikerni ger Rest und
L zweibindiger homo- oder heteroaromatischer ein- oder zweikerni ger Rest bedeutet und
wobei diese Aromaten durch einen oder mehrere, gleiche oder ver schiedene Reste R³⁶, ausgewählt aus der Gruppe Halogen-, Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carbamoyl-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfono rests, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphono-oxyrest, Ester oder Salz des Phosphonooxyrests substi tuiert sein können und
wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino- und Phenylreste unsubstitu iert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R³⁷ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder unge sättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R³⁷ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R³⁷ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfo no-, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und
je zwei Reste R³⁶ oder R³⁷ paarweise über eine Brücke [-CR³⁸R³⁹-)_m mit m gleich 0, 1, 2, 3 oder 4 verknüpft sein können und
R³⁸ und R³⁹ gleich oder verschieden sind und Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeuten und eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR³⁸R³⁹-] durch Sauerstoff, Schwefel oder einen ggf. mit C₁ bis C₅ Alkylrest sub stituierten Iminorest und zwei benachbarte Gruppen [-CR³⁸R³⁹-] durch eine Gruppe [-CR³⁸=CR³⁹-] ersetzt sein können und
I in amidischer Form vorliegender einbindiger Säurerest von Säu ren, ausgewählt aus der Gruppe Carbonsäure mit bis zu 20 C-Ato men, Kohlensäure, Halbester der Kohlensäure oder der Carbaminsäu re, Sulfonsäure, Phosphonsäure, Phosphorsäure, Monoester der Phosphorsäure, Diester der Phosphorsäure bedeutet und
K in amidischer Form vorliegender zweibindiger Säurerest von Säu ren, ausgewählt aus der Gruppe Mono- und Dicarbonsäuren mit bis zu 20 C-Atomen, Kohlensäure, Sulfonsäure, Phosphonsäure, Phos phorsäure, Monoester der Phosphorsäure bedeutet.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind Verbindungen der allge meinen Formel XII, XIII, XIV, XV oder XVI:

sowie deren Salze, Ether oder Ester, wobei
Ar¹ einbindiger homo- oder heteroaromatischer einkerniger Aryl rest und
Ar² zweibindiger homo- oder heteroaromatischer einkerniger Aryl rest bedeutet,
die durch eine oder mehrere, gleiche oder verschiedene Reste R⁴², ausgewählt aus der Gruppe Hydroxy-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sul fonorests, Nitro-, Nitroso-, Amino-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkylrest substi tuiert sein können,
wobei Aminoreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁴³ substituiert sein können und die C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste ge sättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁴³ ein- oder mehrfach substituiert sein kön nen,
wobei R⁴³ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfono-, Nitro-, Amino-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und
je zwei Reste R⁴² paarweise über eine Brücke [-CR³⁸R³⁹-]_m mit m gleich 0, 1, 2, 3 oder 4 verknüpft sein können und
R³⁸ und R³⁹ die bereits genannten Bedeutungen haben und eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR³⁸R³⁹-] durch Sauerstoff, Schwefel oder einen ggf. mit einem C₁ bis C₅ Alkylrest substitu ierten Iminorest und zwei benachbarte Gruppen [-CR³⁸R³⁹-] durch eine Gruppe [-CR³⁸=CR³⁹-] ersetzt sein können,
R⁴⁰ gleiche oder verschiedene einbindige Reste ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonylrest bedeutet, wobei Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁴⁴ substi tuiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁴⁴ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁴⁴ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfo no-, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest bedeutet und
R⁴¹ zweibindige Reste, ausgewählt aus der Gruppe ortho-, meta-, para-Phenylen-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkylen-, C₁-C₅-Alkylendioxyrest bedeutet, wobei Phenylenreste unsubstitu iert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁴⁴ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein kön nen und mit einem Rest R⁴⁴ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
p 0 oder 1 bedeutet und
q eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet.

Vorzugsweise bedeutet Ar¹ Phenylrest und
Ar² ortho-Phenylenrest, wobei Ar¹ durch bis zu fünf und Ar² durch bis zu vier gleiche oder verschiedene Reste ausgewählt aus der Gruppe C₁-C₃-Alkyl-, C₁-C₃-Alkylcarbonyl-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfono rests, Hydroxy-, Cyano-, Nitro-, Nitroso- und Aminorest substitu iert sein können, wobei Aminoreste mit zwei verschiedenen Resten, ausgewählt aus der Gruppe Hydroxy- und C₁-C₃-Alkylcarbonyl substi tuiert sein können.

Vorzugsweise bedeutet R⁴⁰ einbindiger Rest ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff-, Phenyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest, wobei die C₁-C₁₂-Alkylreste und C₁-C₅-Alkoxyreste gesättigt oder un gesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können.

Vorzugsweise bedeutet R⁴¹ zweibindige Reste, ausgewählt aus der Gruppe ortho- oder para-Phenylen-, C₁-C₁₂-Alkylen-, C₁-C₅-Alkylendioxyrest, wobei die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder un verzweigt sein können und mit einem Rest R⁴⁴ ein- oder mehrfach substituiert sein können.

Vorzugsweise bedeutet R⁴⁴ Carboxyrest, Ester oder Salz des Car boxyrests, Carbamoyl-, Phenyl-, C₁-C₃-Alkoxyrest.

Beispiele für Verbindungen, die als Mediatoren eingesetzt werden können, sind N-Hydroxyacetanilid, N-Hydroxypivaloylanilid, N-Hydroxyacrylanilid, N-Hydroxybenzoylanilid, N-Hydroxy-methylsul fonylanilid, N-Hydroxy-N-phenyl-methylcarbamat, N-Hydroxy-3-oxo-butyrylanilid, N-Hydroxy-4-cyanoacetanilid, N-Hydroxy-4-methoxyacetanilid, N-Hydroxyphenacetin, N-Hydroxy-2,3-dimethylacetanilid, N-Hydroxy-2-methylacetanilid, N-Hydroxy-4-methylacetanilid, 1-Hydroxy-3,4-dihydrochinolin-(1H)-2-on, N,N'-Dihydroxy-N,N'-diacetyl-1,3-phenylendiamin, N,N'-Dihydroxy bernsteinsäuredianilid, N,N'-Dihydroxy-maleinsäuredianilid, N,N'-Dihydroxy-oxalsäuredianilid, N,N'-Dihydroxy-phosphorsäuredi anilid, N-Acetoxyacetanilid, N-Hydroxymethyloxalylanilid, N-Hydroxymaleinsäuremonoanilid.

Als Mediatoren werden bevorzugt N-Hydroxyacetanilid, N-Hydroxyformanilid, N-Hydroxy-N-phenyl-methylcarbamat, N-Hydroxy-2-methylacetanilid, N-Hydroxy-4-methylacetanilid, 1-Hydroxy-3,4-dihydrochinolin-(1H)-2-on sowie N-Acetoxyacetani lid.

Der Mediator kann ferner aus der Gruppe der N-Alkyl-N-Hydroxy-A- mide ausgewählt sein.

Bevorzugt werden dabei als Mediatoren Verbindungen der allgemei nen Formeln (XVII) oder (XVIII)

sowie deren Salze, Ether oder Ester eingesetzt, wobei
M gleich oder verschieden ist und einbindiger, linearer oder ver zweigter oder cyclischer oder polycyclischer, gesättigter oder ungesättigter Alkylrest mit 1-24 C-Atomen bedeutet und
wobei dieser Alkylrest durch einen oder mehrere Reste R⁴⁵, die gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe Hydroxy-, Mercapto-, Formyl-, Carbamoyl-, Carboxy-, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfono rests, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Hydroxylamino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphonooxyrest, Ester oder Salz des Phosphonooxyrests substitu iert sein kann und
wobei Carbamoyl, Sulfamoyl-, Amino-, Hydroxylamino-, Mercapto- und Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁴⁶ substituiert sein können und die C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁴⁶ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁴⁶ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl, Sulfo no-, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, Benzoyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und nicht α-ständige Methylengruppen durch Sauerstoff, Schwefel oder einen ggf. einfach substituierten Iminorest ersetzt sein können und
N in amidischer Form vorliegender einbindiger Säurerest von Säu ren, ausgewählt aus der Gruppe aliphatischer oder ein- oder zwei kerniger aromatischer oder ein- oder zweikerniger heteroaromati scher Carbonsäuren mit bis zu 20 C-Atomen, Kohlensäure, Halbester der Kohlensäure oder der Carbaminsäure, Sulfonsäure, Phosphonsäu re, Phosphorsäure, Monoester der Phosphorsäure, Diester der Phos phorsäure bedeutet und
T in amidischer Form vorliegender zweibindiger Säurerest von Säu ren, ausgewählt aus der Gruppe aliphatischer, ein- oder zweiker niger aromatischer oder ein- oder zweikerniger heteroaromatischer Dicarbonsäuren mit bis zu 20 C-Atomen, Kohlensäure, Sulfonsäure, Phosphonsäure, Phosphorsäure, Monoester der Phosphorsäure bedeu tet und
wobei Alkylreste der in amidischer Form vorliegenden aliphati schen Säuren N und T linear oder verzweigt und/oder cyclisch und/oder polycyclisch gesättigt oder ungesättigt sein können und null bis 24 Kohlenstoffatome beinhalten und nicht substituiert sind oder ein- oder mehrfach dem Rest R⁴⁵ substituiert sind und
Aryl- und Heteroarylreste der in amidischer Form vorliegenden aromatischen oder heteroaromatischen Säuren N und T durch einen oder mehrere Reste R⁴⁷, die gleich oder verschieden sind und aus gewählt sind aus der Gruppe Hydroxy-, Mercapto-, Formyl-, Cyano-, Carbamoyl-, Carboxy-, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfono rest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Ni troso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphonooxy rest, Ester oder Salz des Phosphonooxyrests substituiert sein können und
wobei Carbamoyl, Sulfamoyl-, Amino-, Mercapto- und Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit dem Rest R⁴⁶ substitu iert sein können und die Aryl-C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder unge sättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und ein- oder mehrfach mit dem Rest R⁴⁶ substituiert sein können.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind Verbindungen mit den all gemeinen Formeln (XIX, XX, XXI oder XXII):

sowie deren Salze, Ether oder Ester, wobei
Alk¹ gleich oder verschieden ist und einbindiger, linearer oder verzweigter oder cyclischer oder polycyclischer, gesättigter oder ungesättigter Alkylrest mit 1-10 C-Atomen bedeutet, wobei dieser Alkylrest durch einen oder mehrere Reste R⁴⁸, die gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe Hydroxy-, Formyl-, Carbamoyl-, Carboxy-, Ester oder Salz des Car boxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfa moyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Hydroxylamino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Carbonyl-Reste substituiert sein kann und wobei Carbamoyl, Sulfamoyl-, Amino-, Hydroxylamino- und Phenylre ste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁴⁹ sub stituiert sein können und die C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein kön nen und mit einem Rest R⁴⁹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁴⁹ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl, Sulfo no-, Sulfamoyl-, Nitro-, Amino-, Phenyl-, Benzoyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und nicht α-ständige Methylengruppen durch Sauerstoff, Schwefel oder einen ggf. einfach substituierten Iminorest ersetzt sein können und
wobei R⁵⁰ gleiche oder verschiedene einbindige Reste, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff-, Phenyl-, Pyridyl-, Furyl-, Pyrro lyl-, Thienyl-, Aryl-C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonylrest bedeutet,
wobei Phenyl-, Pyridyl-, Furyl-, Pyrrolyl- und Thienylreste un substituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁵¹ substitu iert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy- und C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁵¹ ein- oder mehrfach substituiert sein können und
R⁵¹ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Carboxy rest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfono-, Sulfamoyl-, Nitro-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest bedeutet und
R⁵² zweibindige Reste, ausgewählt aus der Gruppe Phenylen-, Pyri dylen-, Thienylen-, Furylen-, Pyrrolylen-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkylen-, C₁-C₅-Alkylendioxy-Rest bedeutet, wobei Phenylen-, Pyridylen-, Thienylen-, Furylen-, Pyrrolylen- unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁵³ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁵¹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
p 0 oder 1 bedeutet.

Als Mediatoren ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen mit der allgemeinen Formel (XIX-XXII), bei denen
Alk¹ gleich oder verschieden ist und einbindiger, linearer oder verzweigter oder cyclischer, gesättigter oder ungesättigter Al kylrest mit 1-10 C-Atomen bedeutet,
wobei dieser Alkylrest durch einen oder mehrere Reste R⁴⁸, die gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe Hydroxy-, Carbamoyl-, Carboxy-, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Ami no-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Carbonyl-Reste substituiert sein kann und
wobei Carbamoyl, Sulfamoyl-, Amino- und Phenylreste unsubstitu iert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁴⁹ substituiert sein können und die C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁴⁹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei R⁴⁹ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl, Sulfono-, Sulfamoyl-, Ni tro-, Amino-, Phenyl-, Benzoyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und
wobei R⁵⁰ gleiche oder verschiedene einbindige Reste, ausgewählt aus der Gruppe Wasserstoff-, Phenyl-, Furyl-, Aryl-C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₁₀-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonylrest bedeutet,
wobei Phenyl- und Furylreste unsubstituiert oder ein- oder mehr fach mit einem Rest R⁵¹ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy- und C₁-C₁₀-Carbonyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁵¹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁵¹ gleich oder verschieden ist und Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest bedeutet und
R⁵² zweibindiger Rest ausgewählt aus der Gruppe Phenylen-, Fury len-, C₁-C₁₂-Alkylen-, C₁-C₅-Alkylendioxy-Rest bedeutet, wobei Phenylen-, Furanylen- unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁵¹ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-Reste gesättigt oder ungesättigt, ver zweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁵¹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
p 0 oder 1 bedeutet.

Beispiele für Verbindungen, die als Mediatoren eingesetzt werden können, sind
N-Hydroxy-N-methyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-methyl-benzolsul fonsäure-amid, N-Hydroxy-N-methyl-p-toluolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-methyl-furan-2-carbonsäureamid, N-Hydroxy-N-methyl-thiophen-2-carbonsäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-phthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-isophthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-terephthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-benzol-1,3-disulfonsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-furan-3,4-dicarbonsäurediamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-benzolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-p-toluolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-furan-2-carbonsäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-thiophen-2-carbonsäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-phthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-isophthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-terephthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-benzol-1,3-disulfonsäuredi amid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-furan-3,4-dicarbonsäuredi amid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl benzolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-p-toluolsulfonsäure-amid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-furan-2-carbonsäureamid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-thiophen-2-carbonsäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dicyclohexyl-phthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dicyclohexyl-isophthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dicyclohexyl-terephthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dicyclohexyl-benzol-1,3-disulfonsäuredi amid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dicyclohexyl-furan-3,4-dicarbonsäure-di amid, N-Hydroxy-N-isopropyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-ben zol-sulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-p-toluol sulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-furan-2-carbonsäureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-thiophen-2-carbon-säureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-diisopropyl-phthalsäurediamid, N,N'-Dihy droxy-N,N'-diisopropyl-isophthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-diiso propyl-terephthal-säurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-diisopro pyl-benzol-1,3-disulfonsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-diisopro pyl-furan-3,4-dicarbonsäurediamid, N-Hydroxy-N-methyl-acetamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-acetamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-acetamid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-acetamid, N-Hydroxy-N-methyl-pivalinsäureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-pivalinsäureamid, N-Hydroxy-N-methyl-acryl amid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-acrylamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-acryla mid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-acrylamid, N-Hydroxy-N-methyl-methan sulfonamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-methansulfonamid, N-Hydroxy-N- isopropyl-methylcarbamat, N-Hydroxy-N-methyl-3-oxo-buttersäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di benzoyl-ethylendiamin, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl bernsteinsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-maleinsäurediamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-maleinsäuremonoamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-oxalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-phosphor-säurediamid.

Als Mediatoren werden bevorzugt Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe N-Hydroxy-N-methyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-methyl benzolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-methyl-p-toluolsul fon-säureamid, N-Hydroxy-N-methyl-furan-2-carbonsäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-phthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di methyl-terephthalsäurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dimethyl-benzol-1,3-disulfonsäurediamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-benzolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-p-toluolsulfonsäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-furan-2-carbonsäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-terephthalsäurediamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-benzoesäureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-p-to luolsulfon-säureamid, N-Hydroxy-N-isopropyl-furan-2-carbonsäureamid, N,N'-Dihydroxy- N,N'-diisopropyl-terephthal-säurediamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dii sopropyl-benzol-1,3-disulfonsäurediamid, N-Hydroxy-N-methyl-ace tamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-acetamid, N-Hydroxy-N-isopropyl acetamid, N-Hydroxy-N-cyclohexyl-acetamid, N-Hydroxy-N-methyl-pi valinsäureamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-acrylamid, N-Hydroxy-N-i sopropyl-acrylamid, N-Hydroxy-N-methyl-3-oxo-buttersäureamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-dibenzoyl-ethylendiamin, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-maleinsäurediamid, N-Hydroxy-N-tert.-butyl-maleinsäuremonoamid, N,N'-Dihydroxy-N,N'-di-tert.-butyl-oxalsäurediamid.

Der Mediator kann ferner ausgewählt sein aus der Gruppe der Oxime der allgemeinen Formel XXIII oder XXIV

sowie deren Salze, Ether, oder Ester, wobei
U gleich oder verschieden ist und O, S, oder NR⁵³ bedeuten, wobei
R⁵³ Wasserstoff-, Hydroxy-, Formyl-, Carbamoyl-, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphonooxyrest, Ester oder Salz des Phosphonooxyrests bedeutet,
wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino- und Phenylreste unsubstitu iert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁵⁴ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder unge sättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁵⁴ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁵⁴ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Carboxy rest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfono- Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest bedeutet und
die Reste R⁵⁵ und R⁵⁶ gleich oder verschieden sind und Halogen-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests bedeuten, oder die für R⁵³ genannten Bedeutungen haben, oder zu einem Ring [-CR⁵⁹R⁶⁰]_n mit n gleich 2, 3 oder 4 verknüpft sind und
R⁵⁷ und R⁵⁸ die für R⁵³ genannten Bedeutungen haben und
R⁵⁹ und R⁶⁰ gleich oder verschieden sind und Halogen-, Carboxy rest, Ester oder Salz des Carboxyrests bedeuten, oder die für R⁵³ genannten Bedeutungen haben.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind Verbindungen mit der all gemeinen Formel XXIII bei denen U O oder S bedeutet und die übri gen Reste die vorstehend genannten Bedeutungen haben. Ein Bei spiel für eine solche Verbindung ist 2-Hydroxyiminomalonsäure dimethylester.

Als Mediatoren weiterhin besonders bevorzugt sind Isonitrosoderi vate von cyclischen Ureiden der allgemeinen Formel XXIV. Beispie le für solche Verbindungen sind 1-Methylviolursäure, 1,3-Dimethylviolursäure, Thioviolursäure, Alloxan-4,5-dioxim.

Als Mediator insbesondere bevorzugt ist Alloxan-5-oxim Hydrat (Violursäure) und/oder dessen Ester, Ether oder Salze.

Der Mediator kann ferner ausgewählt sein aus der Gruppe vicinal nitrososubstituierter aromatischer Alkohole der allgemeinen For meln XXV oder XXVI

sowie deren Salze, Ether oder Ester, wobei
R⁶¹, R⁶², R⁶³ und R⁶⁴ gleich oder verschieden sind und Wasser stoff-, Halogen-, Hydroxy-, Formyl-, Carbamoyl-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Cyano, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphono-oxyrest, Ester oder Salz des Phosphonooxyrests bedeu ten,
wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino- und Phenylreste unsubstitu iert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁶⁵ substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder unge sättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁶⁵ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁶⁵ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Carboxy rest, Ester oder Salz des Carboxrests, Carbamoyl-, Sulfono-, Sul famoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest bedeutet oder
die Reste R⁶¹-R⁶⁴ paarweise zu einem Ring [-CR⁶⁶R⁶⁷-]_m verknüpft sind, wobei m ganzzahlig ist und einen Wert von 1 bis 4 bedeutet, oder zu einem Ring [-CR⁶⁸=CR⁶⁹-]_n verknüpft sind, wobei n ganz zahlig ist und einen Wert von 1 bis 3 bedeutet, und
R⁶⁶, R⁶⁷, R⁶⁸ und R⁶⁹ gleich oder verschieden sind und die für R⁶¹ bis R⁶⁴ genannten Bedeutungen haben.

Unter aromatischen Alkoholen sind vorzugsweise Phenole oder hö herkondensierte Derivate des Phenols zu verstehen.

Als Mediatoren bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel XXV oder XXVI, deren Synthese sich auf die Nitrosierung substitu ierter Phenole zurückführen läßt. Beispiele für solche Verbindun gen sind 2-Nitrosophenol, 3-Methyl-6-nitrosophenol, 2-Methyl-6-nitrosophenol, 4-Methyl-6-nitrosophenol, 3-Ethyl-6-nitrosophenol, 2-Ethyl-6-nitrosophenol, 4-Ethyl-6-nitrosophenol, 4-Isopropyl-6-nitrosophenol, 4-tert.butyl-6-nitrosophenol, 2-Phenyl-6-nitrosophenol, 2-Benzyl-6-nitrosophenol, 4-Benzyl-6-nitrosophenol, 2-Hydroxy-3-nitrosobenzylalkohol, 2-Hydroxy-3-nitrosobenzoesäure, 4-Hydroxy-3-nitrosobenzoesäure, 2-Methoxy-6-nitrosophenol, 3,4-Dimethyl-6-nitrosophenol, 2,4-Dimethyl-6-nitrosophenol, 3,5-Dimethyl-6-nitrosophenol, 2,5-Dimethyl-6-nitrosophenol, 2-Nitrosoresorcin, 4-Nitrosoresorcin, 2-Nitrosoorcin, 2-Nitrosophloroglucin und 4-Nitrosopyrogallol, 4-Nitroso-3-hydroxyanilin, 4-Nitro-2-nitrosophenol.

Als Mediatoren weiterhin bevorzugt sind o-Nitrosoderivate höher kondensierter aromatischer Alkohole. Beispiele für solche Verbin dungen sind 2-Nitroso-1-naphthol, 1-Methyl-3-nitroso-2-naphthol und 9-Hydroxy-10-nitroso-phenanthren.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind 1-Nitroso-2-naphthol, 1-Nitroso-2-naphthol-3,6-disulfonsäure, 2-Nitroso-1-naphthol-4-sulfonsäure, 2,4-Dinitroso-1,3-dihydroxybenzol sowie Ester, Ether oder Salze der genannten Verbindungen.

Der Mediator kann ferner ausgewählt sein aus der Gruppe Hydroxypyridine, Aminopyridine, Hydroxychinoline, Aminochinoline, Hydroxyisochinoline, Aminoisochinoline mit zu den Hydroxy- oder Aminogruppen ortho- oder para-ständigen Nitroso- oder Mercapto substituenten, Tautomere der genannten Verbindungen sowie deren Salze, Ether und Ester.

Bevorzugt sind als Mediatoren Verbindungen der allgemeinen Formel (XXVII), (XXVIII) oder (XXIX)

sowie Tautomere, Salze, Ether oder Ester der genannten Verbindun gen vorhanden, wobei in den Formeln XXVII, XXVIII oder XXIX zwei zueinander ortho- oder para- ständige Reste R⁷⁰ Hydroxy- und Ni trosorest oder Hydroxy- und Mercaptorest oder Nitrosorest und Aminorest bedeuten
und die übrigen Reste R⁷⁰ gleich oder verschieden sind und ausge wählt sind aus der Gruppe Wasserstoff-, Halogen-, Hydroxy-, Mer capto-, Formyl-, Cyano-, Carbamoyl-, Carboxyrest, Ester und Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester und Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Car bonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphono-oxyrest, Ester und Salz des Phosphonooxyrests und
wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino-, Mercapto- und Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁷¹ substi tuiert sein können und
die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkylreste gesättigt oder unge sättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁷¹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei R⁷¹ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfono-, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest oder C₁-C₅-Alkylcarbonylrest be deutet und je zwei Reste R⁷⁰ oder zwei Reste R⁷¹ oder R⁷⁰ und R⁷¹ paarweise über eine Brücke [-CR⁷²R⁷³-]_m mit m gleich 1, 2, 3 oder 4 ver knüpft sein können und
R⁷² und R⁷³ gleich oder verschieden sind und Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests,- Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest oder C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeuten und eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR⁷²R⁷³-] durch Sauerstoff, Schwefel oder einen ggf. mit C₁-C₅-Alkyl- substitu ierten Iminorest und zwei benachbarte Gruppen [-CR⁷²R⁷³-] durch eine Gruppe [-CR⁷²=R⁷³-] ersetzt sein können.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind Verbindungen der allge meinen Formel (XXVII) oder (XXVIII) sowie deren Tautomere, Salze, Ether oder Ester, wobei in den Formeln (XXVII) und (XXVIII) be sonders bevorzugt zwei zueinander ortho-ständige Reste R⁷⁰ Hydroxy- und Nitrosorest oder Hydroxy- und Mercaptorest oder Ni trosorest- und Aminorest bedeuten und
die übrigen Reste R⁷⁰ gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe Wasserstoff-, Hydroxy-, Mercapto-, Formyl-, Carbamoyl-, Carboxyrest, Ester und Salz des Carboxyrests, Sulfo norest, Ester und Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Ni troso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphono-oxyrest, Ester und Salz des Phosphonooxy rests wobei
Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino-, Mercapto- und Phenylreste unsub stituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁷¹ substituiert sein können und
die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁷¹ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei R⁷¹ die bereits genannten Bedeutungen hat und
je zwei Reste R⁷¹ paarweise über eine Brücke [-CR⁷²R⁷³-]_m mit m gleich 2, 3 oder 4 verknüpft sein können und
R⁷² und R⁷³ die bereits genannten Bedeutungen haben und eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR⁷²R⁷³-] durch Sauerstoff oder einen ggf. mit C₁-C₅-Alkyl- substituierten Imino rest ersetzt sein können.

Beispiele für Verbindungen, die als Mediatoren eingesetzt werden können, sind 2,6-Dihydroxy-3-nitrosopyridin, 2,3-Dihydroxy-4-nitrosopyridin, 2,6-Dihydroxy-3-nitrosopyridin-4-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-3-nitrosopyridin, 3-Hydroxy-2-mercaptopyridin, 2-Hydroxy-3-mercaptopyridin, 2,6-Diamino-3-nitrosopyridin, 2,6-Diamino-3-nitroso-pyridin-4-carbonsäure, 2-Hydroxy-3-nitrosopyridin, 3-Hydroxy-2-nitrosopyridin, 2-Mercapto-3-nitrosopyridin, 3-Mercapto-2-nitrosopyridin, 2-Amino-3-nitrosopyridin, 3-Amino-2-nitrosopyridin, 2,4-Dihydroxy-3-nitrosochinolin, 8-Hydroxy-5-nitrosochinolin, 2,3-Dihydroxy-4-nitrosochinolin, 3-Hydroxy-4-nitrosoisochinolin, 4-Hydroxy-3-nitrosoisochinolin, 8-Hydroxy-5-nitrosoisochinolin sowie Tautomere dieser Verbindungen.

Als Mediatoren sind bevorzugt 2,6-Dihydroxy-3-nitrosopyridin, 2,6-Diamino-3-nitrosopyridin, 2,6-Dihydroxy-3-nitrosopyridin-4-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-3-nitrosopyridin, 2-Hydroxy-3-mercaptopyridin, 2-Mercapto-3-pyridinol, 2,4-Dihydroxy-3-nitrosochinolin, 8-Hydroxy-5-nitrosochinolin, 2,3-Dihydroxy-4-nitrosochinolin so wie Tautomere dieser Verbindungen.

Der Mediator kann ferner aus der Gruppe stabiler Nitroxyl-Radika le (Nitroxide) ausgewählt sein, d. h. diese freien Radikale können in reiner Form erhalten, charakterisiert und aufbewahrt werden.

Bevorzugt werden dabei als Mediatoren Verbindungen der allgemei nen Formel (XXX), (XXXI) oder (XXXII) eingesetzt

wobei
Ar einbindiger homo- oder heteroaromatischer ein- oder zweikerni ger Rest bedeutet und
wobei dieser aromatische Rest durch einen oder mehrere, gleiche oder verschiedene Reste R⁷⁵, ausgewählt aus der Gruppe Halogen-, Formyl-, Cyano-, Carbamoyl-, Carboxy-, Ester oder Salz des Car boxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfa moyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-Alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphonooxyrest, Ester oder Salz des Phos phonooxyrests substituiert sein können und
wobei Phenyl-, Carbamoyl- und Sulfamoylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁷⁶ substituiert sein können, der Aminorest ein- oder zweifach mit R⁷⁶ substituiert sein kann und die Aryl-C₁-C₅-alkyl, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder ungesät tigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁷⁶ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei
R⁷⁶ ein- oder mehrfach vorhanden sein kann und gleich oder ver schieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfono-, Sulfamoyl-, Ni tro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und
R⁷⁴ gleich oder verschieden ist und Halogen-, Hydroxy-, Mercapto-, Formyl-, Cyano-, Carbamoyl-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sul famoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphono-oxyrest, Ester oder Salz des Phosphonooxy rests bedeutet
und R⁷⁴ im Fall bicyclischer stabiler Nitroxylradikale (Struktur XXXII) auch Wasserstoff bedeuten kann und
wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino-, Mercapto- und Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁷⁷ substi tuiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁷⁷ ein- oder mehrfach substituiert sein können, wobei R⁷⁷ gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Cyano-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfo no-, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino, Phenyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und
je zwei Reste R⁷⁶ oder R⁷⁷ paarweise über eine Brücke [-CR⁷⁸R⁷⁹-]_m mit m gleich 0, 1, 2, 3 oder 4 verknüpft sein können und
R⁷⁸ und R⁷⁹ gleich oder verschieden sind und Halogen-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Phenyl, Benzoyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest be deuten und
eine oder mehrere nicht benachbarte Gruppen [-CR⁷⁸R⁷⁹-] durch Sauer stoff, Schwefel oder einen ggf. mit C₁-C₅-Alkyl- substituierten Iminorest und zwei benachbarte Gruppen [-CR⁷⁸R⁷⁹-] durch eine Gruppe [-CR⁷⁸=CR⁷⁹-], [-CR⁷⁸=N-] oder [-CR⁷⁸=N(O)-] ersetzt sein können.

Als Mediatoren besonders bevorzugt sind Nitroxyl-Radikale der allgemeinen Formel (XXXIII) und (XXXIV)

wobei
R⁸⁰ gleich oder verschieden ist und Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl bedeutet
wobei Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit ei nem Rest R⁸² substituiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁸² ein- oder mehrfach substituiert sein können,
wobei R⁸² ein- oder mehrfach vorhanden sein kann und gleich oder verschieden ist und Hydroxy-, Formyl-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Carbamoyl-, Sulfono-, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino, Phenyl-, Benzoyl-, C₁-C₅-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxyrest, C₁-C₅-Alkylcarbonylrest bedeutet und
R⁸¹ gleich oder verschieden ist und Wasserstoff-, Hydroxy-, Mer capto-, Formyl-, Cyano-, Carbamoyl-, Carboxyrest, Ester oder Salz des Carboxyrests, Sulfonorest, Ester oder Salz des Sulfonorests, Sulfamoyl-, Nitro-, Nitroso-, Amino-, Phenyl-, Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-, Phospho-, Phosphono-, Phosphonooxyrest, Ester oder Salz des Phos phono-oxyrests bedeutet
wobei Carbamoyl-, Sulfamoyl-, Amino-, Mercapto- und Phenylreste unsubstituiert oder ein- oder mehrfach mit einem Rest R⁷⁶ substi tuiert sein können und die Aryl-C₁-C₅-alkyl-, C₁-C₁₂-Alkyl-, C₁-C₅-Alkoxy-, C₁-C₁₀-Carbonyl-, Carbonyl-C₁-C₆-alkyl-Reste gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und mit einem Rest R⁷⁶ ein- oder mehrfach substituiert sein können und eine [-CR⁸¹R⁸¹-]-Gruppe durch Sauerstoff, einen ggf. mit C₁-C₅-Alkyl substituierten Iminorest, einen (Hydroxy)iminorest, eine Car bonylfunktion oder eine ggf. mit R⁷⁶ mono- oder disubstituierten Vinylidenfunktion ersetzt sein kann und
zwei benachbarte Gruppen [-CR⁸¹R⁸¹-] durch eine Gruppe [-CR⁸¹=CR⁸¹-] oder [-CR⁸¹=N-] oder [-CR⁸¹=N(O)-] ersetzt sein können.

Beispiele für Verbindungen, die als Mediatoren eingesetzt werden können, sind
2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin-1-oxyl (TEMPO), 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Oxo-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Acetamido-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-(Ethoxyfluorphosphinyloxy)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl 4-(Isothiocyanato)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Maleimido-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-(4-Nitrobenzoyloxy)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-(Phosphonooxy)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Cyano-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 3-Carbamoyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrrolin-1-oxyl, 4-Phenyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazolin-3-oxid-1-oxyl, 4-Carbamoyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazolin-3-oxid-1-oxyl, 4-Phenacyliden-2,2,5,5-tetramethyl-imidazolidin-1-oxyl, 3-(Aminomethyl)-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin-N-oxyl, 3-Carbamoyl-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin-N-oxyl, 3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin-N-oxyl, 3-Cyano-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin-N-oxyl, 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin-N-oxyl, 3-(4-Nitrophenoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-pyrrolidin-N-oxyl.

Als Mediatoren werden bevorzugt
2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin-1-oxyl (TEMPO), 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Oxo-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Acetamido-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-(Isothiocyanato)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Maleimido-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-(4-Nitrobenzoyloxy)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-(Phosphonooxy)-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 4-Cyano-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl, 3-Carbamoyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrrolin-1-oxyl, 4-Phenyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazolin-3-oxid-1-oxyl, 4-Carbamoyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-imidazolin-3-oxid-1-oxyl, 4-Phenacyliden-2,2,5,5-tetramethyl-imidazolidin-1-oxyl.

Als Mediatoren insbesondere bevorzugt sind 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin-1-oxyl (TEMPO), und 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl.

Die Vermeidung eines schädlichen Mediatoreinflusses aus das Ge samtsystem kann auch dadurch erreicht werden, daß eine Hydrolase der Enzymklasse 3.2.1 verwendet wird, welche gegenüber einer Mo difikation durch aktivierten Mediator keine für die beschriebene Verwendung nachteilige Änderung ihrer enzymatischen Eigenschaften zeigt (z. B. eine Mediator-resistente Xylanase oder Zellulase).

Das erfindungsgemäße Mehrkomponentensystem umfaßt mindestens ein enzymatisch wirksames Additiv, ausgewählt aus der Gruppe der Hy drolasen der Enzymklasse 3.2.1.

Bevorzugt handelt es sich bei der Hydrolase der Enzymklasse 3.2.1 um Hemizellulasen, z. B. Xylanasen, Mannanasen oder Zellulasen.

Inbesondere bevorzugt handelt es sich bei dem enzymatisch wirksa men Additiv um eine Endo 1,4-β-Xylanase (Enzymklasse 3.2.1.8) und/oder eine Endo 1,4-β-Glucanase (Enzymklasse 3.2.1.4).

Die Hydrolase der Enzymklasse 3.2.1 sind käuflich erhältlich oder lassen sich nach Standardverfahren gewinnen. Die Hydrolasen der Enzymklasse 3.2.1 können entweder aus den natürlichen Organismen gewonnen werden oder mittels bekannter rekombinanter DNA-Techno logie in geeigneten Expressionssystemen produziert und entspre chend dem Stand der Technik aus dem Kulturmedium isoliert werden. Als Organismen zur Produktion dieser Enzyme kommen beispielsweise Pflanzen, tierische Zellen, Bakterien und Pilze in Betracht. Grundsätzlich können sowohl natürlich vorkommende als auch gen technisch veränderte Organismen Enzymproduzenten sein. Ebenso sind Teile von einzelligen oder mehrzelligen Organismen als En zymproduzenten denkbar, vor allem Zellkulturen.

Die Hydrolasen der Enzymklasse 3.2.1 können auch durch bekannte molekularbiologische Verfahren in einer Weise verändert worden sein, daß sie für die beschriebene Anwendung geeignet sind, z. B. dadurch, daß sie gegenüber dem aktivierten Mediator oder einer proteolytischen Aktivität unempfindlich gemacht wurden.

Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Delignifizierung von ligninhaltigen Materialien, die dadurch gekennzeichnet sind, daß mindestens eine Oxidoreduktase und mindestens ein für die Oxido reduktase geeignetes Oxidationsmittel und mindestens ein Mediator, der ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe der Oxidore duktasen und Hydrolasen der Enzymklasse 3.2.1., nicht inaktiviert und mindestens eine Endohydrolase gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge mit einer wäßrigen Suspension des ligninhaltigen Ma terials mischt.

Überraschenderweise gelingt es im erfindungsgemäßen Verfahren, das oxidative Delignifiziersystem aus Laccase und einer Mediator substanz mit einem hydrolytischen Enzym, wie z. B. der Xylanase und/oder der Zellulase in einem einzigen Verfahrensschritt zu kombinieren.

Dies ist um so überraschender, als bekannt ist, daß bei Verwen dung von HBT als Mediator die Laccase selbst in ihrer Aktivität beeinträchtigt wird (Amann, 1997) und gleichzeitig anwesende En zyme irreversibel geschädigt werden und damit stark verringerte Aktivität zeigen (Oksanen 1997).

Das erfindungsgemäße Verfahren hat folgende Vorteile:

- Es verbessert die Bleichbarkeit von Zellstoff
- es läßt sich unproblematisch mit etablierten chemischen Verfah rensstufen kombinieren.

Beispielsweise auch in Kombination mit üblichen Verfahrensschrit ten aus der Zellstoffherstellung, z. B. einer alkalischen Extrak tion, läßt sich Lignin selektiv aus dem eingesetzten Material entfernen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise ligninhal tiges Material pflanzlichen Ursprungs verwendet, vorzugsweise solches, welches mit den für die Holzstoff- oder Zellstoffher stellung üblichen Verfahren aufgeschlossen wurde.

Das eingesetzte Material kann ungebleichter Zellstoff oder Mate rial sein, welches bereits mit chemischen Delignifizier- und Bleichverfahren behandelt worden ist.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise 0,1-100 IU Oxidoreduktase pro g ligninhaltiges Material (Trockengewicht), besonders bevorzugt 0,5-20 IU pro g ligninhaltiges Material eingesetzt.

Die Konzentration des Oxidationsmittels liegt vorzugsweise im Be reich von 0,001 bis 50 mmol/l. Wenn als Oxidationsmittel Was serstoffperoxid eingesetzt wird, so vorzugsweise im Bereich von 0,001-25 mmol/l.

Der Mediator wird vorzugsweise eingesetzt in Mengen von
1-500 mmol/kg Zellstoff, besonders bevorzugt in Mengen von
5-300 mmol/kg Zellstoff, insbesondere in Mengen von
10-200 mmol/kg Zellstoff (atro - absolut trocken).

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise Zellulasen und/oder Hemizellulasen als enzymatische Additive verwendet. Bei spielsweise können Zellulase, Xylanasen oder Mannanasen in reiner Form oder in Form von Mischungen verwendet werden. Xylanasen wer den bereits in der Bearbeitung von Zellstoffen verwendet und von mehreren Herstellern, z. B. Novo-Nordisk (Pulpzyme®), Clariant (Cartazyme®) angeboten. Zellulasen sind ebenfalls käuflich er hältlich.

Je nach den Bedingungen, welche in dem erfindungsgemäßen Verfah ren für die enzymatische Delignifizierung eingestellt werden, können entsprechend gut geeignete Varianten (pH-Optimum, Tempera turstabilität) dieser Enzyme verwendet werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Hydrolase der Enzym klasse 3.2.1 in Dosierungen von 0,01-1000 IU Enzym/g Zellstoff verwendet, bevorzugt in Dosierungen von 1-500 IU Enzym/g, be sonders bevorzugt in Dosierungen von 5-100 IU/g Zellstoff (atro - absolut trocken).

Hemizellulasen werden vorzugsweise in Dosierungen von 0,1-1000 IU Enzym/g Zellstoff verwendet, bevorzugt in Dosierungen von 1-500 IU Enzym/g, besonders bevorzugt in Dosierungen von 5-100 IU/g Zellstoff (atro - absolut trocken) eingesetzt.

Zellulasen werden vorzugsweise in Dosierungen von 0,01-500 IU Enzym/g Zellstoff verwendet, bevorzugt 0,05-100 IU Enzym/g Zellstoff, besonders bevorzugt 0,1-10 IU Enzym/g Zellstoff ein gesetzt.

Üblicherweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei Temperatu ren zwischen 40 und 90°C, bevorzugt zwischen 45 und 70°C, beson ders bevorzugt zwischen 45 und 65°C durchgeführt.

Je nach Temperaturstabilität der verwendeten Enzyme können auch davon unterschiedliche optimale Reaktionsbedingungen eingestellt werden. Generell lassen sich im pH-Bereich von pH 3 - pH 10 gute Delignifizierergebnisse erzielen, besonderes bevorzugt ist der pH-Bereich von pH 4,5-7.

Bei Verwendung von Laccasen ist die ausreichende Verfügbarkeit von gelöstem Sauerstoff eine notwendige Bedingung. Je nach ge wählter Temperatur kann die ausreichende Sauerstoffkonzentration durch Anlegen eines genügend hohen Drucks an das System gewähr leistet werden. Der notwendige Sauerstoffpartialdruck kann entwe der bereits durch den hydrostatischen Druck gewährleistet sein oder durch Anlegen eines geeigneten Drucks mittels eines geeigneten, sauerstoffhaltigen Gasgemisches, wie z. B. Luft oder auch reines Sauerstoffgas, erreicht werden.

Der übliche Druckbereich liegt im Bereich eines Sauerstoff-Par tialdrucks (pO₂) von 0,1-20 bar, bevorzugt im Druckbereich von 0,3-10 bar.

Je nach Wahl des Mediators, der Enzymdosierungen und der Reakti onsbedingungen kann das Verfahren unterschiedlich schnell ablau fen. Die übliche Reaktionsdauer beträgt zwischen 30 min. und 2 Stunden.

Die Zellstoffkonzentration (Stoffdichte) des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt üblicherweise im Bereich von 1-25%, bevorzugt im Bereich 6-20%, besonders bevorzugt im Bereich 10-15%.

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung weiter be schrieben.

Folgende Komponenten werden in den Beispielen eingesetzt:

Mediatoren:
Mediatoren wurden von den Firmen Aldrich, Merck oder Janssen be zogen oder nach üblichen und allgemein bekannten Verfahren herge stellt. Einige Mediatoren werden im Text wie folgt mit Abkürzun gen bezeichnet: 1-OH-Benzotriazol (HBT), Violursäure (Vio), N-OH-Acetanilid (NHA).

Enzyme:
Laccase:
Fermentativ gewonnene Laccase aus Trametes versicolor wurde ver wendet.

Aktivitätsbestimmung:
Laccaseaktivität wird über die Oxidation von 2,2'-Azino-bis-(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonate), ABTS, Boehringer Mannheim, unter aeroben Bedingungen bestimmt. Die grüne Farbe, welche durch die enzymatische Reaktion entsteht, wird photometrisch bei 420 nm gemessen. Die Reaktionstemperatur beträgt 25°C, der pH 4,5. Eine Laccase-Unit ist die Menge an Enzym, welche die Konversion von 1 mol ABTS/min unter den angegebenen Bedingungen katalysiert. Zur Berechnung des Umsatzes wird ein Extinktionskoeffizient von 36 000 M⁻¹cm⁻¹ verwendet.

Zellulase:
verwendet wurden kommerziell erhältliche Zellulasen der Firmen Fluka (Trichoderma viride), Sigma (Aspergillus niger, Trichoder ma viride, Penicillium funiculosum), Röhm (Rohalase 7069). Die Dosierung erfolgte entsprechend den Aktivitätsangaben der Her steller.

Xylanase:
Verwendet wurden kommerziell erhältliche Xylanasen der Firmen Fluka (Trichoderma viride) oder Clariant. Die Dosierung erfolgte entsprechend den Aktivitätsangaben der Hersteller.

Zellstoffe:
Verwendet wurden Hardwood (HW) und Softwood (SW) Kraft Zellstof fe.
Softwood: Kappa 14,5 (nach Extraktion)
Hardwood: Kappa 12 (nach Extraktion).

Die Bewertung der Delignifizierung erfolgte durch Bestimmung des Kappa-Werts (nach TAPPI Methode T236) der behandelten Zellstoff probe nach alkalischer Extraktion. Die alkalische Extraktion (E-Stufe) erfolgte bei 2% Stoffdichte, 60°C mit 80 g NaOH/kg Zell stoff und einer Dauer von 60 min.

Beispiel 1 Vergleich der Delignifizierung eines SW-Zellstoffes mit einem Laccase-Mediator System (LMS®) bei gleichzeitiger Anwesenheit/Ab wesenheit von Xylanase

In einem 500 ml Laborautoklaven wurde nachfolgend tabellarisch beschriebener Ansatz zwei Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter Anlegen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (L-Stufe).

L-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 5 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 9 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt eines enzymatischen Additivs, wie z. B. der Xylanase, zu bestimmen, wurde der beschriebenen L-Stufe als weiterer Zusatz Xylanase von Trichoderma viride (Fluka) zugegeben (XL-Stufe), so daß der Ansatz wie folgt zusammengesetzt war:

(XL)-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 5 IU/g Zellstoff
Xylanase: 50 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 9 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Beide Ansätze wurden anschließend 60 min. lang alkalisch extra hiert (E-Stufe).

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte wurde der Grad der Delignifi zierung bestimmt. Der Kontrollwert gibt den Kappa-Wert des Aus gangszellstoffs nach alkalischer Extraktion an.

Tabelle 1

Versuchsauswertung

Der Zusatz von Xylanase steigert die Delignifizierung um ca. 30%.

Beispiel 2 Vergleich der Delignifizierung eines HW-Zellstoffs mit einem Lac case-Mediator System (LMS®) bei gleichzeitiger Anwesenheit/Abwe senheit von Xylanase

Das Beispiel entspricht dem Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß anstelle von Softwood- ein Hardwood-Zellstoff verwendet wurde. In einem 500 ml-Laborautoklaven wurde nachfolgend tabellarisch beschriebener Ansatz zwei Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter Anlegen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (L-Stufe).

L-Stufe

5 g Hardwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 5 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 9 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt eines enzymatischen Additivs, wie z. B. der Xylanase, zu bestimmen, wurde der beschriebenen L-Stufe als weiterer Zusatz Xylanase von Trichoderma viride (Fluka) zugegeben (XL-Sufe), so daß der Ansatz wie folgt zusammengesetzt war:

(XL)-Stufe

5 g Hardwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 5 IU/g Zellstoff
Xylanase: 50 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 9 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Die Ansätze wurden anschließend 60 min. lang alkalisch extrahiert (E-Stufe).

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Tabelle 2

Versuchsauswertung

Der Zusatz von Xylanase steigert die Delignifizierung um ca. 96%.

Beispiel 3 Einfluß verschiedener Xylanasen auf die Delignifizierung eines Zellstoffs mit einem Laccase-Mediator System (LMS®)

Um die Auswirkungen des Zusatzes von unterschiedlichen Xylanasen zu untersuchen, wurde die Delignifizierungswirkung entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen (XL)-Stufe bei Verwendung unter schiedlicher Xylanasen untersucht. Als Xylanasen wurden verwen det:
Fa. Clariant : Cartazym HS 10, liquid
Fa. Fluka: Trichoderma viride Xylanase.

L und (XL)-Stufe wurden entsprechend Beispiel 1 durchgeführt, je doch wurden die Ansätze bei pH 6,0 gefahren. Die Xylanasedosie rung betrug jeweils 12 IU/g Zellstoff, Laccase wurde mit 15 IU/g Zellstoff dosiert.

Die Ansätze wurden anschließend 60 min. lang alkalisch extrahiert (E-Stufe, Beispiel 1). Aus der Bestimmung der Kappa-Werte wurde der Grad der Delignifizierung bestimmt.

Tabelle 3

Ergebnisse

Um eine optimale Delignifizierung zu erzielen, müssen die jeweils besten Kombinationen von Zellstoff, LMS und Xylanase ermittelt werden. Verschiedene Xylanasen führen, wie das Beispiel zeigt, zu unterschiedlich guten Delignifizierungen.

Alle Ergebnisse sind jedoch besser als ohne Xylanase.

Beispiel 4 Mediatorabhängigkeit der Delignifizierung mit einem Laccase-Me diator-System (LMS®) bei gleichzeitiger Anwesenheit von Xylanase

Um den Einfluß des Mediators auf das System zu bestimmen, wurde die Delignifizierungswirkung der in Beispiel 1 beschriebenen (XL)-Stufe bei Verwendung unterschiedlicher Mediatoren unter sucht.

Als Mediatoren wurden verwendet (Abkürzungen in Klammern):
1-OH-Benzotriazol (HBT), Violursäure (Vio), N-OH-Acetanilid (NHA), N-OH-Phthalimid (HPI), 1-Nitroso-2-naphthol-3,6-disulfonsäure Dinatriumsalz Hydrat (1-NNS), 2-Nitroso-1-naphthol-4-sulfönsäure Tetrahydrat (2-NNS).

Die Ansätze wurden wie in Beispiel 1 durchführt. Im einzelnen enthielten sie:

(XL)-Stufe (Mediatorabhängigkeit)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Xylanase (Trichoderma): 25 IU/g Zellstoff
Mediatoren: 75 mmol/kg Zellstoff
pH-Wert: 6,0
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Die Ansätze wurden anschließend 60 min. lang alkalisch extrahiert (E-Stufe), wie in Beispiel 1 beschrieben.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte wurde der Grad der Delignifi zierung (Delig.) bestimmt. Der Kontrollwert gibt den Kappa-Wert des Ausgangszellstoffs nach alkalischer Extraktion an.

Tabelle 4

Versuchsauswertung

Der Xylanase-Effekt hängt stark vom verwendeten Mediator ab. Wäh rend sich die Delignifizierung bei Verwendung von 1-OH-Benzotriazol (HBT) fast nicht steigern läßt (+5%), können mit anderen Mediatoren signifikante Steigerungen beobachtet wer den (Bsp. NHA +17,8%).

Beispiel 5 pH-Abhängigkeit der Delignifizierung eines Zellstoffs mit einem Laccase-Mediator-System (LMS®) bei gleichzeitiger Anwesenheit von Xylanase

Um den Einfluß des pH-Werts auf das System zu bestimmen, wurde die Delignifizierungswirkung der in Beispiel 1 beschriebenen (XL)-Stufe bei unterschiedlichen pH-Werten untersucht. Als Ver gleich dienten entsprechende Ansätze ohne Xyl 20236 00070 552 001000280000000200012000285912012500040 0002019804583 00004 20117anase (L-Stufe). Die Ansätze wurden wie in Beispiel 1 durchführt. Im einzelnen ent hielten sie:

(XL)-Stufe-(pH-Abhängigkeit)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)-Kappa 14,5
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Xylanase (Trichoderma viride): 25 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 9 mg/g Zellstoff
pH-Werte: 4/5/6/7 (mit McIllvaine Puffer)
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte wurde der Grad der Delignifi zierung bestimmt.

Tabelle 5

Versuchsauswertung

Durch den Zusatz von Xylanase zum Laccase-Mediator System kann eine drastische Verbesserung der Performance erzielt werden. Der Effekt zeigt eine deutliche pH-Abhängigkeit. Bei allen pH-Werten ist jedoch durch den Zusatz von Xylanase eine Verbesserung zu er reichen.

Beispiel 6 Abhängigkeit der Delignifizierung eines Zellstoffs mit einem Lac case-Mediator-System (LMS®) bei gleichzeitiger Anwesenheit unter schiedlicher Menge Xylanase (Dosisabhängigkeit)

Um den Einfluß der Xylanase-Dosierung auf das System zu bestim men, wurde die Delignifizierungswirkung der in Beispiel 1 be schriebenen (XL)-Stufe bei unterschiedlichen Xylanase-Dosierungen untersucht. Als Vergleich diente ein entsprechender Ansatz ohne Xylanase (L-Stufe). Die Ansätze wurden wie in Beispiel 1 durch führt. Im einzelnen enthielten sie:

L-Stufe (Referenzwert ohne Xylanase)

(XL)-Stufe-(versch. Xylanase-Mengen)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)-Kappa 14,5
Stoffdichte: 10%
Laccase: 5 IU/g Zellstoff
Xylanase (Trichoderma viride): 12,5/25/37,5/50/100/200 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 11 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Nach der Inkubation wurden die Ansätze 60 min. lang alkalisch ex trahiert (E-Stufe).

Tabelle 6

Versuchsauswertung

Die Verbesserung der Effektivität des Laccase-Mediator-Systems ist abhängig von der zugegebenen Dosis an Xylanase.

Beispiel 7 Delignifizierung eines SW-Zellstoffs mit einem Laccase-Mediator System (LMS®) welches als Additiv Zellulase enthält

In einem 500 ml Laborautoklaven wurde nachfolgend tabellarisch beschriebener Referenzansatz 2 Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter Anlegen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (L-Stufe).

L-Stufe (Vergleichsversuch)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt eines enzymatischen Additivs, wie z. B. der Zellulase, zu bestimmen, wurde einem der L-Stufe entsprechen den Ansatz als weiterer Zusatz Zellulase von Trichoderma viride (Sigma) zugegeben (CL-Sufe), so daß der Ansatz wie folgt zusam mengesetzt war:

(CL)-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase: 10 U/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Beide Ansätze wurden anschließend 60 min lang alkalisch extra hiert (E-Stufe).

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte beider Ansätze wurde der Grad der Delignifizierung bestimmt. Der Kontrollwert gibt den Kappa-Wert des Ausgangszellstoffs nach alkalischer Extraktion an.

Tabelle 7

Versuchsauswertung

Der Zusatz von Zellulase steigert die Delignifizierung eines Softwood Zellstoffs gegenüber einer Zellulase freien Referenz um um 43%.

Beispiel 8 Delignifizierung eines HW-Zellstoffs mit einem Laccase-Mediator System (LMS®) welches als Additiv Zellulase enthält

L-Stufe (Vergleichsversuch)

5 g Hardwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt eines enzymatischen Additivs, wie z. B. der Zellulase, zu bestimmen, wurde einem der L-Stufe entspre chenden Ansatz als weiterer Zusatz Zellulase von Trichoderma vi ride (Sigma) zugegeben (CL-Sufe), so daß der Ansatz wie folgt zu sammengesetzt war:

(CL)-Stufe

5 g Hardwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase: 10 U/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 4,5
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Tabelle 8

Versuchsauswertung

Der Zusatz von Zellulase steigert die Delignifizierung eines Hardwood Zellstoffs gegenüber einer zellulasefreien Referenz um 108%.

Beispiel 9 Beeinflussung des Zellulaseaktivität durch das Laccase-Mediator System (LMS®) bei Verwendung unterschiedlicher Mediatoren

Ein Effekt auf die Delignifizierbarkeit von Zellstoff kann nur dann beobachtet werden, wenn die Zellulase in Gegenwart des Lac case-Mediator Systems enzymatisch aktiv ist. Die Aktivität von Zellulasen wurde daher in einem zellstofffreien System, welches Laccase und Mediator enthielt, gemessen. Untersucht wurde Zellu lase aus Aspergillus niger und Trichoderma viride. Als Mediatoren wurden 1-OH-Benzotriazol (HBT), Violursäure (Vio) und N-OH-Ace tanilid (NHA) verwendet.

Die Messung des Zellulaseaktivität erfolgte in einem optischen Test mit Dinitrosalicylsäure (DNSA) als Oxidationsmittel wie nachstehend beschrieben.

Ansätze

Die Ansätze enthielten in einem Gesamtvolumen von 10 ml 20 mg Zellulase, 0,8 mg Laccase und 75 µmol Mediator bei einem pH-Wert von 6,2. Dem Ansatz wurden nach unterschiedlichen Zeiten je 50 µl entnommen und die Zellulaseaktivität bestimmt

Zellulasetest

Prinzip: Bestimmung der Menge an reduzierendem Zucker, welche durch die enzymatische Hydrolyse aus Carboxymethylzellulose (CMC) freigesetzt wird. Eine nachgeschaltete Redoxreaktion zwischen zu gesetztem DNSA und den enzymatisch gebildeten reduzierenden Zuckerenden führt zu einer Färbung der Lösung, welche photometrisch bei 595 nm quantifiziert werden kann.

Für den Enzymtest werden 325 µl Testpuffer (0,1 mol/l Citrat/Phosphat pH 6,2 mit 0,4 mol/l NaCl), 125 µl CMC-Lösung (2% in Testpuffer; Na-Salz) und 50 µl der zu testenden zellulasehaltigen Lösung zusammenpipettiert und bei 45°C unterschiedlich lang inku biert. Nach Ablauf der Inkubation werden jedem Ansatz 750 µl DNSA-Lösung (1 g 3,5-Dinitrosalicylsäure, 0,2 g Phenol, 0,05 g Na₂SO₃ und 20 g NaK-Tartrat in 100 ml 1%iger NaOH lösen) zugege ben und die Mischung anschließend 20 min bei 95°C erhitzt. Die Lösung wird auf Eis abgekühlt, eventuell ausfallendes Material abzentrifugiert (2 min, 14 000 rpm, Eppendorf Zentrifuge) und im Überstand die Extinktion bei 595 nm bestimmt. Durch Vergleich mit einer Eichkurve (Glucose) kann die Bildung reduzierender Zucker quantifiziert werden. Als 1 Unit (1U) wird dabei diejenige En zymaktivität bezeichnet, welch in einer Minute 1 µmol Glucose un ter den angegebenen Bedingungen aus CMC-Zellulose freisetzt.

Tabelle 9

Zeitabhängigkeit der Zellulaseaktivität von Aspergillus niger in Gegenwart des Laccase-Mediator Systems bei Verwendung verschiede ner Mediatoren (HBT, NHA, Vio). Die Zahlen geben die relative Zellulaseaktivität in Prozent des Ausgangswerts an (rel. %).

Tabelle 10

Zeitabhängigkeit der Zellulaseaktivität von Trichoderma viride in Gegenwart des Laccase-Mediator Systems bei Verwendung ver schiedener Mediatoren (HBT, NHA, Vio). Die Zahlen geben die rela tive Zellulaseaktivität in Prozent des Ausgangswerts an (rel. %).

Die enzymatische Aktivität der Zellulasen aus A. niger und T. viride nimmt bei gleichzeitiger Inkubation im Laccase-Mediator System ab. Die geringsten Einbußen findet man mit NHA als Media tor. Eine Abhängigkeit vom verwendeten Enzym ist ebenfalls zu be obachten.

Beispiel 10 Delignifizierung eines SW-Zellstoffs mit einem Laccase-Mediator System (LMS®) welches als Additiv Zellulase unterschiedlicher Herkunft enthält

L-Stufe (Vergleichsversuch)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: je nach Zellulase pH 5-6 (Tabelle)
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt eines enzymatischen Additivs, wie z. B. der Zellulase, zu bestimmen, wurde einem der L-Stufe entspre chenden Ansatz als weiterer Zusatz Zellulase unterschiedlicher zugegeben (CL-Sufe), so daß der Ansatz wie folgt zusammengesetzt war:

(CL)-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase (versch. Herkunft): 10 U/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: je nach Zellulase pH 5-6 (Tabelle 11)
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Tabelle 11 Versuchsauswertung

Verbesserung der Delignifizierung mit dem Laccase-Mediator System bei gleichzeitiger Anwesenheit von Zellulasen unterschiedlicher Herkunft.

Mit allen verwendeten Zellulase kann die Delignifizierleistung des Laccase-Mediator-Systems verbessert werden.

Beispiel 11 Einfluß der Zellulasedosis auf die Delignifizierung mittels eines Laccase-Mediator Systems (LMS®) welches als Additiv Zellu lase enthält

In einem 500 ml Laborautoklaven wurde nachfolgend tabellarisch beschriebener Referenzansatz 2 Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter Anlegen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (L-Stufe)

L-Stufe (Vergleichsversuch)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: pH 6
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt des enzymatischen Additivs (Zellulase) zu bestimmen, wurde einem der L-Stufe entsprechenden Ansatz als weiterer Zusatz verschiedene Mengen an Zellulase zugegeben (CL-Stufe), so daß der Ansatz wie folgt zusammengesetzt war:

(CL)-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase (Trichoderma viride-Sigma) 0-30 U/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert 6
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte beider Ansätze wurde der Grad der Delignifizierung bestimmt. Der Kontrollwert gibt den Kappa-Wert des Ausgangszellstoffs nach alkalischer Extraktion an. Um den Einfluß der kombinierten Behandlung auf die Zellulose zu un tersuchen wurden die Viskosität der Zellstoffproben untersucht. Die Viskositätsbestimmung erfolgt entsprechend den Vorschriften nach TAPPI. Die Angabe der Viskosität erfolgt in ml/g.

Tabelle 12 Versuchsauswertung

Einfluß der Zellulasedosis auf Delignifizierung und Viskosität von Zellstoff (SW; K 16,6) bei Verwendung einer zellulasehaltigen Sequenz (CL) E.

Durch Erhöhung der Zellulasedosis läßt sich bis zu einem Bereich von 9 U/g Zellstoff eine Verbesserung der Delignifizierbarkeit erzielen. Bei weiterer Erhöhung der Dosis wird keine Verbesserung mehr erreicht. Die Viskosität des Zellstoffs bleibt bis zu einer Dosierung von ca. 3 U/g nahezu konstant. Bei weiterer Dosiserhö hung tritt ein deutlicher Verlust an Viskosität auf. Bei geeig neter Dosierung (3 U/g im Beispiel) läßt sich der positive Zellu laseeffekt für eine Verbesserung der Delignifizierung verwenden ohne daß bereits eine Schädigung der Faser (Viskositätsabfall) auftritt.

Beispiel 12 Einfluß des pH-Wertes auf die Delignifizierung mittels eines Laccase-Mediator Systems (LMS®) welches als Additiv Zellulase enthält

Um den Einfluß des pH-Wert s zu demonstrieren wurde die Delignifi zierung in Ansätzen bei verschiedenen pH-Werten verglichen. In einem 500 ml Laborautoklaven wurde nachfolgend tabellarisch be schriebener Ansatz 2 Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter An legen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (CL-Stufe).

(CL)-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase aus Trichoderma viride (Sigma): 2,5 U/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Werte: 4, 5, 6, 7, 8
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Nach der Inkubation wurden die Ansätze 60 min lang alkalisch ex trahiert (E-Stufe).

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte der in diesem System deligni fizierten Zellstoffe wurde der Grad der Delignifizierung be stimmt.

Tabelle 13

pH-Abhängigkeit der Delignifizierung mit einem Laccase Mediator System, welches als Additiv Zellulase enthält (Zellstoff hat nach E-Stufe Kappa 16,6)

Die Tabelle 13 zeigt, daß das Laccase-Mediator System, welches als Zusatz Zellulase enthält, ein deutliches pH-Profil mit einem Optimum für die gewählten Komponenten im Bereich von pH 6 in der Delignifizierung zeigt.

Beispiel 13 Einfluß des Mediators auf die Delignifizierung mittels eines Laccase-Mediator Systems (LMS®) welches als Additiv Zellulase enthält

In 500 ml Laborautoklaven wurden nachfolgend tabellarisch beschriebene Referenzansätze 2 Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter Anlegen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (L-Stufe).

L-Stufe (Vergleichsversuch)

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 6,0
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

(CL)-Stufe

5 g Softwood-Zellstoff (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase: 2,5 U/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 6,0
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte wurde der Grad der Delignifi zierung bestimmt. Der Ausgangszellstoffs hatte einen Kappawert von 16,6 nach alkalischer Extraktion.

Tabelle 14

Delignifizierung (rel. %) mit dem Laccase Mediator System, welches als Additiv Zellulase enthält im Vergleich zu einem zellulase freien System.

Der Zusatz von Zellullase steigert die Delignifizierung eines Softwood Zellstoffs gegenüber einer Zellulase freien Referenz in Gegenwart aller verwendeter Mediatoren.

Beispiel 14 Delignifizierung verschiedener Zellstoffe mit einem Laccase-Me diator System (LMS®) welches als Additiv Zellulase und Xylanase enthält

In 500 ml Laborautoklaven wurden nachfolgend tabellarisch be schriebene Referenzansätze 2 Stunden lang bei 45°C (Wasserbad) unter Anlegen eines Sauerstoffpartialdrucks von 10 bar inkubiert (L-Stufe).

L-Stufe (Vergleichsversuch)

5 g verschiedene Zellstoffe (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 6,0
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Um den positiven Effekt mehrerer gleichzeitiger enzymatischer Ad ditiven, wie z. B. der Zellulase und der Xylanase, zu bestimmen, wurde der L-Stufe entsprechenden Ansätzen als weiterer Zusatz Zellulase von Trichoderma viride (Sigma) und Xylanase zugegeben (CLX-Sufe), so daß die Ansätze wie folgt zusammengesetzt waren:

(LXC)-Stufe

5 g verschiedene Zellstoffe (atro)
Stoffdichte: 10%
Laccase: 15 IU/g Zellstoff
Zellulase: 0,1 U/g Zellstoff
Xylanase: 2,0 U/g
Mediator: N-OH-Acetanilid: 10 mg/g Zellstoff
pH-Wert: 6,0
Gesamtflüssigkeitsvolumen: 50 ml.

Alle Ansätze wurden nach der Inkubation 60 min lang alkalisch ex trahiert (E-Stufe).

E-Stufe

2% Stoffdichte
Temperatur: 60°C
Alkali: 80 g NaOH/kg Zellstoff.

Aus der Bestimmung der Kappa-Werte wurde der Grad der Delignifi zierung bestimmt. Verglichen wurden die erreichbaren Delignifi zierungsgrade (rel. %) einer Behandlung mit Laccase/Mediator (LE) (Vergleichsversuch) mit der Behandlung mit Laccase/Me diator/Zellulase/Xylanase (LXC)E.

Tabelle 15

Vergleich von Delignifizierungen eines mit Zellulase und Xylanase Zusatz versehenen Laccase Mediator Systems - Sequenz (LXC)E - mit dem zusatzfreien System - Sequenz LE -. Getestet wurden verschiedene Zellstoffe.

Bei allen Zellstoffen kann eine deutliche Steigerung der Deligni fizierung mittels Laccase Mediator System durch den gleichzeiti gen Zusatz von Zellulase und Xylanase erzielt werden.

Claims

1. Mehrkomponentensystem zum Verändern, Abbau oder Bleichen von Lignin, ligninhaltigen Materialien oder ähnlichen Stoffen, enthaltend eine Oxidoreduktase und ein für die Oxidoreduktase geeignetes Oxidationsmittel und einen Mediator und mindestens ein enzymatisch wirksames Additiv, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator die Oxidoreduktase und das enzymatisch wirk same Additiv nicht inaktiviert und das enzymatisch wirksame Additiv aus der Gruppe der Hydrolasen der Enzymklasse 3.2.1. ausgewählt ist.

2. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß der Mediator aus der Gruppe der aliphatischen, cy cloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Verbin dungen ausgewählt ist, die mindestens eine N-Hxdroxy-, Oxim-, Nitroso-, N-Oxyl- oder N-Oxi Funktion enthalten, wobei sub stituierte oder nichtsubstituierte 1-Hydroxy-1-benzotriazole, 3H-Benzotriazol-1-oxide und 2H-Benzotriazol-1-oxide ausgenom men sind.

3. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß der Mediator aus der Gruppe der Verbindungen gemäß Formeln I bis XXXIV der Beschreibung ausgewählt ist.

4. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das enzymatisch wirksame Additiv aus der Gruppe der Xylanasen, Mannanasen und Zellulasen ausgewählt ist.

5. Mehrkomponentensystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich net, daß es sich bei dem enzymatisch wirksamen Additiv um ei ne Endo 1,4-β-Xylanase (Enzymklasse 3.2.1.8) und/oder Endo 1,4-β-Glucanase (Enzymklasse 3.2.1.4) handelt.

6. Mehrkomponentensystem nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidoreduktase eine Laccase eingesetzt wird.

7. Verfahren zur Delignifizierung von ligninhaltigen Materiali en, die dadurch gekennzeichnet sind, daß mindestens eine Oxidoreduktase und mindestens ein für die Oxidoreduktase ge eignetes Oxidationsmittel und mindestens ein Mediator der ein Enzym, ausgewählt aus der Gruppe der Oxidoreduktasen und Hy drolasen der Enzymklasse 3.2.1., nicht inaktiviert und minde stens eine Endohydrolase gleichzeitig oder in beliebiger Rei henfolge mit einer wäßrigen Suspension des ligninhaltigen Materials mischt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß 0,1-100 IU Oxidoreduktase pro g ligninhaltiges Material (Trocken gewicht) eingesetzt werden.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator in Mengen von 1-500 mmol/kg Zellstoff ein gesetzt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolase der Enzymklasse 3.2.1. in Dosierungen von 0,01-1000 IU Enzym/g Zellstoff eingesetzt wird.