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DE19801090A1 - Device for isolating of microorganisms from cell-containing fluids using standard syringes - Google Patents

Device for isolating of microorganisms from cell-containing fluids using standard syringes

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DE19801090A1
DE19801090A1 DE19801090A DE19801090A DE19801090A1 DE 19801090 A1 DE19801090 A1 DE 19801090A1 DE 19801090 A DE19801090 A DE 19801090A DE 19801090 A DE19801090 A DE 19801090A DE 19801090 A1 DE19801090 A1 DE 19801090A1
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DE
Germany
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microorganisms
filtration
cell
liquid
filtered
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DE19801090A
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Inventor
Gerhard Haase
Uwe Bales
Norbert Schnitzler
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Original Assignee
Individual
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

A device for isolating microorganisms from cell-containing samples, e.g. blood, is new.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung entsprechend dem Oberbegriff des Anspruchs 1.The invention relates to a device according to the preamble of Claim 1.

Zur Isolierung von Mikroorganismen aus Flüssigkeiten werden verschiedene Verfahren eingesetzt. US-Patent Nr. 4.212.948 (hergestellt von Whampole Laboratories, Cranburry, NJ, USA als Isolator® 10) zeigt beispielsweise ein System, in welchem durch eine Lyse von Blutzellen von diesen vorher aufgenommene Mikroorganismen freigesetzt werden, die dann anschließend kulturell nachgewiesen werden können. Andere Verfahren stellen mikrobielles Wachstum in Flüssigkulturen aufgrund von Stoffwechselaktivitäten automatisch über entsprechende Indikatorsysteme fest (z. B. BacT/Alert®, Organon Teknika Corporation, Eppelheim, Deutschland).Various are used to isolate microorganisms from liquids Process used. U.S. Patent No. 4,212,948 (manufactured by Whampole Laboratories, Cranburry, NJ, USA as Isolator® 10) shows, for example System in which by lysis of blood cells of these previously microorganisms are released, which are then subsequently can be culturally proven. Other methods pose microbial Growth in liquid cultures due to metabolic activities automatically via appropriate indicator systems (e.g. BacT / Alert®, Organon Teknika Corporation, Eppelheim, Germany).

Nachteile der bisherigen Verfahren sind zum einen die fehlende Trennung der Mikroorganismen von Blutzell-Trümmern oder im Verfahren angewandten Substanzen (z. B. US-Pat Nr. 4.212.948), welche sich besonders bei einem anschließenden molekularbiologischen Nachweisverfahren wie der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) störend auswirken, bzw. zum anderen die langen Kulturzeiten und damit verbundenen langen Nachweiszeiten beim automatisierten oder konventionellen kulturellen Nachweisverfahren.Disadvantages of the previous methods are the lack of separation of the Microorganisms from blood cell debris or used in the process Substances (e.g. US Pat. No. 4,212,948) which are particularly found in one  subsequent molecular biological detection methods such as the polymerase Chain reaction (PCR) have a disruptive effect, or the long ones Culture times and the associated long detection times at automated or conventional cultural verification processes.

Aufgabe der Erfindung ist eine schnelle und einfache Isolierung von Mikroorganismen aus zellhaltigen Flüssigkeiten.The object of the invention is a quick and easy isolation of Microorganisms from cell-containing liquids.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.This object is achieved by a device with the features of the claim 1 solved.

Die Lyse von Zellen, welche Mikroorganismen enthalten können, ist ein äußerst sensitives Verfahren zum Nachweis dieser Mikroorganismen in zellhaltigen und flüssigen Proben (z. B. Blut). Die Art und Weise der beschriebenen Lyse ermöglicht eine anschließende Filtration dieser zellhaltigen Probeflüssigkeit, und die beschriebene Filtrationsprozedur gewährleistet eine sehr hohe Rückhaltequote der nachzuweisenden Mikroorganismen.The lysis of cells that can contain microorganisms is extremely sensitive method for the detection of these microorganisms in cell - containing and liquid samples (e.g. blood). The way of the described lysis enables a subsequent filtration of this cell-containing sample liquid, and the described filtration procedure ensures a very high one Retention rate of the microorganisms to be detected.

Fakultativ kann der Nachweis von abfiltrierten Mikroorganismen unmittelbar nach der Filtration durch mikroskopische Betrachtung des Filters ggf. nach vorheriger Anfärbung erfolgen. Dies stellt damit eine extreme zeitliche Beschleunigung des Nachweises dar, welche angesichts der lebensbedrohlichen Erkrankung von entscheidender Bedeutung für die Therapie des Patienten ist. Diese Filter können nach der Mikroskopie auch weiter für molekulargenetische bzw. kulturelle Nachweisverfahren benutzt werden.Optionally, the detection of filtered microorganisms can be done immediately after filtration by microscopic examination of the filter if necessary prior staining. This represents an extreme temporal Acceleration of the proof, which in view of the life-threatening Disease is critical to patient therapy. After microscopy, these filters can also be used for molecular genetics or cultural verification procedures are used.

Die beschriebene Prozedur beeinträchtigt nicht die Lebensfähigkeit und somit auch nicht die Kultivierbarkeit der nachzuweisenden Mikroorganismen. Die so isolierten und anschließend kulturell angezüchteten Mikroorganismen können dann mittels etablierter Standardverfahren identifiziert und bezüglich ihrer Empfindlichkeit gegenüber Chemotherapeutika getestet werden. Der besondere Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht dabei in der nahezu vollständigen Entfernung aller bei diesen Nachweisverfahren störenden Stoffen (z. B. Blutzelldebris, welcher das Koloniewachstum maskiert; antimikrobielle Substanzen aus der Probeflüssigkeit, die das Wachstum unterdrücken). Außerdem wird dadurch die unmittelbare Verwendung der kultivierten Mikroorganismen für Identifikationsverfahren (z. B. Gaschromatographie, molekulargenetische Identifizierung mittels speziesspezifischer Gensondenhybridisierung) ermöglicht, die ansonsten nur nach einer weiteren Subkultivierung der Mikroorganismen (wegen der dadurch sich ergebenden Entfernung von störenden Begleitsubstanzen) dafür eingesetzt werden können. Dies resultiert in einer zeitlichen Beschleunigung der Diagnostik.The procedure described does not affect viability and thus nor the cultivability of the microorganisms to be detected. The so isolated and then cultured microorganisms then identified using established standard procedures and related to them Sensitivity to chemotherapy drugs are tested. The special one The advantage of the described method is that it is almost complete  Removal of all substances interfering with these detection methods (e.g. Blood cell debris masking colony growth; antimicrobial Substances from the sample liquid that suppress growth). It also makes the immediate use of the cultivated Microorganisms for identification procedures (e.g. gas chromatography, molecular genetic identification using species-specific Gene probe hybridization), which otherwise only after another Subcultivation of the microorganisms (because of the resulting Removal of interfering accompanying substances) can be used for this. This results in accelerated diagnostics.

Alternativ zu dem konventionellen kulturellen Nachweisverfahren können die mit der beschriebenen Prozedur abfiltrierten Mikroorganismen auch direkt (d. h. ohne vorherige kulturelle Vermehrung) auf dem Filter mittels moderner molekularbiologischer Nachweisverfahren (z. B. mittels markierter Antikörper) oder entsprechender molekulargenetischer Nachweisverfahren (z. B. mittels Gensondenhybridisierung) ggf. nach vorheriger in-vitro Amplifikation (z. B. mittels PCR) sichtbar gemacht werden und auch identifiziert werden. Der besondere Vorteil des beschriebenen Verfahrens besteht dabei wiederum in der nahezu vollständigen Entfernung aller bei diesen Nachweisverfahren störenden Stoffen (z. B. Hämoglobin bei der PCR u. LCR [Ligase-Kettenreaktion]). Dies ist ansonsten nur durch aufwendige Prozeduren zu bewerkstelligen, die immer mit einem Verlust von Mikroorganismen einhergehen und deshalb die Nachweissensitivität herabsetzen.As an alternative to the conventional cultural verification procedure, the microorganisms filtered off using the described procedure also directly (i.e. without prior cultural propagation) on the filter using modern molecular biological detection methods (e.g. using labeled antibodies) or corresponding molecular genetic detection methods (e.g. using Gene probe hybridization) if necessary after prior in vitro amplification (e.g. be made visible by means of PCR) and also identified. Of the The particular advantage of the described method is again that almost complete removal of all interfering with these detection methods Substances (e.g. hemoglobin in PCR and LCR [ligase chain reaction]). This is otherwise only possible through complex procedures that always with a loss of microorganisms and therefore the Reduce detection sensitivity.

Es ist bei der beschriebenen Prozedur von Vorteil, daß die Isolierung von nachzuweisenden Mikroorganismen sehr schnell, sensitiv und preiswert (u. a. durch Verwendung von Standard-Probeentnahme-Systemen) durchgeführt werden kann.It is advantageous in the procedure described that the isolation of Microorganisms to be detected very quickly, sensitively and inexpensively (including by using standard sampling systems) can be.

Beispielbeschreibung zur PatentanmeldungExample description for patent application

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.An embodiment of the invention is shown in the drawing and is described in more detail below.

Fig. 1 Probe mit Patientenblut in einem Standard-Blutentnahme-Röhrchen. (Beispielsweise 4 ml S-Monovette KE®, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland). Fig. 1 sample with patient blood in a standard blood collection tube. (For example 4 ml S-Monovette KE®, Sarstedt, Nümbrecht, Germany).

Fig. 2 Vorgelöstes Reagenz zum Lysieren von Blutzellen wird mittels einer kleinen Spritze (a: Vol. ca. 1 ml) über zwei Adapter (b1: Multi-Adapter, Sarstedt; b2: Luer-Lock weibl. / Luer-Lock weibl. Adapter, Rometsch GmbH, Heilbronn, Deutschland) der Blutprobe zugefügt. Durch die beiden zwischengeschalteten Adapter erreicht man eine Zugabe des Reagenzes in einem geschlossenen System und gewährleistet damit eine kontaminationsfreie Bearbeitung der Untersuchungsprobe. Fig. 2 Predissolved reagent for the lysing of blood cells is by means of a small syringe (a: Vol. Approx. 1 ml) over two adapters (b1: multi-adapter, Sarstedt; b2: Luer-Lock female / Luer-Lock female adapter , Rometsch GmbH, Heilbronn, Germany) was added to the blood sample. The two interposed adapters allow the reagent to be added in a closed system, thus ensuring contamination-free processing of the test sample.

Fig. 3 Über die bereits beschriebenen Adapter (Fig. 2: b1, b2) wird die dann durch das hinzugefügte Lysereagenz lysierte Blutprobe in eine größere Spritze (c: Volumen 20 ml oder größer) überführt, in welcher sich bereits eine Elektrolyt- Lösung (d) befindet. Diese dient zur Vorverdünnung der lysierten Blutprobe und erleichtert die anschließende Filtration. Fig. 3 Using the adapters already described ( Fig. 2: b1, b2), the blood sample then lysed by the added lysis reagent is transferred to a larger syringe (c: volume 20 ml or larger) in which an electrolyte solution ( d) located. This serves to pre-dilute the lysed blood sample and simplifies the subsequent filtration.

Fig. 4 Auf die beschriebene großvolumige Spritze (Fig. 3: c), welche die lysierte und vorverdünnte Blutprobe enthält, ist ein Spritzenfilterhalter (e: beispielsweise aus V4A-Stahl, 13 mm Durchmesser, Costar GmbH, Bodenheim, Deutschland) mit darin vorher steril eingesetztem Filter (beispielsweise Polycarbonat- Membran, 13 mm Durchmesser, Costar GmbH) aufgesetzt. Fig. 4 On the described large-volume syringe ( Fig. 3: c), which contains the lysed and prediluted blood sample, there is a syringe filter holder (e: for example made of V4A steel, 13 mm diameter, Costar GmbH, Bodenheim, Germany) with it beforehand sterile filter (for example polycarbonate membrane, 13 mm diameter, Costar GmbH) placed.

Fig. 5 Metallscheibe mit rasterartig angeordneten Bohrungen, welche bei der Filtration als Unterstützungsplatte unter der Filterscheibe liegt. Dadurch sammelt sich strömungsbedingt mehr abfiltriertes Material (z. B. nachzuweisende Mikrooganismen, zugesetzter inerter Farbstoff) dort auf der Filterscheibe an, wo sich die Bohrungen der Unterstützungsplatte befinden. Auf diese Weise wird auf der Filterscheibe eine dem Lochmuster der Unterstützungsplatte korrespondierende rasterartige Orientierungshilfe (Farbstoff) erzeugt, die z. B. eine mikroskopische oder fluoreszenzmikroskopische Betrachtung der Filterscheibe ggf. unter Zuhilfenahme von automatisierten Bilderkennungsvorrichtungen stark erleichtert. Fig. 5 metal disc with holes arranged in a grid pattern, which lies in the filtration as a support plate under the filter disc. As a result of the flow, more filtered material (e.g. microorganisms to be detected, added inert dye) collects on the filter disc where the holes in the support plate are located. In this way, a grid-like orientation aid (dye) corresponding to the hole pattern of the support plate is generated on the filter disk, which, for. B. a microscopic or fluorescence microscopic examination of the filter disk, possibly with the aid of automated image recognition devices greatly facilitated.

Fig. 6 Filterscheibe mit rasterartig angeordnetem abfiltriertem Material aus einer lysierten Blutprobe. Diese Filterscheibe kann nun mikroskopisch betrachtet werden und/oder sie kann molekularbiologischen Nachweisverfahren zugeführt werden (z. B. in situ Hybridisierung ggf. nach vorhergehender in-vitro Amplifikation [PCR, LCR]). Weiterhin können aus der Blutprobe abfiltrierte Mikroorganismen auf dem Filter kulturell angezüchtet werden. So gewonnenes Zellmaterial der Mikroorganismen kann der gaschromatographischen oder konventionellen Spezies-Bestimmung zugeführt werden. Außerdem kann die Empfindlichkeit der angezüchteten Mikroorganismen gegenüber Antibiotika bestimmt werden. Fig. 6 filter disc with a grid-like filtered material from a lysed blood sample. This filter disc can now be viewed microscopically and / or it can be added to molecular biological detection methods (eg in situ hybridization, if necessary after previous in vitro amplification [PCR, LCR]). Furthermore, microorganisms filtered from the blood sample can be cultured on the filter. Cell material of the microorganisms obtained in this way can be fed to gas chromatography or conventional species determination. The sensitivity of the cultured microorganisms to antibiotics can also be determined.

Claims (10)

1. Vorrichtung zum Isolieren von Mikroorganismen aus zellhaltigen Flüssigkeiten, wie z. B. Blut dadurch gekennzeichnet, daß Proben der Flüssigkeit in Standard-Entnahme-Systeme (z. B. S-Monovetten® KE, Sarstedt) entnommen werden können.1. Device for isolating microorganisms from cell-containing liquids, such as. B. blood, characterized in that samples of the liquid can be taken in standard withdrawal systems (z. B. S-Monovetten® KE, Sarstedt). 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen in der Flüssigkeit zunächst lysiert werden und die dadurch aus ihnen freigesetzten bzw. sich frei in der Flüssigkeit befindlichen Mikroorganismen anschließend durch Filtration isoliert werden.2. Device according to claim 1, characterized in that cells in the Liquid are first lysed and the resultant release from them or microorganisms freely located in the liquid then be isolated by filtration. 3. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz zur Durchführung der Lyse ein Detergenz, z. B. 3-(3-Cholomidopropyl)-dimethylammonio-1- propansulfonat (CHAPS), eingesetzt wird.3. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that as a reagent for performing the lysis Detergent, e.g. B. 3- (3-Cholomidopropyl) dimethylammonio-1- propane sulfonate (CHAPS), is used. 4. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Verdünnen der lysierten Probe von Patientenmaterial vor der Filtration eine Elektrolyt-Lösung, z. B. Ringerlösung, verwendet wird.4. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that for diluting the lysed sample of Patient material before filtration an electrolyte solution, e.g. B. Ringer's solution is used. 5. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse- und Filtrationsprozedur die Vitalität und damit den kulturellen Nachweis der abzufiltrierenden Mikroorganismen nicht beeinträchtigt. 5. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized that the lysis and filtration procedure the vitality and thus the cultural evidence of the microorganisms to be filtered not affected.   6. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mikroskopisch betrachtbare Filter, z. B. Polycarbonat- Membranen Durchmesser 13 mm, verwendet werden.6. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that microscopic filters, e.g. B. polycarbonate Membranes with a diameter of 13 mm can be used. 7. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß während der Filtration unter dem Filtermedium eine perforierte Unterstützungslochplatte liegt, welche auf dem Filtermedium eine rasterartige Orientierungshilfe erzeugt.7. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that during the filtration under the filter medium perforated support perforated plate, which lies on the filter medium generates a grid-like orientation aid. 8. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Filtration eine Anfärbung der abfiltrierten Mikroorganismen erfolgt, beispielsweise zum erleichterten Auffinden der Mikroorganismen bei mikroskopischer Betrachtung des Filters unter Auflicht-Fluoreszenz.8. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that following the filtration a staining of the filtered microorganisms, for example to facilitate Finding the microorganisms under a microscopic view of the Filters under reflected light fluorescence. 9. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die abfiltrierten Mikroorganismen auf dem Filter mikroskopisch, molekularbiologisch, und/oder kulturell nachgewiesen bzw. identifiziert werden können.9. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the filtered microorganisms on the filter microscopically, molecular biologically, and / or culturally proven or can be identified. 10. Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Filtrationsdruck manuell, mit mechanischen Hilfsmitteln, mittels Zentrifugation, mittels Unter-/Überdruck oder osmotisch erzeugt wird und somit die Filtration der lysierten zellhaltigen Probeflüssigkeit ermöglicht.10. Device according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the filtration pressure is manual, with mechanical Aids, by means of centrifugation, by means of negative / positive pressure or is generated osmotically and thus the filtration of the lysed cell-containing Sample liquid enables.
DE19801090A 1998-01-14 1998-01-14 Device for isolating of microorganisms from cell-containing fluids using standard syringes Withdrawn DE19801090A1 (en)

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