DE19756499C2

DE19756499C2 - microcapsules

Info

Publication number: DE19756499C2
Application number: DE19756499A
Authority: DE
Inventors: Andreas Eberle; Holger Huebner; Rainer Buchholz; Mathias Schroedter
Original assignee: ALPHA-BIOVERFAHRENSTECHNIK GmbH; ALPHA BIOVERFAHRENSTECHNIK GMB
Current assignee: Siegfried Finance Ag Zofingen Ch
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2003-03-20
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: DE19756499A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikrokapseln mit ei ner Membranhülle, wie sie z. B. zur Immobilisierung von Biokatalysatoren verwendet werden.The present invention relates to microcapsules with egg ner membrane envelope, as z. B. for the immobilization of Biocatalysts are used.

Ein Schwerpunkt biotechnischer Forschung ist die Ent wicklung und Applikation von Immobilisierungsmethoden. Unter Immobilisierung versteht man die chemische und/ oder physikalische Bindung von wasserlöslichen Biokataly satoren an einen wasserunlöslichen Träger oder den Ein schluß in eine wasserunlösliche Gelmatrix oder Mikrokap sel, unter Erhaltung der enzymatischen Aktivität. Als immo bilisierte Biokatalysatoren werden alle Arten von enzyma tisch aktivem Material bezeichnet wie Mikroorganismen, isolierte Enzyme, Zellorganellen, pflanzliche und tierische Zellen oder Zellgewebe. Sie werden in analytischen, dia gnostischen und industriellen Verfahren eingesetzt.One focus of biotechnological research is Ent development and application of immobilization methods. Immobilization means chemical and / or physical binding of water-soluble biocataly sensors on a water-insoluble carrier or on in a water-insoluble gel matrix or microcap sel, while maintaining the enzymatic activity. As immo bilized biocatalysts are all types of enzyma table active material like microorganisms, isolated enzymes, cell organelles, vegetable and animal Cells or cell tissue. They are analytical, dia Gnostic and industrial processes.

Es gibt keine universellen Träger. Nur wenn die Anwen dung eines biologischen Systems definiert ist, können die passenden Träger, die Immobilisierungsmethode und die Reaktorform ausgewählt werden, um eine optimale Einsatz möglichkeit zu erreichen. Bei der Mikroverkapselung und dem Einschluß in eine Matrix wird der Reaktionsraum durch eine semipermeable Polymermembran begrenzt, die gut substrat- und produktdurchlässig ist; aber völlig un durchlässig für das verkapselte Material. Um dies eindeutig zu gewährleisten, muß die Trenngrenze "cut-off" der Mem bran bekannt sein. Unter der Trenngrenze versteht man die Ausschlußgrenze für ein Makromolekül bestimmter Größe, bedingt durch den Porendurchmesser der Membran. Die Höhe der Ausschlußgrenze wird in g/mol, der molaren Masse des Moleküls, welches nicht mehr durch die Mem bran diffundieren kann, angegeben. Die Membran der NaCS/PDADMAC Mikrokapseln (NaCS = Natriumcellulo sesulfat; PDADMAC = Polydialylldimethylammonium chlorid - s. u.) ist nur für niedermolekulare Stoffe (kleiner als ca. 5500 g/mol) durchlässig und kann nicht durch die Veränderung der Konzentration eines Reaktionspartners oder der Membranbildungszeit im Reaktionsbad variiert werden, wie es bei den Alginat-Polylysine-Kapseln möglich ist.There are no universal carriers. Only if the users a biological system is defined, the suitable carrier, the immobilization method and the Reactor shape can be selected for optimal use opportunity to achieve. In microencapsulation and the inclusion in a matrix becomes the reaction space bounded by a semi-permeable polymer membrane that is well permeable to substrates and products; but completely un permeable to the encapsulated material. To make this clear To ensure the cut-off of the mem be known. The separation limit is the Exclusion limit for a macromolecule of a certain size, due to the pore diameter of the membrane. The The exclusion limit is given in g / mol, the molar Mass of the molecule that is no longer covered by the mem bran can diffuse. The membrane of the NaCS / PDADMAC microcapsules (NaCS = sodium cellulo sesulfat; PDADMAC = polydialylldimethylammonium chloride - s. u.) is only for low molecular weight substances (smaller than approx. 5500 g / mol) permeable and cannot Change in the concentration of a reaction partner or the membrane formation time in the reaction bath varies as is possible with alginate-polylysine capsules is.

Bei der Immobilisierung in Mikrokapseln werden die Biokatalysatoren durch eine Membran eingeschlossen. Be sondere Kennzeichen dieser Mikroverkapselung sind eine bestimmte und gleichmäßige Form der Kapsel, höhere me chanische und chemische Beständigkeit als Vollkugeln und ein sehr geringer Verlust an Biokatalysatoren. Die geforder ten Eigenschaften der gewählten Ausgangsstoffe sind:
When immobilized in microcapsules, the biocatalysts are enclosed by a membrane. Special features of this microencapsulation are a certain and uniform shape of the capsule, higher mechanical and chemical resistance than solid balls and a very low loss of biocatalysts. The required properties of the selected starting materials are:

Formation of a hydrophilic permeable membrane,
- Biocompatibility regarding the biolo used material;
- good physical and chemical resistance and
- slight capsule formation.

Die Mikrokapseln (oder Mikrohohlkugeln) werden mit einer Vertropfungsapparatur hergestellt, die aus einer ko axialen Doppelkapillardüse besteht. Durch die Mantelkapil lare wird der Polyelektrolyt und durch die Kernkapillare ein biologisches Material, z. B. Biokatalysatoren in Suspension, in ein Reaktionsbad mit geeigneten Vernetzerionen ver tropft. An der Seite kann Luft oder eine Flüssigkeit einge blasen werden, wenn eine Änderung der Kapselgröße er wünscht ist. So kann der Durchmesser der Kapseln zwi schen 0,5 mm und 8 mm variiert werden. Für das NaCS/ PDADAMAC Verkapselungssystem (vgl. DD-219 795 A1, DD-274 051) wird eine NaCS-Lösung durch die Mantelka pillare in ein Reaktionsbad mit einer PDADMAC-Lösung vertropft. Die Tropfenbildung erfolgt anhand der schemati schen Darstellung in Abb. 1.The microcapsules (or hollow microspheres) are produced with a dropletizer, which consists of a coaxial double capillary nozzle. Through the Mantelkapil lare the polyelectrolyte and through the core capillary a biological material, for. B. biocatalysts in suspension, drips ver in a reaction bath with suitable crosslinking ions. Air or a liquid can be blown in on the side if a change in the capsule size is desired. The diameter of the capsules can be varied between 0.5 mm and 8 mm. For the NaCS / PDADAMAC encapsulation system (cf. DD-219 795 A1, DD-274 051), a NaCS solution is dripped through the jacket capillary into a reaction bath with a PDADMAC solution. The drop formation is based on the schematic representation in Fig. 1.

Der Tropfen hängt mit der Kapillarkraft F_K an der Kapil lare, bis er unter seiner eigenen Schwere abreißt. Die Ge wichtskraft F_G ist kurz vor dem Abreißen gleich der Kapil larkraft F_K. Die Kapillarkraft hängt von der Oberflächen spannung der NaCS-Lösung und dem Durchmesser der Mantelkapillare ab. Zur Verringerung der Tropfendurch messer kann der Kapillardurchmesser verringert werden, eine oberflächenaktive Substanz in die NaCS-Lösung ge mischt werden oder dem System ein Luftstrom L in axialer Richtung aufgeprägt werden. Im letzten Fall liegt dann ein Gleichgewicht zwischen Kapillarkraft und der Summe von Windwiderstandskraft und Gewichtskraft vor. Die Tropfen größe hängt außerdem vom Durchsatz der Biokatalysatorlö sung, von der Viskosität der tropfenbildenden Lösung sowie von der Viskosität, Dichte und Oberflächenspannung des Reaktionsbades und der Fallstrecke ab. Die kugelförmige Gestalt der Flüssigkeitstropfen wird durch die Tendenz der Flüssigkeit, ihre Oberfläche so klein wie möglich zu halten, bedingt.The drop hangs on the capillary with the capillary force F _K until it tears off under its own weight. The weight force F _G is equal to the capillary force F _K shortly before tearing off. The capillary force depends on the surface tension of the NaCS solution and the diameter of the jacket capillary. To reduce the drop diameter, the capillary diameter can be reduced, a surface-active substance can be mixed into the NaCS solution or an air flow L can be applied to the system in the axial direction. In the latter case, there is a balance between capillary force and the sum of wind resistance and weight. The drop size also depends on the throughput of the biocatalyst solution, on the viscosity of the drop-forming solution and on the viscosity, density and surface tension of the reaction bath and the drop distance. The spherical shape of the liquid drops is caused by the tendency of the liquid to keep its surface area as small as possible.

Die Membranaufbaureaktion findet im bewegten Reakti onsbad statt. Dies beruht auf der Bildung von Polyelektro lytkomplexen, die durch die Reaktion von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten entstehen. Das Polyanion ist in diesem System NaCS, ein Derivat der Cellulose, das bei der Umsetzung mit Schwefelsäure entsteht. Die NaCS-Lösung ist die tropfenbildende Lösung. Das Polykation ist PDAD MAC. Die PDADMAC-Lösung ist das Reaktionsbad und beinhaltet die Vernetzerionen für die Tropfen.The membrane build-up reaction takes place in the moving reactor onsbad instead. This is due to the formation of polyelectro lytkomplexen by the reaction of opposite charged polyelectrolytes arise. The polyanion is in this system NaCS, a derivative of cellulose that is used in the Reaction with sulfuric acid occurs. The NaCS solution is the drop-forming solution. The polycation is PDAD MAC. The PDADMAC solution is the reaction bath and contains the cross-linking ions for the drops.

Bei der Polyelektrolytkomplexreaktion bilden sich Hohl kugeln, da die Vernetzung der Polymere von außen nach in nen erfolgt. Mit fortschreitender Reaktion verzögert sich das Wachstum der Membranstärke infolge Verarmung des Kap selinneren an reaktiver Komponente und wachsendem Dif fusionswiderstand. Es bilden sich asymmetrische Membra nen, deren trennaktive Schicht außen liegt. Durch Zusatz von geringen Mengen an NaCS in das Reaktionsbad erreicht man infolge der Abschirmung ionischer Gruppen eine loc kere Fällungsstruktur, höhere Wandstärken und eine erhöhte Kapselstabilität. Als Maß für die mechanische Stabilität der Kapseln wird die Kraft angegeben, die nötig ist, um die Kapseln zu zerstören. Mit diesem Verfahren können Mikro kapseln mit einer Wandstärke von 20 bis 100 µm und einer maximalen Stabilität von 3 bis 5 N gebildet werden.Cavities form in the polyelectrolyte complex reaction spheres because the crosslinking of the polymers from the outside to the inside NEN. This slows down as the reaction progresses Growth of membrane thickness due to depletion of the chap inside of reactive component and growing dif fusion resistance. Asymmetrical membra are formed nen, the separating active layer is on the outside. By addition achieved by small amounts of NaCS in the reaction bath if a loc kere precipitation structure, higher wall thicknesses and an increased Capsule stability. As a measure of the mechanical stability of the Capsules are given the force necessary to achieve the Destroy capsules. With this procedure micro capsules with a wall thickness of 20 to 100 µm and a maximum stability of 3 to 5 N can be formed.

In Abb. 2 sind die Polymerstrukturen des NaCS und des PDADMAC dargestellt. Das NaCS besitzt als negativen Elektrolyten eine Sulfat-Seitengruppe, das PDADMAC eine Stickstoff-Seitengruppe als positiven Elektrolyten. Diese reagieren im Reaktionsbad durch Bildung von Ionenbrüc kenbindungen unter Abspaltung von NaCS. Durch die Re aktion der beiden Polymerelektrolyten bildet sich eine stark vernetzte NaCS/PDADMAC-Membran, die nicht wasser löslich und nicht löslich in organischen Lösungsmitteln ist. Der Einfluß des pH-Wertes auf die Membran ist gering. Weiterhin können anorganische Salze die Membran nicht zerstören. Sie ist nicht licht- oder wärmeempfindlich und weist eine hohe mechanische Stabilität auf. Immobilisiert werden können Proteine (Enzyme und Hormone), Zellorga nellen (Mikrosomen), Antikörper (anti-TPO), Mikroorga nismen (z. B. Pilze und Bakterien), Säugerzellen (Hybri doma) und Zellgewebe (z. B. Langerhanssche Inseln). Fig. 2 shows the polymer structures of NaCS and PDADMAC. The NaCS has a sulfate side group as the negative electrolyte, the PDADMAC has a nitrogen side group as the positive electrolyte. These react in the reaction bath by forming ion bridge bonds with the elimination of NaCS. The reaction of the two polymer electrolytes forms a strongly cross-linked NaCS / PDADMAC membrane, which is insoluble in water and insoluble in organic solvents. The influence of the pH on the membrane is slight. Furthermore, inorganic salts cannot destroy the membrane. It is not sensitive to light or heat and has high mechanical stability. Proteins (enzymes and hormones), cell organisms (microsomes), antibodies (anti-TPO), microorganisms (e.g. fungi and bacteria), mammalian cells (hybri doma) and cell tissue (e.g. Langerhans islands) can be immobilized. ,

Die Attraktivität in der Mikroverkapselung von Biokata lysatoren liegt in der einfachen Trennung des verkapselten biologischen Materials vom Produkt. bzw. umgebenden Me dium und ihrer Wiederverwendbarkeit, was besonders bei teuren Enzymen und aufwendiger oder produktschädigen der Aufarbeitung einen großen Vorteil bietet. Die Polyelektrolytkomplexe sind zudem mechanisch stabiler als der Ein schluß in eine Gelmatrix und bieten zusätzlich die Sicher heit, daß keine Enzyme oder Zellen in den extrazellulären Raum gelangen können. Sie bilden durch die Membran eine der natürlichen Zelle nachempfundene Umgebung. Dadurch ist ein Schutz vor Temperatur und pH-Wert Änderungen ge geben. Ein weiterer Vorteil ist die Wiederverwendbarkeit der Katalysatoren und die Möglichkeit einer kontinuierli chen Prozeßführung. Die NaCS/PDADMAC Mikrokapseln sind biokompatibel.The attractiveness in the microencapsulation of biocata lysators lies in the simple separation of the encapsulated biological material from the product. or surrounding me dium and its reusability, which is particularly important for expensive enzymes and more complex or product-damaging processing offers a great advantage. The polyelectrolyte complexes are also mechanically more stable than the one conclude in a gel matrix and additionally offer the safety that no enzymes or cells in the extracellular Space. They form one through the membrane environment modeled on the natural cell. Thereby is a protection against temperature and pH changes give. Another advantage is the reusability of the catalysts and the possibility of a continuous Chen litigation. The NaCS / PDADMAC microcapsules are biocompatible.

Werden Enzyme in Mikrokapseln immobilisiert, wird die Kinetik der enzymatischen Reaktion durch Diffusionsvor gänge überlagert. Limitierend wirken die Diffusion des Sub strats durch die stationäre Grenzschicht zwischen Lösung und Kapsel, die Diffusion von der Oberfläche in die Poren struktur der Kapsel sowie die Rückdiffusion des Produktes aus der Porenstruktur und die Diffusion durch die Grenz schicht. Die Diffusionslimitierung wird bei Enzym-Mem branreaktoren, einer weiteren Möglichkeit der Membran trennung, weitgehend vermieden. Hier tritt aber eine Desak tivierung der Enzyme durch Scherkräfte auf, die beim Um pumpen der Enzymsuspension bei kontinuierlichen Prozes sen hervorgerufen werden. Dieser Reaktor wird erfolgreich in der Technik zur kontinuierlichen L-Aminosäure-Produk tion durch katalytische Racemattrennung von N-Acetyl- D,L-methionin eingesetzt. Einen Vorteil bietet die Diffusi onslimitierung nur für die Verkapselung von Multienzym- Systemen, da dann die Reaktion mit mehreren Enzymen möglich wird. Ein weiterer Nachteil ist die Enzym-Desakti vierung bei der Immobilisierung. Dies kann durch die Im mobilisierung von Enzymen in ganzen Zellen eingeschränkt werden, was jedoch den Diffusionswiderstand für Substrat und Produkt durch die zusätzliche Zellwand erhöht.If enzymes are immobilized in microcapsules, the Kinetics of the enzymatic reaction by diffusion pre corridors overlaid. The diffusion of the sub has a limiting effect strats through the stationary boundary layer between solution and capsule, the diffusion from the surface into the pores structure of the capsule and the back diffusion of the product from the pore structure and the diffusion through the boundary layer. The diffusion limitation is with Enzym-Mem branch reactors, another possibility of the membrane separation, largely avoided. But here comes a desak Activation of the enzymes by shear forces, which pumping the enzyme suspension in a continuous process sen are caused. This reactor is successful in technology for continuous L-amino acid product tion by catalytic resolution of N-acetyl D, L-methionine used. The Diffusi has one advantage Limit only for the encapsulation of multi-enzyme Systems because then the reaction with multiple enzymes becomes possible. Another disadvantage is the enzyme desacti vation in immobilization. This can be done through the Im mobilization of enzymes in whole cells restricted what is the diffusion resistance for substrate and product increased by the additional cell wall.

Die Mikrokapseln werden daher eher für Verfahren in der Zellkulturtechnik, der medizinischen Therapie oder der Si cherheitsfermentation angewendet. In der Sicherheitsfer mentation ist die Mikroverkapselung ein Verfahren, das die Arbeit mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen un ter Berücksichtigung des Gentechnik-Gesetzes und der Gen technik-Sicherheitsverordnung erleichtert. In der Medizin werden Mikrohohlkugeln zur Herstellung künstlicher Or gane verwendet, die entweder als Implantat oder extrakor poral eingesetzt werden. Dabei werden sowohl körpereigene als auch fremde Zellen genutzt, um stoffwechselphysiologi sche oder genetisch bedingte Defekte auszugleichen, da durch die Polymermembran eine Immunbarriere geschaffen wird. In der Zellkulturtechnik wird die Schutzfunktion der Membran vor auftretenden Scherkräften (Rührer, Gasbla sen) genutzt, um hohe Zelldichten und damit hohe Produkti vität zu erzielen. Zusätzlich wird durch die Membran eine effektive Zellzurückhaltung zur Etablierung kontinuierli cher Prozesse bei gleichbleibend hohen Zelldichten erreicht. Versuche auf diesem Gebiet waren mit verschiedenen Syste men erfolgreich. Für die Produktion stabiler Proteine ist es oft wünschenswert, diese in der Kapsel zurückzuhalten, um ein geringeres Volumen aufarbeiten zu müssen. Für eine Applikation in vivo ist es jedoch erforderlich, daß das Pro dukt die Kapsel verlassen kann.The microcapsules are therefore more suitable for processes in the Cell culture technology, medical therapy or the Si security fermentation applied. In the security room microencapsulation is a process that the Working with genetically modified microorganisms and ter consideration of the genetic engineering law and the gene technology safety regulation easier. In the medicine are hollow microspheres for the production of artificial or gane used either as an implant or extracorrectly be used porally. Both the body's own as well as foreign cells used to metabolic physiology to compensate for genetic or genetic defects, because created an immune barrier through the polymer membrane becomes. In cell culture technology, the protective function of Membrane against shear forces (stirrer, gas blad sen) used to high cell densities and thus high produc to achieve vity. In addition, a effective cell retention to establish continuously processes with consistently high cell densities. Trials in this area have been with various systems successful. It is for the production of stable proteins often desirable to withhold this in the capsule having to work up a smaller volume. For one Application in vivo, however, it is necessary that the Pro can leave the capsule.

Es können weitere Laborbeispiele für das NaCS/PDAD MAC-System gefunden werden wie die Immobilisierung von Yarrowia lipolytica Zellen zur Zitronensäureproduk tion, wobei die Zellen über lange Zeit aktiv waren; die Ver kapselung von Invertase, die durch den Diffusionsprozeß li mitiert war; die Coimmobilisierung von Yarrowia 1. Zellen und Invertase; die Verkapselung von Urease, die eine höhere Stabilität, aber geringere Aktivität als native Urease durch die Reaktion mit dem restlichen Cellulosesulfat zeigte und die Immobilisierung von Penicillium raistnickii i 477, wobei eine höhere Biotrockenmasse als bei freien Zellen festge stellt werden konnte.There can be further laboratory examples for the NaCS / PDAD MAC system can be found like immobilization from Yarrowia lipolytica cells to the citric acid product tion where the cells have been active for a long time; the ver encapsulation of invertase by the diffusion process li was middle; the coimmobilization of Yarrowia 1. cells and invertase; the encapsulation of urease, which is a higher Stability but less activity than native urease due to showed the reaction with the remaining cellulose sulfate and the immobilization of Penicillium raistnickii i 477, whereby a higher dry biomass than free cells could be put.

Diese Beispiele geben einen kleinen Einblick in die heu tige Anwendung mit immobilisierten Biokatalysatoren. Es geht weit über die Anwendung in konventionellen Fermen tersystemen wie Bierherstellung, Gewinnung von Essig säure aus Alkohol und in der Abwasserreinigung hinaus. Je nach Anwendungsfall sind die Anforderungen verschieden. Allgemein sollte die Festigkeit der Kapseln einen Einsatz in konventionellen Fermentersystemen ermöglichen, Materia lien und Methoden sind auf ihre schädigende Wirkung auf Organismen zu überprüfen, die Ausschlußgrenze sollte be kannt und wenn möglich einstellbar sein und Nährstoffe und Wachstumsfaktoren müssen die Membran ungehindert pas sieren können.These examples give a little insight into the hay application with immobilized biocatalysts. It goes far beyond the application in conventional fermen systems such as beer production, vinegar production acid from alcohol and in wastewater treatment. ever the requirements vary depending on the application. Generally, the strength of the capsules should be used in enable conventional fermenter systems, Materia lien and methods are based on their harmful effects To check organisms, the exclusion limit should be knows and if possible be adjustable and nutrients and Growth factors must pass the membrane unhindered can sieren.

Am Beispiel des NaCS/PDAMAC-Systems wird deut lich, daß für die Anwendung der Mikrokapsel die Aus schlußgrenze der Kapselhölle von entscheidender Bedeu tung ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, die Größe der Ausschlußgrenze in einem bestimmten Be reich variabel und voreinstellbar zu machen. Dadurch sollen Mikrokapseln zu Verfügung gestellt werden, welche den Durchgang von Substraten oder Produkten durch die Hülle bis zum einer vorwählbaren Molekülgröße erlauben. Insbe sondere soll die auf ca. 5000 g/mol begrenzte Ausschluß grenze von NaCS/PDAMAC Mikrokapseln erweitert wor den.The example of the NaCS / PDAMAC system makes it clear Lich that for the application of the microcapsule final limit of the capsule hell of crucial importance tung is. The object of the present invention was therefore to the size of the exclusion limit in a particular Be richly variable and presettable. This is supposed to Microcapsules are made available which the Passage of substrates or products through the shell allow up to a selectable molecular size. in particular in particular, the exclusion should be limited to approx. 5000 g / mol limit of NaCS / PDAMAC microcapsules expanded the.

Diese Aufgabe wird durch eine erfindungsgemäße Mikro kapsel mit einer Membranhülle gelöst bei denen die Mem bran dadurch herstellbar ist, daß inerte Substanzen und/oder Partikel in die sich bildende Membran eingelagert und an schließend aus der gebildeten Membran entfernt werden.This object is achieved by a micro according to the invention capsule with a membrane shell loosened where the mem bran can be produced in that inert substances and / or Particles are embedded in the membrane that forms and attached finally be removed from the membrane formed.

Durch die Einlagerung von inerten Substanzen oder Parti keln, welche an der Membranbildungsreaktion nicht teilneh men, und welche nach Abschluß der Membranbildung aus dieser entfernbar sind, ist es überraschenderweise gelungen, die wichtige Membraneigenschaft der Ausschlußgrenze be einflussen zu können. Durch eine entsprechende Wahl der inerten Substanzen/Partikel und ihre Konzentration ist es dabei steuerbar geworden, welche Porengröße in der resul tierenden Membran erzielt wird.By storing inert substances or parts which do not participate in the membrane formation reaction men, and which after completion of membrane formation are removable, surprisingly, the important membrane property of the exclusion limit to be able to influence. By an appropriate choice of It is inert substances / particles and their concentration it became controllable what pore size in the resul ting membrane is achieved.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Mikrokap seln mit Membranen aus Polyelektrolytkomplexen gebildet. Bei diesen Komplexen kann es sich z. B. um solche handeln, die aus Natriumcellulosesulfat (NaCS) und Polydialylldi methylammonimchlorid (PDAMAC) gebildet sind.The microcap seln with membranes made of polyelectrolyte complexes. These complexes can e.g. B. act on such that of sodium cellulose sulfate (NaCS) and polydialylldi methylammonimchloride (PDAMAC) are formed.

Bei den inerten Substanzen handelt es sich vorzugsweise Polyalkohole, ganz besonders bevorzugt um Polyethylen glykol (PEG). Polyethylenglykole (PEG) sind wasserlösli che Polymere von über Ätherbindungen polymerisiertem Ethylenglykol mit linearer Sekundärstruktur. Die Formel ist:
HO(C₂H₄O)_nH.The inert substances are preferably polyalcohols, very particularly preferably polyethylene glycol (PEG). Polyethylene glycols (PEG) are water-soluble polymers of ethylene glycol polymerized via ether bonds with a linear secondary structure. The formula is:
HO (C ₂ H ₄ O) _n H.

PEG wird in der Technik zur Fällung von Proteinen be nutzt. Die Gemische können anschließend mit der Ultrafil tration getrennt werden. Ein weiterer Anwendungsbereich ist die Verwendung von PEG mit einer molaren Masse von 10 000 und 20 000 g/mol als Bindungspartner für Coen zyme in Membranreaktoren zur Herstellung von Aminosäu ren. Die Beispiele belegen die physiologische Unbedenk lichkeit des PEG, da es weder auf Proteine noch auf Coen zyme toxisch wirkt.PEG is used in the technology for protein precipitation uses. The mixtures can then with the Ultrafil tration be separated. Another area of application is the use of PEG with a molar mass of 10,000 and 20,000 g / mol as binding partners for Coen zymes in membrane reactors for the production of amino acids ren. The examples demonstrate the physiological safety PEG because it is neither on proteins nor on Coen zyme has a toxic effect.

Bei den inerten Partikeln kann es sich um biologische Zellen, Liposomen oder Ca-Alginat handeln. Diese Aufzäh lung ist jedoch nicht vollständig. Geeignet sind alle Partikel, die bezüglich der Membranbildungsreaktion inert sind (d. h. hieran nicht teilnehmen), und welche sich anschließend aus der Membran entfernen lassen. Diese Entfernung kann z. B. durch ein Auswaschen der Partikel oder Substanzen stattfinden. The inert particles can be biological Act cells, liposomes or Ca alginate. This list However, lung is not complete. All particles are suitable which are inert to the membrane formation reaction (i.e. do not participate in this), and which will then turn out remove the membrane. This distance can e.g. B. by washing out the particles or substances.

Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Mikrokap seln eine Membran Ausschlußgrenze, welche über 5000 g/mol liegt, ganz besonders bevorzugt über 100 000 g/mol bzw. 300 000 g/mol. Derartig hohe Aus schlußgrenzen waren z. B. bei den bekannten NaCS/PDAD MAC-Systemen nicht erreichbar und bekannt.The microcap according to the invention preferably have seln a membrane exclusion limit, which over 5000 g / mol is, very particularly preferably, above 100,000 g / mol or 300,000 g / mol. Such a high out final limits were e.g. B. in the known NaCS / PDAD MAC systems unreachable and known.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln haben einen Durchmesser von 0,1-10 mm, vorzugsweise 0,8-8 mm. Die Dicke ihrer Membranhülle liegt bei 10-200 µm, vorzugs weise 20-100 µm.The microcapsules according to the invention have one Diameter 0.1-10 mm, preferably 0.8-8 mm. The The thickness of their membrane shell is 10-200 µm, preferred as 20-100 µm.

Ein fakultativ anaerobes Bakterium wie beispielsweise Escherichia coli zeigt Anzeichen einer Sauerstofflimitierung bei Einsatz von Kapseln mit einem Durchmesser von mehr als 400 µm bei Kultivierung. Bei Applikation in der Zellkul turtechnik (Spodoptera frugiperda, Sf 9) wurden Sauerstoff limitierungen erst ab einem Durchmesser von 800 µm ge messen. Daher sind für den Einsatz aerober Bakterien oder Hefen Kapseln mit Durchmessern um 400 µm und bei Ein satz in der Zellkulturtechnik mit 800 µm erwünscht. Durch eine geringe Modifikation des Verfahrens konnte der Durch messer der Kapseln wesentlich verkleinert werden. Statt ei nes gasförmigen Fluides (vorzugsweise sterile Luft) wurde ein flüssiges Trägerfluid eingesetzt. Die Kapseldurchmesser konnten bis auf einen Durchmesser von 0,5 mm reduziert werden.An optional anaerobic bacterium such as Escherichia coli shows signs of oxygen limitation when using capsules with a diameter of more than 400 µm when cultivated. When applied in the cell culture turtechnik (Spodoptera frugiperda, Sf 9) became oxygen Limitations only from a diameter of 800 µm measure up. Therefore, the use of aerobic bacteria or Yeast capsules with diameters around 400 µm and at one in cell culture technology with 800 µm desirable. By a slight modification of the process was possible knife of the capsules can be significantly reduced. Instead of egg gaseous fluid (preferably sterile air) a liquid carrier fluid is used. The capsule diameter could be reduced to a diameter of 0.5 mm become.

Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrokapseln. Dieses Verfahren enthält die folgenden Schritte:
The invention also includes a method for producing the microcapsules according to the invention. This procedure includes the following steps:

a) the filling medium for from a central capillary the microcapsules,
b) from a jacket capillary, which the central capil lare concentrically encloses a first membrane forming component and envelops the outlet drop of filling medium,
c) the drop detaching from the capillaries first membrane-forming component and filler dium falls into a second membrane-forming compo nente, in which the reaction to form the Membrane envelope takes place.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
The method is characterized in that

a) the first and / or the second membrane-forming Component contains inert substances or particles, Which
b) after the membrane has been removed, preferably washed out.

Durch den Zusatz der inerten Substanzen/Partikel in die membranbildenden Komponenten werden diese bei der Ausformung der Membran dort eingelagert. Durch den an schließenden Schritt der Entfernung (zum Beispiel durch Auswaschen) werden die inerten Substanzen sodann aus der Membran entfernt und hinterlassen dort entsprechende Lüc ken.By adding the inert substances / particles to the Membrane-forming components are used in the Formation of the membrane stored there. By the closing step of removal (for example by Wash out) the inert substances are then from the Membrane removed and leave there corresponding Lüc ken.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die erste mem branbildende Komponente vorzugsweise NaCS und die zweite membranbildende Komponente PDADMAC.In the method according to the invention, the first mem branch-forming component preferably NaCS and the second membrane-forming component PDADMAC.

Als inerte Substanz findet bei dem Verfahren vorzugs weise PEG Verwendung. Das PEG hat dabei vorzugsweise ein Molekulargewicht von 400-10 000 g/mol und wird mit einer Konzentration von weniger als 5 Gewichts Prozent, ganz besonders bevorzugt weniger als 2 Gewichts Prozent in der membranbildende Komponente eingesetzt.The process is preferred as an inert substance wise PEG use. The PEG preferably has a molecular weight of 400-10 000 g / mol and is with a concentration of less than 5 percent by weight, very particularly preferably less than 2 percent by weight used in the membrane-forming component.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird ferner vorzugs weise so durch geführt, das die Mantelkapillare konzen trisch von einer zweiten Mantelkapillare umgeben ist, aus welcher ein Medium strömt, welches die Tropfenformung unterstützt. Dieses Medium ist vorzugsweise Luft oder eine Flüssigkeit.The inventive method is also preferred performed so that the capillary capillary is surrounded by a second jacket capillary which flows a medium which the drop formation supported. This medium is preferably air or a Liquid.

Die Tropfenbildung in der Kapillare erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, insbesondere in ein Bereich von 30-40°C. Gerade bei NaCS hat sich einer derartige Erhö hung der Temperatur als vorteilhaft erwiesen.The drop formation in the capillary is preferably carried out at elevated temperature, especially in a range of 30-40 ° C. Such an increase has occurred especially at NaCS temperature proved to be advantageous.

Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verkapse lungs- und Kultivierungskonzeptes mit der Möglichkeit, in demselben Rührreaktor verkapseln und kultivieren zu kön nen, werden Kontaminationsquellen und aufwendige Ar beitsschritte eingespart.In a variant of the encapsulation according to the invention development and cultivation concept with the possibility of encapsulate and cultivate the same stirred reactor NEN, contamination sources and expensive ar steps saved.

Ausgehend vom Reaktor, der das Abtrennen von flüssi gem Trägerfluid und PDADMAC einerseits und der voll ständigen Rückhaltung der Kapseln im Kessel garantiert er folgen die drei Arbeitsschritte Verkapselung, Spülvorgang und Medienzufuhr sowie Kultivierung im selben Gefäß. Im Gegensatz zum bisherigen Verfahren kann im PDADMAC beim Kapselherstellungsprozeß der Sauerstoffpartialdruck pO₂ gemessen, mitverfolgt und ggf. geregelt werden.Starting from the reactor, which guarantees the separation of liquid carrier fluid and PDADMAC on the one hand and the complete retention of the capsules in the boiler, it follows the three work steps of encapsulation, rinsing and media supply as well as cultivation in the same vessel. In contrast to the previous method, the oxygen partial pressure pO ₂ can be measured, tracked and, if necessary, regulated in the capsule manufacturing process in the PDADMAC.

Als flüssiges Trägerfluid kann perfluorierte Inertflüssig keit verwendet werden. In der Inertflüssigkeit löst sich Sau erstoff um ein Vielfaches mehr als in wäßrigen Lösungen. Wird die Flüssigkeit vor dem Verkapselungsprozeß mit Sau erstoff gesättigt, so gibt sie diesen bei der Kapselherstellung langsam an das PDADMAC ab und dient somit zusätzlich als Sauerstoffspeicher.Perfluorinated inert liquid can be used as the liquid carrier fluid be used. Sau dissolves in the inert liquid material many times more than in aqueous solutions. If the liquid is sowed before the encapsulation process saturated material, so it gives it during capsule production slowly to the PDADMAC and thus serves additionally as oxygen storage.

Die Immobilisierung in NaGS/PDADMAC Kapseln ver eint einige wichtige Vorteile: Sie haben eine hohe mechani sche Stabilität und können als Minimembranreaktoren be zeichnet werden, die unter sterilen Bedingungen arbeiten. Sie grenzen das immobilisierte biologische Material von dem Umgebungsvolumen ah und erleichtern dadurch die Produkttrennung sowie die Arbeit mit gentechnisch verän derten Mikroorganismen.Immobilization in NaGS / PDADMAC capsules ver unites some important advantages: They have a high mechanical cal stability and can be used as mini membrane reactors be drawn that work under sterile conditions. They limit the immobilized biological material from the surrounding volume ah and thereby facilitate the Product separation and working with genetically modified other microorganisms.

Die Erhöhung der Ausschlußgrenze dieser Membran er weitert ihren Anwendungsbereich deutlich. Zum einen kön nen niedermolekulare Stoffe, wie Glucose und Sauerstoff, durch größere Poren besser diffundieren, zum anderen ist es möglich, daß höhermolekulare. Stoffe, wie Proteine, Poly saccharide und Viren, durch die Membran diffundieren kön nen.He increased the exclusion limit of this membrane broadens their scope of application significantly. On the one hand, low molecular weight substances such as glucose and oxygen, Diffuse better through larger pores, secondly it is possible that higher molecular weight. Substances such as proteins, poly saccharides and viruses that can diffuse through the membrane NEN.

Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Mikrokap seln und ihre Herstellung anhand der folgenden eines Aus führungsbeispiele näher erläutert.The microcap seln and their manufacture based on the following one Aus examples of management explained in more detail.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapsel können verwendet werden, um biologische Zellen einzuschließen. Hierbei kann es sich insbesondere um lebende Insekten- oder Pflan zenzellen handeln. Derartige Zellen können insbesondere für eine Infektion mit rekombinanten, veränderten oder Wildtyp-Viren, Virionen und DNS verwendet werden.The microcapsule according to the invention can be used to include biological cells. in this connection may be living insect or plant in particular act cells. Such cells can in particular for infection with recombinant, altered or Wild-type viruses, virions and DNS can be used.

Erfindungsgemäß ist es überraschend gelungen, eine sta bile Hülle zu erzeugen, die durchlässig für Viren sowie re kombinante DNA ist. Versuche haben gezeigt, daß die Zelle extrem lange lebensfähig bleibt und sich in dieser die Viren stark vermehren. Mit dieser Methode ist es nunmehr mög lich, Viren in Zellen, vorzugsweise in tierischen Zellen zu züchten. Bisher mußte dies konventionell in mehrzelligen Lebewesen höherer Tiere oder Pflanzen durchgeführt wer den. Insbesondere gentechnisch veränderte, neue Viren konnten jedoch in solchen Tieren oder Pflanzen bisher nicht gezüchtet werden, da diese augenblicklich abgetötet oder gelähmt werden. Auch die isolierte Züchtung in Zellen ist nicht möglich, da die Zellwände sehr schnell lysieren und eine Vermehrung der Viren nicht mehr durchgeführt werden kann. Hier führt die erfindungsgemäße Kapselhülle zu über raschenden neuen Erkenntnissen. According to the invention it has surprisingly succeeded in establishing a sta bile envelope to create the permeable to viruses as well as re is combined DNA. Experiments have shown that the cell remains extremely long viable and in this the viruses multiply strongly. With this method it is now possible Lich, viruses in cells, preferably in animal cells too breed. So far, this had to be done conventionally in multicellular Living beings of higher animals or plants are carried out who the. In particular genetically modified, new viruses have so far not been able to do this in such animals or plants be bred as they are instantly killed or be paralyzed. The isolated cultivation in cells is also not possible because the cell walls lyse very quickly and the viruses can no longer be reproduced can. Here the capsule shell according to the invention leads to surprising new knowledge.

example 1 encapsulation

Für die Herstellung der Mikrokapseln werden zu Beginn des jeweiligen Verkapselungsverfahrens die membranbil dende Komponente und das Reaktionsbad hergestellt. Dafür werden je Charge die NaCS-Lösung mit 35 g/l NaCS und die PDADMAC-Lösung mit 65 g/l PDADMAC (38,5%ig) + 9 g/l NaCl (0,9%ig) in Phosphatpuffer (pH 6,8) angesetzt. Es werden vier Chargen für folgende Untersuchungen her gestellt:
For the production of the microcapsules, the membrane-forming component and the reaction bath are produced at the beginning of the respective encapsulation process. For this, the NaCS solution with 35 g / l NaCS and the PDADMAC solution with 65 g / l PDADMAC (38.5%) + 9 g / l NaCl (0.9%) in phosphate buffer (pH 6 , 8). Four batches are made for the following tests:

1. for the TOC value determination of the capsule opening Currency buffer from the capsules with different Chen PEG concentrations in the membrane,
2. for the immobilization of cytochrome C and the E. coli cell disruption in capsules with different PEG content in the membrane,
3. for the immobilization of the protein mixture (Combithek, Boehringer, Mannheim) in capsules with different concentrations and different molar masses of PEG in the membrane, the TOC Value Determination of the capsule storage buffer of Capsules with PEG of different molar mass in the membrane and its stability measurement, and
4. for the stability measurement of the capsules with under different PEG concentrations in the membrane.

Um die Verkapselung steril durchzuführen, werden die Lösungen, die Vorlagegefäße, die Verkapselungsapparatur mit Schläuchen, die Behälter für das Reaktionsbad mit Rüh rer und die Probenbehälter zum Aufbewahren ohne Ver gleichsgefäß autoklaviert (120°C, 30 min).To carry out the encapsulation sterile, the Solutions, the receptacles, the encapsulation apparatus with hoses, the container for the reaction bath with scramble rer and the sample container for storage without Ver autoclaved in the same vessel (120 ° C, 30 min).

Das Verkapselungsverfahren und die gesamte Apparatur wird im folgenden am Beispiel der Kapselsynthese von Kapseln ohne PEG in der Membran und einer Proteinlösung in der Kapsel erläutert. Die Proteinlösung und die NaCS-Lö sung werden in SCHOTT-Gläsern vorgelegt, und mit der Schlauchpumpe (Schlauchdurchmesser: NaCS-Lösung: 3 mm, Proteinlösung: 0,5 mm) in die Vertropfungsapparatur gepumpt. Die Massenströme der NaCS-Lösung und der Pro teinlösung werden durch Auswiegen einer Menge an NaCS- Lösung oder Proteinlösung in einer bestimmten Zeit wie folgt bestimmt:
The encapsulation process and the entire apparatus are explained below using the example of the capsule synthesis of capsules without PEG in the membrane and a protein solution in the capsule. The protein solution and the NaCS solution are placed in SCHOTT glasses and pumped into the dropping apparatus using the peristaltic pump (tube diameter: NaCS solution: 3 mm, protein solution: 0.5 mm). The mass flows of the NaCS solution and the protein solution are determined by weighing an amount of NaCS solution or protein solution in a certain time as follows:

1st setting: 29.74 mg NaCS / s; 1.46 mg protein sol solution / s
2nd setting: 35.68 mg NaCS / s; 1.75 mg protein sol sung / s.

Die Lösungen werden mit der 1. Pumpeneinstellung zur Vertropfungsapparatur gepumpt. In Abb. 3 ist der Verkapse lungsprozeß schematisch dargestellt.The solutions are pumped to the dripping apparatus with the 1st pump setting. In Fig. 3 the encapsulation process is shown schematically.

Aus der Vertropfungsapparatur tropfen die Lösungen in das bewegte Reaktionsbad. Das Reaktionsbad mit der PDADMAC-Lösung hat immer das 3-fache Volumen der vertropften kapselbildenden NaCS-Lösung. Die Fallstrecke (ca. 0,5 m) und die Rührergeschwindigkeit (laminare Strö mung) werden so eingestellt, daß sich die Kapseln gut aus bilden können ohne deformiert zu werden.The solutions drip from the dripping apparatus the moving reaction bath. The reaction bath with the PDADMAC solution always has 3 times the volume of dripped capsule-forming NaCS solution. The fall distance (approx. 0.5 m) and the stirrer speed (laminar flow mung) are adjusted so that the capsules look good can form without being deformed.

Die Kernkapillare der Vertropfungsapparatur hat einen Innendurchmesser d_i = 0,5 mm, die Mantelkapillare einen Innendurchmesser d_i = 1,0 mm und der Luftkanal einen Durchmesser D_L = 5 mm. Die Rührzeit im Reaktionsbad be trägt 45 min. Nachdem die Membran ausgebildet ist, wer den die Kapseln gründlich und schnell mit Puffer (4-fache Menge des Reaktionsbades) und VE-Wasser (2-fache Menge des Reaktionsbades; VE = vollentsalzt) gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.The core capillary of the dropletizing apparatus has an inside diameter d _i = 0.5 mm, the jacket capillary has an inside diameter d _i = 1.0 mm and the air duct has a diameter D _L = 5 mm. The stirring time in the reaction bath is 45 min. After the membrane has formed, the capsules are washed thoroughly and quickly with buffer (4 times the amount of the reaction bath) and demineralized water (2 times the amount of the reaction bath; VE = fully desalinated) and added to the storage buffer.

Als Polymer kommt Polyethylenglykol PEG (Merck- Schuchardt, Hohenbrunn) in Frage. Dabei ist zu klären,
Polyethylene glycol PEG (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn) is a suitable polymer. It should be clarified

1. whether PEG is washed out of the capsule membrane becomes,
2. whether the change in PEG concentration at con constant molecular weight changes the exclusion limit and, if this is not the case,
3. whether the exclusion limit in direct together depend on the variation of the PEG molecular weight stands.

Zu 1: Um das Auswaschen des Polyethylenglykols zu überprüfen, wurde PEG 10 000 dem NaCS und dem PDAD MAC jeweils zu 2, 3, 4 und 5% zugesetzt, mit dem Gemisch Kapseln hergestellt und anschließend in 0,9%iger NaCl-Lö sung aufbewahrt. Weiterhin erfolgte die Zumischung nur in je einem der Kapselkomponenten. Ein weiterer Schritt war das Untersuchen des Auswaschvorganges mit PEG unter schiedlichen Molekulargewichtes, aber gleicher Konzentra tion im NaCS und PDADMAC. Dazu wurde PEG der Größe 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 und 20 000 g/mol den Kap selkomponenten zu 2% zugemischt, Kapseln hergestellt und in physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt.To 1: To wash out the polyethylene glycol check, PEG 10,000 was the NaCS and the PDAD MAC added 2, 3, 4 and 5% each with the mixture Capsules produced and then in 0.9% NaCl solution solution. Furthermore, the admixture was only in one of the capsule components. Another step was examining the washout process with PEG below different molecular weight, but the same concentration tion in NaCS and PDADMAC. For this, PEG became the size 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 and 20 000 g / mol the chap Sel components mixed in 2%, capsules made and stored in physiological saline.

Anhand der Analyse der Aufbewahrungslösung auf ihren Gehalt an organischem Kohlenstoff sollte überprüft werden, ob PEG aus der Membran ausgewaschen wird. In regelmä ßigen Abständen wurden deshalb von der Aufbewahrungs lösung je 5 ml Probe entnommen und mittels TOC-Messung auf ihren organischen Kohlenstoffgehalt untersucht.Based on the analysis of the storage solution on their Organic carbon content should be checked whether PEG is washed out of the membrane. In regular Intervals were therefore removed from storage solution of 5 ml sample taken and by TOC measurement examined for their organic carbon content.

Zu 2: PEG 10000 wurde 2 und 3%ig den Kapselkompo nenten zugemischt und mit den Mischungen zum einen Cy tochrom C (Merck, Darmstadt) verkapselt. Zum zweiten wurde PEG 10000 zu 0.5, 1, 2 und 3% zugemischt und da mit ein Proteingemisch (Combithek, Boehringer Mann heim) verkapselt. Die Kapseln lagerten im Kühlschrank bei 4°C in Phosphatpuffer und nach drei Tagen wurde der Puffer durch Gelelektrophorese auf Proteine überprüft.2: PEG 10000 became 2 and 3% the capsule compo nenten admixed and with the mixtures on the one hand Cy encapsulated tochrom C (Merck, Darmstadt). Second PEG 10000 was mixed in at 0.5, 1, 2 and 3% and there with a protein mixture (Combithek, Boehringer Mann encapsulated. The capsules were stored in the fridge 4 ° C in phosphate buffer and after three days the buffer was checked for proteins by gel electrophoresis.

Zu 3: NaCS und PDADMAC wurde jeweils 2% PEG mit dem Molekulargewicht 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 und 20 000 zugemischt und damit ein Proteingemisch verkap selt. Lagerung und Probenahme und -analyse entspricht Punkt 2.3: NaCS and PDADMAC were each 2% PEG the molecular weight 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 admixed and thus encapsulated a protein mixture puzzled. Storage and sampling and analysis corresponds Point 2.

Die entsprechenden Mengen an PEG werden in die mem branbildenden Komponenten (entweder in beide oder in eine) gemischt, ohne innere Lösung vertropft, gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.The corresponding amounts of PEG are in the mem branch-forming components (either in both or in a) mixed, dripped without internal solution, washed and placed in the storage buffer.

Es wird mit einer Zumischung von 5%, PEG mit einer mo laren Masse von 10 000 g/mol (PEG 10 000) in die beiden Kapselpolymere begonnen. Dafür werden 50 ml NaCS-Lö sung und 150 ml PDADMAC-Lösung mit 5% PEG 10 000 gemischt. Die NaCS/PEG-Lösung wird mit einem Massen strom von 29,74 mg/s vollständig in das PDADMAC/PEG- Reaktionsbad vertropft. Die Tropfen werden 45 min gerührt, mit 900 ml Phosphatpuffer und 450 ml dest. H₂O gewa schen.It is started with an admixture of 5%, PEG with a molar mass of 10,000 g / mol (PEG 10,000) in the two capsule polymers. For this, 50 ml NaCS solution and 150 ml PDADMAC solution are mixed with 5% PEG 10,000. The NaCS / PEG solution is completely dripped into the PDADMAC / PEG reaction bath with a mass flow of 29.74 mg / s. The drops are stirred for 45 min, with 900 ml of phosphate buffer and 450 ml of dist. H ₂ O washed.

Im nächsten Versuch wird PEG 10 000 mit Konzentratio nen von 2%, 3% und 4% in beide Kapselpolymere gemischt. Aus diesen Lösungen werden Kapseln hergestellt, denen PEG entweder in beide oder in eine der beiden Lösungen ge mischt wird. Gleichzeitig werden aus diesen Lösungen Kap seln ohne PEG in der Membran hergestellt. Für jede Kapsel herstellung werden 50 ml der kapselbildenden Lösung in 150 ml des Reaktionsbades vertropft. Die Tropfen werden wie bereits beschrieben gerührt, gewaschen und in den Auf bewahrungspuffer gegeben. In the next experiment, PEG 10,000 with concentration NEN of 2%, 3% and 4% mixed in both capsule polymers. Capsules are made from these solutions PEG either in both or in one of the two solutions is mixed. At the same time chap manufactured without PEG in the membrane. For every capsule 50 ml of the capsule-forming solution are produced in 150 ml of the reaction bath are added dropwise. The drops will stirred, washed and washed as described above preservation buffer given.

Weiterhin werden die Zugabe verschiedener molarer Massen des PEG auf ihre Wirkung auf die Kapseln unter sucht. Der Auswaschprozeß wird für die Zumischung von 2% PEG mit einer molaren Masse von 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 und 20 000 g/mol und ohne PEG in beide Kap selpolymere bestimmt. Der Vorgang wird für die Zumi schung einer molaren Masse kurz erläutert:
Die NaCS/PEG-Lösung wird 5 min in das PDADMAC/ PEG-Reaktionsbad (100 ml) vertropft. Bei dem eingestell ten Massenstrom des NaCS mit 29,74 mg/s werden ca. 700 Kapseln hergestellt. Nach 45 min Rühren im Reaktionsbad werden die Kapseln mit 200 ml H₂O und 400 ml Phosphat puffer gewaschen und in 100 ml Aufbewahrungspuffer ge geben.Furthermore, the addition of various molar masses of the PEG are examined for their effect on the capsules. The washout process is intended for the admixture of 2% PEG with a molar mass of 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 g / mol and without PEG in both capsule polymers. The process is briefly explained for the admixture of a molar mass:
The NaCS / PEG solution is dripped into the PDADMAC / PEG reaction bath (100 ml) for 5 min. Approx. 700 capsules are produced with the set mass flow of the NaCS at 29.74 mg / s. After stirring in the reaction bath for 45 min, the capsules are washed with 200 ml of H ₂ O and 400 ml of phosphate buffer and placed in 100 ml of storage buffer.

Die Untersuchungen haben gezeigt, daß die Kapselstruk tur durch die Zugabe kleiner Mengen an PEG in die Kapsel polymere in ihrer Struktur verändert werden können, ohne an Stabilität zu verlieren.The investigations have shown that the capsule structure by adding small amounts of PEG to the capsule polymers can be changed in their structure without losing stability.

Auch die Größe der PEG-Moleküle hat einen Einfluß auf die Kapselstruktur. PEG mit sehr kleiner molarer Masse (400 g/mol) diffundiert aus der Membran heraus. Seine Größe reicht nicht aus, um die Membranstruktur so aufzu lockern, daß eine höhere Ausschlußgrenze erreicht werden kann. Sehr große PEG-Moleküle (20 000 g/mol) sind dage gen schwerer aus der Membran zu lösen.The size of the PEG molecules also has an influence the capsule structure. PEG with a very small molar mass (400 g / mol) diffuses out of the membrane. His Size is not enough to open up the membrane structure loosen that a higher exclusion limit can be reached can. Very large PEG molecules (20,000 g / mol) are there difficult to separate from the membrane.

Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen wird die PEG-Zugabe vorzugsweise auf 1% bis 3% PEG 10 000 und 2% PEG 6000 in beide Kapselpolymere eingegrenzt. Diese Kapseln sind für Moleküle mit einer relativen Molekül masse von mindestens 240 000 durchlässig. Die Ausschluß grenze läßt sich durch die Zugabe von den verwendeten PEG-Konzentrationen oder molaren Massen des PEG in die Kapselpolymere variieren.Based on the investigations carried out, the PEG addition preferably to 1% to 3% PEG 10,000 and 2% PEG 6000 limited in both capsule polymers. This Capsules are for molecules with a relative molecule permeable mass of at least 240,000. The exclusion limit can be increased by adding the used PEG concentrations or molar masses of the PEG in the Capsule polymers vary.

Example 2 Expression of recombinant proteins with the baculovirus expression system

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS ge löst. 300 ml einer 2,2% polyDADMAG Lösung in PBS an gesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapse lungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is ge in 100 ml of PBS overnight solves. 300 ml of a 2.2% polyDADMAG solution in PBS set. These solutions, about 2 L PBS, as well as the encapsulation equipment with its periphery are used at 121 ° C for Autoclaved for 15 min.

Insektenzellen, die sich in der logarithmischen Wachs tumsphase befinden, werden zentrifugiert. Zur Infektion wird der rekombinierte Baculovirus zu dem Zellpellet gege ben, so daß 1-100% der Zellen sofort infiziert werden, und gut vermischt. Dann werden die Zellen in frischem Medium aufgenommen und in den Vorlagenbehälter der Verkapse lungsapparatur verbracht.Insect cells that are in the logarithmic wax phase are centrifuged. For infection the recombined baculovirus is countered to the cell pellet ben so that 1-100% of the cells are infected immediately, and well mixed. Then the cells are in fresh medium recorded and in the original container of the encapsulation lungs equipment spent.

Die Suspension aus Baculoviren und Insektenzellen wird immobilisiert, die Kapseln für 15 min im Fällbad ausgehär tet und anschließend intensiv mit PBS gespült, um poly DADMAC-Rest zu entfernen. Die Kapseln werden auf dem Schüttler in Kolben mit Schikanen und in frischem Medium bei 27°C kultiviert. Nach 4-6 Tagen werden die Kapseln vom Medium getrennt, mechanisch zerstört und die enthal tenen Zellen und Proteinlösung durch Zentrifugation von Membranfragmenten getrennt. Standardreinigungschritte für die Aufreinigung des produzierten rekombinanten Pro teins schließen sich an.The suspension of baculoviruses and insect cells is immobilized, the capsules cured for 15 min in the precipitation bath tet and then rinsed intensively with PBS to poly Remove DADMAC remainder. The capsules are on the Shaker in flask with baffles and in fresh medium cultivated at 27 ° C. After 4-6 days, the capsules separated from the medium, mechanically destroyed and the contained cells and protein solution by centrifugation of Membrane fragments separated. Standard purification steps for the purification of the recombinant Pro produced teins join.

Verglichen mit der Produktion in Suspension wird eine um 50% höhere Ausbeute an rekombinantem Protein er reicht.Compared to the production in suspension, one by 50% higher yield of recombinant protein enough.

Example 3 Batch production of monoclonal antibodies

Wie Beispiel 2, nur daß Hybridome als Zellkultur ver wendet werden, die nicht infiziert werden müssen. Die Kul tivierungstemperatur beträgt 37°C, der Aufschluß erfolgt nach 5-10 Tagen (spätestens, wenn die Nährstoffe im Me dium verbraucht sind).As Example 2, except that hybridomas ver as cell culture that need not be infected. The Kul Activation temperature is 37 ° C, the digestion takes place after 5-10 days (at the latest when the nutrients in the me dium are used up).

Example 4 Continuous production of monoclonal antibodies

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS mit 2% PEG (MW 10 000) gelöst. 300 ml einer 2,2% polyDAD MAC Lösung in PBS mit 2% FEG (MW 10 000) angesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapselungsap paratur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is added to 100 ml of PBS overnight 2% PEG (MW 10,000) solved. 300 ml of a 2.2% polyDAD MAC solution in PBS with 2% FEG (MW 10,000). These solutions, approx. 2 L PBS, as well as the encapsulation ap parature with its periphery are at 121 ° C for 15 min autoclaved.

Hybridome, die sich in der logarithmischen Wachstums phase befinden, werden zentrifugiert und zur Immobilisie rung in frischem Medium aufgenommen und in den Vorla genbehälter der Verkapselungsapparatur verbracht.Hybridomas that are in logarithmic growth phase are centrifuged and immobilized tion recorded in fresh medium and in the presentation gene container of the encapsulation apparatus spent.

Die Zellsuspension wird immobilisiert, die Kapseln für 15 min im Fällbad ausgehärtet und anschließend intensiv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen. Die Kapseln werden in einem Zellkulturreaktor oder Standard rührreaktor und in frischem Medium bei 37°C kultiviert. Dem Reaktor wird ständig frisches Medium zugegeben und gleichzeitig dasselbe Volumen an "altem" Medium entnom men (Ablauf).The cell suspension is immobilized, the capsules for Cured for 15 min in the precipitation bath and then intensively rinsed with PBS to remove polyDADMAC residue. The Capsules are placed in a cell culture reactor or standard stirred reactor and cultivated in fresh medium at 37 ° C. Fresh medium is constantly added to the reactor remove the same volume of "old" medium at the same time men (process).

Die monoklonalen Antikörper können aus dem Ablauf durch Standardverfahren gewonnen werden.The monoclonal antibodies can run out can be obtained by standard methods.

Example 5 Production of wild-type baculoviruses

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS ge löst. 300 in einer 2,2% polyDADMAC Lösung in PBS ange setzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapse lungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is ge in 100 ml of PBS overnight solves. 300 in a 2.2% polyDADMAC solution in PBS puts. These solutions, about 2 L PBS, as well as the encapsulation equipment with its periphery are used at 121 ° C for Autoclaved for 15 min.

Insektenzellen, die sich in der logarithmischen Wachs tumsphase befinden, werden zentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen. Diese Zellsuspension wird geteilt und die Hälfte mit der Cellulosesulfatlösung gemischt, die andere Hälfte wie bisher an die innere Kapillare der Vertrop fungsapparatur angeschlossen.Insect cells that are in the logarithmic wax phase are centrifuged and fresh Medium recorded. This cell suspension is divided and mixed half with the cellulose sulfate solution that the other half as before to the inner capillary of the vertrop equipment connected.

Die Insektenzellsuspensionen werden immobilisiert, die Kapseln für 15 min im Fällbad ausgehärtet und anschlie ßend intensiv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen. Die Kapseln werden auf dem Schottler in Kolben mit Schikanen und in frischem Medium bei 27°C kultiviert, wobei das Medium regelmäßig durch frisches Medium er setzt werden muß. Nach 7-21 Tagen wird dem frischen Me dium eine Virussuspension zugegeben. Die Viren dringen über die Membranporen in die Kapseln ein und infizieren die Insektenzellen, wodurch es zur Virusvermehrung kommt. Nach weiteren 7-14 Tagen werden die Kapseln aus dem Medium genommen, mechanisch aufgeschlossen und die Dauerform der Baculoviren, die Polyhedra, durch Filtra tion oder Zentrifugation konzentriert gewonnen werden.The insect cell suspensions are immobilized Capsules cured for 15 min in the precipitation bath and then rinsed with PBS to remove polyDADMAC residue remove. The capsules are placed in flasks on the Schottler cultivated with baffles and in fresh medium at 27 ° C, the medium being regularly replaced by fresh medium must be set. After 7-21 days the fresh Me dium added a virus suspension. The viruses invade into the capsules via the membrane pores and infect the insect cells, causing it to multiply virus comes. After another 7-14 days, the capsules are made taken from the medium, mechanically disrupted and the permanent form of the baculovirus, the polyhedra, by filtra tion or centrifugation can be obtained concentrated.

Verglichen mit der Produktion in Suspension werden 4-6 mal mehr Polyhedra pro Insektenzelle erreicht, bezogen auf eine Zelldichte bei der Infektion von 1E6 Zellen/ml; bei hö heren Zelldichten sogar noch mehr, da hier in Suspension für eine optimale intrazelluläre Virusvermehrung entweder nicht mehr genug Sauerstoff und Nährstoffe zu den Insek tenzellen transportiert werden kann, oder diese durch Misch- und Gasdispergiereinrichtungen irreversibel geschä digt werden.Compared to the production in suspension, 4-6 times more polyhedra per insect cell, based on a cell density upon infection of 1E6 cells / ml; at high cell densities even more, because here in suspension for optimal intracellular virus replication either not enough oxygen and nutrients to the insect cells can be transported, or through these Mixing and gas dispersing devices irreversibly damaged be damaged.

Example 6 Continuous production of natural substances from plants cell

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS ge löst. 300 ml einer 2,2% polyDADMAC Lösung in PBS an gesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapse lungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is ge in 100 ml of PBS overnight solves. 300 ml of a 2.2% polyDADMAC solution in PBS set. These solutions, about 2 L PBS, as well as the encapsulation equipment with its periphery are used at 121 ° C for Autoclaved for 15 min.

Pflanzenzellen, die sich in der logarithmischen Wachs tumsphase befinden, werden zentrifugiert und das Pellet in frischem Medium resuspendiert. Diese Suspension wird mit der Cellulosesulfatlösung vermischt und in den Vorlagenbe hälter der Verkapselungsapparatur verbracht.Plant cells that are in the logarithmic wax phase are centrifuged and the pellet in fresh medium resuspended. This suspension comes with the cellulose sulfate solution mixed and in the template Containers of the encapsulation apparatus spent.

Die Suspension aus Pflanzenzellen wird ohne Verwen dung der inneren Kapillare immobilisiert, die Kapseln für 15 min-30 min im Fällbad ausgehärtet und anschließend inten siv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen.The suspension from plant cells is useless immobilization of the inner capillary, the capsules for 15 min-30 min Cured in the precipitation bath and then left to harden rinsed thoroughly with PBS to remove polyDADMAC residue.

Die Kapseln werden in einem Standardrührkessel bei 26°C kultiviert. Das Medium wird durch Zulauf ständig er neuert. Im Medienablauf befinden sich die von den Pflan zenzellen produzierten Naturstoffe, die durch Standardver fahren aufkonzentriert und gewonnen werden können.The capsules are placed in a standard stirred kettle Cultivated at 26 ° C. The medium is constantly increasing Neuert. The von Pflan are in the media flow cells produced natural products, which by standard ver driving concentrated and can be won.

In Immobilisaten steigt die spezifische Produktion von Naturstoffen in Pflanzenzellen um den Faktor 6-10 an.The specific production of Natural substances in plant cells by a factor of 6-10.

Fig. 1-5. Fig. 1-5.

Claims

1. Microcapsules with a membrane envelope, characterized in that the membrane can be produced, in which inert substances and / or particles are stored in the bil dende membrane and then removed from the membrane formed.

2. Microcapsules according to claim 1, characterized records that the membrane be made of polyelectrolytes stands.

3. microcapsules according to one of claims 1 or 2, characterized in that the membrane made of natri cellulose sulfate (NaCS) and polydialylldimethylam monium chloride (PDADMAC) is formed.

4. Microcapsules according to one of claims 1 to 3, characterized in that the inert substances Polyalcohols, preferably polyethylene glycol (PEG) are.

5. Microcapsules according to one of claims 1 to 4, characterized in that the inert particles biolo are genetic cells, lysosomes or Ca alginate.

6. microcapsules according to one of claims 1 to 5, characterized in that the membrane exclusion limit is above 5000 g / mol, preferably above 100,000 g / mol, very particularly preferably over 200,000 g / mol.

7. microcapsules according to one of claims 1 to 6, characterized in that it has a diameter from 0.1 to 10 mm, preferably 0.8 to 8 mm.

8. microcapsules according to one of claims 1 to 7, characterized in that the membrane envelope Thickness of 10 to 200 microns, preferably 20 to 100 microns Has.

9. A method for producing microcapsules according to any one of claims 1 to 8, in which

a) the filling medium for the microcapsules emerges from a central capillary,
b) from a jacket capillary, which concentrically surrounds the central capillary, exits a first membrane-forming component and encloses the outlet drop of the filling medium,
c) the drop separating from the capillaries falls into a second membrane-forming component, whereupon the. Reaction to the formation of the membrane shell takes place,

characterized in that

a) the first and / or the second membrane-forming component contains inert substances and / or inert particles which
b) after formation of the membrane from this ent, preferably washed out.

10. The method according to claim 9, characterized in net that the first membrane-forming component NaCS and / or the second membrane-forming compo is PDADMAC.

11. The method according to any one of claims 9 to 10, there characterized in that as inert substance PEG, preferably with a molecular weight of 400 to 10,000 g / mol and in a concentration of less than 5 percent by weight, very particularly preferably less than 2 percent by weight.

12. The method according to any one of claims 9 to 11, there characterized in that the jacket capillary con centrally surrounded by a second jacket capillary is from which a drop formation is supported Medium, preferably air or a liquid occurs.

13. The method according to any one of claims 9 to 12, there characterized in that the drop formation at he high temperature, preferably at 30 to 40 ° C, instead place.

14. Use of the microcapsules in one of the An say 1 to 8 for the inclusion of biological cells, especially living hybridomas, animal or plant cells, preferably around them with recom binant, modified or wild-type viruses and infect DNS.