DE19755801A1

DE19755801A1 - Mit die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE19755801A1
Application number: DE19755801A
Authority: DE
Inventors: Joerg Meyer; Alfred Jonczyk; Berthold Nies; Horst Kessler; Dirk Finsinger; Martin Kantlehner
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2000-06-21

Abstract

Die Erfindung beschreibt die Möglichkeit der Biofunktionalisierung von Biomaterialien, insbesondere Implantaten, durch deren maßgeschneiderte Beschichtung mit synthetisierten zell- bzw. gewebeselektiven RGD-Peptiden, die in vitro die Adhäsion vorwiegend derjenigen Zell-Spezies stimulieren, die jeweils die Gewebeintegration des entsprechenden Biomaterials vollführen sollen.

Description

Die Erfindung betrifft Implantate allgemeiner Art für den menschlichen und tieri schen Körper, welche mit Peptiden beschichtet sind, die die Adhäsion spezifischer Zellen in der jeweiligen Umgebung des Implantats selektiv zu vermitteln vermögen. Insbesondere betrifft die Erfindung mit RGD-Peptiden beschichtete Implantate und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Erfindung beruht auf dem Prinzip der zielgerichteten Adhäsionsstimulierung ausgewählter Zell-Spezies auf Oberflächenbeschichtungen von Biomaterialien im allgemeinen und Implantaten im speziellen zum Zweck der gewebeselektiven, be schleunigten und verstärkten Integration derselbigen nach operativem Einbringen in das entsprechende Gewebe.

Auf diese Weise können verschiedene Oberflächenteile eines Implantats mit ver schiedenen, die Zelladhäsion vermittelnden Peptiden, insbesondere RGD-Peptiden beschichtet und zur Verfügung gestellt werden, die der speziellen Gewebeumge bung, in welcher die Implantat eingebracht werden, Rechnung tragen.

Auf diese Weise wird zudem im Hinblick auf "Tissue Engineering" die Generation "intelligenter" biohybrider Organe durch Selbstorganisation möglich, die die biolo gische Information zu einer Organregeneration durch gezielte Aktivierung verschie dener Zell-Spezies durch verschiedene Peptide in unterschiedlichen Regionen der Implantatoberfläche tragen.

Der Terminus "erfindungsgemäße Peptide" umfaßt im folgenden, wenn nicht spe ziell anderes oder zusätzliches gesagt wird, alle Peptide, die die Zelladhäsion zu vermitteln vermögen. Hierunter sind vorallem solche gemeint, die die Aminosäuren Argenin (R), Glycin (G) und Asparaginsäure (D) hintereinander enthalten (RGD- Peptide). Beispiele von geeigneten RGD-Peptiden und geeigneten nicht RGD haltigen Peptiden sind weiter unten aufgeführt. Umfaßt sind ferner entsprechende Peptide, die nicht die RGD-Sequenz enthalten, aber dennoch die Zelladhäsion be einflussen. Im weitesten Sinne umfaßt die Erfindung auch nicht-peptidische Verbin dungen, welche qualitativ die gleiche biologische Aktivität wie die besagten pepti schen Verbindungen aufweisen.

Als Biomaterialien oder Implantate im erfindungsgemäßen Sinn werden Materialien bezeichnet, die in den menschlichen oder tierischen Körpers eingebracht werden können, um die Funktion des entsprechenden funktionsgeschädigten natürlichen Gewebes wiederherzustellen. Hierzu zählen beispielsweise Hüftendoprothesen, künstliche Kniegelenke, Kieferimplantate, Sehnenersatz, Hautersatz, Gefäßprothe sen, Herzschrittmacher, künstliche Herzklappen, Brustimplantate, Stents, Katheder und Shunts.

Das Integrationsverhalten von Implantaten in den Körper erweist sich nach wie vor als problematisch. Die Gewebeintegration der Materialien verläuft häufig zu lang sam und zu unvollständig, um eine für die Funktionalität ausreichende mechanische Stabilität der Gewebe/Biomaterial-Bindung herzustellen. Ursächlich verantwortlich hierfür ist häufig die Beschaffenheit der Implantatoberfläche, die aufgrund ihrer un zureichenden Grenzflächenkompatibilität bzw. Bioverträglichkeit eine aktive Anla gerung von umliegendem gesunden Gewebe bzw. Zellen behindert. Dies erschwert die Ausbildung einer stabilen Gewebe-Implantat-Grenzschicht und führt damit zu einer inadäquaten Gewebeintegration, die wiederum in Lockerungen, Gewebere sorption, Infektionen, Entzündungen, Allergien, Microthrombenbildung (Restenose) resultieren. In der Folge werden Revisionseingriffe zum Austausch der Implantate (z. B. Hüftendoprothesen, Kieferimplantate, Katheder oder externe Fixateure) und damit erneute operative Eingriffe erforderlich (Malchau und Herberts, 1996, Pro gnosis of the Total Hip Arthroplasty, 63. Annual Meeting of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, Atlanta; Haddad et al. 1996, The Journal of Bone and Jo int Surgery, 78-B: 546-549; Collinge et al., 1996, Pin Tract Infections).

Darüber hinaus erweist sich insbesondere bei Hüftendoprothesen die sogenannte aseptische Implantatlockerung als problematisch, bei der nicht, wie gewünscht, Knochenzellen und damit Knochengewebe die direkte Verbindung zum Biomaterial ausbilden, sondern als störende Elemente Fibroblasten und Bindegewebe auftreten. In der Konsequenz wird die Prothese dadurch anstelle von Knochengewebe von Bindegewebe umkleidet, wobei die resultierende Stabilität der Prothese- Bindegewebe-Bindung nicht ausreicht, um den mechanischen Anforderungen an die Kraftübertragung eines künstlichen Hüftgelenks gerecht zu werden. Dies kann in der Folge zu einer Auslockerung der Prothese führen (Pilliar et al., 1986, Clin. Orthop., 208: 108-113) und erfordert ebenfalls eine Revision.

Besonders schwerwiegend wirkt der Mangel an Integrierbarkeit von Biomaterialien bzw. Implantaten in den Körper im Falle von kompletten Ersatzorganen, da hier die verschiedenartigen Zelltypen in Kontakt mit dem Implantat treten und die erforder liche Integrierbarkeit zielgerichtet sein sollte. Um extrem aufwendige Transplanta tionsprozeduren mit Hilfe anderer Patienten zu vermeiden, wird beispielsweise an gestrebt, die Therapie des Funktionsversagens von Leber, Pankreas, Niere und Milz immer häufiger im Rahmen des "Tissue Engineering" mittels sogenannter biohybri der Organe zu vollführen, die aus Trägermaterialien bestehen, welche mit lebenden Zellen belegt sind und als funktionelle Einheit implantiert werden können. Meistens werden hierzu funktionsfähige, gesunde Zellen in vitro in resorbierbare oder nicht resorbierbare Membranen eingeschlossen bzw. verkapselt und als künstliche biohy bride Organe oder Hohlorgane in den Patienten transplantiert (z. B.: Lim et al., 1980, Science 210, 908-912; Altman et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; Zekorn et al., 1989, Transplantation Proceedings 21, 2748-2750; Altman et al., 1982, Horm. Met. Res. Suppl. 12, 43-45; EP 0 504 781 B1). Allerdings treten auch hier sehr oft die beschriebenen Problematiken der fibrösen Einscheidung mit ver bundener mangelnder Nährstoffversorgung der Transplantate, immunologischer Abwehrreaktionen durch Zell-Freisetzung aus den Kapseln sowie die Bildung von Blutgerinnseln aufgrund der Thrombogenität der Materialoberflächen auf.

Es ist bekannt, die Gewebeintegration von Biomaterialien/ Implantaten durch Be schichtung derselben mit Peptiden, die die Zell-Adhäsion vermitteln, zu stimulieren. Hierzu kennt man zum einen solche Peptide, die die Tripeptid-Aminosäure-Sequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD), bzw. deren nicht-peptidische Analoga und zum anderen zelladhäsionsvermittelnde, nicht RGD-haltige Peptide (Beispiele siehe unten), bzw. deren nicht-peptische Analoga enthalten, welche bekanntermaßen als integrale Bestandteile vieler Proteine u. a. der extrazellulären Matrix (z. B. Kollagen Typ I, Fibronectin, Laminin, Vitronectin, Entactin, Osteopontin, Thrombospondin) oder der Blutgerinnungskaskade (Fibrinogen, von Willebrand Faktor) als zentrale Erkennungsmuster für die Adhäsion von eukaryontischen Zellen fungieren (z. B.: Pierschbacher und Ruoslahti, 1984, Nature, 309: 30-33; Yamada, 1991, J. Biol. Chem., 266: 12809-12812). Die erfindungsgemäß definierten Sequenzen werden von den jeweiligen Rezeptoren auf der Zell-Oberfläche, den Integrinen, erkannt und ge bunden. Da die Adhäsion von Zellen an die entsprechenden Proteine durch eine Vielzahl verschiedener Integrine vermittelt wird, ist das Integrin-Expressionsmuster einer Zell-Spezies entscheidend für deren Adhäsionseigenschaften an diese Proteine. Das maßgeschneiderte Design und die Synthese von zumeist kurzkettigen, mit den entsprechenden Sequenzen ausgestatteten Peptiden, die selektiv und spezifisch nur an bestimmte Integrine binden können, ermöglicht die zielgerichtete Aktivierung nur derjenigen Zell-Spezies, die diese Integrine exprimieren. So kennt man z. B. RGD-Peptide, die selektiv an alpha_v-Integrin-Rezeptoren binden und damit bevor zugt die Bindung (Adhäsion) von alpha_vbeta₃-/alpha_vbeta₅-tragende Zellen (Osteoblasten, Osteoclasten, Endothelzellen) stimulieren können (Haubner et al., 1996, 7, Am. Chem. Soc., 118: 7461).

Die Beschickung von Implantatoberflächen mit synthetisch zugänglichen, erfin dungsgemäß definierten Peptiden ist bekannt. Dabei werden die Peptide entweder durch Adsorption oder aber durch kovalente Bindung auf der Oberfläche mehr oder weniger fixiert. In der DE 197 06 667 werden zum Beispiel Biomaterialien be schrieben, die Knochenersatzmaterialien betreffen, die auf einem porösen Polymer material basieren, das eine durch Adsorption bedingte Oberflächenbelegung mit Peptiden mit RGD-Aminosäuresequenz aufweist. Aus der WO 91-05036 sind wei terhin metallische Prothesen, insbesondere aus Titan bzw. Titanlegierungen bekannt, an deren Oberflächen Peptide, die u. a. auch RGD-Sequenzen aufweisen können, ko valent gebunden sind. Valentini et al. (May 1997, Transactions of the 23rd Annual Meeting of the Society for Biomaterials, New Orleans, USA) beschreiben die Kova lente Anbindung von RGD-Peptiden an mit einer fluorinierten Ethylenpropylen- Zwischenschicht versehene Titanschrauben. Rezania et al. berichten auf der gleichen Veranstaltung von Siliciumdioxid- bzw. Titandioxid-Oberflächen welche über kova lente Bindung mit aminofunktionalen Organosilanen beschichtet sind und vollfüh ren mittels eines heterobifunktionalen Quervernetzers wiederum kovalent die An bindung thiolhaltiger RGD-Peptide.

Diese technischen Lösungen gehen jedoch nicht auf das Erfordernis ein, Implantate bzw. Biomaterialien zur Verfügung zu stellen, deren Oberfläche gezielt mit erfin dungsgemäß definierten Peptiden beschichtet sind, die selektiv an den jeweiligen Zelltyp des das betreffende Implantat umgebenden Gewebes angepaßt sind.

Es wäre daher wünschenswert, Biomaterialien in der Art verändern zu können, daß gezielt diejenigen Gewebe oder Zell-Spezies, die auch nach Einbringen des Implan tats in den Körper mit diesem aktiv in Funktion treten sollen, also z. B. Knochenzel len bei Hüftendoprothesen oder Epithelzellen für Haut-, Haar- oder Zahnersatz, aus schließlich oder bevorzugt zu deren Gewebeintegration veranlaßt werden.

Es wäre ferner eine wünschenswerte und attraktive Strategie, Implantate mit denje nigen erfindungsgemäß definierten Peptiden (bzw. deren nicht-peptidischen Analo ga) zu beschichten, die die Adhäsion derjenigen ausgewählten Zelltypen ausschließ lich oder zumindest bevorzugt stimulieren, welche die entsprechenden komplemen tären Integrine tragen, was in der Folge zur beschleunigten in vivo-Synthese des entsprechenden ausgewählten Gewebes führt.

Hinsichtlich der Entwicklung kompletter biohybrider Organe (Haut, Blutgefäße, Harnwege, Blase, Ösophagus, Pankreas, Leber, Milz, Niere) wäre es ein entschei dender Fortschritt, die jeweils für ein bestimmtes Organ gewünschten verschiedenen Zell-Spezies durch Beschichtung unterschiedlicher Oberflächenteile eines Implan tats mit verschiedenen zellselektiven erfindungsgemäß definierten Peptiden zielge richtet, räumlich definiert und koordiniert zur Durchführung unterschiedlicher zellu lärer in vivo-Prozesse aktivieren zu können.

Die vorliegende Erfindung beschreibt nun die Möglichkeit der Biofunktionalisie rung von Biomaterialien, insbesondere Implantaten für alle denkbaren Organe durch deren Beschichtung mit synthetisierten zell- bzw. gewebeselektiven erfindungsge mäß definierten RGD-Peptiden, die in vitro die Adhäsion vorwiegend derjenigen Zell-Spezies stimulieren, die jeweils die Gewebeintegration des entsprechenden Biomaterials vollführen sollen. Mit der Verwendung solcher Beschichtungen ist eine beschleunigte und die verstärkte Integration verschiedener Biomateriali en/Implantate mit verbesserter Langzeitstabilität nach deren Einbringen in den Kör per zu erzielen.

Darüber hinaus bestehen mit diesem Konzept der Beschichtung verschiedener Ma terialoberflächenteile eines Implantats mit unterschiedlichen erfindungsgemäß defi nierten Peptiden alle Möglichkeiten zur Entwicklung von "intelligenten", biohybri den Organen ("Tissue Engineering"), die die biologisch Information zur selektiven Aktivierung verschiedener Zielgewebe bzw. Zielzellen tragen und damit durch Selbstorganisation in den Körper integriert werden und hierdurch eine Gewebeinte gration verstärken oder gar erst ermöglichen können.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Implantat, welches geeignet für unter schiedliche menschliche und tierische Organe ist, bestehend im wesentlichen aus ei ner Trägermatrix und einer diese Matrix umhüllenden Peptid-Beschichtung, die zur zielgerichteten Adhäsionsstimulierung von menschlichen oder tierischen Körperzel len Peptide enthält, welche Sequenzen aufweisen, die Bindungsstellen auf den für die Adhäsion verantwortlichen Integrin-Rezeptoren auf humanen oder tierischen Zellen erkennen, wobei die Trägermatrix reaktive bindungsfähige Gruppen an ihrer Oberfläche aufweist, die dazu befähigt sind mit entsprechenden funktionellen reak tiven Gruppen besagter Peptidschicht eine stabile kovalente Bindung einzugehen, wobei das Implantat sich dadurch auszeichnet, daß besagte Peptide so lokal unter schiedlich auf der Oberfläche des Implantats angeordnet sind, daß sie aufgrund ihrer entsprechend unterschiedlichen strukturbedingten, zelladhäsions-stimulierenden Aktivität spezifisch dem natürlichen unterschiedlichen komplementären Integrin muster der in jeweiligen Region an sie angrenzenden Gewebezellen entsprechen, in die das Implantat eingebracht werden soll, wodurch ein lokal differenziertes und selektives bioaktives Beschichtungsmuster der Implantatoberfläche vorliegt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von für Orga ne/Gewebe geeigneten Implantaten auf Basis einer anorganischen Trägermatrix, die eine Oberfläche besitzen, welche mit die Zelladhäsion stimulierenden Peptiden be schichtet sind, wobei die besagten Peptide selektiv in Bezug auf das komplementäre Integrinmuster der an das Implantat unmittelbar angrenzenden Gewebezellen sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man nach an sich bekannten Methoden (i) in vitro die Integrinrezeptor-Struktur der Zielzellen bzw. des Zielgewebes, in welches das Implantat in vivo eingebracht werden soll, bestimmt, (ii) die Peptide mit der ent sprechenden komplementären Struktur auswählt bzw. synthetisiert und (iii) die be sagten Peptide an die betreffende Oberfläche des Implantats bindet.

Insbesondere sind Gegenstand der Erfindung Verfahren und Implanta teßiomaterialien mit folgenden Charakteristika: die besagten Peptide, insbesondere RGD-Peptide sind durch kovalente Bindung, gegebenenfalls über verzweigte, ober flächenvergrößernde Moleküle und/oder Molekülanker an die Implantatoberfläche fixiert; bevorzugt werden RGD-Peptide verwendet, die alpha_vbeta₃-/alpha_vbeta₅- tragende Zellen, insbesondere also beispielsweise die Adhäsion von Osteoblasten, Osteoclasten, Endothelzellen stimulieren können; als Trägermatrices werden ge formte oder ungeformte Teile aus Keramik, Polymermaterial oder Metall oder ein biohybrides Organ oder Hohlorgan eingesetzt.

Die erfindungsgemäß definierten Peptide sind auf molekularer Ebene im wesentli chen aus folgenden Bestandteilen konzipiert:

- einer die für die Adhäsion zuständige Aminosäuresequenz-tragenden Domäne (z. B. die genannte RGD-Sequenz), die selektiv eine ausgewählte Zell-Spezies er kennt und bindet.
- einem Abstandshalter, um die zellerkennende und die Erkennungssequenz tragende Domäne den Zellen in solcher Art zu präsentieren, daß eine Zellbindung unter sterischen Gesichtspunkten erst möglich wird.
- einem Molekülanker, der die stabile Anbindung des betreffenden Peptid-Derivats an die Biomaterial- bzw. Implantatoberfläche vollzieht.
- optional kann die Zell-Adhäsion durch zusätzliche Kopplung der erfindungsgemäß definierten Peptide an verzweigte Molekülstrukturen (sogenannte Dendrimere oder Tentakel) die einen oberflächenvergrößernden Effekt ausüben, bevor die Bindung an die Biomaterialoberfläche erfolgt, gesteigert werden.

Unter der Oberfläche des Biomaterials bzw. Implantats ist erfindungsgemäß nicht nur die unmittelbare Oberfläche der Trägermatrix zu verstehen, sondern auch eine gegebenenfalls vorhandene zusätzliche Beschichtung aus beispielsweise polymerem Material, natürlichen oder artifiziellen Knochenmaterialien, Proteinen oder Protein derivaten.

Als Trägermatrix eigenen sich vorallem Materialien aus Keramik, Metall, Polymer materialien (z. B. PMMA) oder vorzugsweise resorbierbaren Knochenersatzmateria lien. Besonders geeignet sind resorbierbare bzw. bio-abbaubare Werkstoffe, z. B. aus Polylactiden, insbesondere racemische D,L Polylactid-Verbindungen oder re sorbierbare Calciumphosphat-bzw. Hydroxyl-apatit-Mischungen, die bewirken können, daß der ursprüngliche Gewebezustand wiederhergestellt werden kann und wie sie beispielsweise aus der WO 96/36562 oder der EP 0 543 765 bekannt sind. Je nach Einsatzgebiet kann als Trägermatrix auch Collagen oder Agar geeignet sein.

Unter dem Begriff "biohybrides Organ" ist eine üblicherweise anorganische Matrix zu verstehen, die mit lebenden Zellen auf irgendeine Weise beladen bzw. verbunden sind (siehe oben). Erfindungsgemäß ist darunter auch eine entsprechende Anordnung zu verstehen, die frei von Zellen ist und nur die entsprechenden verschiedenartigen erfindungsgemäß definierten Peptide auf unterschiedlichen Implantat-Oberflächen teilen aufweist, welche, in das defekte Gewebe eingebracht, selektiv die umgeben den Zellen zu aktivieren vermögen. Der Vorteil solcher azellulärer biohybrider Or gane besteht darin, daß "intelligente", biokompatible Implantate, die kostengünstig und kontrollierbar produziert werden können, die biologische Information zu einer Organregeneration tragen. Die Integration solcher biohybriden Organe in den Kör per wird dann durch körpereigene Regenerationsprozesse mittels Selbstorganisation vollzogen, wodurch immunologische Abwehrreaktionen, wie sie beispielsweise durch implantierte Fremd-Zellen oder Fremd-Proteine oft auftreten, vermieden wer den können.

Die Implantate liegen erfindungsgemäß in der Regel in Formkörpern bzw. Prothesen vor, wobei der Formkörper dem jeweiligen Gewebe-/Knochendefekt angepaßt sein sollte. Im Falle biohybrider Organe können die Prothesen lediglich aus mit oder oh ne entsprechende Zellen und den erfindungsgemäß definierten Peptiden beschichte teten Membranen oder Folien bestehen oder aber die Anordnungen, wie sie z. B. aus der EP 0 504 781 bekannt sind, aufweisen.

Als erfindungsgemäß einsetzbare Peptide kommen alle Peptide und deren Verbin dungen mit nicht-peptidischen Substituenten, die eine für die Zelladhäsion verant wortliche Domäne bzw. Aminosäuresequenz enthalten und die über ihre peptidi schen und nicht-peptidischen Substituenten auf den Implantatoberflächen binden können, in Betracht. Insbesondere kommen entsprechende Peptide mit einer RGD- Sequenz in Frage.

Folgende Aufzählungen von bevorzugten Peptiden bzw. Peptidverbindungen soll lediglich beispielhaften und keinerlei limitierenden Charakter haben, wobei folgen de Abkürzungen verwendet werden:
Asp (D) = Asparaginsäure
Gly (G) = Glycin
Arg (R) = Arginin
Tyr(Y) = Tyrosin
Ser(S) = Serin
Phe(F) = Phenylalanin
Lys (K) = Lysin
DPhe (f) = D-Phenylalanin
Pro(P) = Prolin
Leu(L) = Leucin
Ile(I) = Isoleucin
Val(V) = Valin
Glu(E) = Glutaminsäure
Thre(T) = Threonin
Ala(A) = Alanin

(a) Beispiele für geeignete RGD-haltige Pentide

RGD (Arg-Gly-Asp),
GRGD (Gly-Arg-Gly-Asp),
GRGDY (Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr),
RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser),
GRGDS (Gly-Arg-Gly-Asp-Ser),
RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe),
GRGDF (Gly-Arg-Gly-Asp-Phe),
cyclo-RGDfK (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin),

(b) Beispiele für geeignete nicht RGD-haltige Peptide

LDV (Leu-Asp-Val),
LGTIPG (Leu-Gly-Thr-Ile-Pro-Gly),
REDV (Arg-Glu-Asp-Val),
IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val),
YIGSRG (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Gly),
LRE (Leu-Arg-Glu),
PDSGR (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg),
DGEA (Asp-Gly-Glu-Ala),
RYVVLPR (Arg-Tyr-Val-Val-Leu-Pro-Arg).

Die erfindungsgemäß definierten Peptide können sowohl linear als auch zyklisch sein. Die oben genannten Peptide bzw. Peptidsequenzen können auch innerhalb län gerer Peptide mit je nach ausgewähltem erfindungsgemäßen Peptid etwa insgesamt 4 bis 20 Aminosäuren vorkommen. Ebenso sind Aminosäuren, welche D- oder L- Konfiguration aufweisen oder die C- und/oder N-alkyliert sind, erfindungsgemäß mit umfaßt. Unter zyklischen Peptiden werden erfindungsgemäß solche Peptide verstanden, die über eine Amidbindung ringförmig geschlossen sind, wobei im Molekül vorzugsweise keine freien Carboxyl- oder Amino-Gruppen vorhanden sind. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäß RGD-Peptide, insbesondere solche aus der oben genannten Liste und hiervon besonders das Pentapeptid RGDfK, welches in seiner zyklischen Form aus der DE-OS-195 38 741 bekannt ist.

Entsprechende erfindungsgemäß definierte lineare und zyklische Peptide sind zum Beispiel in folgenden Patentanmeldungen beschrieben: EP 0 632 053, EP 0 655 462, EP 0578 083, EP 0 770 622, DE 195 38 741. Insbesondere sind jene Peptide geeig net, die selektiv an alpha_vbeta₃-/alpha_vbeta₅-Integrin-exprimierende Zell-Spezies (z. B. Osteoblasten, Osteoclasten, Endothelzellen) binden. Die Peptide sowie die ent sprechenden Derivate können nach Standardmethoden leicht synthetisiert werden, sofern sie nicht anderweitig erhältlich sind.

Prinzipiell können die erfindungsgemäß definierten Peptide an die Oberfläche des Biomaterials durch Adsorption oder Kovalenzbindung fixiert sein. Die Adsorpti onsmethode ist bei Verwendung unterschiedlicher Peptide an ein und demselben Implantat weniger gut geeignet, da die erfindungsgemäß lokal selektive unter schiedliche Belegung der Oberfläche mit dieser Technik nur schwer zufriedenstel lend zu bewerkstelligen ist.

Die Kopplung der Peptide bzw. deren nicht-peptidische Analoga an Trägeroberflä chen durch Kovalenzbindung meist mittels sogenannter Molekülanker ist per se hin reichend bekannt und beschrieben worden, so beispielsweise bei Singer et al. (1987, J. Cell. Biol. 104: 573); Brandley, Schnaar (1989, Develop. Biol. 135: 74); Massia, Hubbell (1990, Anal. Biochem. 187: 292); Hirano et al. (1991, J. Biomed. Mat. Res. 25: 1523); Lin et al. (1992, Biomaterials 13: 905); Nicol at al. (1992, J. Biomed. Mat. Res. 26: 393); Dee et al. (1995, Tissue Engin. 1: 135), ohne daß dabei aller dings auf die Beschichtung von Implantaten im allgemeinen und im speziellen in ir gend einer Weise eingegangen wäre.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind nun neue Anwendungen von an sich bekannten Beschichtungsmethoden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Implan tate, wie zum Beispiel das "Kevloc"-Verfahren (EP 0 712 621), welches erstmals erfindungsgemäß zur Kopplung der genannten Peptide (bzw. deren nicht-peptidische Analoga) an Oberflächen, welche Acryolyl- bzw. Methacryolyl-Ankerkomponenten enthalten, eingesetzt wurde, oder das "Silicoater"-Verfahren (DE-OS 42 25 106), das hier erfindungsgemäß zur Kopplung der entsprechenden Peptide mittels Acry loyl- oder Methacryloyl-Ankerkomponenten in der Regel über eine Acryloyl- /Methacryloyl-Silanderivat-Zwischenschicht (z. B. 3-Methacryloxypropyl-trimeth oxysilan) an die entsprechenden Trägermatrices verwendet wurde. Eine weitere Möglichkeit, die erfindungsgemäß definierten Peptide an die Oberfläche der Trä germatrix bzw. des Implantats zu binden, besteht in der analogen Anwendung eines Silanisierungsverfahrens, das in der DE-OS 43 21 005 beschrieben ist, welches ur sprünglich die technische Lehre der Beschichtung von Perlglanzpigmenten für Was serlacksysteme für Metalle und Kunststoffe in der Automobil- und Kunststoffindustrie darlegt. Ferner ist erfindungsgemäß ein Verfahren für die Beschichtung von Gol doberflächen mit thiolgruppentragenden Peptiden geeignet, das ursprünglich in ei nem anderen Zusammenhang beschrieben wurde (Heuvel et al., 1993, Analytical Biochem. 21 S. 223).

Die geschilderten Verfahren sind bislang für die Beschichtung von Implantaten zwecks deren Bioaktivierung noch nicht eingesetzt worden.

Die Kopplung der entsprechenden erfindungsgemäß definierten Peptide an die Im plantatoberfläche erfolgt erfindungsgemäß über entsprechende Ankermoleküle, d. h. das Peptid wird in der Regel nicht unmittelbar selbst auf die Implantatoberfläche fi xiert. Die Einfügung eines solchen, unten näher definierten Moleküls hat vor allem den Sinn, den sterischen Erfordernissen des biologischen Rezeptors auf den Zielzel len in Zusammenhang mit der Bindung des entsprechenden Peptids Rechnung zu tragen.

Die Implantatoberfläche muß hierzu entsprechende funktionelle Gruppen bzw. re aktive Einheiten tragen, welche eine Bindung der entsprechenden funktionellen Gruppe des Ankermoleküls ermöglichen. Die funktionellen Gruppen, die auf der Implantatoberfläche bereitzustellen sind, richten sich wiederum nach der Beschaf fenheit der eigentlichen je nach Erfordernis unterschiedlichen Trägermatrix (Metall, Kunststoff, Knochenmaterialien). Bei Metallimplantaten, kann man beispielsweise eine für SH-Reste des Ankermoleküls reaktive Oberflächenschicht durch Bedamp fung mit Gold erzeugen. Die Silanisierung von Metalloberflächen nach bekannten Verfahren (siehe oben) führt ebenfalls zu reaktiven Oberflächen, welche mit den geeigneten erfindungsgemäßen Ankermolekülen, ggf. unter Verwendung von silan haltigen Haftvermittlern, Verbindungen eingehen können (siehe unten). Implantate aus natürlichen Knochen oder naturähnlichen Knochenmaterialien (z. B. Calcium phosphat-Zemente) können Ankermoleküle binden, welche eine reaktive Phos phonatgruppe enthalten (Prinzip beschrieben bei Chu, Orgel, 1997, Bioconjugates Chem. 8: 103). An Implantate aus Kunststoff auf Acrylatbasis (z. B. PMMA) oder aus anderen Materialien mit einer entsprechenden Kunststoffbeschichtung können wiederum erfindungsgemäße Ankermoleküle angekoppelt werden, die ihrerseits selbst einen reaktiven Acrylatrest aufweisen.

Ankermoleküle im Sinne der Erfindung sind also Moleküle auf Basis von modifi zierten bzw. substituierten Alkylketten bzw. Kohlenstoffketten, die zumindest zwei unterschiedliche funktionelle Gruppe aufweisen, wobei eine funktionelle Gruppe in der Regel ein freier Carboxyl-Rest ist, der mit einer freien NH₂-Gruppe einer Sei tenkette eines erfindungsgemäß definierten Peptids, insbesondere eines RGD- Peptids, eine Amidbindung (-CO-NH-) erzeugt, und die andere funktionelle Gruppe, welche vorzugsweise am anderen Ende der C-Kette des Ankermoleküls lokalisiert ist und eine direkte oder indirekte Bindung mit der Implantatoberfläche bewirkt, je nach Beschaffenheit bzw. Erfordernis der Implantatoberfläche, vorzugsweise ein (meth)acrylathaltiger Rest oder eine Mercaptogruppe ist. Prinzipiell können auch andere funktionelle Gruppen verwendet werden, die mit den jeweiligen reaktiven Gruppen unmittelbar auf der Implantatoberfläche oder auf einer geeigneten Zwi schenschicht zu einer stabilen Bindung zu reagieren vermögen.

Die Ankermoleküle der Erfindung besitzen, wie bereits angedeutet, gleichzeitig die Funktion von Abstandshaltern oder Spacern, weisen also neben ihren geschilderten Verknüpfungsoptionen eine entsprechende gegebenenfalls spezifisch angepaßte Länge auf, um zu ermöglichen, daß die für die Zelladhäsionsstimulierung verant wortliche Domäne den richtigen Abstand zur Zielzelle hat, so daß eine Zellbindung unter sterischen Gesichtspunkten verbessert oder erst ermöglicht werden kann.

Die biologische Funktion der zellerkennenden und die entsprechende Aminosäure sequenz-tragenden Domäne wurde beispielhaft anhand eines selektiv an alpha_vbeta₃- /alpha_vbeta₅-Integrin-exprimierende Zell-Spezies (z. B. Osteoblasten, Osteoclasten, Endothelzellen) bindendes synthetisiertes Peptid bewiesen (Haubner et al., 1996, J. Am. Chem. Soc., 118: 7461-7472).

Die Ankermoleüle der Erfindung weisen vorzugsweise folgende lineare Strukturen auf, wobei die erfindungsgemäß definierten Peptide über die NH₂-Gruppe einer ihrer Aminosäure-Seitenketten, vorzugsweise Lysin-Seitenkette an das freie Carboxyl- Ende des jeweiligen Ankermoleküls gebunden werden.

a) Mercapto(amido)carbonsäure-Derivate:
-CO-(CH2)_k-X-SH,
wobei X eine Einfachbindung oder -CO-NH-(CH2)₁-,
k = 2 bis 12 und 1 = 2 bis 4 bedeutet;
b) Acrylamidocarbonsäure-Derivate:
-CO-(CH2)_m[NWCO-(CH2)_n]_p-NH-CO-CH=CH2,
wobei m, n = 2 bis 8; p = 0 bis 2 bedeuten,
c) Acrylamido-amidotriethylenglycolsäure-Derivate:
(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)_q-CO-(CH2)_r-NH-CO-CH=CH2,
wobei q = 1 bis 3 und r = 2 bis 8 bedeutet.
Bevorzugt sind insbesondere die folgenden Typen spezieller Ankermoleküle:
d) CO-CH2-CH2-SH (Mercaptopropionsäure),
e) CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH (Mercaptoethylamidobernsteinsäure),
f) -CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2 (Acrylamidohexansäure),
g) -CO-(CH2)₅-NH-CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2 (Acrylamidohexansäure-amidohexansäure),
h) -CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2 (Acrylamidohexansäure-amidotriethylenglycolsäure),
i) -(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)₂-CO-(CH2)₅-NH-CO- CH=CH2 (Acrylamidohexansäure-di-amidotriethylenglycolsäure).

Generell sind erfindungsgemäß jene Ankermolekülstrukturen bevorzugt, welche in der linearen C-Kette mindestens sechs C-Atome aufweisen. Es wurde nämlich über raschend gefunden, daß diese Länge des Ankermoleküls besonders günstig ist, um optimale Ergebnisse in bezug auf die beschleunigte und verstärkte Gewebeintegra tion des Implantats zu erzielen. Die Angabe von mindestens sechs C-Atomen in der linearen Kette bezieht sich erfindungsgemäß auf die Gesamtlänge des Moleküls zwischen Peptid und Implantatoberfläche. So sind auch Ankermoleküle der oben gezeigten Strukturen mit kürzerer Kette (z. B. Typ ia) geeignet, falls noch andere nicht genannte, kettenverlängernde Kopplungskomponenten zwischen Peptid und Implantatoberfläche eingefügt werden.

Die Ankermoleküle werden nach Standardmethoden mit den erfindungsgemäß de finierten Peptiden über die Carboxyl-Funktion amidartig verbunden, wodurch Strukturen des Typs Peptid-NH-CO-Ankermolekül entstehen, welche wiederum, wie dargelegt, auf dem Implantat fixiert werden, wodurch wiederum Konstrukte des folgenden Typs entstehen:

Peptid-NH-CO-Ankermolekül-Implantat(oberfläche).

Bevorzugt sind entsprechende Implantat-Konstrukte, welche sich zusammensetzen aus einem der oben einzeln genannten definierten Peptide, insbesondere RGD- Peptide, einem der oben einzeln aufgeführten allgemeinen und speziell definierten Ankermoleküle und einem entsprechend oberflächenreaktiven Implantat. Besonders bevorzugt sind folgende Implantate:

cyclo-RGDfK NH-CO-Thiol-Derivate (Typ: i)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivate (Typ: ii)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivate (Typ: iii)-Implantat,

worin die lineare C-Kette des gesamten Ankermoleküls mindestens sechs C-Atome aufweist.

Darunter sind inbesondere bevorzugt:

cyclo-RGDfK NH-CO-Thiol-Derivat (Typ: ib)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivat (Typ: iiia)-Implantat,
cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Glycol-Derivat (Typ: iiib)-Implantat.

Die Herstellung dieser bevorzugten Strukturen erfolgt nach Standardmethoden, bzw. ist weiter unten, oder in der am gleichen Tag angemeldeten Parallelanmeldung des Anmelders, die die Peptid-Ankerstrukturen als solche zum Gegenstand hat, be schrieben.

Wie bereits weiter oben angesprochen, werden zur Verankerung der beschriebenen zell- bzw. gewebeselektiven Peptid-Derivate an Biomaterialoberflächen gemäß der Erfindung im wesentlichen drei Alternativwege verfolgt, wobei das molekulare Er kennungsmuster der die jeweilige RGD-Sequenz tragenden Domäne selektiv für ei nen bestimmten Zelltyp sowie der Abstandshalter unverändert bleiben können, wäh rend der Molekülanker je nach den aufgeführten Kopplungsvarianten, variiert wer den kann, beispielsweise durch:

- Kopplung von Thiol-Peptid-Derivaten an goldbeschichtete Biomaterialoberflä chen (z. B. mit Typ (i) Ankermolekülen);
- Kopplung von (Meth)Acryloyl-Peptid-Derivaten an acrylat- bzw. methacrylat beschichtete Biomaterialoberflächen. (z. B. mit Typ (ii) Ankermolekülen);
- Kopplung von (Meth)Acryloyl-Peptid-Derivaten an silanbeschichteten Bioma terial-oberflächen mit einem (Meth)Acryloyl-Silanderivat als Haftvermittler bzw. Zwischenschicht (z. B. 3-Methacryloxypropyl-trimethoxysilan).

Die Erzielung der kritischen Mindestlänge des Ankermoleküls für verschiedene Peptid-Kopplungsvarianten an Biomaterialoberflächen erfolgt durch Synthese der erfindungsgemäß definierten Peptide mit den erfindungsgemäß definierten Anker molekülen von einer Kettenlänge mit vorzugsweise 6 bis 18 C-Atomen und wahl weise unterschiedlichen Hydrophobie-/Hydrophilie-Eigenschaften (z. B. durch Verwendung zahlenmäßig unterschiedlicher Einheiten von -CH₂- und/oder Ami dohexansäure oder Ethylenglycol nach an sich Standardmethoden und anschließen der Testung der biologischen Wirksamkeit durch Bestimmung der Zelladhäsion in vitro nach Beschichtung entsprechender Biomaterialoberflächen).

Auf die beschriebene Weise kann je nach den Materialeigenschaften des Implantats ein geeignetes Beschichtungsverfahren zur Konditionierung der Oberflächen vor der eigentlichen Kopplung mit den erfindungsgemäßen Peptid-Derivaten ausgewählt werden. Darüber hinaus ist in Abhängigkeit vom Gewebetyp bzw. dem Zelltyp, der die Integration des Biomaterials/Implantats vollführen soll, die Beschichtung mit anderen Peptiden möglich, die wiederum zielgerichtet die Integrine der entspre chenden Ziel-Zell-Spezies aktivieren, wie z. B. das alpha₆beta₄-Integrin von Epit helzellen (z. B. zum Einsatz von Knochen-, Kiefer-, Haut- oder Haarimplantaten) oder das alpha_IIbbeta₃-Integrin von Blutplättchen. Alpha_vbeta₃-spezifische RGD- Peptide weisen eine Selektivität gegenüber Endothelzellen auf, wodurch sie sich z. B. zur Beschichtung von Gefäßprothesen eignen würden. Hierdurch kann für Im plantate auf dem Gebiet des Knochen,- Gefäß, Zahn-, Haut- und Haarersatzes für nahezu jedes beliebige Organ eine geeignete bioaktivierende Oberflächenbeschich tung realisiert werden.

Ehe entsprechende erfindungsgemäße Implantate oder biohybride Organe bereitge stellt werden können, müssen zuvor die für den jeweiligen Zelltyp geeigneten Pepti de in einem in vitro-Testsystem auf biologische Wirksamkeit geprüft und ermittelt werden, um später eine gezielte und selektive Beschichtung des Implantats, welches in das ausgesuchte Gewebe eingebracht werden soll, vorzunehmen zu können. Die hierfür notwendige Analyse der Integrin-Rezeptor-Struktur des Zielgewebes bzw. der Zielzellen, in welches das Implantat eingebracht werden soll, erfolgt mit tels gängiger, bekannter, immunhistologischer Verfahren, wie z. B. mittels Immun fluoreszenz oder der Immunhistochemie von Gewebeproben. Die hierfür erforderli chen Antikörper gegen verschiedene Integrin-Rezeptoren bzw. deren Untereinheiten sind mittlerweile bekannt und stehen zur Verfügung oder können entsprechend mit tels an sich bekannter Standardmethoden, wie beispielsweise geeigneter Immunisie rungen, erzeugt werden.

Die erfindungsgemäß definierten Peptide werden in verschiedenen Konzentrationen kovalent an Kulturoberflächen beispielsweise aus mit Rinderserumalbumin (BSA) beschichteten Polystyrol gekoppelt. Das Material dieses Testträgers spielt bei der Ermittlung der geeigneten Peptide keine essentielle Rolle. Ebenso ist die angewen dete Kopplungsmethode hier noch von geringer Bedeutung. Aus praktischen Grün den kann die Kopplung bei diesen Ermittlungen auch mittels Inkubation und Ad sorption der besagten Peptide an den Testträger erfolgen.

Anschließend wird die Adhäsion von ausgesuchten Gewebe-Zellkulturen (z. B. Osteoblasten), die den Zellen, die in vivo im natürlichen Gewebe aktiviert werden sollen, in ihren Adhäsionseigenschaften zu entsprechen vermögen, an die entspre chend beschichteten Oberflächen untersucht. Das Kriterium zur Auswahl geeigneter Zellkulturen für die Adhäsionsexperimente besteht im vergleichbaren Integrations expressionsmuster zu den Zielzellen in vivo nach Implantation, zum Beispiel deren alpha_vbeta₃-/alpha_vbeta₅-Expression, die mittels fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen alpha_vbeta₃ -und alpha_vbeta₅-Integrine bzw. gegen die alpha_v-, die beta₃- bzw. gegen die beta₅-Untereinheiten des Integrin-Rezeptors anhand eines Fluore scence Activated Cell Sorter (FACS) verifiziert wird. Bei anderen Ziel-Zell-Spezies in vivo mit unterschiedlichen Integrinrezeptor-Muster müssen entsprechend andere Antikörper eingesetzt werden. Solche sind mittlerweile bekannt und stehen zur Ver fügung oder können entsprechend bekannter Standardmethoden z. B. mittels geeig neter Immunisierung erzeugt werden. Die verschiedenen selektierten Zell-Spezies werden auf mit den in Frage kommen den Peptiden beschichteten, BSA-vorbehandelten Polystyrol-Kulturoberflächen an gesät und inkubiert. Anschließend werden nicht adherierte Zellen abgewaschen. Das Bindungsverhalten der unterschiedlichen, ausgewählten Zell-Spezies an den mit unterschiedlichen erfindungsgemäß definierten Peptiden beschichteten Testoberflä chen entspricht im positiven Fall, das heißt, wenn eine ausreichende Spezifität vor liegt, jeweils einer Titrationskurve mit einer maximalen Adsorptionsrate von etwa 60 bis 100% der angesäten Zellen sowie einer halbmaximalen Zellanbindung bei einer RGD-Peptid-Konzentration in der Beschichtungslösung von etwa 5 nM bis 5 µM.

In ähnlicher Weise, wie für die Kopplung geeigneter Peptide an BSA- vorbeschichteten Polystyroloberflächen beschrieben, sind Verankerungsstrategien an modifizierte bzw. konditionierte Biomaterialoberflächen unter Verwendung ver schiedener Haftvermittlungszwischenschichten möglich.

Zusammengefaßt, läßt sich folgendes sagen:
Die Implantate des Standes der Technik weisen folgende Nachteile auf:

- unvollständige, langsame Implantatintegration ins Gewebe,
- eingeschränkte Akzeptanz im Gewebe,
- unzureichende funktionelle Stabilität der Implantat/Gewebegrenzschicht
- mangelnde stimulierende Wirkung des Implantats auf die Gewebeneogenese
- unphysiologische Eigenschaften der Implantatoberfläche.

Als Konsequenzen hieraus ergaben sich weitere Probleme:

- aseptische Implantatlockerungen (z. B. fibröse Kapselbildung)
- lokale Bildung von Mikrothrombi,
- Infektionen,
- Entzündungen,
- Geweberesorptionen,
- Revisonen.

Diese Probleme können durch das bereitgestellte erfindungsgemäße Verfahren bzw. der hierdurch erzeugten Implantate weitgehend beseitigt werden. Die erfindungsge mäßen Gegenstände zeichnen sich aus durch:

- maßgeschneidertes Design von Adhäsionspeptiden, welche komplementär zum Integrin-Expressions-muster der Zielgewebe/Zielzellen sind;
- selektive Stimulierung der Zelladhäsion der Zielzellen, die die Gewebeneoge nese vollführen sollen;
- Beschichtungen höherer Stabilität mittels neuartiger Peptid-Anker-Moleküle;
- Beschleunigung und Verstärkung des Implantat-Integrationsprozesses in das Gewebe.

Es konnte gezeigt werden, daß der kritische sterische absolute Mindestabstand zwi schen Zellerkennungssequenz auf dem Peptid und unbeschichteter Matarialoberflä che zwischen 2,0 und 3,5 nm, vorzugsweise zwischen 2,5 und 3,5 nm liegt. Maxi male Belegungsraten (80-100%) können bei einem Mindestabstand von 3,0 bis 5,0 nm erzielt werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb.

1:
Analyse der Integrinzusammensetzung von primären Human- Osteoblasten durch FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) mittels fluoreszenzkonjugierter Antikörper gegen alpha_v

beta₃

- und alpha_v

beta₅

- Integrine.
x-Achse: Fluoreszenzintensität (Counts)
y-Achse: Zellzahl
M21: alpha_v

beta₃

- und alpha_v

beta₅

-Positivkontrollen
O1-O3: Kulturen primärer Human-Osteoblasten aus drei verschiede nen Patienten.

Abb. 2:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden über BSA beschichteten Polystyrol-Testoberflächen.
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung, (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%);
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-S-(Sulfo-SMPB) ("Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat"), SMPB = Succinimidyl-4(p-Maleimido phenyl)-Butyrat;
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-S- (Sulfo-SMPB) ("Thiolpeptid 2-SMPB-Derivat")
untere Kurve: Thiolpeptid-Kontrolle: cyclo-RßADfK-NH-CO-CH₂- CH2-S-(Sulfo-SMPB).

Abb. 3:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat be schichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2):
x-Achse: Peptidkonzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%),
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere obere Kurve: primäre humane Osteoprogenitorzellen
mittlere untere Kurve: primäre humane Osteoblasten
untere Kurve: primäre Ratten-Osteoblasten.

Abb. 4:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPP-Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. Abb. 2)
x-Achse: Konzentr. an gelöstem cyclo-RGDfK (ohne Molekülanker) im Anhaftungsmedium (µM),
y-Achse: Zell-Belegungsgrad (%);
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: primäre Ratten-Osteoblasten.

Abb. 5:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. Abb. 2),
x-Achse: Zahl angesäter Zellen/cm²
y-Achse: Zahl adherierter Zellen/cm²
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
mittlere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: BSA-Negativbeschichtung.

Abb. 6:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2),
x-Achse: Zahl angesäter Zellen/cm
y-Achse: berechneter Flächenbedarf/Zellen (µm²)
obere Kurve: primäre Human-Osteoblasten
untere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten.

Abb. 7:
Adhäsion von Osteoblasten an mit Thiolpeptid 1-SMPB-Derivat Derivat (10 µM in der Beschichtungslösung) beschichteten Testoberflächen (s. unter Abb. 2),
x-Achse: Zeit (min)
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: MC3T3 H1-Mäuse-Osteoblasten;
untere Kurve: primäre Human-Osteoblasten.

Abb. 8:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten Knochenzement-PMMA-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDJK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib),
mittlere untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia).

Abb. 9:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten, porösen PMMA/PHEMA-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib).

Abb. 10:
Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD- Peptiden beschichteten, porösen PMMA/Plex Y7H-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid Konzentration in der Beschichtungslösung (µM),
y-Achse: Zellbelegungsgrad (%)
obere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiia),
mittlere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iiib),
untere Kurve: cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iib).

Abb. 11:
Maximale Adhäsion von MC3T3 H1-Osteoblasten an mit verschiedenen RGD-Peptiden verschiedener Moleküllängen beschichteten Knochen zement-PMMA- bzw. Polystyrol-BSA-SMPB-Oberflächen:
x-Achse: RGD-Peptid-Moleküllängen (nm)
y-Achse: maximaler Belegungsgrad (%).

Beispiel 1

a) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Mercaptopropionsäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Thiol-Derivat Typ: ia) wurde entsprechend dem Verfahren aus der DE 195 38 741 durchgeführt. Ana log wurde die Synthese des in seiner biologischen Wirkung inaktiven entsprechen den cyclo-RßADfK-Derivats sowie des cyclo-RGDfK-Derivats ohne Ankermolekül durchgeführt.
b) cyclo (R(Pbf)GD(tBu)fK(Z)) (Pbf = pentamethyl-benzofuran-sulfonyl; tBu = tert. Butyl) wurde durch Festphasenpeptidsynthese (Merrifield, Angew. Chem. 1985, 97: 801) und anschließender Cyclisierung (z. B. nach Zimmer et al., 1993, Liebigs Ann. Chem: 497) erhalten. Nach selektiver Abspaltung der Z- Schutzgruppe nach Standardmethodik kann die Lysinseitenkette durch Umsetzen von 0.1 mmol cyclo (R(PbfJGD(tBu)fK) mit 0.2 mmol Bernsteinsäureanhydrid (bsa) in 5 ml Dimethylformamid zu cyclo (R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]) verlängert werden.
c) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Mercaptoethylamidobernsteinsäure (→ cyclo-RGDtK NH-CO-Thiol- Derivat Typ: ib = cyclo(RGDf[Thiol-bsa-K]) wurde wie folgt, durchgeführt: 10 mmol Cysteaminhydrochlorid und eine äquimolare Menge (eq.) an Triphenylmetha nol wurden bei 60°C in Eisessig gelöst und unter Rühren mit 1.1 eq. BF₃-Etherat versetzt. Nach 50 minütigem Rühren wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung neu tralisiert und mit Essigester extrahiert. Das aus dem Extrakt verbleibende Öl wurde zur Überführung in das Hydrochlorid in tert.-Butanol gelöst, mit verdünnter Salz säure auf pH = 2 gebracht und gefriergetrocknet. Ausbeute 99%. Der so erhaltene Baustein wird mit EDCl×HCl nach Standardmethoden an cyclo (R(Pbf)GD(tBu)f[bsa-K]) gekuppelt und die Seitenschutzgruppen werden abgespal ten.
d) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Acrylamidohexansäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Acryl-Derivat Typ: iia = cyclo(RGDf[Acryl-ahx-K]) wurde wie folgt, durchgeführt:
Das Acrylankersystem wurde seperat synthetisiert und als Aktivester an die Pep tidseitenkette gekuppelt. Dazu wurden 10 mmol 6-Aminohexansäure und 1.8 eq. Calciumhydroxid in Wasser suspendiert und bei 0°C 1,2 eq. Acrylsäurechlorid zuge geben. Unlösliches Calciumhydroxid wurde abfiltriert und das Filtrat mit konzen trierter Salzsäure auf pH 2 angesäuert. Das ausgefallene Produkt wurde aus Essige ster rekristallisiert. Ausbeute: 65%. 10 mmol der kristallinen 6-Acryl amidohexansäure wurden in 50 ml Dichlormethan suspendiert, mit 1 eq. N- Hydroxysuccinimid versetzt und bei 0°C 1.2 eq. EDCl×HCl zugegeben. Nach ein stündigem Rühren wurde die Reaktion durch Zusatz von 10 µl Eisessig gestoppt. Es wurde mehrfach mit kalter, gesättigter Natriumcarbonatlösung und mit Wasser ex trahiert und anschließend über Natriumsulfat getrocknet. Ausbeute: 52%. Der nun vorliegende Aktivester wurde in DMF an cyclo(R(Pbf)GD(tBu)fK) angekuppelt und die Seitenkettenschutzgruppen nach Standardvorschriften abgespalten.
e) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Acrylamidohexansäure-amidohexansäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO- Acryl-Derivat Typ: iib = cyclo(RGDf[Acryl-ahx-ahx-K]) wurde wie folgt, durchge führt:
Zur Synthese des Acrylankersystems werden 10 mmol Aminohexansäure in wäßri gem Natriumphosphatpuffer (pH 8) gelöst und auf 0°C gekühlt. 2 mmol Acrylami dohexansäureaktivester (siehe (d)) wurden in Ethanol/CHCl₃ gelöst und langsam zugegeben. Der pH-Wert wurde mit verdünnter NaOH konstant auf 8 gehalten.
Nach Abdestillieren der organischen Lösungsmittel wurde die wäßrige Phase mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2.6 angesäuert und der ausfallende Feststoff abfil triert, mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 70%. Das nun vorliegende Acrylankersystem wird mit EDCl×HCl nach an sich be kannten Methoden an die Peptidseitenkette gekuppelt und die Schutzgruppen abge spalten.
f) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Acrylamidohexansäure-amidotriethylenglycolsäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Acryl-Derivat Typ: iiia = cyclo(RGDf[Acryl-ahx-tEG-K]) wurde wie folgt, durchgeführt:
Das Acrylankersystem wurde durch Festphasenpeptidsynthese (siehe oben) darge stellt. Als letzter Baustein wurde die Acrylamidohexansäure (siehe oben) gekuppelt. Ausbeute: 97%. Das nun vorliegende Acrylankersystem wird mit EDC×HCl nach an sich bekannten Methoden an die Peptidseitenkette gekuppelt und die Schutzgrup pen abgespalten.
g) Die Synthese des cyclo-RGD-Peptids (Arg-Gly-Asp-DPhe-Lysin) mit dem Anker Acrylamidohexansäure-amidotriethylenglycolsäure-amidotriethylen glycolsäure (→ cyclo-RGDfK NH-CO-Acryl-Derivat Typ: iiib = cyclo(RGDf [Acryl-ahx-tEG-tEGK]) erfolgte analog zu (f). Ausbeute: 85%.

Beispiel 2

In Anlehnung an die etablierten Verfahren von Singer et al., 1987, J. Cell. Biol. 104: 573, bzw. von Ruoslahti et al. (1982, Methods. Enzymol., 82: 803-831) wurde die kovalente Kopplung der erfindungsgemäßen Peptide mit Sulfo-Succinimidyl-4 (p-Maleimidophenyl)-Butyrat (Sulfo-SMPB) an mit Rinderserumalbumin (BSA) vorbeschichteten Kulturoberflächen aus Polystyrol vollzogen.

Hierzu wurden 48-Wells (Costar, "non-tissue culture treated", Art. Nr. 3547) mit je 250 µl PBS (phosphate buffered sahne), pH = 8,3, 2% BSA, pro Vertiefung über schichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um eine auf dem Polystyrol befindliche BSA-Schicht zu generieren. Anschließend wurde mit 250 µl PBS, pH = 8,3 pro Vertiefung gewaschen und mit je 250 µl einer Lösung mit 100 µg/ml SMPB in PBS, pH 8,3, 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte ein drei maliges Waschen der Wells mit je 250 µl PBS, pH 8,3. Zur Herstellung der Be schichtungslösungen wurde das entsprechende Thiol-RGD-Peptid in folgenden Endkonzentrationen in PBS, pH 8,3, angesetzt: 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM, 10 µM, 100 µM, und 1 mM. Nach Zugabe von je 250 µl Beschichtungslösung/Well wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend dreimal mit PBS, pH 8,3, gewaschen. Durch Zugabe von je 250 µl einer 5%igen BSA-Lösung in PBS, pH 7,4, anschließender Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS, pH 7,4, wurden unspezifische Zellbindestellen blockiert. Als Beschich tungs-Negativkontrollen fungierten Polystyroloberflächen, die ab der Beschichtung mit einer 5%igen BSA-Lösung identisch wie die Positivproben behandelt wurden. Anschließend wurde die Adhäsion von vier Zellkulturen, die aus drei unterschiedli chen Spezies gewonnen wurden, an die oben genannten mit RGD-Peptid beschichte ten Oberflächen untersucht:

- primäre humane Osteoblasten aus der Femurkopfspongiosa adulter Patienten (Siggelkow et al., 1997, Bone 20: P231);
- primäre humane Osteoprogenitorzellen aus dem Knochenmark adulter Patienten (Vilamitjana-Amedee et al., 1993, In vitro Cell Dev. Biol. 29: 699);
- primäre Osteoblasten aus der Kalvaria neonataler Ratten, deren Präparation und Kultivierung in Anlehnung an die Methode von Yagiela und Woodbury (1977, The Anatomical Record, 188: 287-305) erfolgte; und
- Osteoblasten-Zellinie MC3T3 H1, gewonnen aus der Kalvaria neonataler Mäuse (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials, 5: 309-321).

Bevor diese Zell-Spezies zu den Adhäsionsexperimenten eingesetzt wurden, wurde deren Integrin-Expression mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen die al pha_vbeta₃- bzw. alpha_vbeta₅-Rezeptoren sowie gegen die Integrin-Untereinheiten al pha_v, beta₃ und beta₅ anhand eines Becton-Dickenson Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS) verifiziert. Es zeigte sich dabei eine starke Expression der besagten Integrine (Abb. 1).

Die beschriebenen Zell-Spezies wurden mit einer Ansaatdichte von 48.000 Zel len/cm² in, wie oben beschrieben, mit RGD-Peptid beschichteteten Costar-48-Wells, angesät und anschließend 1 Stunde bei 37°C, 95% Luftfeuchte und 5% CO₂ inku biert. Anschließend wurden während des Experiments nicht adherierte Zellen zwei mal mit PBS, pH 7,4, abgewaschen.

Die Quantifizierung der adherierten Zellen erfolgte indirekt über die Aktivitätsbe stimmung des zellulären Enzyms N-Acetyl-Hexosaminidase unter Verwendung ei ner entsprechenden Standardkurve nach der Methode von Landegren (1984, J. Im munol. Methods, 67: 379-388).

Die Beschichtung von BSA-vorbehandelten Polystyrol-Zellkulturoberflächen mit den alpha_vbeta₃- bzw. alpha_vbeta₅-selektiven Thiolpeptiden 1-, 2-(Sulfo-SMPB)- Derivaten führt zu einer starken und dosisabhängigen Stimulierung der Adhäsion von kultivierten Maus MC3T3 H1-Osteoblasten (s. Abb. 2). Im Gegensatz hierzu hat die biologisch inaktive Thiolpeptid-Kontrolle keinen signifikanten Effekt, wo durch die hohe Selektivität und die hohe Spezifität der Integrin-RGD-Peptid Wech selwirkung gezeigt wird.

Das Bindungsverhalten der unterschiedlichen Zell-Spezies an mit Thiolpeptid 1- (Sulfo-SMPB)-Derivat oder Thioplpeptid 2-(Sulfo-SMPB)-Derivat beschichtete, BSA-vorbehandelte Polystyroloberflächen entspricht einer Titrationskurve mit ei ner maximalen Adsorptionsrate von ca. 70% (primäre Ratten-Osteoblasten), ca. 80% (primäre humane Osteoblasten und primäre humane Osteoprogenitorzellen) und ca. 90-100% (MC3T3 H1- Maus-Osteoblasten) der angesäten Zellen sowie einer halb maximalen Zellanbindung bei einer RGD-Peptid-Konzentration in der Beschich tungslösung von 50-1000 nM (Abbildung3).

Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten sind gegenüber mit 5% BSA-beschich teten Oberflächen, welche zu keiner signifikanten Zell-Adhäsion für alle eingesetz ten Osteoblasten Kulturen führen, ca. 20-40fach erhöht.

Das ähnliche Verhalten der genannten Osteoblasten-Kulturen belegt, daß die adhä sionsstimulierenden Effekte osteoblastenspezifisch jedoch speziesunabhängig sind. Die Bindung der oben genannten Osteoblasten-Zellkulturen an mit Thiolpeptid 1- Sulfo-SMPB-Derivat beschichteten BSA-vorbehandelten Polystyroloberflächen kann durch Zugabe von gelöstem zyklischen RGDfK im Anhaftungsmedium voll ständig inhibiert werden (Abb. 4). Dieses Ergebnis beweist, daß die beobachteten Zelladhäsionsphänomene alleine durch RGD-Peptide vermittelt werden.

Die Abhängigkeit der Zelladhäsion von primären humanen Osteoblasten bzw. von MC3T3 H1-Zellen auf den genannten Thiolpeptid 1,2 (Sulfo-SMPB) beschichteten, BSA-vorbehandelten Polystyroloberflächen von der Anzahl angesäter Zellen liefert eine Sättigungskurve (Abb. 5). Auf der BSA-Negativbeschichtung dagegen ist keine signifikante Zellanhaftung zu erkennen. Die bei maximaler Zellaussaatdichte be rechnete durchschnittliche Fläche pro adherierte Zelle von ca. 400 bis 500 µm² lie fert auf dieser Oberfläche einen durchschnittlichen Zell-Zell-Abstand von < 20 µm (Abb. 6). Da der Osteoblasten-Zelldurchmesser ca. 10 bis 15 µm beträgt, wird deutlich, daß die Peptidbeschichtung Zellanhaftungsstellen in solcher Zahl bereit stellt, daß eine mit Osteoblasten dicht belegte Oberfläche erzielt werden kann, bei der die Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander angeordnet sind. Der zeit liche Verlauf des Zellanhaftungsprozesses auf der genannten Oberfläche zeigt eine schnelle Adhäsion der Zellen, die, je nach Zelltyp, nach etwa 45 bis 60 Minuten ab geschlossen ist (Abb. 7). Signifikante Unterschiede zwischen den beiden verwende ten Thiolpeptid-Derivaten sind bei diesen Versuchen nicht erkennbar.

Beispiel 3

Zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Peptidmoleküllängen und damit des Abstandes zwischen der zellerkennenden RGD-Sequenz und der Materialoberfläche auf das Ausmaß der Osteoblasten-Adhäsion wurden vier verschiedene Acrylat- RGD-Peptide (cyclo-RGDfK NH-CO-Acrylat-Derivat (Typ: iia, iib, iiia, iiib), mit unterschiedlichen molekularen Abstandshalterlängen hergestellt.

Die Synthesen der cyclo-RGD-Peptide wurden, wie in Beispiel 1 angegeben oder entsprechend den Verfahren von Pless et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 2340-2349 bzw. von Gurrath et al., 1992, Eur. J. Biochem. 210: 911-921 durchgeführt. Die entsprechenden Moleküllängen dieser Peptide betragen etwa 2,6 nm (Acrylatpeptid 1, Typ iia), 3,5 nm (Acrylatpeptid 2, Typ iib), 3,7 nm (Acrylatpeptid 3, Typ iiia) bzw. 4,2 nm (Acrylatpeptid 4, Typ iiib).

Zur kovalenten Kopplung dieser Peptide an αuspolymerisierte PMMA (Polymethylmethacrylat)-Oberflächen wurden entsprechende Formkörper unter schiedlicher Porosität (Durchmesser: 10 mm; Höhe: 2 mm) aus drei verschiedenen PMMA-Komponenten hergestellt.

- Knochenzement auf PMMA-Basis (Fa. Merck KGaA, Germany, Zul. Nr. 5181.00.00) entsprechend der Produktbeschreibung (40 g Pulver + 20 ml Flüssig keit).
- 10 g PMMA/PHEMA (Polyhydroxyethylmethacrylat)-Granulat, Partikelgröße 0,5-0,6 mm (Fa. Biomet) wurden mit 1,3 ml einer HEMA-Lösung (68,6% HEMA, 29,4% TEGMA, [Triethylenglykoldimethacrylat], 2% tBPB, [tert. Butylperoxyben zoat]) vermischt und dadurch zu einem porösen Trägermaterial verklebt.
- 10 g PMMA-Granulat (Plex Y7H, Röhm, Germany), Kornfraktion 0,7-2 mm wur den mit 1,5 ml einer Methylmethacrylat (MMA)-Lösung (68,6% MMA, 29,4% TEGMA 2% tBPB) vermischt und dadurch zu einem porösen Trägermaterial ver klebt.

Zur kovalenten Kopplung der Acrylatpeptide an die vorpolymerisierten PMMA- Formkörper wurden Stammlösungen der Acrylatpeptide 1, 2, 3 und 4 in einer End konzentration von jeweils 100 µM in DMSO/0,2% Campherchinon (w/v) herge stellt. Anschließend wurden durch Verdünnung mit Isopropanol/0,2% Campher chinon (w/v) Konzentrationsreihen mit Peptidendkonzentrationen von jeweils 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM und 10 µM hergestellt. Die Formkörper wurden 2 Stunden bei Tageslicht und Raumtemperatur inkubiert und anschließend in trockenem Zu stand bei 4°C gelagert. Vor Gebrauch wurden die Proben zur Entfernung ungebun dener Peptide dreimal mit PBS, pH 7,4, gewaschen und über Nacht in PBS, pH 7,4, bei 4°C gelagert.

Durch Zugabe von je 250 µl/Formkörper einer 5%igen BSA-Lösung in PBS, pH 7,4, und anschließender Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und einmali gem Waschen mit PBS, pH 7,4, wurden unspezifische Zellbindestellen blockiert. Als Negativkontrollen fungieren PMMA-Formkörper, die anstelle mit den Peptidlö sungen mit einer Lösung aus Isopropanol/0,2% Campherchinon (w/v) behandelt wurden.

Im Anschluß wurde die Adhäsion von Osteoblasten der MC3T3 H1-Linie, gewon nen aus der Kalvaria neonataler Mäuse (Heermeier et al., 1995, Cells and Materials 5: 309-321) an o. b. peptidbeschichtete Oberflächen untersucht.

Die MC3T3 H1-Osteoblasten wurden mit einer Ansaatdichte von 48.000 Zellen/cm² auf, wie oben beschrieben, in Costar-48-Wells befindlichen, mit RGD-Peptid be schichteten, PMMA-Formkörpern angesät und anschließend 1 Stunde bei 37°C, 95% Luftfeuchte und 5% CO₂ inkubiert. Anschließend wurden während des Expe riments nicht adherierte Zellen zweimal mit PBS, pH 7,4, abgewaschen.

Das Bindungsverhalten der MC3T3 H1-Osteoblasten an mit genannten Acrylat- RGD-Peptiden 1 (Typ iia), 2 (Typ iib), 3 (Typ iiia) und 4 (Typ iiib) beschichteten, unterschiedlichen PMMA-Formkörpern entspricht jeweils einer Titrationskurve. Die maximalen Adsorptionsraten betragen ca. 20% für Acrylatpeptid 1 und ca. 80-100% für die Acrylatpeptide 2, 3 und 4. Die halbmaximale Zellanbindung erfolgen bei ei ner RGD-Peptidkonzentration in der Beschichtungslösung von ca. 1-10000 nM für die Acrylatpeptide 2, 3 und 4.

Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten auf RGD-Peptid-beschichteten Knochen zement-Formkörpern sind gegenüber unbeschichteten Oberflächen ca. 1,5fach (Acrylatpeptid 1) und ca. 5-15fach (Acrylatpeptide 2, 3 und 4) erhöht (Abb. 8).

Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten auf RGD-Peptid-beschichteten porösen PMMA/PHEMA-Granulat-Formkörpern sind gegenüber unbeschichteten Oberflä chen 2-5fach (Acrylatpeptide 2, 3 und 4) erhöht (Abb. 9).

Die beschriebenen Zell-Adsorptionsraten auf RGD-Peptid-beschichteten porösen Plex Y7H-Granulat-Formkörpem sind gegenüber unbeschichteten Oberflächen 2-3 fach (Acrylatpeptide 2, 3 und 4) erhöht (Abb. 10).

Für PMMA/PHEMA- bzw. für PMMA-Plex Y7H-Proben werden sowohl eine grö ßere Schwankungsbreite der Zelladhäsionswerte als auch eine stärkere Anhaftung der Osteoblasten an unbeschichtete Kontrollproben bei gleichbleibenden maximalen Anhaftungsraten an RGD-Peptid-beschichtete Proben beobachtet als für PMMA- Knochenzementformkörper.

Für die Acrylatpeptide 2, 3 und 4 werden sowohl im Vergleich untereinander als auch im Vergleich zu den auf der Test-BSA-Kontrolle beschichteten Thiolpeptiden 1 und 2 sehr ähnliche Stimulierungen der Zell-Adhäsion beobachtet, das kürzeste Peptid, Acrylatpeptid 1, ist dagegen fast inaktiv. Daraus kann geschlossen werden, daß ein kritischer Mindestabstand zwischen RGD-Zellerkennungssequenz und der Materialoberfläche von ca. 2,5-3,5 nm erforderlich ist, um eine sterisch erfolgreiche Zell-Adhäsion vollziehen zu können (Abb. 11).

Die höhere Aktivität von Acrylatpeptid 3 auf dem Knochenzement-PMMA-Träger weist auf eine für die Zellanhaftung optimale Molekülstruktur hinsichtlich sowohl der Moleküllänge als ggf. auch der Hydrophilie/Hydrophobie-Verteilung bzw. -Ver hältnis im Abstandshalter hinweisen.

Claims

1. Implantat, geeignet für unterschiedliche menschliche und tierische Organe, beste hend im wesentlichen aus einer Trägermatrix und einer diese Matrix umhüllenden Peptid-Beschichtung, die zur zielgerichteten Adhäsionsstimulierung von menschli chen oder tierischen Körperzellen Peptide enthält, welche Sequenzen aufweisen, die Bindungsstellen auf den für die Adhäsion verantwortlichen Integrin-Rezeptoren auf humanen oder tierischen Zellen erkennen, wobei die Trägermatrix reaktive bin dungsfähige Gruppen an ihrer Oberfläche aufweist, die dazu befähigt sind mit ent sprechenden funktionellen reaktiven Gruppen besagter Peptidschicht eine stabile kovalente Bindung einzugehen, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Peptide so auf der Oberfläche des Implantats angeordnet sind, daß sie aufgrund ihrer entsprechend unterschiedlichen strukturbedingten, zelladhäsions-stimulierenden Aktivität spezi fisch dem natürlichen unterschiedlichen komplementären Integrinmuster der in der jeweiligen Region an sie angrenzenden Gewebezellen entsprechen, in die das Im plantat eingebracht werden soll, wodurch ein lokal differenziertes, selektives, bio aktives Beschichtungsmuster der Implantatoberfläche vorliegt.

2. Implantat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide mit Hilfe von Ankermolekülen auf der Oberfläche des Implantats fixiert sind.

3. Implantat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankermoleküle aus einer der folgenden Strukturen bestehen:
-CO-(CH2)_k-X-SH, (i)
wobei X eine Einfachbindung oder -CO-NH-(CH2)-,
k = 2 bis 12 und 1 = 2 bis 4 bedeutet;
-CO-(CH2)_m-[NH-CO-(CH2)_n]_p-NHCO-CH=CH2, (ii)
wobei m, n = 2 bis 8; p = 0 bis 2 bedeuten;
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)_q-CO-(CH2)_r-NH-CO-CH=CH2, (iii)
wobei q = 1 bis 3 und r = 2 bis 8 bedeutet.

4. Implantat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankermoleküle aus einen der folgenden Strukturen ausgewählt werden:
-CO-CH2-CH2-SH; (ia)
-CO-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-SH; (ib)
-CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2; (iia)
-CO-(CH2)₅-NH-CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2; (iib)
-CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH-CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2; (iiia)
-(CO-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-NH)₂-CO-(CH2)₅-NH-CO-CH=CH2 (iiib)

5. Implantat nach einen der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Pepti de über die Carboxyl-Gruppe des Ankermoleküls durch Amid-Bindung und die An kermoleküle über die Mercapto- oder Acrylat-Gruppe an die Implantatoberfläche gebunden sind.

6. Implantat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein solches Peptid- Ankermolekül an der Implantatoberfläche fixiert ist, so daß ein sterisch kritischer, absoluter Mindestabstand zwischen Zellerkennungsdomäne des Peptides und un schichteter Materialoberfläche von 2,5 bis 3,5 nm, vorliegt.

7. Implantat nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide an α_vβ₃- /α_vβ₅ exprimierende Zellen zu binden vermögen.

8. Implantat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es Pepti de mit der Aminosäuresequenz RGD aufweist.

9. Implantat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es Peptide der Sequenz cyclo-RGDfK aufweist.

10. Implantat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zwi schem den besagten Peptiden bzw. Peptid-Ankermolekülen und der Oberfläche der Trägermatrix eine haftvermittelnde Zwischenschicht und/oder verzweigte Molekü le, die einen oberflächenvergrößernden Effekt bewirken, aufweist.

11. Implantat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägermatrix ein entsprechendes Formstück aus Keramik, Polymermaterial, Metall ist oder ein strukturiertes Gebilde aus diesen Materialien darstellt, daß durch in vivo oder in vitro Besiedlung mit Zellen als biohybrides Organ ausgebildet werden kann.

12. Verfahren zur Herstellung von Implantaten gemäß der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Integrin-Rezeptor-Struktur des Zielgewebes, in welches das Implantat in vivo eingebracht werden soll, mittels eines in-vitro Testsystems bestimmt,
b) die besagten Peptide mit der entsprechenden komplementären Struktur auswählt bzw. synthetisiert und,
c) die besagten Peptide direkt oder über die besagten Ankermoleküle an die jewei lige, gegebenenfalls modifizierte Oberfläche des Implantats kovalent bindet, wobei die lokale Anordnung unterschiedlicher Peptide auf der Oberfläche des Implantats der jeweiligen zuvor festgestellten lokalen Anordnung der Zielzellen mit dem kom plementären Integrinmuster entspricht, in die das Implantat eingebracht werden soll.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die in vitro-Bestimmung der Integrin-Rezeptor-Struktur des Zielgewebes mittels immunhistologisch wirksa mer Antikörper erfolgt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung der besagten Peptide bzw. der Peptid-Ankermoleküle an die Implantatoberfläche mittels für andere Beschichtungsarten bekannter Verfahren erfolgt.