DE19750215C1 - Gelatin membrane filter increasing number of viable micro-organisms collected from gas - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Gelatinemembranfilter zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen unter Erhalt einer erhöhten Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.The invention relates to gelatin membrane filters for collecting microorganisms Gases while maintaining an increased number of viable microorganisms as well Process for their production.
Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter sind zur Sammlung von Mikroorganismen aus gasförmigen Medien, insbesondere aus Luft, in der pharmazeutischen, biotechnologischen und Lebensmittelindustrie, im Umweltschutz, in der Abfallwirtschaft und in medizinischen Einrichtungen zur Bestimmung der Keimzahlbelastung der Medien einsetzbar. Sie dienen beispielsweise in Kombination mit einem Luftkeimsammelgerät zur Sammlung von Bakterien, Viren, Hefen und Pilzen, um deren Konzentration in Räumen bestimmen zu können. Derartige Überwachungen sind Voraussetzung für die rechtzeitige Einleitung von Maßnahmen, um Personen und Produkte vor Schädigungen durch zu hohe Mikroorganismenkonzentrationen zum Beispiel in der Raumluft zu bewahren.The gelatin membrane filters according to the invention are for collecting microorganisms from gaseous media, in particular from air, in the pharmaceutical, biotechnological and food industry, environmental protection, waste management and in medical facilities for determining the bacterial count of the media applicable. They are used, for example, in combination with an air sampler Collection of bacteria, viruses, yeasts and fungi in order to concentrate them in rooms to be able to determine. Such monitoring is a prerequisite for timely Initiation of measures to prevent persons and products from being damaged by to maintain high concentrations of microorganisms, for example in the room air.
In bestimmten Räumen mit besonderen Anforderungen an die Beschaffenheit der Luft, wie in klimatisierten Räumen, Reinräumen und Isolatoren, wird die Luft regelmäßig auf ihren Keimgehalt hin untersucht. Da es sich in der Regel um gefilterte Luft handelt, die naturgemäß einen geringen Gehalt an Mikroorganismen aufweist, müssen gewöhnlich große Volumina untersucht werden, um ausreichend Keime für aussagefähige Ergebnisse zu sammeln. Dazu wird eine Luftprobe durch ein geeignetes Filter filtriert. Als Filter werden für diesen Zweck sterile Membranfilter mit Porengrößen im Mikrofiltrationsbereich vorwiegend auf der Basis von Cellulosenitrat, Celluloseacetat und Gelatine eingesetzt, wie sie beispielsweise in der DE-PS 11 73 640 beschrieben sind. Besonders geeignet sind Gelatinemembranfilter, auf denen die zurückgehaltenen Mikroorganismen feucht und vermehrungsfähig gehalten werden sollen. Nach der Probenahme können die Gelatinemembranfilter entweder auf einem Agarnährboden bebrütet werden, wobei aus den einzelnen gesammelten Keimaggregaten Mikroorganismenkolonien heranwachsen (der Gelatinemembranfilter verflüssigt sich und verschwindet und die Mikroorganismenkolonien können direkt auf dem Agar gezählt werden), oder in einer sterilen Lösung, wie einer Pepton-Wasser- oder einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst werden, so daß Teilmengen auf verschiedenen Nährmedien bebrütet werden können.In certain rooms with special air quality requirements, As in air-conditioned rooms, clean rooms and isolators, the air is regularly raised examined their germ content. Since it is usually filtered air, the naturally has a low content of microorganisms, usually large volumes are examined to ensure sufficient germs for meaningful results to collect. To do this, an air sample is filtered through a suitable filter. As a filter For this purpose, sterile membrane filters with pore sizes in the Microfiltration area mainly based on cellulose nitrate, cellulose acetate and gelatin used, as described for example in DE-PS 11 73 640. Gelatin membrane filters on which the retained ones are particularly suitable Microorganisms should be kept moist and capable of reproduction. After The gelatin membrane filters can be sampled either on an agar culture medium are incubated, from the individual collected germ aggregates Colonies of microorganisms grow (the gelatin membrane filter liquefies and disappears and the microorganism colonies can be counted directly on the agar ) or in a sterile solution such as a peptone water or a physiological saline solution, so that subsets on different Culture media can be incubated.
Die DE-PS 11 73 640 schlägt auch allgemein vor, bei der Herstellung in das Gefüge einer Gelatinemembran Nährstoffe für die Anzüchtung von Mikroorganismen, ferner puffernd wirkende Substanzen, Farbstoffe oder Chemikalien einzulagern, die geeignet sind, in der Luft enthaltene, biologisch giftig wirkende Stoffe, wie Spuren von Schwermetallen oder schädliche Gase, zu absorbieren. Nachteilig ist, daß trotz Zugabe von Nährmedien oder von absorbierenden Stoffen zu den Gelatinemembranen, aus den auf ihnen gesammelten Mikroorganismen deutlich weniger Kolonien heranwachsen und bestimmt werden können als tatsächlich in dem kontaminierten Medium ursprünglich vorhanden waren.DE-PS 11 73 640 also generally suggests the manufacture of the structure a gelatin membrane nutrients for the cultivation of microorganisms, furthermore store buffering substances, dyes or chemicals that are suitable are biologically toxic substances in the air, such as traces of Absorb heavy metals or harmful gases. The disadvantage is that despite the addition from nutrient media or from absorbent substances to the gelatin membranes from which significantly fewer colonies grow on them and can be determined as actually original in the contaminated medium were present.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Gelatinemembranfilter zur Sammlung von Mikroorganismen aus Gasen zu schaffen, bei denen die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen deutlich erhöht ist als bei den Gelatinemembranfiltern des Standes der Technik sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Gelatinemembranfilter zu finden.The invention is therefore based on the object of collecting gelatin membrane filters by creating microorganisms from gases in which the number of detectable Microorganisms is significantly increased than in the gelatin membrane filters of the prior art Technology as well as a method for producing these gelatin membrane filters.
Die Aufgabe wird gelöst durch Gelatinemembranfilter, die durch die Merkmale der unabhängigen Patentansprüche charakterisiert sind. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Merkmale der abhängigen Patentansprüche benannt.The task is solved by gelatin membrane filters, which are characterized by the characteristics of independent claims are characterized. Advantageous further developments of Invention are identified by the features of the dependent claims.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen, die durch Filtration aus Gasen auf Gelatinemembranfilter gesammelt wurden, deutlich ansteigt, wenn die Gelatinemembranfilter sogenannte osmoprotektive Substanzen enthalten. Zu den osmoprotektiven Substanzen gehören beispielsweise Inositol, Betain, Lycin, Oxyneurin und andere. Es ist bekannt, daß diese Substanzen der Dehydratation der Mikroorganismen, einem osmotischen Streß, entgegenwirken. Offensichtlich verliert ein Teil der Mikroorganismen bei der Sammlung auf Gelatinemembranfiltern soviel an zellulärem Wasser, daß er nicht mehr lebensfähig ist und durch Bebrüten nicht mehr über Koloniebildungen nachweisbar ist. Darauf deutet auch die Tatsache hin, daß nurmehr etwa die Hälfte an Bakterien nachgewiesen werden konnte, wenn mit der gleichen Anzahl Bakterien beaufschlagte Gelatinemembranfilter beispielsweise statt eine Minute weitere 8 Minuten lang mit einem Luftstrom von 7,5 m3/h durchströmt wurden. Dieser Effekt war bei Gelatinemembranfiltern nicht zu erwarten, weil Gelatinemembranfilter Mikroorganismen ausdrücklich feucht und vermehrungsfähig halten sollten (Prospekt "Laborfiltration, Mikrobiologie, Elektrophorese" Seite 14, Sartorius GmbH 1984).Surprisingly, it was found that the number of detectable microorganisms, which were collected by filtration from gases on gelatin membrane filters, increases significantly if the gelatin membrane filters contain so-called osmoprotective substances. The osmoprotective substances include, for example, inositol, betaine, lycin, oxyneurin and others. It is known that these substances counteract the dehydration of the microorganisms, an osmotic stress. Obviously, some of the microorganisms lose so much cellular water when they are collected on gelatin membrane filters that they are no longer viable and are no longer detectable by colony formation through incubation. This is also indicated by the fact that only about half of the bacteria could be detected if the same number of bacteria was applied to the gelatin membrane filters with the same number of bacteria, for example, instead of a minute, with an air flow of 7.5 m 3 / h for a further 8 minutes. This effect was not to be expected with gelatin membrane filters because gelatin membrane filters should specifically keep microorganisms moist and capable of reproduction (brochure "Laboratory filtration, microbiology, electrophoresis" page 14, Sartorius GmbH 1984).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die Gelatinemembranfilter die osmoprotektiven Substanzen in einer Menge, die wenigstens zu einer Verdopplung der Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen führt im Vergleich zu Gelatinemembranfiltern ohne die osmoprotektiven Substanzen, wenn die Gelatinemembranfilter zur Sammlung der Mikroorganismen eine Minute und weitere 8 Minuten mit einem Luftstrom von 7,5 m3/h durchströmt werden. Es wurde nämlich gefunden, daß gleiche Anteile an osmoprotektiven Substanzen in den Gelatinemembranfiltern bei unterschiedlichen Mengen an Gasen, die die Gelatinemembranfilter mit der gleichen Anzahl gesammelter Mikroorganismen durchströmen, zu unterschiedlich Anteilen an lebensfähigen Mikroorganismen führen.In a preferred embodiment of the invention, the gelatin membrane filters contain the osmoprotective substances in an amount which leads at least to a doubling of the number of viable microorganisms in comparison to gelatin membrane filters without the osmoprotective substances, if the gelatin membrane filters for collecting the microorganisms last one minute and another eight minutes Air flow of 7.5 m 3 / h can be flowed through. It was found that the same proportions of osmoprotective substances in the gelatin membrane filters lead to different proportions of viable microorganisms in the case of different amounts of gases which flow through the gelatin membrane filters with the same number of collected microorganisms.
Als besonders geeignet hat sich ein Gehalt an Trimethylammonioacetat als osmoprotektiver Substanz in den Gelatinemembranfiltern erwiesen, insbesondere wenn diese Substanz in der Membranziehlösung, aus der die Membran erhältlich ist, mit einem Anteil von 0,005 bis 0,75% bezogen auf den Gehalt an der Gelatine vorhanden ist. Die Membranziehlösung stellt eine wäßrige homogene Lösung dar, die Gelatine mit einem Anteil von 4,6 bis 5,6% an der gesamten Membranziehlösung und Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46% an der gesamten Membranziehlösung enthält. Dabei ist es für die Stabilität der Membran von Vorteil, wenn die Gelatine zusätzlich durch ein Bindemittel stabilisiert ist. Das Bindemittel kann beispielsweise Polyvinylalkohol sein.A content of trimethylammonioacetate has proven to be particularly suitable osmoprotective substance proven in the gelatin membrane filters, especially if this substance in the membrane drawing solution from which the membrane is obtainable with a Proportion of 0.005 to 0.75% based on the gelatin content is present. The Membrane drawing solution is an aqueous homogeneous solution, the gelatin with a Share of 4.6 to 5.6% of the total membrane drawing solution and ethanol with a Contains 38 to 46% of the total membrane drawing solution. It is for the Stability of the membrane is an advantage if the gelatin is additionally bound by a binder is stabilized. The binder can be, for example, polyvinyl alcohol.
Aufgrund der Gelatinestruktur ist es von Vorteil, wenn die osmoprotektiven Substanzen die Gelatinematrix möglichst gleichmäßig durchsetzen. Befinden sich diese Substanzen nur auf der äußeren Oberfläche der Gelatinemembranmatrix, besteht die Gefahr, daß bei Langzeitlagerungen ein Teil der osmoprotektiven Substanzen in die innere Matrix abwandert und für die gesammelten Mikroorganismen nur noch eingeschränkt oder gar nicht mehr wirksam ist. Deshalb werden die osmoprotektiven Substanzen in einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren über einen Phaseninversionsprozeß, durch welchen die Gelatinemembranfilter erzeugt werden, in homogener Verteilung in die Membranmatrix eingebaut. Dazu werden die osmoprotektiven Substanzen in die Membranziehlösung eingebracht. Alternativ werden die osmoprotektiven Substanzen während der Ausbildung der Gelatinemembranfilter im Verfestigungsbad eingebracht. Das geschieht in einem ersten Verfestigungsbad, das aus Methylacetat mit einem Alkohol, vorzugsweise Methanol, mit einem Anteil von 10 bis 20% an der gesamten Lösung besteht, sowie aus den osmoprotektiven Substanzen in einer Konzentration von bis zu etwa 2% an der gesamten Lösung. In diesem ersten Verfestigungsbad sind die Gelatinemembranfilter noch nicht vollständig ausgebildet, so daß die osmoprotektiven Substanzen in die gesamte Membranmatrix eindringen können.Due to the gelatin structure, it is advantageous if the osmoprotective substances enforce the gelatin matrix as evenly as possible. Are these substances only on the outer surface of the gelatin membrane matrix is there a risk that Long-term storage of some of the osmoprotective substances in the inner matrix migrates and only limited or even for the collected microorganisms is no longer effective. Therefore, the osmoprotective substances are in one preferred method according to the invention via a phase inversion process which the gelatin membrane filters are produced in a homogeneous distribution in the Membrane matrix installed. For this purpose, the osmoprotective substances in the Membrane drawing solution introduced. Alternatively, the osmoprotective substances introduced during the formation of the gelatin membrane filter in the hardening bath. This happens in a first solidification bath, which consists of methyl acetate with a Alcohol, preferably methanol, with a share of 10 to 20% of the total Solution consists, as well as from the osmoprotective substances in a concentration of up to about 2% of the total solution. In this first consolidation bath they are Gelatin membrane filter is not yet fully developed, so that the osmoprotective Substances can penetrate the entire membrane matrix.
Die erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter weisen gegenüber den Gelatinemembranfiltern des Standes der Technik, einschließlich den nach der DE-PS 11 73 640 erhältlichen, nicht nur eine erhöhte mechanische Stabilität auf, wodurch ihre Handhabung deutlich verbessert wird, sondern sie verfügen auch über einen deutlich höheren Luftdurchfluß, der mindestens um den Faktor 2 größer ist. Sie sind damit für hohe Luftdurchsätze zur Keimsammlung besonders geeignet. Dadurch ist es möglich, mit den erfindungsgemäßen Gelatinemembranfiltern die Zeit für die Sammlung von Mikroorganismen zu reduzieren oder äußerst gering belastete Gase zu testen, weil größere Volumina filtriert werden können, ohne daß die Gelatinemembranfilter in ihrer Wirkung beeinträchtigt oder zerstört werden.The gelatin membrane filters according to the invention have compared to the Prior art gelatin membrane filters, including those of the prior art DE-PS 11 73 640 available, not only increased mechanical stability, making their Handling is significantly improved, but they also have a significant higher air flow, which is at least a factor of 2 larger. So you're for high air throughputs are particularly suitable for collecting germs. This makes it possible to use the time for the collection of Reduce microorganisms or test extremely low-pollution gases because larger volumes can be filtered without the gelatin membrane filter in their Effect can be impaired or destroyed.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gelatinemembranfilter wird
durchgeführt, in dem
The method for producing the gelatin membrane filter according to the invention is carried out in the
- a) eine wäßrige homogene Membranziehlösung, die mindestens Gelatine und Ethanol enthält, hergestellt,a) an aqueous homogeneous membrane drawing solution containing at least gelatin and Contains, produced,
- b) ein dünner Film aus der Membranziehlösung auf einer Unterlage ausgebreitet,b) spread a thin film of the membrane drawing solution on a base,
- c) der dünne Film zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt,c) the thin film is exposed to air to form a gelled phase,
- d) die gelierte Phase zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht undd) the gelled phase is introduced into a precipitation bath for aftertreatment and
- e) der Gelatinemembranfilter getrocknet wird, und ist gekennzeichnet, dadurch, daße) the gelatin membrane filter is dried, and is characterized in that
- f) der Membranziehlösung wenigstens eine osmoprotektive Substanz hinzugefügt wird.f) at least one osmoprotective substance is added to the membrane drawing solution becomes.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens enthält die Membranziehlösung zwischen 0,005 und 0,75% Trimethylammonioacetat bezogen auf die Gelatine.In a preferred embodiment of the method, the membrane drawing solution contains between 0.005 and 0.75% trimethylammonioacetate based on the gelatin.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens, wird zur Erhöhung der mechanischen Stabilität der Gelatinemembranfilter ein Bindemittel über die Membranziehlösung mit einem Anteil von 0,02 bis 0,1% an der gesamten Membranziehlösung eingebracht.In a further embodiment of the method, the mechanical Stability of the gelatin membrane filter with a binder over the membrane drawing solution a share of 0.02 to 0.1% of the total membrane drawing solution.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als erstes Verfestigungsbad Methylacetat mit einem Alkohol, insbesondere Methanol, mit einem Anteil von 10 bis 20% am gesamten ersten Verfestigungsbad verwendet. Die Membran verbleibt in diesem ersten Verfestigungsbad über eine Zeitdauer von ein bis drei Stunden bei Raumtemperatur bevor sie in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat überführt wird. Trocknung und Sterilisierung, vorzugsweise mit Gammastrahlen, schließen sich an.In a further preferred embodiment of the invention, the first Solidification bath methyl acetate with an alcohol, especially methanol, with a Proportion of 10 to 20% of the total first hardening bath used. The membrane remains in this first solidification bath for a period of one to three hours at room temperature before entering a second solidification bath made of pure methyl acetate is transferred. Drying and sterilization, preferably with gamma rays, join.
Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden Ausführungsbeispiele erläutert.The invention will now be explained on the basis of the exemplary embodiments below.
Zur Herstellung eines Gelatinemembranfilters werden 200 g Gelatine (Gelita-Pul vergelatine 250 Bloom, DGF Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess AG) und 2 g Polyvinylalkohol (Mowiol Typ 18-88, Hoechst AG) unter einstündigem Rühren bei 60°C in 2000 g Wasser gelöst und anschließend mit 1645 g Ethanol und 0,02 g Trimethylammonioacetat gelöst in 10 g Wasser versetzt. Die auf 33°C temperierte Membranziehlösung wird zu einem Film der Stärke 350 µm auf eine Unterlage ausgebreitet und Luft mit einer relativen Feuchte von 45% bei Raumtemperatur 5 Minuten ausgesetzt. Der gelierte Film wird zusammen mit der Unterlage in ein erstes Verfestigungsbad, daß aus Methylacetat mit einem Anteil von 14% Methanol besteht, für die Dauer von 3 Stunden und danach in ein zweites Verfestigungsbad aus reinem Methylacetat für die Dauer von 3 Stunden eingebracht. Der Gelatinemembranfilter wird von der Unterlage abgezogen und getrocknet.To produce a gelatin membrane filter, 200 g of gelatin (Gelita-Pul vergelatine 250 Bloom, DGF Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess AG) and 2 g Polyvinyl alcohol (Mowiol type 18-88, Hoechst AG) with stirring at 60 ° C for one hour dissolved in 2000 g of water and then with 1645 g of ethanol and 0.02 g Trimethylammonioacetate dissolved in 10 g of water. The tempered at 33 ° C Membrane drawing solution becomes a film with a thickness of 350 µm on a base spread and air with a relative humidity of 45% at room temperature 5 Exposed for minutes. The gelled film is put together with the backing in a first Consolidation bath, which consists of methyl acetate with a share of 14% methanol, for a period of 3 hours and then in a second solidification bath made of pure Methyl acetate introduced for a period of 3 hours. The gelatin membrane filter will peeled off and dried.
Die so erhaltenen Gelatinemembranfilter weisen einen Porendurchmesser von etwa 3 µm und einen Luftdurchfluß von 138 l/min cm2 bar auf.The gelatin membrane filters thus obtained have a pore diameter of about 3 μm and an air flow of 138 l / min cm 2 bar.
Die nach Beispiel 1 erhaltenen Gelatinemembranfilter werden mit Probe A bezeichnet.The gelatin membrane filters obtained according to Example 1 are designated Sample A.
Analog Beispiel 1 werden Proben B, C, D und E hergestellt, wobei lediglich die Masse an Trimethylammonioacetat in der Membranziehlösung variiert wird (Tabelle, Zeile 2).Samples B, C, D and E are produced analogously to Example 1, only the mass of trimethylammonioacetate in the membrane drawing solution is varied (table, line 2).
Analog Beispiel 1 wird eine Vergleichsprobe F hergestellt, wobei aber auf den Zusatz von Trimethylammonioacetat verzichtet wird.A comparative sample F is produced analogously to Example 1, but with the addition of trimethylammonioacetate is dispensed with.
Zur Überprüfung der Wirksamkeit der osmoprotektiven Substanzen wurden die nach den Beispielen 1 bis 6 hergestellten Gelatinemembranfilter A bis F mit der gleichen Menge Keime von Escherichia coli ATCC 8739 während einer Minute beaufschlagt und über einen weiteren Zeitraum 8 Minuten Luft mit einem Fluß von 7,5 m3/h durch die beaufschlagten Gelatinemembranfilter hindurchgesaugt. Die Gelatinemembranfilter wurden unmittelbar danach auf Agar-Nährkartonscheiben, die Trypton-Soja-Bouillon- Agar (TSBA-Nährbouillon) enthalten, aufgebracht, über Nacht bei 37°C inkubiert und die Koloniezahl mikroskopisch bestimmt.To check the effectiveness of the osmoprotective substances, the gelatin membrane filters A to F produced according to Examples 1 to 6 were exposed to the same amount of Escherichia coli ATCC 8739 germs for one minute and air for a further period of 8 minutes with a flow of 7.5 m 3 / h sucked through the loaded gelatin membrane filter. Immediately afterwards, the gelatin membrane filters were applied to agar nutrient cardboard slices containing trypton-soy broth agar (TSBA nutrient broth), incubated overnight at 37 ° C. and the colony number was determined microscopically.
Die Ergebnisse sind in den Zeilen 3 und 4 der Tabelle enthalten. Sie stellen Mittelwerte aus jeweils 5 Messungen dar und zeigen, daß Trimethylammonioacetat als osmoprotektive Substanz wenigstens zu einer Verdopplung der Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen führt (Proben A, B und C) im Vergleich zu Gelatinemembranfiltern ohne diese osmoprotektive Substanz (Probe F), wenn es mit einem Anteil von 0,01 bis 0,25% bezogen auf den Gelatinegehalt in der Membranziehlösung vorhanden ist und wenn die Gelatinemembranfilter zur Sammlung der Mikroorganismen eine Minute und weitere 8 Minuten mit einem Luftstrom von 7,5 m3/h durchströmt werden. The results are shown in rows 3 and 4 of the table. They represent mean values from 5 measurements each and show that trimethylammonioacetate as an osmoprotective substance leads to at least a doubling of the number of viable microorganisms (samples A, B and C) compared to gelatin membrane filters without this osmoprotective substance (sample F), if it is used with a A proportion of 0.01 to 0.25% based on the gelatin content is present in the membrane drawing solution and if the gelatin membrane filters are flowed through for one minute and a further 8 minutes with an air flow of 7.5 m 3 / h to collect the microorganisms.
In den Tests wurde Escherichia coli ATTCC 8739 verwendet. Dieser Stamm findet breite Anwendung in mikrobiologischen QS-Abteilungen für pharmazeutische Validierungsprüfungen. Es wurde ein eingefrorenes Fläschchen mit einer Konzentration ca. 103 koloniebildende Einheiten pro Milliliter [KBE/ml] verwendet. Jeweils 0,1 ml der aufgetauten Suspension wurde auf Platten mit Trypton-Soja-Bouillon-Agar (TSBA-Nähr bouillon) in zwei identischen Parallelen ausgestrichen. Die Agarplatten wurden über Nacht bei 37°C ± 2°C bebrütet, und die Bakterien nach der Gram-Färbung mikroskopisch bestimmt. Die Objektträger wurden als Rückstellmuster archiviert.Escherichia coli ATTCC 8739 was used in the tests. This strain is widely used in microbiological QA departments for pharmaceutical validation testing. A frozen vial with a concentration of approximately 10 3 colony-forming units per milliliter [CFU / ml] was used. In each case 0.1 ml of the thawed suspension was spread on plates with tryptone soy broth agar (TSBA broth) in two identical parallels. The agar plates were incubated overnight at 37 ° C. ± 2 ° C., and the bacteria were determined microscopically after the Gram staining. The slides were archived as reserve samples.
Eine Kultur-Suspension wurde durch Beimpfen von 50 ml der oben genannten Nährbouillon mit einer vorher auf einer Platte gewachsenen Kolonie in einem Gefäß mit einem Fassungsvermögen von 250 ml hergestellt. Das Gefäß wurde über Nacht bei 37°C ± 2°C unter Schütteln in einem Wasserbad bebrütet. Die Suspension wurde anhand von Kultivierungstechniken untersucht, in sterile Flaschen umgefüllt und bei 4°C ± 2°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.A culture suspension was made by inoculating 50 ml of the above Nutrient broth with a colony previously grown on a plate in a jar with a capacity of 250 ml. The jar was left overnight Incubated 37 ° C ± 2 ° C with shaking in a water bath. The suspension was calculated using Cultivation techniques examined, transferred to sterile bottles and at 4 ° C ± 2 ° C to kept for further use.
Sporen von Bacillus subtilis var niger (NCTC 10073) wurden als mikrobiologische Tracer eingesetzt. Diese Sporen wurden 3 Mal mit Hilfe von Zentrifugation gewaschen und mit sterilem, destilliertem Wasser wieder in Suspension gebracht. Die Konzentration der Stammlösung von B. subtilis betrug ca. 2 × 1011 KBE/ml. Eine 1-Liter-Suspension aus Bacillus subtilis wurde für den Einsatz in diesen Tests hergestellt, indem die Stammlösung auf ca. 2,5 × 109 KBE/ml mit sterilem, destilliertem Wasser verdünnt und 40 Minuten lang auf 60°C zur Abtötung eventuell vorhandener vegetativer Organismen erhitzt wurde. Die Bestimmung der für die Tests verwendeten Sporensuspension ergab eine Endkonzentration an B. subtilis Sporen von 2,26 × 109 KBE/ml.Bacillus subtilis var niger spores (NCTC 10073) were used as microbiological tracers. These spores were washed 3 times by centrifugation and resuspended with sterile, distilled water. The concentration of the B. subtilis stock solution was approx. 2 × 10 11 CFU / ml. A 1 liter suspension of Bacillus subtilis was prepared for use in these tests by diluting the stock solution to approximately 2.5 x 10 9 CFU / ml with sterile, distilled water and possibly 40 ° C for 40 minutes to kill existing vegetative organisms was heated. The determination of the spore suspension used for the tests gave a final concentration of B. subtilis spores of 2.26 × 10 9 CFU / ml.
Die Suspension von E. coli ATCC 8739 wurde zwei Wochen bei 4°C ± 2°C vor dem Einsatz aufbewahrt. Eine Nachbestimmung anhand von Kultivierungstechniken zeigte, daß die E. coli Konzentration während dieser Zeit konstant blieb. Einleitende Tests wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Test- und Tracerkeime durchgeführt, um die geeigneten Konzentrationen für die Endprüfungen zu ermitteln.The suspension of E. coli ATCC 8739 was two weeks at 4 ° C ± 2 ° C before Use kept. A re-determination based on cultivation techniques showed that the E. coli concentration remained constant during this time. Preliminary tests were carried out with different concentrations of the test and tracer germs to determine the appropriate concentrations for the final tests.
Die Konzentration der Stammsuspension von E. coli ATCC 8739 betrug 2,1 × 1010 KBE/ml. Die Herstellung einer Verneblungssuspension von 10 ml erfolgte durch Mischen von 5-ml-Suspensionen von E. coli (verdünnt mit destilliertem Wasser, ergibt 7,6 × 103 bis 2,8 × 104 KBE/ml) und einer 5-ml-Suspension von B. subtilis (verdünnt mit destilliertem Wasser, ergibt 4,0 × 103 KBE/ml). Die Endsuspension wurde innerhalb von 30 Minuten vernebelt (aerosolisiert).The concentration of the stock suspension of E. coli ATCC 8739 was 2.1 × 10 10 CFU / ml. A nebulization suspension of 10 ml was prepared by mixing 5 ml suspensions of E. coli (diluted with distilled water, giving 7.6 × 10 3 to 2.8 × 10 4 CFU / ml) and a 5 ml Suspension of B. subtilis (diluted with distilled water, gives 4.0 × 10 3 CFU / ml). The final suspension was aerosolized within 30 minutes.
Der Prüfstand besteht aus einem Verneblungsapparat des Typs Collison 3-jet Nebulizer zur Erzeugung von Bakterienaerosolen in einer geschlossenen und abgedichteten Kammer. Die Aerosolkammer ist mit einem 1 Meter langen Rohrsystem aus Edelstahl mit einem Innendurchmesser von 45 mm verbunden. Der Filterkopf des Sartorius Luftkeimsammlers ist an diese Rohrleitung mittels eines entsprechenden Adapters angeschlossen. Der Eingang zur Kammer ist durch ein leistungsstarkes Luftfilter geschützt.The test bench consists of a nebulizer of the Collison 3-jet nebulizer type for the generation of bacterial aerosols in a closed and sealed Chamber. The aerosol chamber is made of stainless steel with a 1 meter long pipe system connected with an inner diameter of 45 mm. The Sartorius filter head Air sampler is attached to this pipeline using an appropriate adapter connected. The entrance to the chamber is through a powerful air filter protected.
Der Sartorius MD8 airscan Luftkeimsammler (Serien-Nr. 9 607 001) mit Kalibrierzertifikat, Schlauch und Filterkopf wurde gemäß der Bedienungsanleitung betrieben.The Sartorius MD8 airscan air sampler (serial no. 9 607 001) with Calibration certificate, hose and filter head was according to the operating instructions operated.
Es wurden sterile Gelatinemembranfilter mit einer Porengröße von etwa 3,0 µm, die jeweils als Probe A, B, C, D, E und F gekennzeichnet waren, eingesetzt. Die modifizierten Gelatinemembranfilter A, B, C, D und E enthielten verschiedene, oben in der Tabelle genannte Mengen Trimethylammonioacetat als osmosprotektive Substanz.Sterile gelatin membrane filters with a pore size of approximately 3.0 μm were used were each identified as sample A, B, C, D, E and F. The modified gelatin membrane filters A, B, C, D and E contained various, above in the amounts of trimethylammonioacetate mentioned in the table as an osmosprotective substance.
9 ml der zu vernebelnden Suspension wurden in den Collison Vernebelungsapparat eingegeben (1 ml wurde zum mikrobiologischen Nachweis zurückbehalten). Der jeweilige Gelatinemembranfilter wurde in den Filterkopf gelegt und an den Prüfstand (wie oben beschrieben) angeschraubt.9 ml of the suspension to be nebulized were placed in the Collison nebulizer entered (1 ml was retained for microbiological detection). Of the The respective gelatin membrane filter was placed in the filter head and on the test bench (as described above) screwed on.
Das MD8 airscan wurde auf einen Luftdurchsatz von 7,5 m3/h eingestellt. Das MD8 airscan wurde eingeschaltet, und nach 15 Sekunden wurde der Collison Verneblungsapparat durch Anschluß an eine Druckgasleitung mit 180 kPa aktiviert. Der Verneblungsapparat wurde 1 Minute lang aktiviert, und das MD8 wurde danach ausgeschaltet.The MD8 airscan was set to an air flow of 7.5 m 3 / h. The MD8 airscan was turned on and after 15 seconds the Collison nebulizer was activated by connecting to a pressurized gas line at 180 kPa. The nebulizer was activated for 1 minute and the MD8 was then switched off.
Die Gelatinemembranfilter wurden entweder nach dieser 1-minütigen Beaufschlagung mit keimhaltigem Aerosol (angesaugt mit Hilfe des Luftkeimsammlers MD8) direkt oder nach einer weiteren 8 minütigen Beaufschlagung mit filtrierter Luft auf die TSBA Platten aufgelegt und wie weiter oben beschrieben bebrütet und vermessen.The gelatin membrane filters were either after this 1 minute exposure with germ-containing aerosol (sucked in with the help of the MD8 air sampler) directly or after a further 8 minutes exposure to filtered air on the TSBA plates applied and incubated and measured as described above.
Die in der Erfindungsbeschreibung verwendeten %-Angaben sind Masseprozente.The percentages used in the description of the invention are percentages by mass.
Claims (13)
- a) Gelatine mit einem Anteil von 4,6 bis 5,6% an der gesamten Membranziehlösung,
- b) Ethanol mit einem Anteil von 38 bis 46% an der gesamten Membranziehlösung,
- c) wenigstens einer osmoprotektiven Substanz mit einem Anteil an der gesamten Membranziehlösung, der wenigstens zu einer Verdopplung der Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen führt im Vergleich zu Gelatinemembranfiltern ohne diese osmoprotektiven Substanzen, wenn die Gelatinemembranfilter zur Sammlung der Mikroorganismen eine Minute und weitere 8 Minuten mit einem Luftstrom von 7,5 m3/h durchströmt werden und
- d) Bindemittel mit einem Anteil von 0,02 bis 0,1% an der gesamten Membranziehlösung.
- a) gelatin with a share of 4.6 to 5.6% of the total membrane drawing solution,
- b) ethanol with a share of 38 to 46% of the total membrane drawing solution,
- c) at least one osmoprotective substance with a proportion of the total membrane drawing solution, which leads at least to a doubling of the number of viable microorganisms in comparison to gelatin membrane filters without these osmoprotective substances, if the gelatin membrane filter to collect the microorganisms for one minute and a further 8 minutes with an air flow of 7.5 m 3 / h are flowed through and
- d) Binder with a share of 0.02 to 0.1% of the total membrane drawing solution.
- a) eine wäßrige homogene Membranziehlösung, die mindestens Gelatine und Ethanol enthält, hergestellt,
- b) ein dünner Film aus der Membranziehlösung auf einer Unterlage ausgebreitet,
- c) der dünne Film zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt,
- d) die gelierte Phase zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht und
- e) der Gelatinemembranfilter getrocknet wird,
dadurch gekennzeichnet, daß - f) der Membranziehlösung wenigstens eine osmoprotektive Substanz hinzugefügt wird.
- a) an aqueous homogeneous membrane drawing solution which contains at least gelatin and ethanol is prepared,
- b) spread a thin film of the membrane drawing solution on a base,
- c) the thin film is exposed to air to form a gelled phase,
- d) the gelled phase is introduced into a precipitation bath for aftertreatment and
- e) the gelatin membrane filter is dried,
characterized in that - f) at least one osmoprotective substance is added to the membrane drawing solution.
- a) eine wäßrige homogene Membranziehlösung, die mindestens Gelatine und Ethanol enthält, hergestellt,
- b) ein dünner Film aus der Membranziehlösung auf einer Unterlage ausgebreitet,
- c) der dünne Film zur Ausbildung einer gelierten Phase Luft ausgesetzt,
- d) die gelierte Phase zur Nachbehandlung in ein Fällbad eingebracht und
- e) der Gelatinemembranfilter getrocknet wird,
dadurch gekennzeichnet, daß gemäß Schritt d) die gelierte Phase in einem ersten Verfestigungsbad aus Methylacetat, einem Alkohol, vorzugsweise Methanol mit einem Anteil von 10 bis 20% und Trimethylammonioacetat als osmoprotektiver Substanz mit einem Anteil von weniger als 2% an der gesamten Lösung des ersten Verfestigungsbades nachbehandelt wird.
- a) an aqueous homogeneous membrane drawing solution which contains at least gelatin and ethanol is prepared,
- b) spread a thin film of the membrane drawing solution on a base,
- c) the thin film is exposed to air to form a gelled phase,
- d) the gelled phase is introduced into a precipitation bath for aftertreatment and
- e) the gelatin membrane filter is dried,
characterized in that according to step d) the gelled phase in a first solidifying bath of methyl acetate, an alcohol, preferably methanol with a proportion of 10 to 20% and trimethylammonioacetate as an osmoprotective substance with a proportion of less than 2% of the total solution of the first Solidification bath is treated.
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