DE19739119A1

DE19739119A1 - Mikrotiterplatte

Info

Publication number: DE19739119A1
Application number: DE1997139119
Authority: DE
Inventors: Heidrun Dr Med Rhode; Anton Prof Dr Med Horn; Max Scharff; Helmut Woelfel
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 1997-09-06
Filing date: 1997-09-06
Publication date: 1999-03-11

Description

Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte, insbesondere zur Behandlung von Proben mit organischen Lösungsmitteln und deren Analyse mittels lichterzeugender Verfahren. Sie findet Verwendung in der biochemischen und immunologischen Forschung, in der medizinischen Diagnostik, in der chemischen und pharmazeutischen Industrie sowie in der Biotechnologie.

Mikrotiterplatten, die eine Pluralität von Probengefäßen in einem dem Koordinatenraster von Multipipetten entsprechenden Raster, beispielsweise 8×12 oder n×8×m×12, aufweisen, gewinnen in der Analytik zunehmend an Bedeutung. Ihr Vorteil liegt darin, daß eine Vielzahl von gleichen oder unterschiedlichen Proben, einschließlich Referenzlösungen, parallel behandelt und ausgewertet werden können. In letzter Zeit kommen mehr und mehr fluorimetrische und luminometrische Untersuchungen in Verbindung mit der Mikrotiterplattentechnologie, insbesondere wegen ihrer hohen Empfindlichkeit, zum Einsatz.

Derartige Mikrotiterplatten sind für viele Anwendungen an sich bekannt [z. B. A. Yamaguchi et al., Clin. Chem. 35 (1989) 1962-1964, T. Tuuminen et al., Clin. Chim. Acta 212 (1992) 155-158] und bestehen insbesondere aus Polystyrol.

Bei Screeninguntersuchungen unter Verwendung stark gefärbter Proben, insbesondere von Blutproben, kommt es zu einer erheblichen Einengung der Anwendbarkeit optischer Analyseverfahren, da die analysierte Lichtintensität durch die Probe stark verfälscht wird und es daher zu einer bedeutenden Senkung der Empfindlichkeit kommt. Sehr häufig lassen sich die störenden Substanzen, wie beispielsweise Hämoglobin, elegant mit organischen Lösungsmitteln fällen, d. h. enteiweißen, und die besagten Störungen dadurch beheben oder zumindest stark vermindern. Neben dieser Art der Screeninguntersuchung werden gegenwartig in zunehmenden Maße Verfahren entwickelt, die durch Naturstoffscreening und kombinatorische Chemie die effiziente Entwicklung neuer oder die Verbesserung bekannter Pharmaka erlauben. Sehr häufig müssen die zu screenenden Proben mit organischen Lösungsmitteln behandelt und danach analysiert werden.

Die gegenwartig verfügbaren Mikrotiterplatten erfüllen die Anforderungen, die durch Hochdurchsatzscreening-Projekte gestellt werden (z. B. Nutzungs möglichkeit für gefärbte Proben, ökonomisch vertretbaren Einsatz von teueren, hochstandardisierten Reagenzien und die praktikable Verwendbarkeit von Trockenproben auf Trägern, wie Filterpapier-Stanzlingen) nicht. Für den die Analysenkosten und die Reagenzienvolumina reduzierenden Mikroliterbereich sind keine lösungsmittelbeständigen mit optischen Mitteln analysierbaren Mikrotiterplatten verfügbar.

Einerseits bestehen die bisher bekannten, zur miniaturisierten Analyse mit optischen Mitteln geeigneten Mikrotiterplatten mit kleinen Höhlungen, alle aus Polystyrol und schließen wegen der Unverträglichkeit gegenüber Lösungsmitteln eine Analyse nach Lösungsmittel-Extraktion praktisch aus, wobei darüber hinaus übliche Filterpapierstanzlinge von auf Filterpapier aufgetrockneten Blutproben nicht problemlos und praktikabel in die bekannten Aufnahmegefäße der Mikrotiterplatte eingebracht werden können.

Andererseits sind lösungsmittelbeständige herkömmliche Mikrotiterplatten (z. B. Fa. Greiner) relativ teuer, aufgrund ihrer Transparenzeigenschaften nicht für alle optischen Analyseverfahren geeignet und erfordern außerdem große Probenvolumina und damit Reagenzien-Mengen. Diese Mikrotiterplatten sind auf Grund der zu erwartenden hohen Kosten für Screening-Untersuchungen ebenfalls nicht geeignet.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, eine mit geringem Aufwand herstellbare und gut handhabbare Mikrotiterplatte zu schaffen, welche die vorgenannten Nachteile in der Gesamtheit nicht aufweist und damit für eine Vielzahl unterschiedlichster Screening-Untersuchungen, insbesondere mit Einsatz von Fluoreszenz- und Lumineszenzmessungen, universell anwendbar ist. Die Mikrotiterplatte soll trotz kleiner Volumina der Analysengefäße problemlos, z. B. mit Filterpapierstanzlingen, beschickbar sein.

Erfindungsgemäß wird eine Mikrotiterplatte vorgeschlagen, die aus lichtundurchlässiger, nichtfluoreszierender und gegen organische Lösungsmittel resistenter formnachgiebiger Thermoplaste, wie thermisch verformbares Polypropylen, besteht und bei welcher die, vorzugsweise durch thermische Verformung hergestellten, Probengefäße, kegelstumpfförmig für Proben volumina im Mikroliterbereich ausgebildet sind.

In den Unteransprüchen 2 bis 8 sind zweckmäßige Ausgestaltungsmerkmale der Erfindung, wie Mittel zur Erhöhung der mechanischen Stabilität, zur Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten und zur Verbesserung der Handhabung, beschrieben.

Die Mikrotiterplatte kann auf einfachste Weise und damit sehr wirtschaftlich, beispielsweise durch thermische Abformung von einer Matrize (Master) hergestellt werden und ist auf Grund ihrer Material- und Formeigenschaften der Probengefäße universell für zumindest eine Vielzahl von Anwendungen zur Probenbehandlung und Probenauswertung geeignet. Diese Anwendungen schließen auch optische Auswerteverfahren mit ein, ohne daß die Materialeigenschaften der Mikrotiterplatte die Empfindlichkeit der Auswertung beeinträchtigen. Durch die kegelstumpfförmige Form der Probengefäße wird eine gute und praktikable Beschickung der Probengefäße gewährleistet, wobei auch Partikel, wie Filterpapierstanzlinge etc., trotz der kleinen Gefäßvolumina ebenfalls mit inbegriffen sind. Die geringen Voluminagrößen gestatten außerdem eine sehr kostengünstige Probenauswertung.

In der Gesamtheit vereinigt die Mikrotiterplatte dabei einzelne Vorteile speziell für bestimmte Anwendungsfälle bereits bekanntgewordener Mikrotiterplatten für eine breite und universelle Anwendbarkeit unter verschiedensten Nutzungsvoraussetzungen.

Die Erfindung soll nachstehend anhand der Zeichnung näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1 Perspektivdarstellung der Mikrotiterplatte mit Stabilisierungsplatte

Fig. 2 Mikrotiterplatte in Draufsicht

Fig. 3 Prinzipanordnung der Mikrotiterplatte mit Stabilisierungsplatte in seitlichen Schnittdarstellungen

Fig. 4 Prinzipanordnung der Mikrotiterplatte mit Stabilisierungsplatte und Auswurfplatte in seitlichen Schnittdarstellungen

Fig. 5 Auf Filterpapier aufgetrocknete Überstände von bluthaltigen Proben nach Enteiweißung in der Mikrotiterplatte mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln

Fig. 6 Präzision der Fluoreszenzmessung in der Mikrotiterplatte

Fig. 7 Unpräzision eines miniaturisierten Neugeborenen-Screening-Testes auf Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase-Mangel

Fig. 8 Signalhöhe und Unpräzision eines miniaturisierten Neugeborenen-Screen ing-Testes auf Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase-Mangel unter Verwendung verschiedener Enteiweißungsmittel.

In Fig. 1 und 2 ist eine Mikrotiterplatte 1 in Perspektivansicht und Draufsicht dargestellt, die in einem an sich bekannten x-y-Rastermaß 8×12 insgesamt 96 Probengefäße 2 zur Aufnahme und Behandlung von Proben mit Volumina im Mikroliterbereich besitzt. Die Mikrotiterplatte 1 besteht aus Polypropylen LM-885/30-T1480-160 und ist durch thermische Verformung (Abformung von einer Matritze) aus einer folienartigen Platine hergestellt. In diesem Abformungsprozeß wurden gleichzeitig die 96 Vertiefungen für die Probengefäße 2 in die Platine eingeprägt sowie Formstabilisierungselemente von Seitenflächen 3 und 4, Eckenabschrägungen 5 und Abstufungen 6 erzeugt. Die eingeprägten Vertiefungen für die Probengefäße 2 sind kegelstumpfförmig, so daß ihr oberer Durchmesser 7 größer als ihr unterer Durchmesser 8 am Boden der Analysengefäße 2 ist und Seitenwände 9 konisch ausgebildet sind (vgl. Fig. 2). Mit der kegelstumpfförmigen Ausbildung der Probengefäße 2 im µl-Probenvoluminabereich wird gegenüber einer bekannten Mulden- oder Kegelform eine gute und praktikable Beschickung (u. a. auch mit Filterpapierstanzlingen) ermöglicht. Die kleinen Höhlungen der Probengefäße 2 machen diese Untersuchungen, welche dadurch lediglich geringe Probenmengen benötigen, in jeder Hinsicht sehr vorteilhaft und wirtschaftlich.

Das Material der Mikrotiterplatte 1 ist resistent gegen organische Lösungsmittel, wie insbesondere Aceton, Acetonitril, Methanol, Butanol, Hexan und Gemischen daraus, wodurch auch eine diesbezügliche Eignung für zahlreiche Anwendungsfälle (z. B. Enteiweißung in der biochemischen und klinisch-chemischen Analytik, Naturstoffscreening, kombinatorische Chemie etc.) gegeben ist.

Ferner ist dieses Material der Mikrotiterplatte 1 lichtundurchlässig sowie nichtfluoreszierend, so daß die Anwendung für optische Analyseverfahren gegeben ist, ohne daß das Gefäßmaterial die Probenauswertung einschränkt oder beeinflußt.

Auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte 1 (siehe Fig. 2) ist eine Koordinatenkennung 10 für das Raster der Probengefäße 2 in Form von Buchstaben und Zahlen der entsprechenden Koordinate des 8×12 Probenrasters sichtbar. Diese kann beispielsweise aufgedruckt werden (Siebdruck o. ä.) bzw. gleich bei der thermischen Abformung der Mikrotiterplatte 1 mit eingeprägt werden.

Um die mechanische Formstabilität der Mikrotiterplatte 1 (gerade für sehr dünnwandige und folienartig flexible Plattenausführungen) bei der Verwendung zu erhöhen, ist eine Stabilisierungsplatte 11 (Grundkörper) vorgesehen, auf welche die Mikrotiterplatte 1 aufgesetzt wird. Dazu besitzt die Stabilisierungsplatte 11 zwecks Aufnahme der Probengefäße 2 zu diesen korrespondierende Vertiefungen 12 (siehe Fig. 1). Fig. 3 zeigt die Prinzipanordnung der Mikrotiterplatte 1 mit Stabilisierungsplatte 11 in seitlichen Schnittdarstellungen (getrennter und aufgesetzter Zustand). Die Darstellung entspricht der in Fig. 2 angedeuteten Schnittebene A-B. Eine dünnwandige und damit formnachgiebige Ausführung der Probengefäße 2 (folienartige Seitenwände 9) unterstützt dabei eine form- und kraftschlüssige Passung der Probengefäße 2 in den Vertiefungen 12, was beispielsweise für einen engen Wärmekontakt bei einer Temperierung der Probengefäße 2 über die Stabilisierungsplatte 11 (in der Zeichnung nicht dargestellt) relevant ist.

Um ein praktikables Trennen der Mikrotiterplatte 1 von der Stabilisierungsplatte 11 zu ermöglichen, ist eine Auswurfplatte 13 vorgesehen, die zwei Auswurfstifte 14 besitzt. Die Stabilisierungsplatte 11 weist zwei mit diesen korrespondierende Löcher 15 auf, durch welche die Auswurfstifte 14 hindurchgreifen und die Mikrotiterplatte 1 zum Auswurf an ihrer Unterseite antasten. Die Schnittdarstellung von Fig. 4 entspricht dabei der in Fig. 2 angedeuteten Schnittebene C-D.

Um die universelle Verwendbarkeit der erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte 1 für die unterschiedlichsten Probenauswertungen zu demonstrieren, sollen vier Anwendungsbeispiele mit den Zeichnungen 5-8 vorgestellt werden.

Anwendungsbeispiel 1 Fällung von Hämoglobin mit organischen Lösungsmitteln

Je ein 3 mm-Blutblättchen wird in jedes Probengefäß 2 der Mikrotiterplatte 1 placiert und mit je 20 µl 100 mM Triäthanolamin/HCl, pH 7,8 mit 0,133% (w/v) Digitonin, 0,9 mM EDTA, 0,63 mM Dithiothreitol und 0,02% NaN₃ (1 und 2 in Fig. 5) bzw. H₂O (3 und 4 in Fig. 5) zwei Stunden bei 37 °C eluiert. Danach werden die Mikrotiterplatte auf Raumtemperatur abgekühlt und in jeweils zwei Probengefäße identisch je 40 µl (1 und 3 in Fig. 5) bzw. 60 µl (2 und 4 in Fig. 5) der folgenden Lösungsmittel pipettiert: (A) Aceton, (B) Acaetonitril, (C) Methanol, (D) Äthanol, (E) Propanol, (F) Isopropanol, (G) Butanol, 1/1(v/v)-Mischungen aus (H) Äthanol/Aceton, (I) Metanol/Ace ton, (J) Butanol/Aceton, (K) Methanol/Äthanol, (L) Methanol/Propanol, (M) Propanol/Aceton, (N) Methanol/Isopropanol, (O) Methanol/Butanol und (P) H₂O.

Blutblättcheneluat und Lösungsmittel werden auf einem Mikrotiterplatten schüttler gemischt und bei 4000 g für 5 min zentrifugiert. 5 µl des Überstandes werden auf MN818 pipettiert und die Anwesenheit von Hämoglobin auf dem Filterpapier visuell beurteilt. Fig. 5 zeigt, daß unter allen Bedingungen nur Aceton, Acetonitril, Propanol und Methanol und 1/1-Mischungen aus Methanol/Aceton eine komplette Enteiweißung erzeugen.

Anwendungsbeispiel 2 Fluoreszensmessung in der Mikrotiterplatte

Die Fluoreszenz jeweils aller 96 Probengefäße 2 der Mikrotiterplatte 1 werden leer, oder mit 80, 90 bzw. 100 µl eines Puffers ohne oder mit NADH oder Methylumbelliferon gefüllt bei 460 nm (Anregung 355 nm) in einem an sich bekannten Fluorimeterreader gemessen. In Fig. 6 sind Signal-Höhen und Unpräzisionen dieser Messungen zusammengestellt.

Die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte besitzt damit gegenüber herkömmlichen zur Fluorimetrie verwendeten Mikrotiterplatten aus weißem oder schwarzem Polystyrol vergleichbar gute Präzisionseigenschaften.

Anwendungsbeispiel 3 Miniaturisierter Neugeborenen-Screening-Test auf Galaktose-1-Phosphat-Uri dyltransferase-Aktivität

Zu jeweils einem Blutblättchen (3 mm ∅) pro Probengefäß 2 der Mikrotiterplatte 1, welches Normalblut eines erwachsenen freiwilligen Spenders oder entsprechende Verdünnungen im Eigenplasma aufgetrocknet enthält, werden 20 µl des Testgemisches pipettiert. Das Testgemisch enthält 100 mM Triäthanolamin/HCl, pH 7,8, 0,133% (w/v) Digitonin, 0,9 mM EDTA, 0,63 mM Dithiothreitol, 0,02% NaN3 (w/v), 6,48 mM Galaktose-1-phosphat, 4,4 mM UDP-glukose, 4,82 mM NADP. Individuelle Blindwerte werden mit dem gleichen Testgemisch, aber ohne Galaktose-1-phosphat parallel mitbestimmt.

Die Mikrotiterplatte wird kurz auf einem Mikrotiterplattenschüttler geschüttelt, mit einer Klebefolie abgedeckt und zwei Stunden bei 38°C inkubiert. Danach erfolgt die Enteiweißung durch Zugabe von 60 µl Methanol/Aceton (1/1, v/v), Schütteln und Zentrifugation bei 4000 g für 5 min. Die Fluoreszenz der Lösung in den Probengefäßen 2 wird direkt in der Mikrotiterplatte 1, welche in die Stabilisierungsplatte 11 eingedrückt ist, bei 460 nm (355 nm Anregung) im Fluorimeter gemessen. Die erhaltenen Signale (Skalenteile) und Unpräzisionen des Testes sind in Fig. 7 zusammengestellt.

Die Signalhöhen übersteigen diejenigen, die bei herkömmlichen Tests mit größeren Volumina erreicht werden um das 5-10-fache. Die erreichten Präzisionen machen den Test für Screeningzwecke gut geeignet.

Anwendungsbeispiel 4 Test auf Galaktose-1-Phosphat-Uridyltransferase-Aktivität unter Verwendung verschiedener Enteiweißungsmittel

Der miniaturisierte Test wird wie in Anwendungsbeispiel 3 durchgeführt, jedoch verschiedene Lösungsmittel als Enteiweißungsreagenz mit einem Volumen von 40 bzw. 60 µl eingesetzt: Es werden jeweils 6 Proben in einer Serie gleichermaßen behandelt.
60 µl Testpuffer: Aceton/Methanol (1/1), Äthanol, Methanol, Aceton, Propanol, Acetonitril;
40 µl Äthanol.

Die erreichten Fluoreszenzen und Unpräzisionen sind in Fig. 8 zusammengestellt.

Es ist zu sehen, daß die Lösungsmittel Methanol und Aceton/Methanol (1/1), die komplett enteiweißen (vgl. Fig. 5), auch die höchsten Test-Fluoreszenssignale bei guten Testpräzisionen ermöglichen. Propanol, Acetonitril und Aceton führen zu einer Verminderung der NADPH-Fluoreszenz. Testpuffer und Äthanol entfernen das störende Hämoglobin nicht bzw. nur unvollständig.

Bezugszeichenliste

1

Mikrotiterplatte

2

Probengefäß

3

,

4

Seitenfläche

5

Eckenabschrägung

6

Abstufung

7

,

8

Durchmesser

9

Seitenwand

10

Koordinatenkennung

11

Stabilisierungsplatte

12

Vertiefung

13

Auswurfplatte

14

Auswurfstift

15

Loch

Claims

1. Mikrotiterplatte, insbesondere zur Behandlung von Proben mit organischen Lösungsmitteln und zur Analyse mittels lichterzeugender Verfahren, mit in einem an sich bekannten Raster, beispielsweise n×8×m×12, angeordneten Probengefäßen, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrotiterplatte (1) aus lichtundurchlässiger, nichtfluoreszierender und gegen organische Lösungsmittel resistenter formnachgiebiger Thermoplaste, wie thermisch verformbarem Polypropylen, besteht und daß die, vorzugsweise durch thermische Verformung hergestellten, Probengefäße (2), kegelstumpfförmig zur Aufnahme von festen und flüssigen Proben im Mikroliter-Voluminabereich ausgebildet sind.

2. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermoplaste mit colorierten Pigmenten versehen ist.

3. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrotiterplatte (1) Mittel (3, 4, 5, 6) zur Erhöhung der Formstabilität, wie beispielsweise Seitenflächen, Wülste, Stufen, Falze, Sicken, Abschrägungen u.ä. vorgesehen sind.

4. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Oberfläche der Mikrotiterplatte (1) eine Koordinatenkennung (10) für das Raster der Probengefäße (2) angegeben ist.

5. Mikrotiterplatte nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Koordinatenkennung (10) ebenfalls durch thermische Verformung in die Oberfläche der Mikrotiterplatte (1) eingeprägt ist.

6. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Stabilisierungsplatte (11) vorgesehen ist, die zu den als Vertiefungen der Mikrotiterplatte (1) ausgebildeten Probengefäßen (2) korrespondierende Aufnahmevertiefungen (12) besitzt, in welche die Probengefäße (2) der Mikrotiterplatte (1) form- und kraftschlüssig eingesetzt werden.

7. Mikrotiterplatte nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stabilisierungsplatte (11) Mittel zur Temperierung besitzt, z. B. eine interne elektrische Heizspirale, oder mit solchen in Verbindung steht, z. B. zu einem Flüssigkeitsbad.

8. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Auswurfplatte (13) vorgesehen ist, die mindestens zwei Auswurfstifte (14) besitzt, welche zum Auswurf der Mikrotiterplatte (1) aus der Stabilisierungsplatte (11) durch korrespondierende Löcher (12) der Stabilisierungsplatte (11) hindurchgreifen und die Mikrotiterplatte (1) von der Unterseite antasten.