DE19735614A1 - Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen). - Google Patents
Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen).Info
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Description
Es handelt sich hierbei um eine Erfindung aus dem Gebiet der Biochemie.
IGFBP-Proteasen (auch als IGFBP-Proteinasen bezeichnet) sind Enzyme, die die
proteolytische Spaltung von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen
katalysieren. Insulin-like Growth Factor Binding Proteine sind eine Familie von
bisher sieben bekannten Proteinen (IGFBP-1 bis -7), die spezifisch und mit hoher
Affinität zwei Peptidhormone, Insulin-Like Growth Factor-I (IGF-I, früher als
Somatomedin C bezeichnet) und Insulin-Like Growth Factor-II (IGF-II =
Somatomedin A) binden. Durch diese Bindung werden vermutlich die Aktivitäten
der beiden Peptidhormone reguliert. Eine Funktion der IGFBP's als
Transportprotein oder auch als "Depotform" der IGF's wird ebenfalls diskutiert. Die
Affinität der IGFBP's zu IGF-I und IGF-II kann durch posttranslationale
Modifikationen, wie z. B.: Phosphorylierungen verändert werden. Ein weiterer
Mechanismus ist die proteolytische Spaltung der IGFBP's durch Proteasen. Durch
die proteolytische Spaltung wird die Affinität der IGFBP's zu den IGF's
abgeschwächt, die Präferenz der Bindung für IGF-I oder IGF-II geändert, oder
Fragmente erzeugt, die die Bindungsfähigkeit verloren haben.
Der Nachweis der Proteaseaktivität erfolgt gegenwärtig im wesentlichen durch drei
Techniken:
- 1. Radioaktiv markiertes IGFBP wird proteolytisch gespalten, die Fragmente beispielweise durch Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradigraphie ein Abbild des Gels erzeugt. Nachteile dieser Methode sind: Umgang mit radioaktiven Materialien und teilweise mehrtägige Expositionszeiten.
- 2. Unmarkiertes IGFBP wird mit eine Probe z. B. Serum inkubiert, die eine Protease enthält, proteolytisch gespalten und die Bruchstücke durch Western-Immunoblot nachgewiesen. Diese Methode hat den Nachteil daß es unmöglich ist zwischen den IGFBP's aus der Probe und dem zugegebenen IGFBP zu unterscheiden. Deshalb muß stets eine Kontrolle mitgeführt werden, der kein IGFBP zugesetzt wird. Nur über einen Vergleich der Intensität der Dicke der Banden im Immunoblot ist eine halbquantitative Aussage möglich.
- 3. Unmarkiertes IGFBP wird proteolytisch gespalten und die Bruchstücke durch Western-Ligand Blot nachgewiesen. Dabei wird markiertes IGF-I oder IGF-II zum Nachweis eingesetzt. Nachteil ist, daß nur Bruchstücke, die noch IGF-I oder IGF-II binden können, nachgewiesen werden können. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß es möglich ist, IGFBP's nichtradioaktiv zu markieren, beispielsweise mit Biotin, ohne daß die Zugänglichkeit für die Spaltung durch Proteasen verloren geht. Außerdem ist die Synthese markierter Teilsequenzen der IGFBP's möglich, die der natürlichen Spaltstelle entsprechen. Außerdem besteht die Möglichkeit, synthetische Substrate herzustellen, die die Spaltstelle imitieren und bei der Spaltung durch die Protease beispielsweise ein farbiges oder fluoreszierendes Substrat freisetzen.
Die nichtradioaktiv markierten IGFBP's oder die nichtradioaktiv markierten
Teilsequenzen können beispielsweise in folgenden Anwendungen eingesetzt
werden:
- 1. Western Blot: Das markierte IGFBP (oder eine Teilsequenz) wird mit einer Probe, die eine Protease enthält, inkubiert, durch Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Membran übertragen. Durch die nichtradioaktive Markierung kann das zugesetzte IGFBP selektiv nachgewiesen werden. IGFBP's aus der Probe stören dabei nicht. Die Anfärbung des Western Blots ist in wenigen Stunden durchführbar, radioaktive Materialien werden nicht benötigt.
- 2. Immunoassay mit markiertem IGFBP:
Das markierte IGFBP wird in einem Reaktionsgefäß inkubiert, daß mit einen spezifischen Antikörper beschichtet ist und so an das Reaktionsgefäß gebunden. Die Markierung wird selektiv so durchgeführt, beispielsweise an der N-terminalen Aminogruppe, daß durch die Proteasewirkung der markierte Teil abgespalten wird. Nach Inkubation mit der Protease werden die abgespaltenen markierten Fragmente durch Waschen entfernt und die nichtabgespaltenen Markierungsgruppen quantitativ nachgewiesen. Auf diese Weise ist ein quantitativer Nachweis der Proteaseaktivität möglich. - 3. Immunoassay mit doppelt markierten Teilsequenzen, die die Spaltstelle
enthalten:
Peptide können mit molekularbiologischen Methoden sowohl C-terminal als auch N-terminal mit unterschiedlichen Markierungen versehen werden. Die markierten Peptide werden in einem Reaktionsgefäß inkubiert, das mit Antikörpern beispielsweise gegen die N-terminale Markierung beschichtet ist und so an das Reaktionsgefäß gebunden. Durch Inkubation mit einer Protease wird das Peptid gespalten und damit die C-terminale Markierung entfernt. Die Fragmente werden durch Waschen entfernt und das verbliebene, intakte Peptid quantitativ bestimmt. Auf diese Weise ist ein quantitativer Nachweis der Proteaseaktivität möglich. - 4. Enzymtest mit markierten Substraten, die die Spaltstelle imitieren.
Synthetische Peptide werden C-terminal oder N-terminal oder mit einer Markierungsgruppe versehen, die durch die Protease abgespalten wird. Die Markierungsgruppe ist so beschaffen, daß sie an das Peptid gebunden farblos ist. Durch die Abspaltung entsteht ein farbiges Molekül. Ein Beispiel für eine solche Markierung ist die Dinitrophenylgruppe, die gebunden an das Peptid farblos ist, aber nach Abspaltung gelb gefärbt ist. Andere Markierungen sind Verbindungen, die nach der Abspaltung fluoreszieren, bzw. deren Fluoreszenz nach der Abspaltung unterdrückt ("gequencht") wird (Beispiel Methoxycoumarin-derivate von Peptiden). Gemeinsam ist diesen Markierungen, daß durch die Abspaltung ein Signal (z. B.: Farbe, Fluoreszenz, Licht) erzeugt oder unterdrückt wird, das direkt gemessen werden kann. Dadurch ist eine quantitative Messung der Aktivität der Proteasen möglich.
Zusammenfassend liegen die Vorteile der Erfindung darin, daß kein Umgang mit
radioaktiven Markierungen erforderlich ist. Die Haltbarkeit der nichtradioaktiven
Verbindungen ist deutlich höher. Eine quantitative Bestimmung der
Proteaseaktivität ist in wenigen Stunden möglich. Die Möglichkeit der
Automatisierung ist ebenfalls gegeben. Dadurch eignen sich diese
Nachweismethoden für den Einsatz in der klinischen Forschung und auch im
Routinelabor, wodurch Testpackungen, die alle Testreagentien enthalten,
kommerziell verwertbar sind
IGFBP-3 ist im humanem Serum das IGFBP mit der höchsten Konzentration. Im
Serum von Schwangeren ist jedoch die Aktivität einer spezifischen Protease stark
erhöht, der Anteil an intaktem IGFBP-3 nimmt stark ab und ist abhängig vom
Schwangerschaftsstadium. Andere Quellen für IGFBP-3 Proteasen sind
beispielweise Peritonealflüssigkeit, Seminalplasma, Thymuszellen, oder
Überständen von Fibroblasten- oder Prostatazellkarzinomkulturen.
Zur Markierung des IGFBP-3 wird Biotin verwendet. Biotin bindet mit hoher Affinität
an ein Protein aus Hühnereiweiß, Avidin oder ein nahe verwandtes Protein aus
Streptomyces avidinii, das Streptavidin. Avidin oder Streptavidin lassen sich sehr
leicht an Enzyme koppeln. Enzymkonjugate sind kommerziell erhältlich und werden
Zum Nachweis biotinylierter Moleküle verwendet. Reagentien zur Biotinylierung
sind kommerziell erhältlich. Bewährt haben sich N-hydroxysuccinimidester des
Biotins. Um eine bessere Zugänglichkeit für Avidin oder Streptavidin zu
gewährleisten, wird oft ein sogenannter "Spacer" zwischen das markierte Molekül
und den Biotinrest eingefügt. Für IGFBP-3 wurde 6-Aminohexansäure als Spacer
verwendet. Überschüssiges Biotinylierungsreagenz kann durch
Größenausschlußchromatographie entfernt werden. Das biotinylierte IGFBP-3 wird
mit einer Probe inkubiert, die Proteasen enthält, beispielsweise mit Serum von
Schwangeren. Die Inkubationszeiten liegen im Bereich von 30 Minuten bis mehrere
Stunden. Nach der Inkubation wird das Serum in Probepuffer erhitzt, dabei wird die
Reaktion gestoppt. Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (oder eine andere
Elektrophoresmethode) wird nach Herstellervorschrift durchgeführt. Für den
Transfer auf die Nitrocellulosemembran (den sogenannten "Blot") können alle
gängigen Blotting-Techniken verwendet werden, wie Elektroblot, Semi-Dry Blot
etc., aber auch ein einfacher Kapillarblot ist gut geeignet.
Nach dem Transfer werden die freien Bindungsstellen auf der Membran blockiert,
dies geschieht durch Inkubation (1 h bei Raumtemperatur) auf einem Schüttler mit
einer Protein-haltigen Lösung, beispielweise mit einer 1% Gelatinelösung in
TRIS-gepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 mit 0,05% Tween-20. Nach der
Blockierung wird die Membran mit einem Streptavidin-Peroxidasekonjugat
inkubiert. Dieses bindet nur an das biotinylierte IGFBP-3 bzw. die biotinylierten
Fragmente, die durch die proteolytische Spaltung entstanden sind, nicht aber an
IGFBP-3, das in der Probe vorhanden war. Überschüssiges Streptavidin-Peroxidase
konjugat wird durch Waschen entfernt. Danach wird der Blot mit einem
lumineszierenden Substrat inkubiert. Dabei wird an den Stellen an denen das
Streptavidin-Peroxidasekonjugat gebunden hat, Licht erzeugt. Durch Exposition mit
einem Film kann eine Abbildung erzeugt werden. Die Auswertung kann durch
Denistometrie erfolgen.
Alternativ kann ein colorimetrisches Substrat verwendet werden, dann entstehen
gefärbte Banden direkt auf der Membran. Ein colorimetrische Nachweis ist auch im
Anschluß an eine Detektion mit einem lumineszierenden Substrat möglich. Die
Membran wird lediglich einige Minuten gewaschen und anschließend mit dem
colorimetrischen Substrat inkubiert.
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Regulation 2, S. 69-79.
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17. Lee, C. Y. und Rechler, M. M. et al. (1996): Proteolysis of Insulin-Like Growth Factor (IGF)-Binding Protein (IGFBP-3) in 150-Kilodalton IGFBP Complexes by a Cation-Dependent Protease Activity in Adult Rat Serum Pomotes the Release of Bound IGF-I. Endocrinology Vol 137, No. 5, S. 2051-2058.
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21. Durham, S. K. et al. (1995): Alterations in Insulin-Like Growth Factor (IGF)-Dependent IGF-Binding Protein-4 Proteolysis in Transformed Osteoblastic Cells. Endocrinology Vol. 136, No. 4, S. 1374-1380.
Claims (1)
- Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Proteasen für Insulin-like Growth Factor Binding Proteine (IGFBP-Proteasen), gekennzeichnet dadurch, daß als Substrat für die Proteasen nichtradioaktiv markierte Insulin-like Growth Factor Binding Proteine oder Teilsequenzen von Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen, die der Spaltstelle der Proteasen entsprechen, oder synthetische Substrate, die die Spaltstelle der Proteasen imitieren, verwendet werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19735614A DE19735614A1 (de) | 1997-08-16 | 1997-08-16 | Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen). |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19735614A DE19735614A1 (de) | 1997-08-16 | 1997-08-16 | Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen). |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19735614A1 true DE19735614A1 (de) | 1999-02-18 |
Family
ID=7839216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19735614A Ceased DE19735614A1 (de) | 1997-08-16 | 1997-08-16 | Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen). |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19735614A1 (de) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2808111A1 (de) * | 1977-02-26 | 1978-08-31 | Ajinomoto Kk | Neue dipeptidderivate und deren verwendung zur messung der enzymatischen aktivitaet |
| DE2854987A1 (de) * | 1978-12-20 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene |
| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
| DE3211932A1 (de) * | 1982-03-31 | 1983-10-13 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Chromophore peptide, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung zum nachweis von dd-carboxypeptidasen |
-
1997
- 1997-08-16 DE DE19735614A patent/DE19735614A1/de not_active Ceased
Patent Citations (4)
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| DE2808111A1 (de) * | 1977-02-26 | 1978-08-31 | Ajinomoto Kk | Neue dipeptidderivate und deren verwendung zur messung der enzymatischen aktivitaet |
| DE2854987A1 (de) * | 1978-12-20 | 1980-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene |
| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
| DE3211932A1 (de) * | 1982-03-31 | 1983-10-13 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Chromophore peptide, verfahren zu ihrer herstellung, diese enthaltende mittel und ihre verwendung zum nachweis von dd-carboxypeptidasen |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8131 | Rejection |