DE19734389C2 - Verfahren zur Gewinnung von Paramylon (ß-1,3-Glucan) in Euglena gracilis sowie Verwendung des so erzeugten Paramylons als Folie oder als Verpackungsmaterial - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Paramylon sowie für die Verwendung des erzeugten Paramylons als Folie oder als Verpackungsmaterial nach dem Oberbegriff dieser Ansprüche.

Im Bereich der Kartoffel- und Stärkeindustrie falten jährlich in der Ern­ tezeit bei der Isolierung von Stärke aus Kartoffeln und Getreide bis zu 400.000 m³ organisches Abwasser an. Diese gewaltigen Abwasser­ mengen stellen für die Stärkeindustrie ein großes Entsorgungsproblem dar, das bisher nicht zufriedenstellend gelöst werden konnte. Da das, Abwasser für eine normale Verklappung zu hohe Nährstoffkonzentra­ tionen an Nitraten, Proteinen und vor allen Dingen Kohlenhydraten enthält, wird es unter großem Energieaufwand eingedampft, wobei die dabei ausfallenden Rückstände zu Viehfutter verarbeitet werden und die Restflüssigkeit zur Düngung in der Landwirtschaft Verwendung fin­ det. Die isolierte Stärke wird zu Stärkemehl und verschiedenen Nah­ rungsmittelzusätzen verarbeitet.

Es ist auch bekannt, aus Kartoffelstärke biologisch abbaubare Verpac­ kungsmaterialien wie Folien und Müllbeutel herzustellen, die jedoch sehr spröde sind, was nur durch den Zusatz von Weichmachern besei­ tigt werden kann.

Weiterhin ist bekannt, zur Klärung von Abwässern Mikroorganismen einzusetzen, wobei dann allerdings die Frage der Entsorgung der ein­ gesetzten Organismen ungeklärt bleibt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein weiteres Verfahren zur Gewinnung von Paramylon in Euglena-gracilis zu schaffen, mit den Verfahrensschritten der Kultivierung in einem Kulturmedium, Abtrennung der Euglena Zellen aus dem Kulturmedium und Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen.

Ein derartiges Verfahren ist bereits aus der US-A-5 385 832 bekannt. Dort erfolgt die Kultivierung der Euglena-gracilis Zellen in einem speziellen synthetischen Kulturmedium, welches zwingend eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, ein Makronahrungsmittel für das Zellwachstum, Spurenelemente für das Zellwachstum und Vitamine für das Zellwachstum jeweils in speziellen Mengen enthalten muß, wie in Spalte 2, Zeile 36 bis 60 sowie in Spalte 4, Zeile 5 bis 43 im einzelnen offenbart. Die Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen erfolgt durch eine Aufspaltung der Zellen und Extraktion der Zellen mittels eines Extraktionsmittels, welches Fett und Pigmente aus den Zellen entfernt und β-1,3-Glucan enthält, welches zunächst von dem Extraktionsmittel getrennt wird. Daraufhin wird zu dem β-1,3-Glucan unter Rühren und Erhitzen Säure hinzugefügt, um eine säurelösliche und eine säureunlösliche Fraktion zu erhalten, wobei die säureunlösliche Fraktion kristallines β-1,3-Glucan enthält und die säureunlösliche Fraktion, die das kristallines β-1,3-Glucan enthält mit sterilem Wasser gewaschen wird, um ein im wesentlichen reines β-1,3-Glucan mit einer Reinheit von mehr als 95% zu erhalten.

In diesem Stand der Technik ist also zwingend vorgeschrieben, sowohl ein synthetisches speziell zusammengesetztes Kulturmedium einzusetzen, als auch im Rahmen der Isolierung des Paramylons als Extraktionsmittel ein organisches Lösemittel zu verwenden, welches Methanol und Chloroform enthält, beides heutzutage bedenkliche Lösemittel.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gemäß Kennzeichen von Anspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 7.

Mithin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Paramylon (β-1,3-Glucan) in Euglena-gracilis durch Kultivierung der Euglena-gracilis Zellen in einem Kulturmedium, Abtrennung der Euglena Zellen aus dem Kulturmedium und Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Kulturme­ dium ein von festen Bestandteilen gereingtes, sterilfiltriertes kohlenhydrathaltiges organisches Abwasser ausgewählt aus Getreide- und/ oder Kartoffelabwässern, einsetzt.

Insofern verwendet das erfindungsgemäße Gewinnungsverfahren für Paramylon kein technisch aufwendiges und speziell zusammengesetzte Kulturmedium für die Paramylongewinnung, sondern vielmehr eine natürlich Quelle, nämlich ein von festen Bestandteilen gereinigtes, steril filtriertes, kohlenhydrathaltiges organisches Abwasser ausgewählt aus Getreide- und/oder Kartoffelabwässern. Darüber hinaus erfolgt die Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen auch lösemittelfrei, insbesondere aber ohne Verwendung von bedenklichen Lösemitteln wie Methanol und Chloroform.

Ein Einsatz dieses speziellen Kulturmediums, wie auch ein Einsatz eine Aufarbeitung lösemittelfrei ist aber aus diesem Stand der Technik nicht ableitbar, weil dort als Einzelschritte sowohl eine Lösemittelbehandlung als Extraktion, wie auch eine Kultivierung in einem speziellen synthetischen Kulturmedium vorgesehen sind.

Weiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des nach vorstehend genannten Verfahren erzeugten Paramylons als Folie, insbesondere biologisch abbaubare recyclbare Folie oder als Verpackungsmaterial.

Das bei der Isolierung von Stärke aus Kartoffeln und Getreide anfal­ lende organische Abwasser mit den darin in gelöster Form vorliegen­ den Kohlenhydraten wird bei dem Reinigungsverfahren zunächst me­ chanisch von festen Bestandteilen gereinigt und anschließend sterilfil­ triert, wonach es zur Kultivierung von kohlenhydratreduzierenden Mi­ kroorganismen in einem Fermenter mit den entsprechenden Zellen geimpft wird und anschließend über einen bis mehrere Tage, bei einer zu bevorzugenden Verfahrensvariante 5-10 Tage bei einer Temperatur zwischen 20-30°C, gehalten wird, währenddessen sich die Organis­ men vermehren, die aus dem kohlenhydratreichen Abwasser als Spei­ cherkohlenhydrate beta-1,3-Glucan synthetisieren. Aus dem nach die­ sem Verfahren von Kohlenhydraten gereinigten Abwasser können an­ schließend die Mikroorganismen entnommen und verwertet und das Abwasser verklappt werden.

Hierbei wird als Mikroorganismus die einzellige Alge Euglena-gracilis kul­ tiviert, die als Speicherkohlenhydrat das beta-1,3-Glucan Paramylon in granulärer Form in der Zelle ablagert. Euglena-gracilis ist ein einzelli­ ger Organismus, der sowohl photoautotroph, also photosynthesetrei­ bend, als auch heterotroph existieren kann. Dieser Organismus, der sehr leicht im Labormaßstab kultiviert werden kann, zeichnet sich durch seine relative Anspruchslosigkeit im Hinblick auf seine Wachs­ tumsbedingungen aus und kommt in der Regel in allen stehenden Ge­ wässern wie Tümpeln und Teichen natürlich vor. Als Speicherkohlen­ hydrat synthetisiert dieser Organismus sowohl unter photoautotrophen, wie heterotrophen Wachstumsbedingungen Paramylon, ein zu den beta-1,3-Glucanen zählendes Polysaccharid, das in granulärer Form in der Zelle abgelagert wird und somit leicht aus dieser isoliert werden kann.

Dieses Speicherkohlenhydrat ist prinzipiell der Stärke (Reservepoly­ saccharid der Grünalgen und höheren Pflanzen) vergleichbar, unter­ scheidet sich jedoch von dieser in seiner chemischen Struktur (beta- 1,3-glucosidische Bindungen) sowie den Stoffeigenschaften. Die beta- 1,3-glycosidisch verknüpften Glucane weisen im Gegensatz zur Stärke (alpha-1,4-glycosidisch verknüpfte Glucane) biologische Aktivität auf, d. h. sie sind in der Lage, das Immunsystem von Mensch und Tier kas­ kadisch zu aktivieren und können so Tumorwachstum, Virusinfektionen (Aids) oder strahlungsbedingten Hautschädigungen entgegenwirken, fördern die Wundheilung und wirken vorbeugend gegen Faltenbildung. Aufgrund dieser Eigenschaften werden beta-1,3-Glucane auch als Zu­ sätze bei der Herstellung von Kosmetika, Salben und Cremes verwen­ det.

Als besonders vorteilhaft bei der Verwendung von Euglena-gracilis- Zellen ist anzuführen, daß das in der Zelte in granulärer Form vorlie­ gende Paramylon in einer sehr reinen Form vorliegt und nicht durch weitere Bestandteile, wie beispielsweise diverse Proteinkomponenten verunreinigt ist, wie dies in der Regel bei aus den Zellwänden von He­ fezellen oder anderen Pilzen gewonnenen beta-1,3-Glucanen der Fall sein kann, die unter aufwendigen Methoden daraus isoliert werden müssen. Weiterhin weist das nach dem erfinderischen Ver­ wertungsverfahren als Nebenprodukt erzeugte Paramylon eine hohe biologische Wirksamkeit und Aktivität auf, die jeweils abhängig ist von der Feinstruktur des jeweiligen Glucans und die bei dem nach dem er­ finderischen Verfahren gewonnenen Paramylon eine hohe immunmo­ dulatorische Wirkung besitzt, beispielsweise anti-HIV, antitumoraktive, antimikrobielle und Adjuvansaktivität.

Vorteilhafterweise kann bei einem erfinderischen Verfahrensschritt nach abgeschlossener Fermentation ein Teil der Zellkultur zum Impfen des Abwassers eines sich anschließenden Fermentationszyklusses verwendet werden. Ein solcher Fermentationsprozess dauert bei einem bevorzugten Verfahren 5 bis 10 Tage und wird bei einer optimalen Temperatur zwischen 20 und 30°C gehalten. Abschließend werden die Mikroorganismen durch Zentrifugation oder nach deren Absetzen auf­ grund ihres Eigengewichtes mit anschließendem Abkippen und Ver­ klappen des nun von Kohlehydratbestandteilen freien Abwassers aus diesem entfernt. Für eine anschließende Isolierung des granularen Pa­ ramylons müssen die Zellen aufgebrochen werden. Dies erfolgt bevorzugt entweder durch eine Ultraschallbehandlung der Zellen für einige Minuten oder durch Verkochen der Zellen in einprozentiger Natriumdodecylsul­ fat-Lösung (SDS-Lösung) für eine Stunde am Rückfluß. Anschließend läßt man das Paramylon am Boden absetzen und saugt vorsichtig den Überstand ab, der verworfen werden kann. Das so gewonnene Pa­ ramylon wird einige Male mit Wasser und zum Schluß mit Ethanol ge­ waschen, welches durch Destillation zurückgewonnen werden kann. Nach der Trocknung des Paramylons, beispielsweise durch Gefrier­ trocknung, steht dieses für nachfolgende Verarbeitungsschritte zur Verfügung.

Zur Herstellung von Verpackungsmaterial und Folien wird das Pa­ ramylon beispielsweise in 4 Mol/l Natriumhydroxid NaOH gelöst. Nach vollständiger Auflösung erfolgt die Neutralisation mit konzentrierter Salzsäure HCl. Bei diesem Schritt fällt das Paramylon als schleimiges, stark gequollenes Produkt aus. Es wird abzentrifugiert und so oft mit Wasser gewaschen, bis mit Silbernitrat kein Chlorid mehr nachweisbar ist. Anschließend wird das Paramylon mit Wasser zu einer homogenen und gießfähigen Masse verarbeitet, die etwa 1% Glycerin enthält. Sol­ len die Folien später eine bestimmte Farbe haben, werden hier zusätz­ lich noch Farbstoffe zugesetzt, bis die gewünschte Farbintensität er­ reicht ist. Diese Masse wird auf einer flachen Plexiglasform ausgegos­ sen. Nachdem Trocknen und Verdunsten des Wassers kann die Folie vom Untergrund abgezogen werden und steht zur weiteren Verarbei­ tung zur Verfügung.

Eine nach diesem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugte Folie besitzt den Vorteil, daß das hergestellte Folienmaterial zu jeder Zeit nicht nur biologisch abbaubar ist, sondern auch wieder vollständig recycelbar ist, durch erneutes Auflösen der Folienabfälle in NaOH oder Dimethylsul­ foxid DMSO. Somit können aus Folienabfällen immer wieder neue Foli­ en hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren der Folien­ herstellung aus Paramylon ist prinzipiell auch unter dem medizinischen Aspekt von Interesse. Da beta-1,3-Glucane fördernd bei der Wundhei­ lung wirken, könnten die hergestellten Folien auch gezielt auf Wunden und entzündete Stellen aufgebracht werden.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Nebenprodukt anfallende Paramylon läßt sich vorteilhafterweise auch für medizinische Zwecke verwenden, beispielsweise in der Tumorthe­ rapie, zur Unterstützung des Immunsystems bei diversen Erkrankungen oder zur Förderung der Wundheilung durch äußere Anwendung in Form von Salben. Dazu ist es jedoch notwendig, das Paramylon in eine lösliche Form umzuwandeln, da es in der isolierten Form wasserunlös­ lich ist. Dies kann beispielsweise durch eine Sulfatisierung der Sub­ stanz mit Chlorsulfonsäure erfolgen. Dazu wird 1 g Paramylon (für die Herstellung von 1 g wasserlöslicher Substanz) zunächst in 30 ml Di­ methylsulfoxid DMSO gelöst und unter Rühren in eine Mischung aus 30 ml getrockneten Pyridin und 2 ml Chlorsulfonsäure eingerührt. Nach der Reaktion, die bei 80°C für drei Stunden unter leichtem Rühren er­ folgt, wird die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. Anschließend werden 200 ml Methanol hinzugefügt. Das gefällte Präzipitat wird abfiltriert und in 150 ml 5­ %iger NaCl-Lösung unter Rühren gelöst. Schließlich wird der PH-Wert mit 5 Mol/l NaOH auf 9 eingestellt und das Paramylonsulfat durch Ver­ setzen mit 450 ml Aceton gefällt. Der Überstand, aus dem das Aceton durch Destillation zurückgewonnen werden kann, wird dekantiert. Das Produkt wird anschließend mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Die so hergestellte Substanz ist vollkommen wasserlöslich. Für die Anwen­ dung in Salben oder Cremes kann das Paramylon sehr gut in DMSO gelöst werden. DMSO ist ein ungiftiges Lösungsmittel, das in der pharmazeutischen Industrie bei der Herstellung von Salben häufig als Lösungsvermittler verwendet wird und gute Hautverträglichkeit auf­ weist.

Bei dem erfinderischen Verfahren gelingt es also, die immensen Mengen an organischem Abwasser, die bei der Isolie­ rung von Kartoffel- und Getreidestärke anfallen, biologisch von der Kohlenhydratfracht zu befreien und gleichzeitig sinnvoll als Kulturme­ dium für die Anzucht eines Organismus zu verwenden, der aufgrund seines biologisch bedeutungsvollen Speicher-Polysaccharids Paramy­ lon zu verschiedenen Produkten weiterverarbeitet werden kann, wobei die Isolierung des beta-1,3-Glucans aus den Zellen im Gegensatz zu den bekannten Verfahren zur Isolierung aus den Zellwänden von Hefe­ zellen mit wesentlich einfacheren Methoden erfolgen kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren verwertet die genannten anfallenden Abwässer als biotechnologisches Kulturmedium zur Gewinnung von beta-1,3-Glucan als Ausgangsstoff für die Herstellung biologisch ab­ baubarer Verpackungsmaterialien sowie zur Herstellung medizinischer und kosmetischer Präparate. Da die heterotrophen Zellen im Dunkeln wachsen, bleibt dem Anwender eine aufwendige Photobioreaktortech­ nik erspart, wie sie beispielsweise beim Einsatz photoautotropher Or­ ganismen notwendig wäre. Die Isolierung des Paramylons ist aufgrund der Tatsache, daß das Glucan in granulärer Form in der Zelle abgela­ gert wird, methodisch leicht durchführbar. Hierin liegt ein wesentlicher Vorteil im Vergleich zu anderen Organismen (Hefe), die nichtgranuläre beta-1,3-Glucane synthetisieren. Da das isolierte Paramylon bei der Herstellung von Verpackungsmaterial stark quillt, reichen bereits gerin­ ge Mengen für die Herstellung dünner Folien aus.

Claims (8)

1. Verfahren zur Gewinnung von Paramylon (β-1,3-Glucan) in Euglena-gracilis durch

• - Kultivierung der Euglena-gracilis Zellen in einem Kulturmedium,
• - Abtrennung der Euglena Zellen aus dem Kulturmedium
• - und Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen,

dadurch gekennzeichnet, daß man als Kulturmedium ein von festen Bestandteilen gereingtes, sterilfiltriertes kohlenhydrathaltiges organisches Abwasser ausgewählt aus Getreide- und/oder Kartoffelabwässern, einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen durch eine Ultraschallbehandlung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isolierung des Paramylons aus den Euglena Zellen durch Verkochen mit wäßriger Natriumdodecylsulfatlösung vornimmt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das isolierte Paramylon mit Wasser und Ethanol wäscht und trocknet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mittels Gefriertrocknung trocknet.

6. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Paramylon als Folie isoliert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des Paramylons als Folie durch Lösen in Natriumhydroxidlösung, Neutralisation in wässriger Salzsäure, Waschen des Präzipitats bis zur Chloridfreiheit, Gießen auf eine glatte Unterlage und Trocknen erfolgt.

8. Verwendung des nach Anspruch 1 bis 5 erzeugten Paramylons als Folie, insbesondere biologisch abbaubare recyclbare Folie oder als Verpackungsmaterial.