DE19730535A1

DE19730535A1 - Spezielle Virus-DNA-Fragmente und ihre Verwendung als Promotor

Info

Publication number: DE19730535A1
Application number: DE1997130535
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Rohde; Dieter Becker; John W Randles; Alain Hehn; Francesco Salamini
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1997-07-16
Publication date: 1999-01-21
Also published as: EP1000165A1; AU9065098A; CA2296796A1; WO1999004022A1

Description

Es ist allgemein bekannt, daß sich mittels gentechnologi scher Arbeitstechniken gezielt einzelne Gene in das Genom von Lebewesen, wie Mikroorganismen, Hefen oder Pflanzen, übertragen lassen. Diese als Transformation oder bei höheren Zellen auch als Transfection bekannte Technik wird routinemäßig auf ver schiedenen Wegen durchgeführt, z. B. durch "particle gun bom bardment" (vgl. M.E. Fromm, F. Morrish, C. Armstrong, R. Wil liams, J. Thomas und T.M. Klein: "Inheritance and expression of chimeric genes in the progeny of transgenic maize plants", Bio/Technology 8: 833-839, 1990), "nackten DNA-Transfer" (vgl. P. Meyer, I. Heidmann, G. Forkmann und H. Saedler: "A new petu nia flower colour generated by transformation of a mutant with a maize gene", Nature 330: 677-678, 1987) oder durch Agrobacte rium-vermittelte stabile Integration von Genen oder Genab schnitten in das Genom einer Empfängerpflanze. Als Alternative zur chromosomalen Integration von Fremdgenen können z. B. ex trachromosomal replizierende Vektoren benutzt werden, um Fremdgene ohne Integration in einem gewünschten Organismus zu exprimieren. Für Pflanzen stehen hierfür beispielsweise ex trachromosomal replizierende Vektoren zur Verfügung, die aus Pflanzenviren entwickelt wurden (vgl. z. B. J. W. Davies und J. Stanley: "Geminivirus genes and vectors", Trends Genet. 5: 77-81, 1989). Die in den gewählten Organismen zu exprimierenden Fremdgene müssen zu diesem Zweck unter die Kontrolle von für diesen Organismus geeigneten Regulationssignalen (Promotor, Terminator) gebracht werden, die entweder für eine konstituti ve, gewebe- und/oder entwicklungsspezifische Transkription sor gen. Außerdem ist es wünschenswert, durch Verwendung eines starken Promotors eine erhöhte mRNA-Synthese des Fremdgens zu bewirken.

Ein bekannter Promotor für Pflanzen, der die Anforderung an einen starken, konstitutiven Promotor erfüllt und daher vor wiegend für die Pflanzentransformation eingesetzt wird (vgl. R. Walden: "Genetic Transformation in Plants", Open University Press, Milton Keynes, 1988) ist der 35S-RNA-Promotor des cau liflower mosaic virus (CaMV).

Nachteilig an dem bekannten CaMV 35S-Promotor ist seine geringe Aktivität in Monokotyledonen und im Phloemgewebe.

In dem deutschen Patent DE 43 06 832 der Max-Planck- Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften sowie in Rohde et al., Plant Molecular Biology 27: 623-628, 1995, wurde die Ver wendung einer aus dem die Kokospalme Cocos nucifera befallenden Virus CFDV (coconut foliar decay virus) stammenden DNA, deren Struktur in den Fig. 1, 3A und 3B der Patentschrift darge stellt ist, als viraler phloemspezifischer Promotor zur gewebe spezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen be schrieben.

Das CFDV-Virus ist im vaskulären System der Pflanze loka lisiert (vgl. J.W. Randles et al.: "Localization of coconut foliar decay virus in coconut palm", Ann. Appl. Biology 1992, 601-617). Eine mit den Krankheitssymptomen und dem Auftreten von Viruspartikeln assoziierte DNA war bereits früher kloniert, sequenziert und ihre Struktur bestimmt worden (vgl. W. Rohde et al.: "Nucleotide sequence of a circular single-stranded DNA as sociated with coconut foliar decay virus", Virology 176: 648-651, 1990). CFDV ist ein virales Phytopathogen mit einem Genom aus einzelsträngiger, zirkulärer, kovalent geschlossener DNA. In Rohde et al., Virology 176: 648-651, 1990, wurden ein DNA- Molekül des CFDV mit einer Größe von 1291 Nukleotiden sowie De letionsmutanten davon beschrieben. CFDV ist kein Vertreter der Geminivirus-Gruppe, sondern bildet vermutlich den Prototyp der DNA-Virusgruppe der "Circoviren".

Für die Phloemspezifität dieses Virus könnten verschiedene Mechanismen verantwortlich sein. Für PLRV (potato leafroll vi rus) z. B., einen Vertreter der Luteovirus-Gruppe, konnte ge zeigt werden, daß eine Suppressor-tRNA, auf die das Virus für seine Genexpression angewiesen ist, nur im Phloem vorhanden ist und dadurch die Virusausbreitung über dieses Gewebe hinaus ver hindert (Rohde et al., unveröffentlichte Daten).

Aufgabe der Erfindung ist es, einen gegenüber den genann ten Promotoren stärkeren Promotor bereitzustellen, der sich insbesondere zur gewebespezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen eignet und sowohl in Monokotyledonen als auch in Dikotyledonen wie auch im Phloemgewebe aktiv ist.

Es wurde gefunden, daß die gestellte Aufgabe mit speziel len Virus-DNA-Fragmenten gelöst werden kann, die von der DNA des CFDV-Virus in der in Anspruch 1 angegebenen Weise abgelei tet sind.

Gegenstand der Erfindung sind demzufolge die in den An sprüchen gekennzeichneten Virus-DNA-Fragmente und deren Verwen dung als Promotoren.

Überraschenderweise wurde herausgefunden, daß die soge nannte "stem-loop"-Struktur, die allgemein nur als notwendiges Element für die Replikation von CFDV und den Geminiviren ange sehen wird, einen entscheidenden Einfluß auf die Transkription ausübt. So sind Konstrukte für die transiente Expression eines Reportergens in Kartoffelprotoplasten nur dann aktiv, wenn die "stem-loop"-Struktur erhalten ist. Darüber hinaus wurde gefun den, daß die Anwesenheit des oder der Translationsstart(s) für die beiden offenen CFDV-Leseraster ORF1 und/oder ORF2 die Translation eines Reportergens negativ beeinflußt.

Die CFDV-Fragmente entsprechend der Erfindung sind dement sprechend durch die vollständige "stem-loop"-Struktur und das Fehlen des oder der Translationsstart(s) für die offenen Le seraster ORF1 und/oder ORF2 des CFDV gekennzeichnet.

Bezogen auf das 5'-Ende der aus der Spaltung der zirkulä ren DNA des CFDV mit der Restriktionsendonuklease XhoI resul tierenden linearisierten DNA als Position 1 umfaßt die "stem-loop"- Struktur die Nukleotide 941 bis 971; die offenen CFDV- Leseraster ORF1 und ORF2 umfassen die Nukleotide 1004 bis 583 bzw. 1215 bis 383.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer CFDV-DNA-Fragmente be dient man sich dem Fachmann wohlbekannter Techniken, wie bei spielsweise geeigneter Schnittstellen von Restriktionsendonu kleasen auf der CFDV-DNA oder der Polymerase-Kettenreaktions technik, die es ermöglicht, mittels spezifischer Primer CFDV- DNA-Fragmente der gewünschten Länge ausgehend von einem Vollän gen-CFDV-DNA-Konstrukt zu amplifizieren. Hierzu werden auf an sich bekannte Weise die Primer entsprechend dem gewünschten CFDV-Fragment anhand der von W. Rohde et al. in Virology 176: 648-651, 1990 beschriebenen Nukleotidsequenz des CFDV-Virus und genauer der Nukleotidsequenzen im Bereich der 5'- bzw. 3'-Enden des gewünschten Fragments synthetisiert.

Insbesondere bevorzugte erfindungsgemäße CFDV-DNA-Frag mente sind die DNA-Fragmente mit den Nukleotiden 211 bis 991, 409 bis 991, 611 bis 991 oder 711 bis 991.

Im Vergleich zu den in dem deutschen Patent DE 43 06 832 beschriebenen Promotoren weisen die neuen Konstrukte überra schenderweise eine bis zu 4-fache Steigerung der Aktivität, im Vergleich zu dem CaMV 35S-Promotor eine bis zu 2-fach höhere Aktivität in Pflanzenzellen auf. Dabei wird insbesondere eine starke und spezifische Expression von Genen unter der Kontrolle dieser erfindungsgemäßen Promotoren im Phloemgewebe beobachtet. Dementsprechend ist ein wichtiger Anwendungsbereich der Erfin dung beispielsweise die phloemspezifische Expression von luteo viralen Genen mit dem Ziel, virusresistente Pflanzen zu schaf fen. Luteoviren, wie z. B. PLRV (potato leafroll virus) sind phloemspezifisch replizierende Viren und der bislang u. a. ver wendete CaMV 35S-Promotor zeigt nur schwache Aktivität im Phloemgewebe.

Ein weiterer überraschender Befund ist die Tatsache, daß erfindungsgemäße CFDV-DNA-Fragmente auch in Bakterien eine deutlich höhere Aktivität aufweisen als der gleichfalls in Bak terien aktive CaMV 35S-Promotor (Assaad und Signer, Molecular and General Genetics 223: 517-520, 1990). So weist das CFDV- Konstrukt pRT CF4 eine bis zu 60-fach höhere Aktivität in E. coli als der CaMV 35S-Promotor auf. Aufgrund dieser Aktivität eignen sich die erfindungsgemäßen CFDV-Promotoren auch für den Einsatz in bakteriellen Systemen, beispielsweise zur Herstel lung von pharmakologisch aktiven Proteinen oder Peptiden.

Weitere Untersuchungen deuten auf eine gleichfalls hohe Aktivität dieser CFDV-Fragment-Promotoren in Hefen und Pilzen hin.

Gleichfalls Gegenstand der Erfindung sind DNA-Fragmente, die von den vorstehend definierten CFDV-Fragmenten durch Sub stitution, Deletion, Insertion oder Modifizierung von einzelnen Nukleotiden oder kleineren Gruppen von Nukleotiden abgeleitet sind und die eine vergleichbare Promotoraktivität wie die Aus gangsfragmente aufweisen, sowie deren Verwendung als Promoto ren. Als vergleichbare Promotoraktivität kann beispielsweise eine Promotoraktivität angesehen werden, die bis zu 20% über oder unter derjenigen des Ausgangsfragments liegt.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind transformierte Pflanzen-, Bakterien- und Hefezellen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Fragmente erhalten wurden.

Die Figuren zeigen in:

Fig. 1: die schematische Struktur der CFDV-DNA mit 6 möglichen offenen Leserastern (ORF1-6) und der sogenannten "stem-loop"-Struktur. Der Pfeil weist auf die XhoI-Schnittstelle hin.

Fig. 2: die sogenannte "stem-loop"-Struktur; sie zeigt Homologie zu einer ähnlichen Struktur im Genom von Geminiviren und ist vermutlich für die Replikation des Virus verantwortlich.

Fig. 3: die schematische Anordnung möglicher Signale für die Transkriptions-Regulation auf der durch Schnitt an der XhoI-Schnittstelle linearisierten CFDV-DNA. Die Pfeile kennzeichnen die größeren offenen Leseraster ORF1, ORF2, ORF3 und ORF4 auf der CFDV-DNA. Die mit TATAA gekennzeichnete Stelle umfaßt eine mögliche TATA-Box, die zwei Pfeilköpfen zugeordnete Abkürzung RPT weist auf eine wiederholte Sequenz hin; die "stem-loop"- Struktur ist mit SL gekennzeichnet.

Fig. 4: die Sequenz der zwei wiederholten Sequenzen (RPT) und deren Anordnung als stabile "stem-loop"- Strukturen mit der üblichen CGAAG-loop- Sequenz.

Fig. 5: eine schematische Darstellung der Lage von für Konstrukte zur Bestimmung der Promotorstärke verwendeten verschiedenen CFDV-Fragmenten auf der durch Schnitt an der XhoI-Schnittstelle li nearisierten CFDV-DNA. Die Pfeilköpfe zeigen die Lage der zwei direkt wiederholten Sequenzen (RPT) oberhalb eines 52 bp-Elements (schwarzer Kasten) an. Dieses Element zeigt 70% Sequenzi dentität zwischen CoYMV und CFDV. Die Pfeile kennzeichnen größere offene Leseraster in den drei Leserastern 1, 2 und 3 (ORF1, ORF2, ORF3) der CFDV-DNA. Die Abkürzung TATAA weist auf eine mögliche TATA-Box hin, die Lage der "stem-loop"- Struktur ist gleichfalls angegeben. XboI, AflIII und StyI kennzeichnen die Lage von Schnittstel len für Restriktionsendonukleasen.

Von den schematisch dargestellten CFDV-Fragment- Promotoren sind die mit pRT CF2, pRT CF3, pRT CF4 und pRT CF5 bezeichneten Fragmente erfin dungsgemäße DNA-Fragmente. Zu Vergleichszwecken aufgeführt sind die nicht erfindungsgemäßen CFDV-Konstrukte pRT CF7, pRT CF8, pRT CF9 und pRT CF10, die zwar sämtlich noch die TATAA-Box enthalten, jedoch am 3'-Ende der CFDV-Sequenz derart deletiert sind, daß eine Ausbildung der "stem-loop"-Struktur nicht mehr möglich ist. Gleichfalls Vergleichszwecken dienen das in dem deutschen Patent P 43 06 832 offenbarte, nicht erfindungsgemäße Konstrukt pRT Xho/Sty, das den Translationsstart des offenen Leserasters ORF1 mit umfaßt, und das mit 35S bezeichnete entspre chende CaMV 35S-Konstrukt.

Fig. 6: die schematische Struktur des Ausgangsplasmids pRTsynLUC.

Untersuchungen zur Promotorstärke verschiedener CFDV-Fragmente in Pflanzen und Bakterien

Für Untersuchungen zur Promotorregion und -stärke durch die transiente Expression in Pflanzenzellen und Bakterien wur den Fragmente der CFDV-DNA ausgehend von einem CFDV-Konstrukt voller Länge (Rohde et al., Plant Mol. Biol. 27: 623-628, 1995) zunächst mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifi ziert und als subgenomische Fragmente in dem Plasmidvektor pRT2synGUSΔH in transkriptionelle Fusion zum Gen der β- Glucuronidase (GUS) gebracht. Die erhaltenen Plasmide wurden in Experimenten zur transienten Expression mit einem entsprechen den CaMV 35S-Konstrukt sowie mit Konstrukten mit nicht erfin dungsgemäßen CFDV-DNA-Fragmenten verglichen.

Sämtliche nachfolgend aufgeführten Verfahrenschritte wur den, sofern nicht anders angegeben, entsprechend Standardver fahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA (1989) beschrieben werden, ausgeführt.

Anwendungsbeispiel I. Herstellung der CFDV-Fragment-GUS-Konstrukte für die transiente Expression

Als Ausgangsplasmid diente das CFDV-Konstrukt voller Län ge, das in Rohde et al., Plant Mol. Biol. 27: 623-628, 1995 be schrieben wurde. Mit Hilfe spezifischer Primer, die zusätzliche Restriktionsschnittstellen enthielten, und zwar HindIII für das 5'-Ende und NcoI für das 3'-Ende der amplifizierten DNA- Moleküle, wurde das CFDV-Genom amplifiziert. Entsprechend der Wahl der Primer wurden hinsichtlich ihrer Länge festgelegte CFDV-Fragmente erhalten. Die Primer wurden anhand der von W. Rohde et al. in Virology 176: 648-651, 1990 beschriebenen Nu kleotidsequenz des CFDV-Virus und zwar genauer anhand der Nu kleotidsequenzen im Bereich der 5,- bzw. 3'-Enden des gewünsch ten Fragments synthetisiert, um durch die spätere DNA- Amplifikation die in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten CFDV-Fragmente zu gewinnen. Die Primer waren zusätzlich um DNA- Abschnitte ergänzt, die die vorstehend genannten zusätzlichen Restriktionsschnittstellen enthielten.

Die Amplifikationsprodukte wurden mit HindIII/NcoI ver daut, die Spaltungsprodukte in einem Agarosegel aufgetrennt und die gewünschten DNA-Fragmente durch Elektroelution isoliert.

Die CFDV-Fragmente wurden dann in den Vektor pRT2synGUSΔH ligiert, der vorab aus dem Plasmid pRTsynLUC (Fig. 6; Turner et al., Arch. Virol. 137: 123-132, 1994) hergestellt worden war. Dazu wurde das Luziferase-Gen durch NcoI/BamHI-Verdau entfernt und durch das GUS-Gen mit NcoI/BamHI-Enden ersetzt. Schließlich wurde die Hindiil-Schnittstelle am 35S 3'-Ende deletiert, indem das Plasmid partiell mit HindIII geschnitten, die Schnittstelle aufgefüllt und das lineare Molekül durch Religation zu pRT2synGUSΔH zirkularisiert wurde. Anstelle der HindIII- Schnittstelle wurde so eine NheI-Schnittstelle geschaffen. Der 35S-Promotor wurde aus diesem Plasmid durch HindIII/Ncol-Verdau entfernt und durch die entsprechenden Hindlll/NcoI-CFDV-Frag mente ersetzt.

Die in den erzeugten CFDV-Fragment-GUS-Konstrukten als Promotoren enthaltenen CFDV-Fragmente sind hinsichtlich ihrer exakten Lage auf der CFDV-DNA in Tabelle 1 aufgeführt und sche matisch in Fig. 4 gezeigt. Die in Tabelle 1 angegebenen Nu kleotidpositionen beziehen sich auf eine durch Spaltung mit der Restriktionsendonuklease XhoI linearisierte CFDV-DNA, deren 5'- Ende die Position 1 zugewiesen wurde. Zur Ergänzung wurden auch die entsprechenden DNA-Abschnitte für die "stem-loop"-Struktur, die offenen Leseraster ORF1 und ORF2 und weitere Strukturele mente der CFDV-DNA aufgenommen.

Die in Tabelle 1 enthaltenen und in Fig. 4 schematisch dargestellten, mit pRT CF2-5 bezeichneten CFDV-Fragmente sind erfindungsgemäße CFDV-Fragmente. Bei den mit pRT CF7-10 be zeichneten CFDV-Fragmenten handelt es sich um nicht erfindungs gemäße Fragmente von CFDV, da diese zwar noch die TATAA-Box um fassen, jedoch bei diesen die CFDV-Sequenz an ihrem 3'-Ende derart deletiert ist, daß eine Ausbildung der "stem-loop"- Struktur nicht mehr möglich ist.

TABELLE 1

Die gleichfalls zu Vergleichszwecken eingesetzten Kon strukte pRT CF XS und pRT 35S, die das GUS-Reportergen in Ver bindung mit dem XhoI/StyI-Fragment des CFDV-Virus (Tabelle I) bzw. dem CaMV 35S-Promotor enthalten, wurden, wie in dem deut schen Patent P 43 06 832 beschrieben, hergestellt.

II. Transiente Expression von CFDV-Fragment-GUS-Konstrukten in Tabak-Protoplasten II.1. Protoplastenmedien

K3: Makroelemente
Mikroelemente
25 mM KNO₃	100 µM H₃BO₃
1 mM NaH₂PO₄	130 µM MnSO₄
6 mM CaCl₂	40 µM ZnSO₄
3 mM NH₄NO₃	5 µM KCl
1 mM (NH₄)₂SO₄	1 µM CuSO₄
1 mM MgSO₄	1 µM CoCl₂

Eisen in EDTA
Vitaminlösung
1 µM FeSO₄	270 µM Glycin
1 µM Na₂EDTA	160 µM Nicotinsäure
100 µM Pyridoxin
3 µM Thiamin

Kohlenhydrate
Hormone
400 mM Saccharose	5,5 µM NAA
1,7 mM Xylose	1,0 µM Kinetin
0,5 mM Inosit@	pH 5,6 osmotischer Wert: 600 mOs

W5:
150 mM NaCl
125 mM CaCl₂

5 mM KCl
5 mM Glucose
pH 5,6-6,0

MaMg:
450 mM Mannitol
15 mM MgCl₂
0,1% MES
pH 5,6

II.2. Herstellen von Tabak-Protoplasten

(Vgl. I. Negrutiu et al., "Fusion of plant proto plasts: a study using auxotrophic mutants of Nicotia na plumbagenifolia, viviani", Theor. Appl. Genet. 72: 279-286, 1987).

Blätter (10 g) von in Gewebekultur herangezogenen Nicotia na tabacum-Pflanzen (var. SR1) wurden in 100 ml Enzymlösung für 16 h bei 25°C im Dunkeln inkubiert und die erhaltenen Protopla sten durch Siebe (Maschenweite 100 µm) von groben Geweberesten abgetrennt. Die weitere Aufreinigung der Protoplasten erfolgte durch wiederholte Zentrifugationen und Waschen mit K3-Medium, wobei sich die vitalen Protoplasten jeweils an der Oberfläche konzentrierten, sowie schließlich durch Resuspension in W5- Medium und Sedimentation durch Zentrifugation. Das Protopla sten-Sediment wurde in MaMg-Puffer aufgenommen und auf eine Konzentration von 10⁶/ml eingestellt.

II.3. Transformation von Protoplasten

(vgl. C. Maas und W. Werr: "Mechanism and optimized conditions for PEG mediated DNA-transfection into plant protoplasts", Plant Cell Rep. 8: 148-151, 1989).

Zu jeweils 500 µl Protoplasten wurden 15 µl Plasmid/Car rier-DNA (entsprechend 10 µg CFDV-Fragment-GUS-Konstrukt- bzw. CaMV35S-GUS-Plasmid-DNA und 50 µg Kalbsthymus-DNA) gegeben, die Suspension für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, danach vor sichtig mit PEG-Lösung (40% PEG 4000, 0,1 M Ca(NO₃)₂, 0,4 M Mannitol) unterschichtet und sofort geschwenkt, bis keine Schlieren mehr sichtbar waren. Nach weiterer 30-minütiger Inku bation erfolgte die Zugabe von 4 ml K3-Medium (mit Antibiotikum und Kinetinen) und die einzelnen Transformationsansätze wurden für 20 h bei 25°C im Dunkeln gehalten.

II.4. Analyse der Protoplasten-Transformationen

Die Protoplasten-Ansätze wurden nach 20 h mit W5-Medium auf 10 ml aufgefüllt, zentrifugiert, die sedimentierten Protopla sten nach Resuspension in 1 ml W5-Medium erneut abzentrifugiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Bestimmung von Proteinmenge und GUS-Enzymaktivität mörserte man die Protopla sten in 50 µl GUS-Extraktionspuffer und bestimmte die GUS- Aktivität fluorimetrisch mit 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucu ronid (4-MUG; vgl. R.A. Jefferson: "Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system", Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405, 1987). Hierzu wurde mit 4-Methylumbelliferyl-β-D- glucuronid (4-MUG) 1 h bei 37°C inkubiert. Die Proteinmenge wurde nach Bradford bestimmt (vgl. M. Bradford: "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramme quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding", Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976).

Die für die einzelnen Konstrukte erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt. Die Ergebnisse in Tabelle 2 sind angegeben als Prozentsatz an Aktivität der ein zelnen CFDV-Konstrukte bezogen auf diejenige des CaMV 35S- Promotor-Konstrukts (pRT 35S), die zu 100% gesetzt wurde. Es werden die Ergebnisse von zwei oder drei unabhängigen Experi menten wie auch der Mittelwert aus diesen Ergebnissen angege ben. Das Konstrukt pRT CF XS enthält das in dem deutschen Pa tent P 43 06 832 offenbarte, nicht erfindungsgemäße Fragment, das durch die Spaltung der CFDV-DNA mittels der Restriktionsen donukleasen XhoI und StyI erhalten wird und zusätzlich den Translationsstart des offenen Leserasters ORF1 mit umfaßt.

TABELLE 2

Wie die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse zeigen, wei sen die erfindungsgemäßen CFDV-Fragmente eine deutlich höhere Promotoraktivität in Tabak-Protoplasten als der XhoI/Styl-CFDV- Fragment-Promotor des Konstrukts pRT CF XS auf, der zusätzlich den Translationsstart des offenen Leserasters ORF1 enthält und in dem deutschen Patent P 43 06 832 beschrieben worden ist.

Die nicht erfindungsgemäßen Konstrukte pRT CF7-10 zeigen in Tabak-Protoplasten keinerlei Aktivität, was zeigt, daß die Möglichkeit der Ausbildung der "stem-loop"-Struktur im Bereich der Nukleotide 941 bis 971 in dem CFDV-Fragment-Promotor für die Promotoraktivität essenziell ist.

Das erfindungsgemäße Konstrukt pRT CF4 zeigt in Tabak- Protoplasten darüber hinaus eine vergleichbare Promotoraktivität wie der CaMV 35S-Promotor (vgl. Konstrukt pRT 35S).

III. Transiente Expression von CFDV-Fragment-GUS-Konstrukten in E. coli III.1. Transformation von E. coli

Kompetente E. coli JM109-Zellen wurden mit den entspre chenden Plasmid-DNAs durch Elektroporation transformiert und auf LB-Platten (unter Zusatz von Ampicillin) selektioniert.

III.2. Analyse der E. coli-Transformationen

Man ließ einzelne Kolonien in 2 ml LB-Medium (unter Zusatz von Ampicillin) über Nacht hochwachsen. Je 10 µl Bakteriensuspensi on wurden mit 35 µl Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat- Puffer, pH 7; 10 mM EDTA; 0,1% Triton X-100) aufgeschlossen, mit 5 µl 10x 4-MUG-Lösung (4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuro nid; vgl. R.A. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387-405, 1987) versetzt und bei 37°C 10 min oder für die Messung des Zeitverlaufs der GUS-Aktivität 10 min, 20 min oder 47 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 0,2 M Na₂CO₃-Puffer gestoppt und die GUS-Aktivität mit 4-MUG fluori metrisch bestimmt. Die Proteinmenge wurde nach Bradford (vgl. M. Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) bestimmt.

Die für die einzelnen Konstrukte erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 3A und 3B aufgeführt. Die Ergeb nisse in Tabelle 3A sind angegeben als Prozentsatz an Aktivität bezogen auf die Aktivität des CFDV-Promotor-Konstrukts pRT CF4, die als die insgesamt höchste in diesem Beispiel erzielte Pro motoraktivität zu 100% gesetzt wurde. Es werden die Ergebnisse von zwei oder drei unabhängigen Experimenten sowie der Mittel wert aus diesen Ergebnissen angegeben. Die in Tabelle 3B in der jeweils rechten Spalte für die einzelnen Inkubationsdauern an gegebenen Prozentangaben geben den Prozentsatz an Aktivität be zogen auf diejenige des CFDV-Promotorkonstrukts pRT CF4 ent sprechend den in den jeweils linken Spalten aufgeführten Absolutwerten für ausgewählte Konstrukte wieder.

TABELLE 3A

TABELLE 3B

Die in Tabelle 3A aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß sämtliche erfindungsgemäßen CFDV-DNA-Fragmente auch in Bakteri en als Promotor aktiv sind und eine höhere Aktivität als der CaMV 35S-Promotor (vgl. Konstrukt pRT 35S) zeigen. Gegenüber dem Konstrukt pRT CF4, das als Promotor ein CFDV-DNA-Fragment enthält, das die wiederholten Strukturen (RPT), die 52 bp- Sequenz, die TATAA-Sequenz und die "stem-loop"-Struktur im Be reich der Nukleotide 941 bis 971 umfaßt, jedoch keinerlei DNA- Abschnitte der offenen Leseraster ORF1, ORF2 und auch ORF3 ent hält, zeigt das Konstrukt pRT 35S mit dem CaMV 35S-Promotor nur weniger als 10% von dessen Aktivität.

Claims

1. CFDV-Virus-DNA-Fragment, das die "stem-loop"-Struktur, nicht jedoch den oder die Translationsstart(s) für die offenen Leseraster ORF1 und/oder ORF2 umfaßt.

2. CFDV-Virus-DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die wiederholten RPT-Strukturen, die 52 bp-Sequenz und die TATAA-Sequenz zusätzlich zu der "stem-loop"-Struktur umfaßt.

3. CFDV-Virus-DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die Nukleotide 211 bis 991, 409 bis 991, 611 bis 991 oder 711 bis 991 umfaßt, wobei für die Numerierung der Nukleotide dem 5'-Ende der aus der Spaltung der zirkulären CFDV-DNA mit der Restriktionsendonuklease XhoI resultierenden linearisierten DNA die Position 1 zugewiesen worden ist.

4. DNA-Fragment, das von einem der CFDV-Virus-DNA-Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Substitution, Deletion, Insertion oder Modifizierung von einzelnen Nukleotiden oder kleineren Gruppen von Nukleotiden abgeleitet ist und eine vergleichbare Promotoraktivität wie das Ausgangsfragment aufweist.

5. Verwendung eines oder mehrerer DNA-Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Promotor.

6. Verwendung eines oder mehrerer DNA-Fragmente nach Anspruch 5 als Promotor in Bakterien oder Hefen.

7. Verwendung eines oder mehrerer DNA-Fragmente nach Anspruch 5 als Promotor zur gewebespezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen.

8. Verwendung eines oder mehrerer DNA-Fragmente nach Anspruch 7 zur phloemspezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen.

9. Verwendung eines oder mehrerer DNA-Fragmente nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung von chimären Konstrukten zur transienten und stabilen Expression.

10. Transgene Pflanzen, Pflanzenteile, transformierte Pflanzen-, Hefe- oder Bakterienzellen, die unter Verwendung einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 erhalten worden sind.