DE19727943A1

DE19727943A1 - Method for the simultaneous determination of HIV antigens and HIV antibodies

Info

Publication number: DE19727943A1
Application number: DE19727943A
Authority: DE
Inventors: Frederic Donie; Barbara Dipl Biol Dr Upmeier; Elke Dipl Biol Dr Faatz; Eva Dipl Chem Dr Hoess
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-03-10
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 1998-09-24
Also published as: ZA981955B; DE59806359D1; AR011954A1

Abstract

The invention relates to a method for diagnosing an HIV infection by means of an immunoassay specifically detecting p24 antigen of HIV1, HIV1-subO and/or p26 antigen of HIV2, at least one antibody against the env range of HIV1, HIV1-subO and/or HIV2 and at least one antibody against the pol and/or gag range from HIV1, HIV1-subO and/or HIV2. The invention further relates to reagent kits and test strips suitable for said diagnosis method, and to monoclonal antibodies against p24 and the use thereof.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose einer HIV-Infektion mittels eines Immunoassays durch den spezifischen Nachweis von HIV-Antigenen und HIV- Antikörpern.The invention relates to a method for diagnosing HIV infection by means of a Immunoassays through the specific detection of HIV antigens and HIV Antibodies.

AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) ist eine erworbene Immunschwäche- Krankheit, die durch das HIV-Virus verursacht wird. Bisher sind als Erreger die Stämme HIV1 und HIV2 bekannt. Beide Stämme ähneln sich in Bezug auf Morphologie, Zelltropismus, Wechselwirkung mit dem CD4-Rezeptor von T-Zellen, den in vitro cytopathischen Effekt auf CD4-Zellen, die generelle genomische Struktur und die Fähigkeit, die Krankheit AIDS auszulösen (Clavel, 1987, AIDS 1, 135-140). Allerdings ist der immunologische Verwandtschaftsgrad gering, so daß HIV1-spezifische Antikörper im allgemeinen keine Kreuzreaktion zu HIV2 zeigen. Neben den am weitesten verbreiteten HIV1 Gruppe M Subtypen ist noch ein weiterer HIV1-Subtyp, der Subtyp O bekannt (Myers et al, Los Alamos Datenbank, 1994; Sharp et al. AIDS Suppl. 8, S27-S42, 1994). Der Verwandtschaftsgrad zwischen HIV1-SubO und HIV1 ist wesentlich größer als zwischen HIV1-SubO und HIV2. Antikörper, die gegen HIV1 gerichtet sind, kreuzreagieren allerdings nur zum Teil mit dem entsprechenden Antigen von HIV1-SubO. Auch ein großer Teil der HIV1-SubO spezifischen Antikörper reagiert nicht mit HIV1 Gruppe M Antigenen.AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) is an acquired immune deficiency Disease caused by the HIV virus. So far, the strains are the pathogen HIV1 and HIV2 known. Both strains are similar in terms of morphology, Cell tropism, interaction with the CD4 receptor of T cells, the in vitro cytopathic effect on CD4 cells, the general genomic structure and the Ability to trigger AIDS (Clavel, 1987, AIDS 1, 135-140). However the immunological relationship is low, so that HIV1-specific antibodies in the generally show no cross-reaction to HIV2. In addition to the most common HIV1 Group M subtypes is yet another HIV1 subtype, known as subtype O. (Myers et al, Los Alamos database, 1994; Sharp et al. AIDS Suppl. 8, S27-S42, 1994). The degree of relationship between HIV1-SubO and HIV1 is much greater than between HIV1-SubO and HIV2. Antibodies directed against HIV1 however, cross-react only partially with the corresponding antigen of HIV1-SubO. A large part of the HIV1-SubO-specific antibodies do not react with HIV1 Group M antigens.

Der Verlauf der HIV-Infektion läßt sich in mehrere diagnostisch relevante Phasen einteilen. In der Frühphase der Infektion können bereits HIV-Antigene, jedoch noch keine HIV-Antikörper nachgewiesen werden. In der Phase der Serokonversion können HIV- Antigene schwach positiv oder negativ, d. h. nicht nachweisbar sein. HIV-Antikörper der Klasse IgM sind in dieser Phase nachweisbar, HIV-Antikörper der Klasse IgG dagegen nicht oder nur schwach positiv. In der folgenden, symptomlosen Phase sind hauptsächlich HIV-Antikörper vom Typ IgG nachweisbar, während HIV-Antigen in der Regel nicht auftritt. Das gleiche gilt für den fortschreitenden Krankheitsverlauf in der klinischen Phase. The course of the HIV infection can be divided into several diagnostically relevant phases organize. In the early phase of the infection, HIV antigens can already, but not yet HIV antibodies are detected. In the seroconversion phase, HIV Antigens weakly positive or negative, i.e. H. not be detectable. HIV antibodies of the Class IgM are detectable in this phase, HIV antibodies of the IgG class, however not or only weakly positive. In the following, asymptomatic phase are mainly HIV antibodies of the IgG type are detectable, while HIV antigens usually do not occurs. The same applies to the progressive course of the disease in the clinical phase.

In der Spätphase der Erkrankung schließlich können HIV-Antikörper schwach positiv oder negativ werden, während die HIV-Antigene entweder negativ bleiben oder aufgrund der Zunahme der Viruslast, wenn das Immunsystem des Patienten zusammenbricht, wieder positiv nachgewiesen werden können. Bei diesen verschiedenen Phasen der Erkrankung, deren Verläufe sich patientenabhängig stark unterscheiden können, gibt es somit immer Zeitpunkte, an denen entweder Antigen- oder Antikörper-Nachweise falsch negative Werte ergeben können.Finally, in the late phase of the disease, HIV antibodies can be weakly positive or become negative while the HIV antigens either remain negative or because of the Increased viral load when the patient's immune system breaks down again can be positively proven. In these different phases of the disease, the courses of which can differ greatly depending on the patient are therefore always there Points in time when either antigen or antibody detection false false values can result.

Zur Detektion von Infektionen mit HIV1, HIV2 oder HIV1-SubO werden häufig Antikörper-Tests (IgG und IgM) im Brückentest-Format, das beispielsweise in der EP-A-0 280 211 beschrieben ist, durchgeführt. Als Antigene werden hierfür im allgemeinen die Antigene des sogenannten Envelope-Bereiches (env), das sind gp160, gp120, gp41 für HIV1/HIV1-SubO und gp140, gp110, gp36 für HIV2, zusammen mit dem Antigen p24 (HIV1), aus dem der Viruskern aufgebaut ist, bzw. p26 (HIV2) eingesetzt. Die Antigene p24 bzw. p26 werden vom sogenannten gag-Bereich kodiert. Diese Tests ergeben dann ein positives Signal, wenn in der Probe Antikörper gegen die genannten Antigene vorhanden sind. In der Früh- und Spätphase der Erkrankung, wenn freies p24 bzw. p26-Antigen vorhanden ist, kommt es häufig vor, daß keine Antikörper nachweisbar sind, da entweder das Immunsystem des Patienten noch nicht genügend Antikörper gebildet hat oder so erschöpft ist, daß nicht mehr ausreichend Antikörper gebildet werden, um diese detektieren zu können.To detect infections with HIV1, HIV2 or HIV1-SubO are common Antibody tests (IgG and IgM) in bridge test format, for example in EP-A-0 280 211 is carried out. For this purpose, the antigens are generally Antigens of the so-called envelope range (env) are gp160, gp120, gp41 for HIV1 / HIV1-SubO and gp140, gp110, gp36 for HIV2, together with the antigen p24 (HIV1), from which the virus core is built, or p26 (HIV2). The antigens p24 and p26 are coded by the so-called gag area. These tests then result in a positive signal if the sample contains antibodies against the named antigens are. In the early and late phase of the disease, when free p24 or p26 antigen is present, it often happens that no antibodies are detectable because either the patient’s immune system hasn’t made enough antibodies or something is exhausted that sufficient antibodies are no longer formed to detect them to be able to.

Antigen-Tests zum Nachweis von p24-Antigen werden im allgemeinen getrennt von Antikörper-Tests durchgeführt. Nur in der Frühphase der Infektion und in der Endphase von AIDS ist der Antigen-Titer beim Patienten erhöht, so daß nur in diesen Phasen p24 sicher nachweisbar ist.Antigen tests for the detection of p24 antigen are generally separated from Antibody tests performed. Only in the early phase of the infection and in the final phase The antigen titer of AIDS is increased in the patient, so that only in these phases p24 is reliably detectable.

Nachteil der bisher bekannten Tests ist, daß keiner der Tests für sich genommen den gesamten diagnostisch relevanten Zeitraum der HIV-Infektion abdeckt. The disadvantage of the tests known to date is that none of the tests taken separately covers the entire diagnostically relevant period of HIV infection.

Mit Hilfe von Kombitests können Antigene eines bestimmten Erregers und Antikörper gegen denselben Erreger gleichzeitig nachgewiesen werden. Ein solches Verfahren zur simultanen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern wird in der DE 42 36 189 A1 offenbart. Ein Lösungsansatz zur lückenlosen diagnostischen Erfassung aller Phasen einer HIV-Infektion wird jedoch nicht beschrieben.With the help of combined tests, antigens of a certain pathogen and antibodies can against the same pathogen at the same time. Such a process for Simultaneous determination of antigens and antibodies is described in DE 42 36 189 A1 disclosed. A solution for the complete diagnosis of all phases of a However, HIV infection is not described.

In der WO 93/21346 wird ein Kombitest zur simultanen Detektion von HIV1 p24-Antigen, HIV1 gp41-Antikörpern und HIV2 gp36-Antikörpern (in beiden Fällen Antikörper gegen Proteine des env-Gens) mittels eines heterogenen Immunoassays beschrieben. Mit diesem Test werden jedoch HIV-positive Proben, die kein p24 oder keine Antikörper gegen die env-Proteine enthalten, nicht als positiv erfaßt. Nur mit gp41 können nicht alle Antikörper positiven HIV1-Proben erkannt werden, da Proben weit verbreitet sind, die dadurch charakterisiert sind, daß sie im Western-Blot nur ein unvollständiges Bandenmuster aufweisen und keine Färbung der gp41-Bande zeigen.WO 93/21346 describes a combination test for the simultaneous detection of HIV1 p24 antigen, HIV1 gp41 antibodies and HIV2 gp36 antibodies (in both cases antibodies against Proteins of the env gene) using a heterogeneous immunoassay. With this However, test will be HIV-positive samples that have no p24 or no antibodies to the env proteins contained, not recorded as positive. Only with gp41 can not all antibodies positive HIV1 samples can be detected because samples are widely used as a result are characterized in that they have only an incomplete band pattern in the Western blot and show no staining of the gp41 band.

Hashida et al (1996, J. Clin. Lab. Anal. 10, 213-219) beschreiben einen diagnostischen Test für den Nachweis von HIV1-Infektionen. Bei diesem Test werden gleichzeitig p24- Antigen, IgG-Antikörper gegen p17 (aus dem gag-Bereich) und IgG-Antikörper gegen Reverse Transkriptase (RT), die vom pol-Gen kodiert wird, nachgewiesen. Mit dieser Testführung ist allerdings nur der Nachweis von HIV1-Infektionen möglich. Außerdem werden Serokonversionsseren, die nur schwach affine IgM-Antikörper gegen die beiden oben verwendeten Antigene enthalten, nicht erfaßt. Außerdem werden Serokonversionsseren, die Antikörper gegen die env-Proteine enthalten, nicht erfaßt. Nach dem Abfall des HIV-Antigen-Titers in der Frühphase der Infektion treten oft nur IgM- Antikörper gegen das env-Protein gp41 auf. In diesem Fall zeigt der Test von Hashida et al. ein falsch negatives Ergebnis.Hashida et al (1996, J. Clin. Lab. Anal. 10, 213-219) describe a diagnostic Test for the detection of HIV1 infections. In this test, p24- Antigen, IgG antibodies against p17 (from the gag range) and IgG antibodies against Reverse transcriptase (RT) encoded by the pol gene was detected. With this However, the test can only be used to detect HIV1 infections. Furthermore are seroconversion sera that have only weakly affine IgM antibodies against the two contain antigens used above, not detected. Also be Seroconversion sera containing antibodies to the env proteins were not detected. After the drop in the HIV antigen titer in the early phase of the infection often only results in IgM Antibodies against the env protein gp41. In this case, the test by Hashida et al. a false negative result.

Es existiert im Stand der Technik bisher kein diagnostisches Testsystem, mit dem die simultane Detektion von HIV1, HIV1-SubO und HIV2 lückenlos für alle Infektionsstadien zuverlässig möglich ist. There is no diagnostic test system in the prior art with which the simultaneous detection of HIV1, HIV1-SubO and HIV2 without gaps for all stages of infection is reliably possible.

Aufgabe war es daher, einen verbesserten Test auf HIV-Infektionen zu entwickeln, der es ermöglicht, als einzelner Test alle diagnostisch erfaßbaren Phasen der HIV-Infektion richtig, zuverlässig und lückenlos nachzuweisen. Der Test sollte die gleichzeitige Bestimmung von HIV1, HIV1-SubO und HIV2 ermöglichen.The task, therefore, was to develop an improved test for HIV infection that it enables, as a single test, all diagnostically detectable phases of HIV infection can be proven correctly, reliably and without gaps. The test should be simultaneous Allow determination of HIV1, HIV1-SubO and HIV2.

Die Aufgabe wird gelöst durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose einer HIV- Infektion mittels eines Immunoassays durch den spezifischen Nachweis von p24-Antigen von HIV1, HIV1 -SubO und/oder p26-Antigen von HIV2, mindestens einem Antikörper gegen den env-Bereich von HIV1, HIV1-SubO und/oder HIV2 und mindestens einem Antikörper gegen den pol- und/oder gag-Bereich aus HIV1, HIV1-SubO und/oder HIV2. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, bereits beim Auftreten von nur einem der oben aufgeführten Analyten die HIV-Infektion sicher nachzuweisen.The object is achieved by the method according to the invention for diagnosing an HIV Infection using an immunoassay through the specific detection of p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or p26 antigen from HIV2, at least one antibody against the env range of HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 and at least one Antibodies against the pol and / or gag range from HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2. With the aid of the method according to the invention, it is possible even when Only one of the analytes listed above can reliably detect HIV infection.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß durch den Nachweis von Antikörpern gegen ein Genprodukt insbesondere des pol-Bereichs von HIV in Kombination mit dem Nachweis von p24-Antigen von HIV1, HIV1-SubO und/oder p26-Antigen von HIV2 und dem Nachweis von mindestens einem Antikörper gegen den HIV-env-Bereich die bisher zu beklagende diagnostische Lücke geschlossen werden kann. Überraschenderweise hat sich ein Verfahren zur Detektion einer HIV-Infektion als besonders geeignet erwiesen, in dem Antikörper gegen die Reverse Transkriptase (RT) von HIV nachgewiesen werden, in Kombination mit dem Nachweis von p24-Antigen von HIV1, HIV1-SubO und/oder p26- Antigen von HIV2 und dem Nachweis von mindestens einem Antikörper gegen den HIV- env-Bereich.Surprisingly, it has been shown that the detection of antibodies against a Gene product in particular of the pol range of HIV in combination with the detection p24 antigen from HIV1, HIV1-SubO and / or p26 antigen from HIV2 and the like Detection of at least one antibody against the HIV env area to date lamentable diagnostic gap can be closed. Surprisingly, has a method for the detection of HIV infection has proven particularly suitable, in which Antibodies to HIV reverse transcriptase (RT) are detected in Combination with the detection of p24 antigen from HIV1, HIV1-SubO and / or p26- HIV2 antigen and detection of at least one antibody against HIV env area.

Der Nachweis der HIV-Infektion durch den erfindungsgemäßen Kombitest mittels Bestimmung der einzelnen genannten Parameter erfolgt simultan. Die Bezeichnung "Kombitest" bedeutet, daß gleichzeitig HIV-Antigene und Antikörper, die gegen HIV- Antigene gerichtet sind, nachgewiesen werden können. Mit Hilfe dieses Testes können alle HIV-Infektionsstadien sicher erfaßt werden. Durch die erfindungsgemäße Auswahl von Test-Antigenen bzw.-Antikörpern und den dazugehörigen spezifisch bindenden Rezeptoren ist es möglich, das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Zudem ist der Nachweis von HIV1, HIV1-SubO und HIV2 mit einem einzigen Test möglich. Darüberhinaus ist durch geeignete Wahl von Rezeptoren eine breite Erkennung von HIV1-Subtypen der HIV1-Gruppe M möglich. Der Test beruht bevorzugt auf dem Prinzip des heterogenen Immunoassays. Jedoch sind auch homogene Testführungen wie beispielsweise turbidimetrische Tests, bei denen keine Trennung von fester und flüssiger Phase erfolgt, denkbar.The detection of HIV infection by means of the combination test according to the invention The individual parameters mentioned are determined simultaneously. The label "Combined test" means that at the same time HIV antigens and antibodies against HIV Antigens are directed, can be detected. With the help of this test, everyone can HIV infection stages can be reliably detected. The inventive selection of Test antigens or antibodies and the associated specific binding receptors it is possible to carry out the method according to the invention. It is also proof of HIV1, HIV1-SubO and HIV2 possible with a single test. Beyond that through a suitable choice of receptors, a broad recognition of HIV1 subtypes of the HIV1 group M possible. The test is preferably based on the principle of heterogeneous Immunoassays. However, homogeneous test runs are also possible, such as turbidimetric tests in which there is no separation of solid and liquid phases, conceivable.

Erfindungsgemäß werden im Nachweisverfahren als Rezeptoren R1 und R2 solche eingesetzt, die das zu bestimmende HIV1-p24- und/oder HIV2-p26-Antigen spezifisch binden. Als Rezeptoren R3 und R4 werden ein oder mehrere Antigene aus dem env- Bereich von HIV1, HIV2 oder HIV1-SubO verwendet (gp160, gp120, gp41 für HIV1/HIV1-SubO und gp140, gp110, gp36 für HIV2). Bevorzugt werden als Rezeptoren R3 und R4 gp41 und/oder gp36 oder Fragmente davon verwendet. Als Rezeptoren R5 und R6 werden ein oder mehrere Antigene aus dem pol- oder gag-Bereich von HIV1, HIV2, oder HIV1-SubO verwendet, wobei dies nicht Epitope oder Sequenzen von p24 oder p26 sein dürfen, die mit den Rezeptoren R1 oder R2 reagieren können. Bevorzugt werden als R5 und R6 Antigene aus dem pol-Bereich von HIV1, HIV2, oder HIV1-SubO eingesetzt. Besonders bevorzugt wird als Rezeptor R5 und R6 die Reverse Transkriptase (RT) verwendet.According to the invention, such as receptors R1 and R2 are used in the detection method used that specifically the HIV1-p24 and / or HIV2-p26 antigen to be determined tie. One or more antigens from the env- Range of HIV1, HIV2 or HIV1-SubO used (gp160, gp120, gp41 for HIV1 / HIV1-SubO and gp140, gp110, gp36 for HIV2). Are preferred as receptors R3 and R4 used gp41 and / or gp36 or fragments thereof. As receptors R5 and R6, one or more antigens from the pol or gag range of HIV1, HIV2, or HIV1-SubO, which is not epitopes or sequences from p24 or p26 may be that can react with the receptors R1 or R2. Are preferred as R5 and R6 antigens from the pol range of HIV1, HIV2, or HIV1-SubO are used. Reverse transcriptase (RT) is particularly preferred as receptor R5 and R6. used.

Durch die erfindungsgemäße Kombination von Rezeptoren ist es möglich, alle Stadien der HIV-Infektion sicher zu detektieren. Es werden dadurch sowohl HIV-spezifische Analyten nachgewiesen, die nur in der Früh- oder Spätphase der Infektion vorhanden sind (z. B. p24- bzw. p26-Antigen), als auch Analyten, die in der asymptomatischen Phase auftauchen und über einen längeren Zeitraum detektierbar sind, wie beispielsweise Antikörper gegen die env-Genprodukte gp160, gp120 oder gp41 und Antikörper gegen die pol-Genprodukte Reverse Transkriptase, Integrase oder Protease oder Antikörper gegen die gag- Genprodukte p17 oder p15.The combination of receptors according to the invention enables all stages of the Detect HIV infection safely. This makes both HIV-specific analytes detected that are only present in the early or late phase of the infection (e.g. p24- or p26 antigen), as well as analytes that appear in the asymptomatic phase and are detectable over a longer period of time, such as antibodies against the env gene products gp160, gp120 or gp41 and antibodies against the pol gene products Reverse transcriptase, integrase or protease or antibody against the gag Gene products p17 or p15.

Durch geeignete Wahl der Rezeptoren können, falsch gewünscht, mit einem einzigen Test Infektionen mit HIV1, HIV2 und HIV1-SubO einschließlich aller HIV1-Subtypen der Gruppe M nachgewiesen werden. Für eine solche Testführung können als Rezeptoren R1 und R2 solche ausgewählt werden, die spezifisch das p24-Antigen von HIV1 binden. R1 und R2 werden in diesem Fall so gewählt, daß sowohl HIV1-p24 als auch HIV1-SubO-p24 erkannt und gebunden wird. Dabei kann es notwendig sein, mehrere verschiedene Rezeptoren für R1 und R2 zu verwenden, um alle HIV1 Gruppe M Subtypen und den HIV1 Subtyp O zu detektieren. Zusätzlich werden beim gleichzeitigen Nachweis von HIV1, HIV2 und HIV1-SubO entweder entsprechende kreuzreagierende oder weitere Rezeptoren R1 und R2 eingesetzt, die spezifisch auch das p26-Antigen von HIV2 erkennen. Die Anzahl der insgesamt zu verwendenden Rezeptoren R1 und R2 ist abhängig von der Kreuzreaktivität bzw. Homologie der gewählten Epitope. Durch günstige Auswahl ist es möglich, die Anzahl der verwendeten Rezeptoren zu reduzieren. Als Rezeptoren R3 und R4 können solche eingesetzt werden, die Antikörper gegen env-Genprodukte von HIV1 und HIV1-SubO spezifisch binden. Besonders geeignet ist hierbei das gp4l-Antigen (HIV1 bzw. HIV1-SubO) oder Fragmente bzw. Epitope hiervon. Als weitere Rezeptoren R3 und R4 werden solche Rezeptoren eingesetzt, die Antikörper gegen env-Genprodukte von HIV2 spezifisch erkennen. Als besonders geeignet erweist sich hierbei das gp36- Antigen oder Fragmente bzw. Epitope hiervon. Als Rezeptoren R5 und R6 können solche Rezeptoren ausgewählt werden, die Antikörper gegen gag- oder pol-Genprodukte von HIV1 und HIV1-SubO spezifisch erkennen - mit Ausnahme der Epitope von p24, die mit den Rezeptoren R1 oder R2 reagieren können. Zusätzlich können für die HIV2-Erkennung weitere Rezeptoren R5 und R6 verwendet werden, die Antikörper gegen gag- oder pol- Genprodukte von HIV2 spezifisch binden. Bevorzugt für alle Rezeptoren R5 und R6 sind solche, die Antikörper gegen die pol-Genprodukte von HIV1 und HIV1-SubO bzw. von HIV2 erkennen. Von den Rezeptoren R5 und R6 gegen die drei möglichen pol- Genprodukte Reverse Transkriptase, Integrase und Protease werden besonders bevorzugt solche Rezeptoren verwendet, die Antikörper gegen die Reverse Transkriptase erkennen.With a suitable choice of receptors, wrongly desired, with a single test Infections with HIV1, HIV2 and HIV1-SubO including all HIV1 subtypes of the Group M can be detected. For such a test procedure, R1 and R2 those are selected that specifically bind the p24 antigen of HIV1. R1 and R2 in this case are chosen so that both HIV1-p24 and HIV1-SubO-p24 is recognized and bound. It may be necessary to do several different things Receptors for R1 and R2 to use all HIV1 group M subtypes and the To detect HIV1 subtype O In addition, the simultaneous detection of HIV1, HIV2 and HIV1-SubO are either appropriate cross-reactive or others Receptors R1 and R2 are used, which also specifically contain the p26 antigen of HIV2 detect. The number of total receptors R1 and R2 to be used depends on the cross reactivity or homology of the chosen epitope. Through an inexpensive selection it is possible to reduce the number of receptors used. As receptors R3 and R4 can be used those which antibodies against env gene products of Binding HIV1 and HIV1-SubO specifically. The gp4l antigen is particularly suitable (HIV1 or HIV1-SubO) or fragments or epitopes thereof. As further receptors R3 and R4 such receptors are used, the antibodies against env gene products of HIV2 specifically recognize. The gp36- Antigen or fragments or epitopes thereof. Such receptors R5 and R6 can be such Receptors are selected that have antibodies against gag or pol gene products from Detect HIV1 and HIV1-SubO specifically - with the exception of the epitopes of p24 that are associated with the receptors R1 or R2 can react. In addition, for HIV2 detection further receptors R5 and R6 are used, the antibodies against gag- or pol- Specifically bind HIV2 gene products. R5 and R6 are preferred for all receptors those that have antibodies against the pol gene products of HIV1 and HIV1-SubO and Detect HIV2. From the receptors R5 and R6 against the three possible pol- Gene products reverse transcriptase, integrase and protease are particularly preferred used such receptors that recognize antibodies against reverse transcriptase.

Gegenstand der Erfindung ist auch das oben beschriebene Verfahren zum Nachweis einer HIV-Infektion, wobei die Rezeptoren R1 und R2 jeweils als einzelne Rezeptoren oder in Form von Gemischen verschiedener Rezeptoren eingesetzt werden. Bei Verwendung von Gemischen erkennen die Rezeptoren bevorzugt unterschiedliche Epitope des p24 bzw. p26. The invention also relates to the method described above for the detection of a HIV infection, the receptors R1 and R2 each as individual receptors or in Form of mixtures of different receptors can be used. When using Mixtures preferentially recognize the receptors of different p24 or p26 epitopes.

Der Einsatz der Rezeptorgemische dient dazu, die Erkennung verschiedener HIV-Subtypen - im Falle des p24 Antigens die Erkennung von HIV1 Gruppe M Subtypen und HIV1- SubO - mit einer einzigen Testzusammensetzung zu gewährleisten.The use of the receptor mixtures serves to identify different HIV subtypes - in the case of the p24 antigen, the detection of HIV1 group M subtypes and HIV1- SubO - to ensure with a single test composition.

Erfindungsgemäß können mit dem Nachweisverfahren auch Infektionen mit dem HIV1- Subtyp O detektiert werden.According to the invention, infections with the HIV1- Subtype O can be detected.

Außerdem können mit dem Nachweisverfahren erfindungsgemäß auch Infektionen mit den HIV1-Subtypen der Gruppe M nachgewiesen werden.In addition, the detection method according to the invention can also be used for infections with the Group M HIV1 subtypes are detected.

Erfindungsgemäß können daher auch die Rezeptoren R3, R4, R5 und R6 jeweils in Form von Gemischen verschiedener Rezeptoren eingesetzt werden, um zu gewährleisten, daß HIV1-, HIV1-SubO- und HIV2-positive Proben in einem Testansatz sicher erkannt werden. Es muß jedoch auch immer gewährleistet sein, daß sich die verschiedenen Rezeptoren gegenseitig nicht wesentlich in ihrer Bindung um das nachzuweisende Antigen bzw. den nachzuweisenden Antikörper behindern. Bevorzugt werden als Rezeptoren R3 und R4 solche eingesetzt, die jeweils die gleichen Epitope präsentieren. Dadurch wird gewährleistet, daß die antigenbindenden Teile des nachzuweisenden Antikörpers die beiden Rezeptoren R3 und R4 verbrückt. Je nach Anforderung können aber auch Rombinationen verschiedener Epitope verwendet werden. Beispielsweise könnte als R3 rekombinantes gp41 und als R4 Peptide, die vom gp41 abgeleitet sind, oder Polyhaptene - wie sie in der WO 96/03652 beschrieben sind - eingesetzt werden. Das gleiche gilt für die Rezeptoren R5 und R6. Je nach Anforderung können Rombinationen verschiedener Epitope verwendet werden. Jedoch werden auch hier bevorzugt solche Rezeptoren eingesetzt, die die gleichen Epitope darstellen.According to the invention, the receptors R3, R4, R5 and R6 can therefore also each be in the form of mixtures of different receptors can be used to ensure that HIV1-, HIV1-SubO- and HIV2-positive samples safely detected in a test batch will. However, it must also always be guaranteed that the different Receptors do not mutually bind in the antigen to be detected or hinder the antibody to be detected. Preferred receptors are R3 and R4 used those that each present the same epitopes. This will ensures that the antigen-binding parts of the antibody to be detected bridged both receptors R3 and R4. Depending on your requirements, you can also Combinations of different epitopes can be used. For example, as R3 recombinant gp41 and as R4 peptides derived from gp41, or polyhaptens - as described in WO 96/03652 - are used. The same goes for the R5 and R6 receptors. Depending on the requirements, combinations can be different Epitopes are used. However, such receptors are also preferred here used that represent the same epitopes.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen als Naßtest durchgeführt. Neben den sogenannten Naßtesten, bei denen die Testreagenzien in flüssiger Phase vorliegen, können auch alle gängigen Trockentestformate, die zum Nachweis von Proteinen bzw. Antikörpern geeignet sind, verwendet werden. Bei diesen Trockentests oder Teststreifen, wie sie beispielsweise in der EP-A-0 186 799 beschrieben sind, sind sämtliche Testkomponenten auf einem Träger aufgebracht.The process according to the invention is generally carried out as a wet test. Next the so-called wet tests, in which the test reagents are in the liquid phase, all common dry test formats that are used to detect proteins or Antibodies are suitable to be used. With these dry tests or test strips, as are described, for example, in EP-A-0 186 799, are all Test components applied to a carrier.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren, das bevorzugt als heterogener Immunoassay durchgeführt wird, erfolgt der Nachweis der Antigene durch die Rezeptoren R1 und R2 nach dem Sandwich-Prinzip. Das nachzuweisende Antigen (hier: p24 bzw. p26) wird von R1 und R2 in Form eines Sandwiches von zwei Seiten gebunden. Die Bindung der Antikörper durch die Rezeptoren R3, R4, R5 und R6 erfolgt nach dem Prinzip des Brückentests. Der zu detektierende Antikörper verbrückt die Rezeptoren R3 und R4 miteinander. Das gleiche gilt für die Rezeptoren R5 und R6. Beide Testführungen, der Sandwich- und der Brückentest, sind gleichzeitig im gleichen Ansatz durchführbar, ohne daß die beiden Prinzipien sich gegenseitig stören. Es ist daher auch möglich, alle Rezeptoren mit der Probe zusammen zu inkubieren und das Verfahren in wenigen Stufen durchzuführen. Lediglich vor der Nachweisreaktion ist ein Wasch-Schritt zur Abtrennung der ungebundenen Rezeptoren und Probenbestandteile von Vorteil, aber nicht unbedingt notwendig. Die Rezeptoren R1, R3 und R5, die mit der Festphase bindefähig sind, können in flüssiger Phase oder bereits an die Festphase gebunden vorliegen. Bevorzugt werden alle Rezeptoren R1 bis R6 zusammen inkubiert. Dabei kann die Festphase, an die R1, R3 und R5 binden können, bereits anwesend sein oder erst später zugegeben werden oder per Diffusion oder Transfer erst später erreicht werden.In the method according to the invention, preferably as a heterogeneous immunoassay the antigens are detected by the receptors R1 and R2 according to the sandwich principle. The antigen to be detected (here: p24 or p26) is from R1 and R2 bound in the form of a sandwich from two sides. Binding the Antibodies through the receptors R3, R4, R5 and R6 are based on the principle of Bridge tests. The antibody to be detected bridges the receptors R3 and R4 together. The same applies to the receptors R5 and R6. Both test runs, the Sandwich and bridge tests can be carried out simultaneously in the same approach without that the two principles interfere with each other. It is therefore also possible for everyone Incubate receptors with the sample and complete the procedure in a few steps perform. Only before the detection reaction is there a washing step for the separation of the unbound receptors and sample components is an advantage, but not necessarily necessary. The receptors R1, R3 and R5, which are capable of binding to the solid phase, can are present in the liquid phase or already bound to the solid phase. All are preferred Receptors R1 to R6 incubated together. The solid phase can be connected to R1, R3 and R5 can bind, already present or be added later or by Diffusion or transfer can only be achieved later.

Bei der Inkubation bildet sich der Sandwich zwischen Festphase.R1.p24(p26).R2, die Brücke zwischen Festphase.R3.HIV-Anti-env-Antikörper.R4 und die Brücke zwischen Festphase.R5.HIV-Anti-gag/polAntikörper.R6 aus. Anschließend wird im Falle des heterogenen Immunoassays die feste von der flüssigen Phase getrennt, gegebenenfalls die feste Phase gewaschen und die Markierung von R2, R4 und R6 bestimmt. Die Markierung wird zumeist an der festen Phase gemessen, sie kann jedoch auch in der flüssigen Phase bestimmt werden.During the incubation, the sandwich forms between the solid phase.R1.p24 (p26) .R2, the Bridge between solid phase.R3.HIV-Anti-env-Antibody.R4 and the bridge between Solid phase.R5.HIV-Anti-gag / polAntibör.R6 aus. Then in the case of heterogeneous immunoassays separate the solid from the liquid phase, possibly the solid phase washed and the labeling of R2, R4 and R6 determined. The mark is mostly measured on the solid phase, but it can also be measured in the liquid phase be determined.

Liegen einer oder mehrere der Rezeptoren R1, R3 und R5 bereits in festphasengebundener Form vor, so werden die Probe und die entsprechenden Rezeptoren, d. h. R2, R4 und R6 zu den festphasengebundenen Rezeptoren R1, R3 und R5 dazugegeben und zusammen inkubiert. Es ist aber auch möglich, die Probe zuerst mit den Rezeptoren R1, R3 und R5 in An- oder Abwesenheit der Festphase zusammenzubringen und erst in einem nachfolgenden Schritt die Rezeptoren R2, R4 und R6 zuzugeben.Are one or more of the receptors R1, R3 and R5 already in the solid phase Form, the sample and the corresponding receptors, i.e. H. R2, R4 and R6 too added to the solid phase bound receptors R1, R3 and R5 and together incubated. However, it is also possible to test the sample first with the receptors R1, R3 and R5 To bring the presence or absence of the solid phase together and only in a subsequent one Step add the receptors R2, R4 and R6.

Ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV mittels eines Immunoassays, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Rezeptoren R3, R4, R5 und R6 eingesetzt werden. Die Rezeptoren R1 und R2 kommen bei diesem reinen Antikörpernachweis nicht zum Einsatz. Als Rezeptoren R3 und R4 werden wie im zuvor beschriebenen Kombitest ein oder mehrere Antigene aus dem env-Bereich von HIV1, HIV2 oder HIV1-SubO verwendet (gp160, gp120, gp41 für HIV1/HIV1-SubO und gp140, gp110, gp36 für HIV2). Bevorzugt werden als Rezeptoren R3 und R4 gp41 und/oder gp36 oder Fragmente davon verwendet. Als Rezeptoren R5 und R6 werden wie im zuvor beschriebenen Kombitest ein oder mehrere Antigene aus dem pol- oder gag- Bereich von HIV1, HIV2, oder HIV1-SubO verwendet. Bevorzugt werden als R5 und R6 Antigene aus dem pol-Bereich von HIV1, HIV2, oder HIV1-SubO eingesetzt. Besonders bevorzugt wird als Rezeptor R5 und R6 die Reverse Transkriptase (RT) verwendet.The invention also relates to a method for the detection of antibodies against HIV by means of an immunoassay, which is characterized in that the Receptors R3, R4, R5 and R6 are used. The receptors R1 and R2 are included this pure antibody detection is not used. As receptors R3 and R4 as in the combination test described above, one or more antigens from the env range used by HIV1, HIV2 or HIV1-SubO (gp160, gp120, gp41 for HIV1 / HIV1-SubO and gp140, gp110, gp36 for HIV2). Preferred receptors R3 and R4 are gp41 and / or gp36 or fragments thereof. As receptors R5 and R6 are like in the combination test described above, one or more antigens from the polar or gag Range of HIV1, HIV2, or HIV1-SubO used. Preferred as R5 and R6 Antigens from the pol range of HIV1, HIV2, or HIV1-SubO are used. Especially reverse transcriptase (RT) is preferably used as receptor R5 and R6.

Die Durchführung des Antikörpernachweises, die Testformate sowie die Eigenschaften der verwendeten Rezeptoren sind analog zum Kombitest, so daß sie hier nicht gesondert aufgeführt werden. Die im folgenden gemachten Ausführungen zu den Rezeptoren R1 und R2 gelten für den weiter oben beschriebenen kombinierten Nachweis (Kombitest) von HIV-Antikörpern und HIV-Antigenen. Die Ausführungen für die Rezeptoren R3, R4, R5 und R6 gelten sowohl für den Kombitest als auch für das Verfahren zum Nachweis von HIV-Antikörpern.The implementation of the antibody detection, the test formats and the properties of the Receptors used are analogous to the combi test, so that they are not separate here be listed. The explanations given below for receptors R1 and R2 apply to the combined proof (combination test) of HIV antibodies and HIV antigens. The versions for the receptors R3, R4, R5 and R6 apply to both the combined test and the procedure for the detection of HIV antibodies.

Wesentlicher Bestandteil von Rezeptor R1 ist ein Antikörper, der spezifisch das p24- Antigen von HIV1 und gegebenenfalls von HIV1-SubO oder das p26-Antigen von HIV2 bindet. Es können Antikörper aller Subklassen, die mit dem p24 oder dem p26 spezifisch bindefähig sind, verwendet werden. Statt der vollständigen Antikörper können selbstverständlich auch deren Fragmente, wie Fab-, Fab'- oder F(ab')₂-Fragmente, verwendet werden. Die Antikörper können polyklonal sein, sofern sie keine Kreuzreaktivität zu übrigen Testbestandteilen zeigen. Da an die Spezifität der Anti-p24- bzw. Anti-p26-Antikörper bezüglich der HIV-Subtypenerkennung hohe Anforderungen zu stellen sind, werden jedoch bevorzugt monoklonale Antikörper eingesetzt. Gegenstand der Erfindung sind daher auch monoklonale Antikörper gegen das p24-Antigen. Die Eigenschaften dieser Antikörper werden in einem späteren Abschnitt näher erläutert.An essential component of receptor R1 is an antibody that specifically binds the p24 antigen of HIV1 and possibly HIV1-SubO or the p26 antigen of HIV2. Antibodies from all subclasses that are specifically bindable with the p24 or the p26 can be used. Instead of the complete antibodies, it is of course also possible to use their fragments, such as Fab, Fab 'or F (ab') ₂ fragments. The antibodies can be polyclonal, provided that they do not show any cross-reactivity with other test components. Since high demands are made on the specificity of the anti-p24 or anti-p26 antibodies with regard to HIV subtype recognition, however, monoclonal antibodies are preferably used. The invention therefore also relates to monoclonal antibodies against the p24 antigen. The properties of these antibodies are explained in more detail in a later section.

R1 kann entweder direkt an die Festphase gebunden sein, oder die Bindung an die Festphase erfolgt indirekt über ein spezifisches Bindungssystem. Die direkte Bindung von R1 an die Festphase erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Wird die Bindung indirekt über ein spezifisches Bindungssystem durchgeführt, so ist R1 ein Konjugat, das aus einem Antikörper gegen p24 bzw. gegen p26 und einem Reaktionspartner eines spezifischen Bindungssystems besteht. Unter einem spezifischen Bindungssystem werden hier zwei Partner verstanden, die spezifisch miteinander reagieren können. Das Bindungsvermögen kann dabei auf einer immunologischen Reaktion oder auf einer anderen spezifischen Reaktion beruhen. Bevorzugt wird als spezifisches Bindungssystem eine Kombination von Biotin und Avidin oder Biotin und Streptavidin verwendet. Weitere bevorzugte Kombinationen sind Biotin und Antibiotin, Hapten und Anti-Hapten, Fc- Fragment eines Antikörpers und Antikörper gegen dieses Fc-Fragment oder Kohlenhydrat und Lectin. Einer der Reaktionspartner dieses spezifisch bindefähigen Paares ist dann Teil des Konjugates, das den Rezeptor R1 bildet.R1 can either be bound directly to the solid phase, or binding to the Solid phase takes place indirectly via a specific binding system. The direct binding of R1 on the solid phase is carried out according to methods known to the person skilled in the art. Will the bond carried out indirectly via a specific binding system, R1 is a conjugate which from an antibody against p24 or against p26 and a reaction partner of one specific binding system. Be under a specific attachment system here understood two partners who can react specifically with each other. The Attachment can be based on an immunological reaction or on a other specific response. Preferred is a specific binding system a combination of biotin and avidin or biotin and streptavidin used. Further preferred combinations are biotin and antibiotin, hapten and anti-hapten, Fc- Fragment of an antibody and antibody against this Fc fragment or carbohydrate and lectin. One of the reaction partners of this specifically bindable pair is then part of the conjugate that forms the receptor R1.

Der andere Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystems für R1 liegt als Beschichtung der festen Phase vor. Die Bindung des anderen Reaktionspartners des spezifischen Bindungssystems an ein unlösliches Trägermaterial kann nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen werden. Hierbei ist sowohl eine kovalente als auch eine adsorptive Bindung geeignet. Als feste Phase geeignet sind Reagenzgläschen oder Mikrotiterplatten aus Polystyrol oder ähnlichen Kunststoffen, die an der Innenoberfläche mit einem Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystems beschichtet sind. Weiterhin geeignet und besonders bevorzugt sind teilchenförmige Substanzen, wie beispielsweise Latexpartikel, magnetische Partikel, Molekularsiebmaterialien, Glaskörperchen, Kunststoffschläuche und dergleichen. Auch poröse, schichtförmige Träger wie Papier können als Träger verwendet werden. Besonders bevorzugt werden magnetische Kügelchen (sogenannte Beads) verwendet, die wiederum mit dem entsprechenden Bindepartner des oben beschriebenen spezifischen Bindesystems beschichtet sind. Diese Mikropartikel können dann nach Ablauf der Testreaktion für die Durchführung der Nachweisreaktion beispielsweise durch Filtration, Zentrifugation oder im Falle der magnetischen Partikel durch einen Magneten von der flüssigen Phase getrennt werden.The other reactant of the specific binding system for R1 lies as Solid phase coating before. Binding of the other reactant of the specific binding system to an insoluble carrier material can be methods known to the person skilled in the art are carried out. Here is both covalent as well as an adsorptive bond. Are suitable as a solid phase Test tubes or microtiter plates made of polystyrene or similar plastics attached to the inner surface with a reaction partner of the specific binding system are coated. Also particularly suitable and particularly preferred are particulate Substances such as latex particles, magnetic particles, Molecular sieve materials, vitreous bodies, plastic tubes and the like. Also Porous, layered supports such as paper can be used as supports. Especially magnetic beads (so-called beads) are preferably used, which in turn with the corresponding binding partner of the specific binding system described above are coated. These microparticles can then be used for the test reaction Carrying out the detection reaction, for example by filtration, centrifugation or in the case of magnetic particles separated from the liquid phase by a magnet will.

Der Rezeptor R2 besteht aus einem Antikörper, der spezifisch das p24-Antigen von HIV1 und gegebenenfalls von HIV1-SubO oder das p26-Antigen von HIV2 bindet, und einer Markierung. Es können - wie beim Rezeptor R1 - Antikörper aller Subklassen, die mit dem p24 oder dem p26 spezifisch bindefähig sind, verwendet werden. Statt der vollständigen Antikörper können auch hier deren Fragmente, wie Fab-, Fab'- oder F(ab')₂-Fragmente, verwendet werden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Bevorzugt werden wie bei R1 monoklonale Antikörper eingesetzt. Besonders bevorzugt werden auch bei R2 die in einem späteren Abschnitt beschriebenen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen das p24-Antigen verwendet. Entscheidend ist, daß die in R1 und R2 eingesetzten Antikörper mindestens 2 verschiedene Epitope des p24- bzw. des p26- Antigens erkennen. Beide Rezeptoren R1 und R2 müssen gleichzeitig spezifisch an p24 oder p26 binden können, um den Sandwich auszubilden. Die von den Antikörper- Bestandteilen in R1 und R2 erkannten Epitope müssen sich also räumlich voneinander getrennt befinden. Das heißt, daß die von R1 und R2 erkannten Epitope zwar überlappen dürfen, jedoch muß gewährleistet sein, daß beide Rezeptoren gleichzeitig an das p24 bzw. p26-Epitop binden können. Bedingung ist immer, daß sich die beiden Rezeptoren in ihrem Bindungsverhalten an p24 bzw. p26 gegenseitig nicht wesentlich behindern.The receptor R2 consists of an antibody which specifically binds the p24 antigen of HIV1 and optionally of HIV1-SubO or the p26 antigen of HIV2, and a label. As with the R1 receptor, antibodies from all subclasses that are specifically bindable to the p24 or p26 can be used. Instead of the complete antibodies, fragments such as Fab, Fab 'or F (ab') ₂ fragments can also be used here. The antibodies can be polyclonal or monoclonal. As with R1, monoclonal antibodies are preferably used. The monoclonal antibodies against the p24 antigen according to the invention described in a later section are also particularly preferably used in R2. It is crucial that the antibodies used in R1 and R2 recognize at least 2 different epitopes of the p24 and p26 antigens. Both receptors R1 and R2 must be able to specifically bind to p24 or p26 at the same time in order to form the sandwich. The epitopes recognized by the antibody components in R1 and R2 must therefore be spatially separated from one another. This means that the epitopes recognized by R1 and R2 may overlap, but it must be ensured that both receptors can bind to the p24 or p26 epitope simultaneously. The condition is always that the two receptors do not significantly interfere with each other in their binding behavior to p24 or p26.

Beim Einsatz von Rezeptorgemischen für R1 und R2 ist es auch möglich, die gleichen Rezeptoren sowohl für R1 als auch für R2 zu verwenden. Eine bestimmte Anzahl an R1- Rezeptoren wäre dann mit der Festphase bindefähig, die verbleibenden R1-Rezeptoren wären nicht mit der Festphase bindefähig und würden statt dessen die Markierung tragen. Das gleiche gilt dann für R2. Der Sandwich kann sich dann sowohl in der Orientierung Festphase.R1.p24.R2 als auch in der Orientierung Festphase.R1(R2-Epitop).p24.R2(R1- Epitop) ausbilden.When using receptor mixtures for R1 and R2 it is also possible to use the same To use receptors for both R1 and R2. A certain number of R1 Receptors would then be able to bind to the solid phase, the remaining R1 receptors would not be able to bind to the solid phase and would instead carry the label. The same applies to R2. The sandwich can then change both in orientation Solid phase.R1.p24.R2 as well as in the orientation solid phase.R1 (R2 epitope) .p24.R2 (R1- Epitope).

Ein weiterer Bestandteil des Rezeptors R2 ist die Markierung. Bevorzugt wird als Markierung eine direkt nachweisbare Substanz, beispielsweise eine chemilumineszierende, elektrochemilumineszierende, fluoreszierende oder radioaktive Substanz oder ein Metallsol-, Latex- oder Goldpartikel eingesetzt. Weiterhin bevorzugt als Markierung sind Enzyme oder andere Moleküle wie Haptene (z. B. Digoxigenin) oder Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise Fluorescein. Eine besonders bevorzugte Markierung sind elektrochemilumineszierende Metallchelate wie sie in der WO 96/03651 beschrieben sind. Als Metallchelate werden bevorzugt Rutheniumkomplexe eingesetzt, die ebenfalls in der WO 96/03651 offenbart sind. Die Verfahren zur Markierung sind dem Fachmann geläufig und bedürfen hier keiner weiteren Erklärung. Der Nachweis der Markierung erfolgt in an sich bekannter Weise direkt durch Messung der chemilumineszierenden, fluoreszierenden oder radioaktiven Substanz oder des Metallsol-, Latex- oder Goldpartikels oder durch Messung des durch das Enzym umgesetzten Substrats.Another component of the R2 receptor is labeling. Is preferred as Labeling a directly detectable substance, for example a chemiluminescent, electrochemiluminescent, fluorescent or radioactive substance or a Metal sol, latex or gold particles used. Are also preferred as a marker Enzymes or other molecules such as haptens (e.g. digoxigenin) or fluorescent dyes, for example fluorescein. A particularly preferred marking are electrochemiluminescent metal chelates as described in WO 96/03651. Ruthenium complexes are preferably used as metal chelates, which also in the WO 96/03651 are disclosed. The marking methods are familiar to the person skilled in the art and need no further explanation here. The marking is verified in on known way directly by measuring the chemiluminescent, fluorescent or radioactive substance or the metal sol, latex or gold particle or by Measurement of the substrate converted by the enzyme.

Der Nachweis der Markierung kann auch auf indirekte Weise erfolgen. Dabei bindet ein weiterer Rezeptor, der selbst wiederum mit einer signalerzeugenden Gruppe gekoppelt ist, spezifisch an die Markierung von R2, beispielsweise ein Hapten wie Digoxigenin. Die Herstellung von haptenmarkierten und insbesondere digoxigenimnarkierten Rezeptoren wird in der WO 96/03423 beschrieben.The marking can also be verified indirectly. Involve another receptor, which in turn is coupled to a signal-generating group, specifically to the labeling of R2, for example a hapten such as digoxigenin. The Production of hapten-labeled and in particular digoxigenim-labeled receptors is described in WO 96/03423.

Der Nachweis der signalerzeugenden Gruppe, beispielsweise eine elektrochemilumines zierende, fluoreszierende oder radioaktive Substanz oder ein Enzym oder Goldpartikel, erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Methoden. Als weiterer Rezeptor kann beispielsweise ein Antikörper oder ein Antikörperfragment eingesetzt werden, der spezifisch an die Markierung von R2 bindet. Wird dieser indirekte Nachweis der Markierung verwendet, so ist die Markierung von R2 bevorzugt Digoxigenin oder ein anderes Hapten, und der Nachweis erfolgt über einen Antikörper, der gegen Digoxigenin oder gegen das Hapten gerichtet ist und mit Peroxidase oder einer anderen Markierung wie oben beschrieben markiert ist.Detection of the signal generating group, for example an electrochemilumines ornamental, fluorescent or radioactive substance or an enzyme or gold particles, is carried out according to methods familiar to the person skilled in the art. Another receptor can for example, an antibody or an antibody fragment can be used, the binds specifically to the label of R2. If this indirect proof of Label used, the labeling of R2 is preferably digoxigenin or a other hapten, and detection is via an antibody against digoxigenin or is directed against the hapten and with peroxidase or another label such as is marked as described above.

Bevorzugt werden als Bestandteile der Rezeptoren R1 und R2 monoklonale Antikörper oder deren Fragmente eingesetzt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch monoklonale Antikörper, die das p24-Antigen von HIV1 spezifisch mit ausreichend hoher Affinität zur Ausbildung eines Sandwichs binden. Die monoklonalen Antikörper können dadurch in allen dem Fachmann geläufigen Tests zum Nachweis eines Proteins wie beispielsweise im Sandwich-Test verwendet werden.Monoclonal antibodies are preferred as constituents of the receptors R1 and R2 or their fragments used. The present invention therefore also relates to monoclonal antibodies that are specific for the p24 antigen of HIV1 with a sufficiently high level Tie affinity for forming a sandwich. The monoclonal antibodies can thereby in all tests for the detection of a protein known to the person skilled in the art such as can be used for example in the sandwich test.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können allen möglichen Immunglobulinklassen (Ig) angehören. Bevorzugt gehören die monoklonalen Antikörper der IgGl-Klasse an. Die Kopplung von weiteren Komponenten wie beispielsweise Markierungen wie Enzyme oder Haptene oder Bindepartner, die zur Bindung des Antikörpers an eine Festphase bei heterogenen Immunoassays benötigt werden, kann bevorzugt an IgGl-Antikörper erfolgen. Auch die Herstellung von Antikörper-Fragmenten wie beispielsweise F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fragmenten ist bei der IgGl-Klasse unproblematisch.The monoclonal antibodies according to the invention can belong to all possible immunoglobulin classes (Ig). The monoclonal antibodies preferably belong to the IgGl class. The coupling of further components such as, for example, labels such as enzymes or haptens or binding partners, which are required to bind the antibody to a solid phase in heterogeneous immunoassays, can preferably be carried out on IgGl antibodies. The production of antibody fragments such as F (ab ') ₂ , Fab' or Fab fragments is also unproblematic with the IgGl class.

Erfindungsgemäß werden unter der Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" sowohl der vollständige Antikörper als auch alle bei Immuntests und sonstigen Verwendungen gängigen Fragmente davon, wie F(ab')₂-, Fab'- oder Fab-Fragmente, verstanden. Umfaßt sind auch solche Antikörper, die durch Veränderung der monoklonalen Antikörper hergestellt wurden, solange die Antigenbindeeigenschaft nicht entscheidend beeinflußt wurde. Beispielsweise können durch gentechnologische Maßnahmen Teile der normalerweise in Mäusen hergestellten monoklonalen Antikörper durch entsprechende humane Antikörpersequenzen ersetzt werden, um unspezifische Bindungen im Immunoassay zu minimieren. Verfahren zur Herstellung solcher chimärer monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann beispielsweise aus Antibody Engineering, J. Mc Cafferty, H.R. Hoogenboom und D.J. Chiswell, The Practical Approach Series, Series Editor: B.D. Hames, Oxford University Press, 1996, bekannt. According to the invention, the term "monoclonal antibody" means both the complete antibody and all fragments thereof common in immunoassays and other uses, such as F (ab ') ₂ , Fab' or Fab fragments. Also included are those antibodies which have been produced by changing the monoclonal antibodies as long as the antigen binding property has not been decisively influenced. For example, genetic engineering measures can be used to replace parts of the monoclonal antibodies normally produced in mice by corresponding human antibody sequences in order to minimize non-specific binding in the immunoassay. Methods for producing such chimeric monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art, for example from Antibody Engineering, J. Mc Cafferty, HR Hoogenboom and DJ Chiswell, The Practical Approach Series, Series Editor: BD Hames, Oxford University Press, 1996.

Entscheidend für die Eignung der Antikörper sind die Epitope des p24, die von den Antikörpern erkannt werden, da diese für die Erkennung aller Subtypen entscheidend sind. Für die p24-Epitope wurde die Strukturinformation aus Gitti et al (Science 1996, Vol 273, S. 231-235) zugrundegelegt. Erfindungsgemäß sind demnach auch anders erzeugte Antikörper, die die gleichen Epitope wie die im folgenden beschriebenen Antikörper oder zu diesen überlappende Epitope erkennen. Die Epitope lassen sich beispielsweise durch die Pepscan-Methode charakterisieren. Im Beispiel 4 der vorliegenden Anmeldung ist die genaue Vorgehensweise bei der Epitop-Kartierung der erfindungsgemäßen Antikörper beschrieben. Bevorzugt wird der Epitopbereich des p24, an den die erfindungsgemäßen Antikörper binden, ausgewählt aus der Gruppe der folgenden Aminosäuresequenzen. Diese Sequenzen sind auch im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO 1-36 angegeben.
The p24 epitopes, which are recognized by the antibodies, are decisive for the suitability of the antibodies, since these are crucial for the detection of all subtypes. The structural information from Gitti et al (Science 1996, Vol 273, pp. 231-235) was used as the basis for the p24 epitopes. Accordingly, according to the invention there are also differently produced antibodies which recognize the same epitopes as the antibodies described below or epitopes overlapping them. The epitopes can be characterized, for example, by the Pepscan method. Example 4 of the present application describes the exact procedure for the epitope mapping of the antibodies according to the invention. The epitope region of p24 to which the antibodies according to the invention bind is preferably selected from the group of the following amino acid sequences. These sequences are also given in the sequence listing under SEQ ID NO 1-36.

Gegenstand der Erfindung sind monoklonale Antikörper gegen HIV1 p24-Antigen, die die p24-Epitope gemäß SEQ ID NO: 1-36 spezifisch binden.The invention relates to monoclonal antibodies against HIV1 p24 antigen, which Specifically bind p24 epitopes according to SEQ ID NO: 1-36.

Weiterhin sind Gegenstand der Erfindung monoklonale Antikörper gegen HIV1 p24- Antigen, die die p24-Epitope gemäß SEQ ID NO: 3, 9, 17, 31 oder 34 spezifisch binden. Diese Sequenzen sind in der obigen Aufstellung fett hervorgehoben.The invention furthermore relates to monoclonal antibodies against HIV1 p24- Antigens that specifically bind the p24 epitopes according to SEQ ID NO: 3, 9, 17, 31 or 34. These sequences are highlighted in bold in the table above.

Außerdem sind die Epitope des p24 gemäß SEQ ID NO: 3, 9, 17, 31 oder 34 Gegenstand der Erfindung. In addition, the epitopes of p24 according to SEQ ID NO: 3, 9, 17, 31 or 34 are the subject the invention.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können beispielsweise aus den Zellinien MAK<p24<M-6A9/5, MAK<p24<M-4B1/1, MAK<p24<M-6D9/4, MAK<p24<M-2E7/3 oder MAK<p24<M6A9/5 hergestellt werden. Die monoklonalen Antikörper MAK<p24<M-4B1/1 (Hinterlegungsnummer DSM ACC2299), MAK<p24<M-6D9/4 (Hinterlegungsnummer DSM ACC2300) und MAK<p24<M-2E7/3 (Hinterlegungsnummer DSM ACC2301), wurden am 26.02.1997 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) hinterlegt. Der monoklonale Antikörper MAK<p24<M6A9/5 wurde am 11.06.1997 bei der DSMZ unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2310 hinterlegt.The monoclonal antibodies according to the invention can, for example, from the cell lines MAK <p24 <M-6A9 / 5, MAK <p24 <M-4B1 / 1, MAK <p24 <M-6D9 / 4, MAK <p24 <M-2E7 / 3 or MAK <p24 <M6A9 / 5. The monoclonal antibodies MAK <p24 <M-4B1 / 1 (deposit number DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (Deposit number DSM ACC2300) and MAK <p24 <M-2E7 / 3 (deposit number DSM ACC2301), were on February 26, 1997 at the DSMZ (German Collection of Microorganisms and cell cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) deposited. The monoclonal antibody MAK <p24 <M6A9 / 5 was released on June 11, 1997 at the DSMZ deposited under the deposit number DSM ACC2310.

Mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Epitopkartierungsverfahren wurde festgestellt, daß die Antikörper, die von der Zellinie MAK<p24<M-6A9/5 produziert werden, kein sequentielles Epitop erkennen, sondern an ein Konformationsepitop des p24 binden.Using the epitope mapping procedure described in Example 4, it was found that the antibodies produced by the cell line MAK <p24 <M-6A9 / 5 do not recognize sequential epitope, but bind to a conformation epitope of p24.

Mit dem gleichen Verfahren wurde festgestellt, daß die Antikörper, die von der Zellinie MAK<p24<M-2E7/3 (DSM ACC2301) produziert werden, an das Epitop binden, das einem Peptid gemäß SEQ ID NO: 9 entspricht (p24-Strukturinformation gemäß Gitti et al 1996, Science 273, 231-235). Es konnte außerdem gezeigt werden, daß das eigentliche Epitop noch kleiner ist. Zur spezifischen Bindung des MAK<p24<M-2E7/3 an p24 ist ein nur 11 Aminosäuren umfassendes Epitop gemäß SEQ ID NO: 34 ausreichend.Using the same procedure, it was determined that the antibodies derived from the cell line MAK <p24 <M-2E7 / 3 (DSM ACC2301) are produced, bind to the epitope that corresponds to a peptide according to SEQ ID NO: 9 (p24 structure information according to Gitti et al 1996, Science 273, 231-235). It could also be shown that the real thing Epitope is even smaller. A is for the specific binding of the MAK <p24 <M-2E7 / 3 to p24 epitope of only 11 amino acids according to SEQ ID NO: 34 is sufficient.

Mit dem gleichen Verfahren wurde festgestellt, daß die Antikörper, die von der Zellinie MAK<p24<M-6D9/4 (DSM ACC2300) produziert werden, an das Epitop binden, das einem Peptid gemäß SEQ ID NO: 3 entspricht. Außerdem konnte gezeigt werden, daß das für die spezifische Bindung erforderliche Epitop noch kleiner ist: Zur spezifischen Bindung des MAK<p24<M-6D94 an p24 ist ein 15 Aminosäuren umfassendes Epitop gemäß SEQ ID NO: 31 ausreichend.Using the same procedure, it was determined that the antibodies derived from the cell line MAK <p24 <M-6D9 / 4 (DSM ACC2300) are produced, bind to the epitope that corresponds to a peptide according to SEQ ID NO: 3. It could also be shown that the epitope required for specific binding is even smaller: for specific binding the MAK <p24 <M-6D94 at p24 is a 15 amino acid epitope according to SEQ ID NO: 31 sufficient.

Mit dem gleichen Verfahren wurde festgestellt, daß die Antikörper, die von der Zellinie MAK<p24<M-4B1/1 (DSM ACC2299) produziert werden, an das Epitop binden, das einem Peptid gemäß SEQ ID NO: 17 entspricht. Using the same procedure, it was determined that the antibodies derived from the cell line MAK <p24 <M-4B1 / 1 (DSM ACC2299) are produced, bind to the epitope that corresponds to a peptide according to SEQ ID NO: 17.

Die von den Zellinien MAK<p24<M-4B1/1 und MAK<p24<M-6D9/4 produzierten Antikörper binden nicht nur die zuvor charakterisierten p24-Epitope von HIV1, sondern auch von HIV1-SubO. Für die gleichzeitige Erkennung des p24-Antigens von HIV1 und HIV1-SubtypO sind daher besonders die von diesen Zellinien produzierten Antikörper geeignet. In Beispiel 5 ist die Austestung der erfindungsgemäßen Antikörper in Bezug auf die p24-Subtypenerkennung dargestellt. Von den beiden Antikörpern wird MAK<p24<M- 4B1/1 bevorzugt auf der Festphasen-Seite, d. h. als Rezeptor R1 eingesetzt, und MAK<p24<M-6D9/4 wird bevorzugt als Kezeptor R2 verwendet.Those produced by the cell lines MAK <p24 <M-4B1 / 1 and MAK <p24 <M-6D9 / 4 Antibodies bind not only the previously characterized p24 epitopes of HIV1, but also also from HIV1-SubO. For the simultaneous detection of the p24 antigen of HIV1 and HIV1-SubtypO are therefore especially the antibodies produced by these cell lines suitable. In example 5 the testing of the antibodies according to the invention is related to the p24 subtype detection is shown. Of the two antibodies, MAK <p24 <M- 4B1 / 1 preferably on the solid phase side, i.e. H. used as receptor R1, and MAK <p24 <M-6D9 / 4 is preferably used as the R2 receptor.

Besonders bevorzugt werden für eine effektive gleichzeitige Erkennung von HIV1 und HIV1-SubO die Antikörper MAK<p24< 4B1/1 und MAK<p24<6A9 als R1 und MAK<p24<2E7/3 und MAK <p24<6D9/4 als R2 eingesetzt, da so die umfassendste Erkennung verschiedener HIV1 und HIV1-Subtyp O Virusisolate erreicht wird (siehe Beispiel 5).Are particularly preferred for an effective simultaneous detection of HIV1 and HIV1-SubO the antibodies MAK <p24 <4B1 / 1 and MAK <p24 <6A9 as R1 and MAK <p24 <2E7 / 3 and MAK <p24 <6D9 / 4 used as R2, because it is the most comprehensive Detection of various HIV1 and HIV1 subtype O virus isolates is achieved (see Example 5).

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper, die in äquivalenter Weise an p24 binden, wie die monoklonalen Antikörper MAK<p24<M- 6A9/5 (DSM ACC2310), MAK<p24<M-4B1/1 (DSM ACC2299), MAK<p24<M-6D9/4 (DSM ACC2300) oder MAK<p24<M-2E7/3 (DSM ACC2301). Unter "in äquivalenter Weise binden" wird verstanden, daß diese Antikörper mit gleich hoher oder vergleichbar hoher Affinität an p24 wie die hinterlegten monoklonalen Antikörper binden. Dies kann beispielsweise durch entsprechende Versuche am BIAcore® oder auch mit dem 2-Schritt- Sandwich-ELISA gemäß Beispiel 4 festgestellt werden.The invention furthermore relates to antibodies, preferably monoclonal antibodies, that bind to p24 in an equivalent manner to the monoclonal antibodies MAK <p24 <M- 6A9 / 5 (DSM ACC2310), MAK <p24 <M-4B1 / 1 (DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (DSM ACC2300) or MAK <p24 <M-2E7 / 3 (DSM ACC2301). Under "in equivalent Bind way "is understood to mean that these antibodies are of the same level or comparable bind high affinity to p24 like the deposited monoclonal antibodies. This can For example, through appropriate tests on the BIAcore® or with the 2-step Sandwich ELISA can be determined according to Example 4.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antikörper, bevorzugt monoklonale Antikörper, die an die gleichen Epitope an p24 binden, wie die hinterlegten Antikörper MAK<p24<M- 6A9/5 (DSM ACC23 10), MAK<p24<M-4B1/1 (DSM ACC2299), MAK<p24<M-6D9/4 (DSM ACC2300) oder MAK<p24<M-2E7/3 (DSM ACC2301). Dies kann durch Bestimmung der Kreuzreaktivität der Antikörper, beispielsweise durch Kompetitions experimente im ELISA oder mit dem BIAcore®-System festgestellt werden. Bevorzugt besitzen diese Antikörper ebenfalls eine hohe Affinität zu p24.The invention furthermore relates to antibodies, preferably monoclonal antibodies, that bind to the same epitopes on p24 as the deposited antibodies MAK <p24 <M- 6A9 / 5 (DSM ACC23 10), MAK <p24 <M-4B1 / 1 (DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (DSM ACC2300) or MAK <p24 <M-2E7 / 3 (DSM ACC2301). This can be done by Determination of the cross-reactivity of the antibodies, for example by competition experiments can be determined in ELISA or with the BIAcore® system. Prefers these antibodies also have a high affinity for p24.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung mindestens von einem der in den oberen Abschnitten beschriebenen Antikörpern in einem diagnostischen Test zum Nachweis einer HIV-Infektion. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der beschriebenen Antikörper in dem weiter oben erläuterten erfindungsgemäßen Kombitest zum Nachweis einer HIV-Infektion.Another object of the invention is the use of at least one of the in the antibodies described above in a diagnostic test for Evidence of HIV infection. The invention also relates to the use the antibodies described in the invention described above Combined test to detect HIV infection.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können in an sich bekannter Weise durch Immunisierung mit isoliertem p24 (aus humanem Gewebe isoliert oder rekombinant) in geeigneten Versuchstieren wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen und anschließender Fusion der Milzzellen der immunisierten Tiere mit Myelomzellen hergestellt werden. Neben Milzzellen als Lymphocyten-Quelle können auch periphere Blut-Lymphocyten (PBL) oder Lymphknoten-Zellen von immunisierten Tieren (bevorzugt: Maus oder Ratte) verwendet werden. Anstelle von isoliertem p24 können zur Immunisierung auch synthetische, von p24 abgeleitete Peptide, die alleine oder an Träger gekoppelt verwendet werden, zur Erzeugung der gewünschten Antikörper verwendet werden.The monoclonal antibodies according to the invention can be in a manner known per se by immunization with isolated p24 (isolated from human tissue or recombinant) in suitable experimental animals such as mice, rats, rabbits and subsequent fusion of the spleen cells of the immunized animals with myeloma cells getting produced. In addition to spleen cells as a source of lymphocytes, peripheral cells can also be used Blood lymphocytes (PBL) or lymph node cells from immunized animals (preferably: Mouse or rat) can be used. Instead of isolated p24 can be used for Immunization also synthetic, p24-derived peptides, alone or on carriers used in conjunction, used to generate the desired antibodies will.

Alternativ können auch Lymphocyten von humanen Spendern, die Antikörper gegen p24 entwickelt haben, immortalisiert werden. Solche Anti-p24-Antikörper produzierenden Lymphocyten können entweder durch Fusion mit einer humanen Myelom-Zellinie oder durch Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformation zu Antikörper-produzierenden Hybridom-Zellen immortalisiert werden (Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology, A.M. Campbell, Elsevier Verlag 1991; Monoklonale Antikörper, J.H. Peters, H. Baumgarten, Springer Verlag 1990; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, ed. Lawrence B. Schook, Marcel Dekker Verlag 1987).Alternatively, lymphocytes from human donors that have antibodies against p24 have developed, are immortalized. Such anti-p24 antibodies producing Lymphocytes can either be fused with a human myeloma cell line or by Epstein-Barr Virus (EBV) transformation to antibody-producing Hybridoma cells are immortalized (Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology, A.M. Campbell, Elsevier Verlag 1991; Monoclonal Antibodies, J.H. Peters, H. Baumgarten, Springer Verlag 1990; Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, ed. Lawrence B. Schook, Marcel Dekker Verlag 1987).

Wesentlicher Bestandteil von Rezeptor R3 ist ein Antigen, das mit den zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem HIV1- bzw. HIV1-SubO- und/oder HIV2-env-Bereich gerichteten Antikörpern spezifisch bindefahig ist. Das Antigen ist bevorzugt bindefahig mit Antikörpern, die gegen gp41 oder gp120 (HIV1) bzw. gp36 oder gp110 (HIV2) gerichtet sind, besonders bevorzugt bindefähig mit Antikörpern, die gegen gp41 bzw. gp36 gerichtet sind. Unter dem Begriff "Antigen" ist ein Molekül zu verstehen, das zu einer spezifischen Bindung mit einem gegen ein HIV-env-Genprodukt gerichteten Antikörper fähig ist. Das Antigen kann dabei dem natürlichem Antigen entsprechen. Es kann also aus dem Virus isoliert oder rekombinant hergestellt worden sein. Es können auch synthetische oder rekombinant hergestellte Peptide eingesetzt werden, die in der Lage sind, die zu bestimmenden Antikörper spezifisch zu binden. Das Antigen kann auch durch andere Liganden wie beispielsweise Lipide oder Zucker derivatisiert worden sein. Auch Aminosäureaustausche (D- und L-Aminosäuren oder verwandte Moleküle) oder Deletionen oder Insertionen von Aminosäuren sind möglich. Weitere, für die Testführung vorteilhafte Modifikationen des Antigens wie z. B. durch die in der WO 96/03652 beschriebene Herstellung von Polyhaptenen, können vom Fachmann leicht herausgefunden werden. Einzige Voraussetzung ist, daß die zu bestimmenden Antikörper trotz der Modifikationen immer noch spezifisch an das modifizierte Antigen binden können. Das heißt, die Bindungsstelle für den oder die Antikörper muß auf dem Antigen, das Bestandteil von R3 ist, erhalten bleiben.An essential component of receptor R3 is an antigen, which is linked to the against an antigen from the HIV1 or HIV1 SubO and / or HIV2 env range directed antibodies is specifically bindable. The antigen is preferably bindable to Antibodies directed against gp41 or gp120 (HIV1) or gp36 or gp110 (HIV2) are, particularly preferably bindable with antibodies directed against gp41 or gp36 are. The term "antigen" is to be understood as a molecule that leads to a specific Binding with an antibody directed against an HIV env gene product. The Antigen can correspond to the natural antigen. So it can be from the virus isolated or recombinantly produced. It can also be synthetic or recombinantly produced peptides are used, which are able to specific antibody to bind. The antigen can also be used by others Ligands such as lipids or sugars have been derivatized. Also Amino acid exchanges (D- and L-amino acids or related molecules) or Deletions or insertions of amino acids are possible. Further, for the test lead advantageous modifications of the antigen such. B. by the in WO 96/03652 described preparation of polyhaptens can easily be found out by the person skilled in the art will. The only requirement is that the antibodies to be determined despite the Modifications can still bind specifically to the modified antigen. The means that the binding site for the antibody (s) must be on the antigen that Part of R3 is retained.

R3 kann entweder direkt an die Festphase gebunden sein, oder die Bindung an die Festphase erfolgt indirekt über ein spezifisches Bindungssystem. Die direkte und die indirekte Bindung von R3 an die Festphase erfolgt analog zu der für den Rezeptor R1 beschriebenen Weise.R3 can either be bound directly to the solid phase or the bond to the Solid phase takes place indirectly via a specific binding system. The direct and the indirect binding of R3 to the solid phase takes place analogously to that for the receptor R1 described way.

Der Rezeptor R4 besteht aus einem Antigen, das mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem HIV1- bzw. HIV1-SubO- und/oder HIV2-env-Bereich gerichteten Antikörper spezifisch bindefähig ist und einer Markierung. Das Antigen ist bevorzugt bindefähig mit einem Antikörper, der gegen gp41 oder gp120 bzw. gp36 oder gp110 gerichtet ist, besonders bevorzugt bindefähig mit einem Antikörper, der gegen gp41 bzw. gp36 gerichtet ist. Die Bedingungen für das Antigen sowie die Definition des Begriffes sind identisch mit den für den Rezeptor R3 genannten Bedingungen. Bevorzugt werden als "Antigen-Komponenten" der Rezeptoren R3 und R4 die gleichen Antigene eingesetzt. Es ist aber auch möglich, verschiedene Antigene einzusetzen. Es muß jedoch sichergestellt sein, daß beide Antigen-Komponenten aus R3 und R4 mit dem gleichen zu bestimmenden Antikörper bindefähig sind. Voraussetzung ist immer, daß der zu bestimmende Antikörper die beiden Rezeptoren R3 und R4 verbrückt.The R4 receptor consists of an antigen that is compatible with the one to be determined Antigens directed from the HIV1 or HIV1 SubO and / or HIV2 env range Antibody is specifically bindable and a label. The antigen is preferred bindable with an antibody against gp41 or gp120 or gp36 or gp110 is particularly preferably capable of binding with an antibody which is directed against gp41 or gp36 is directed. The conditions for the antigen as well as the definition of the term are identical to the conditions mentioned for the receptor R3. Are preferred as "Antigen components" of the receptors R3 and R4 used the same antigens. It it is also possible to use different antigens. However, it must be ensured be that both antigen components from R3 and R4 to be determined with the same Antibodies are bindable. The prerequisite is always that the antibody to be determined the two receptors R3 and R4 are bridged.

Ein weiterer Bestandteil von Rezeptor R4 ist die Markierung. Die Voraussetzungen für die Markierung in R4 sind die gleichen wie die für die Markierung von Rezeptor R2 beschriebenen. Bevorzugt werden für R2 und R4 die gleichen Markierungen verwendet.Another component of receptor R4 is labeling. The requirements for Labeling in R4 is the same as that for labeling receptor R2 described. The same markings are preferably used for R2 and R4.

Der Rezeptor R5 besteht im wesentlichen aus einem Antigen, das mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem pol- oder -gag-Bereich von HIV1, HIV1-SubO und/oder HIV2 gerichteten Antikörper spezifisch bindefähig ist, wobei dies nicht Epitope oder Sequenzen von p24 oder p26 sein dürfen, die mit den Rezeptoren R1 oder R2 reagieren können. Das Antigen ist bevorzugt bindefähig mit einem Antikörper, der gegen Genprodukte des pol-Bereiches gerichtet ist, besonders bevorzugt bindefähig mit einem Antikörper, der gegen die Reverse Transkriptase (RT) gerichtet ist. Besonders geeignet ist hierbei die natürlicherweise vorkommende RT, die als Heterodimer (bestehend aus den beiden Untereinheiten von 51 und 66 kDa) vorkommt und eine möglichst native Struktur besitzt. Die Untereinheiten können aber auch einzeln verwendet werden. Besonders bevorzugt wird eine rekombinant hergestellte aufgereinigte RT verwendet, die von einem Expressionsklon wie er beispielsweise bei Müller et al. in J. Biol. Chem. 264/24: 13975-13978 (1989) beschrieben ist, exprimiert wird. Aufgrund des hohen Homologiegrades auf Aminosäureebene zwischen HIV1- und HIV2-RT von etwa 60% bzw. abschnittweise sogar 100%-iger Übereinstimmung der beiden Proteine reicht die HIVl-RT im allgemeinen aus, um auch von HIV2-Antikörpern erkannt zu werden. Gegebenenfalls kann jedoch auch HIV2-RT allein oder zusätzlich eingesetzt werden. Statt der RT kann auch ein Antigen verwendet werden, das mit einem Antikörper bindefähig ist, der gegen Genprodukte des gag-Bereiches mit Ausnahme der Epitope von p24 oder p26, die mit den Rezeptoren R1 oder R2 reagieren, gerichtet ist. Bevorzugt ist das Antigen bindefähig mit einem Antikörper, der gegen gag-p17 gerichtet ist. Zur Definition des Begriffes "Antigen" gilt das gleiche wie für die Rezeptoren R3 und R4 beschriebene mit Ausnahme der Spezifität: Das Antigen beim Rezeptor R5 ist natürlich ein Molekül, das zu einer spezifischen Bindung mit einem gegen ein HIV-gag- oder pol-Genprodukt gerichteten Antikörper fähig ist.The receptor R5 consists essentially of an antigen that is associated with the determining, against an antigen from the pol or gag range of HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2-directed antibodies is specifically bindable, but this is not epitopes or may be sequences of p24 or p26 which are linked to the receptors R1 or R2 can react. The antigen is preferably bindable with an antibody against Gene products of the pol range is directed, particularly preferably bindable with a Antibody directed against reverse transcriptase (RT). Is particularly suitable here the naturally occurring RT, which as a heterodimer (consisting of the two subunits of 51 and 66 kDa) occurs and a structure that is as native as possible owns. The subunits can also be used individually. Especially a recombinantly produced purified RT is preferably used, which is from a Expression clone as described, for example, by Müller et al. in J. Biol. Chem. 264/24: 13975-13978 (1989) is expressed. Due to the high degree of homology Amino acid level between HIV1 and HIV2-RT of about 60% or even in sections 100% agreement between the two proteins is generally sufficient for HIVl-RT, to be recognized by HIV2 antibodies. However, if necessary HIV2-RT can be used alone or in addition. An antigen can also be used instead of the RT can be used, which is bindable with an antibody which is against gene products of gag region with the exception of the epitopes of p24 or p26, which are associated with the receptors R1 or R2 respond. The antigen is preferably capable of binding to a Antibody directed against gag-p17. This applies to the definition of the term "antigen" same as described for the receptors R3 and R4 with the exception of the specificity: Das Antigen at the R5 receptor is of course a molecule that binds specifically to an antibody directed against an HIV gag or pol gene product.

R5 kann entweder direkt an die Festphase gebunden sein, oder die Bindung an die Festphase erfolgt indirekt über ein spezifisches Bindungssystem. Die direkte und die indirekte Bindung von R5 an die Festphase erfolgt analog zu der für die Rezeptoren R1 und R3 beschriebenen Weise.R5 can either be bound directly to the solid phase or the bond to the Solid phase takes place indirectly via a specific binding system. The direct and the indirect binding of R5 to the solid phase takes place analogously to that for the receptors R1 and R3 described manner.

Der Rezeptor R6 besteht im wesentlichen aus einem Antigen, das mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem pol- oder -gag-Bereich von HIV1, HIV1-SubO und/oder HIV2 gerichteten Antikörper spezifisch bindefähig ist. Das Antigen ist bevorzugt bindefähig mit einem Antikörper, der gegen Genprodukte des pol-Bereiches gerichtet ist, besonders bevorzugt bindefähig mit einem Antikörper, der gegen die Reverse Transkriptase gerichtet ist. Die im Abschnitt zu Rezeptor R5 gemachten Ausführungen bezüglich der bevorzugten Antigen-Eigenschaften gelten auch für R6. Zur Definition des Begriffes "Antigen" gilt das gleiche wie für den Rezeptor R5. Bevorzugt werden als "Antigen-Komponenten" der Rezeptoren R5 und R6 die gleichen Antigene eingesetzt. Es ist aber auch möglich, verschiedene Antigene einzusetzen. Es muß jedoch sichergestellt sein, daß beide Antigen-Komponenten aus R5 und R6 mit dem gleichen zu bestimmenden Antikörper bindefähig sind. Voraussetzung ist immer, daß der zu bestimmende Antikörper die beiden Rezeptoren R5 und R6 verbrückt.The receptor R6 consists essentially of an antigen that is associated with the determining, against an antigen from the pol or gag range of HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2-directed antibody is specifically bindable. The antigen is preferred bindable with an antibody that is directed against gene products of the pol region, particularly preferably bindable with an antibody against the reverse Transcriptase is directed. The statements made in the section on receptor R5 with regard to the preferred antigen properties also apply to R6. To define the The term "antigen" is the same as for the R5 receptor. Are preferred as "Antigen components" of the receptors R5 and R6 used the same antigens. It it is also possible to use different antigens. However, it must be ensured be that both antigen components from R5 and R6 to be determined with the same Antibodies are bindable. The prerequisite is always that the antibody to be determined the two receptors R5 and R6 are bridged.

Ein weiterer Bestandteil von Rezeptor R6 ist die Markierung. Die Voraussetzungen für die Markierung in R6 sind die gleichen wie die für die Markierung der Rezeptoren R2 und R4 beschriebenen. Bevorzugt werden für R2, R4 und R6 die gleichen Markierungen verwendet.Another component of receptor R6 is labeling. The requirements for Labeling in R6 is the same as that for labeling receptors R2 and R4 described. The same markings are preferred for R2, R4 and R6 used.

Für alle Antigene, die als Rezeptoren R3, R4, R5 oder R6 verwendet werden, gilt, daß sie einzeln oder bevorzugt auch vernetzt als Oligomere oder als Polyhaptene (mit den Antigenen beladene Trägermoleküle oder Trägerpartikel) gemäß der WO 96/03652 eingesetzt werden können. Dadurch wird die IgM-Erkennung verbessert.For all antigens which are used as receptors R3, R4, R5 or R6, it applies that they individually or preferably also crosslinked as oligomers or as polyhaptens (with the Carrier molecules or carrier particles loaded with antigens) according to WO 96/03652 can be used. This improves IgM detection.

Als Proben, die im Nachweisverfahren eingesetzt werden, können alle dem Fachmann bekannten biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Bevorzugt werden als Probe Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Speichel etc. eingesetzt.Samples that are used in the detection method can all be used by the person skilled in the art known biological fluids can be used. Are preferred as a sample Body fluids such as whole blood, blood serum, blood plasma, urine, saliva etc. are used.

In den Testansätzen können neben der Probe, der Festphase und den aufgeführten Rezeptoren weitere, je nach Anwendung benötigte Zusätze wie Puffer, Salze, Detergenzien, Proteinzusätze wie beispielsweise RSA und Proteinspaltprodukte wie beispielsweise Pepton vorhanden sein. Die notwendigen Zusätze sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm auf einfache Weise herausgefunden werden.In addition to the sample, the solid phase and the listed Receptors further additives, depending on the application, such as buffers, salts, Detergents, protein additives such as RSA and protein breakdown products such as for example peptone may be present. The necessary additives are the specialist known or can be found out easily by him.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zum Nachweis einer HIV- Infektion, enthaltend mindestens einen Rezeptor R1, der mit dem p24-Antigen von HIV1, HIV1-SubO und/oder dem p26-Antigen von HIV2 spezifisch bindefähig ist und an eine Festphase gebunden ist oder gebunden werden kann, mindestens einen Rezeptor R2, der mit dem p24-Antigen von HIV1, HIV1-SubO und/oder dem p26-Antigen von HIV2 spezifisch bindefähig ist und eine Markierung trägt, wobei die von R1 und R2 erkannten Epitope verschieden sind, mindestens einen Rezeptor R3, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem env-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO und/oder HIV2- Antikörper spezifisch bindefähig ist und an eine Festphase gebunden ist oder gebunden werden kann, mindestens einen Rezeptor R4, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem env-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO und/oder HIV2-Antikörper spezifisch bindefähig ist und eine Markierung trägt, mindestens einen Rezeptor R5, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem pol- oder gag-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO und/oder HIV2-Antikörper spezifisch bindefähig ist und an eine Festphase gebunden ist oder gebunden werden kann, mindestens einen Rezeptor R6, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem pol- oder gag-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO oder HIV2-Antikörper spezifisch bindefähig ist und eine Markierung trägt, sowie gegebenenfalls weitere übliche Hilfsstoffe. Another object of the invention is a reagent kit for the detection of HIV Infection containing at least one receptor R1 which is associated with the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 is specifically bindable to and Solid phase is bound or can be bound, at least one receptor R2 with the p24 antigen from HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen from HIV2 is specifically bindable and bears a label, the ones recognized by R1 and R2 Epitopes are different, at least one receptor R3, which is associated with the against an antigen from the env range HIV1-, HIV1-SubO and / or HIV2- Antibody is specifically bindable and bound or bound to a solid phase can be at least one receptor R4, which with the one to be determined against a Antigen from the env range directed HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibodies is specifically bindable and bears a label, at least one receptor R5, which with the one to be determined, directed against an antigen from the pole or gag range HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibodies are specifically bindable to and Solid phase is bound or can be bound, at least one receptor R6 with the one to be determined, directed against an antigen from the pole or gag range HIV1, HIV1-SubO or HIV2 antibody is specifically bindable and a label carries, as well as, if necessary, other customary auxiliaries.

Weiterhin ist ein Gegenstand der Erfindung ein zuvor beschriebenes Reagenzienkit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Rezeptoren R1 und R2 Antikörper, die von den Zellinien MAK<p24<M-6A9/5, MAK<p24<M-4B 1/1, MAK<p24<M-6D9/4, und/oder MAK<p24<M-2E7/3 produziert werden, eingesetzt werden.Furthermore, an object of the invention is a previously described reagent kit that characterized in that the receptors R1 and R2 are antibodies derived from the Cell lines MAK <p24 <M-6A9 / 5, MAK <p24 <M-4B 1/1, MAK <p24 <M-6D9 / 4, and / or MAK <p24 <M-2E7 / 3 are produced, used.

Ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV, in dem die Rezeptoren R3, R4, R5 und R6, sowie gegebenenfalls weitere übliche Hilfsstoffe enthalten sind. Die Rezeptoren R1 und R2 sind nicht enthalten.The invention also relates to a reagent kit for the detection of Antibodies against HIV, in which the receptors R3, R4, R5 and R6, and optionally other common auxiliaries are included. The receptors R1 and R2 are not included.

Auch ein Gegenstand der Erfindung ist ein Teststreifen zum Nachweis einer HIV- Infektion, auf dem mindestens ein Rezeptor R1, der mit dem p24-Antigen von HIV1, HIV1-SubO und/oder dem p26-Antigen von HIV2 spezifisch bindefähig ist und an eine Festphase gebunden ist oder gebunden werden kann, mindestens einen Rezeptor R2, der mit dem p24-Antigen von HIV1, HIV1-SubO und/oder dem p26-Antigen von HIV2 spezifisch bindefähig ist und eine Markierung trägt, wobei die von R1 und R2 erkannten Epitope verschieden sind, mindestens ein Rezeptor R3, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem env-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO und/oder HIV2- Antikörper spezifisch bindefähig ist und an eine Festphase gebunden ist oder gebunden werden kann, mindestens ein Rezeptor R4, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem env-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO und/oder HIV2-Antikörper spezifisch bindefähig ist und eine Markierung trägt, mindestens ein Rezeptor R5, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem pol- oder gag-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO und/oder HIV2-Antikörper spezifisch bindefähig ist und an eine Festphase gebunden ist oder gebunden werden kann, mindestens ein Rezeptor R6, der mit dem zu bestimmenden, gegen ein Antigen aus dem pol- oder gag-Bereich gerichteten HIV1-, HIV1-SubO oder HIV2-Antikörper spezifisch bindefähig ist und eine Markierung trägt, sowie gegebenenfalls weitere übliche Hilfsstoffe aufgebracht sind. The invention also relates to a test strip for the detection of HIV Infection on which at least one receptor R1 which is associated with the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 is specifically bindable to and Solid phase is bound or can be bound, at least one receptor R2 with the p24 antigen from HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen from HIV2 is specifically bindable and bears a label, the ones recognized by R1 and R2 Epitopes are different, at least one receptor R3, which is associated with the against an antigen from the env range HIV1-, HIV1-SubO and / or HIV2- Antibody is specifically bindable and bound or bound to a solid phase can be, at least one receptor R4, with the one to be determined against a Antigen from the env range directed HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibodies is specifically bindable and bears a label, at least one receptor R5, which with the one to be determined, directed against an antigen from the pole or gag range HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibodies are specifically bindable to and Solid phase is bound or can be bound, at least one receptor R6, with the one to be determined, directed against an antigen from the pole or gag range HIV1, HIV1-SubO or HIV2 antibody is specifically bindable and a label carries, as well as other usual auxiliaries are optionally applied.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Teststreifen zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV, in dem die Rezeptoren R3, R4, R5 und R6, sowie gegebenenfalls weitere übliche Hilfsstoffe enthalten sind. Die Rezeptoren R1 und R2 sind nicht enthalten.Another object of the invention is a test strip for the detection of antibodies against HIV, in which the receptors R3, R4, R5 and R6, as well as possibly other conventional ones Excipients are included. The receptors R1 and R2 are not included.

In den Fig. 1 bis 5 ist folgendes dargestellt:In Figs. 1 to 5: FIG

Fig. 1 Plateaubestimmung des monoklonalen Antikörpers MAK<p24<M-6A9/5: Die Bestimmung der optimalen MAK-Einsatzkonzentration für die Epitopkartierung wird gemäß dem in Beispiel 4.2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Fig. 1 Plateau determination of the monoclonal antibody mAb <p24 <M-6A9 / 5: Determination of the optimal MAK-use concentration for epitope mapping is performed according to the method described in Example 4.2.

Fig. 2 Plateaubestimmung des monoklonalen Antikörpers MAK<p24<M-4B1/1 Fig. 2 plateau determination of the monoclonal antibody MAK <p24 <M-4B1 / 1

Fig. 3 Plateaubestimmung des monoklonalen Antikörpers MAK<p24<M-6D9/4 Fig. 3 Plateau determination of the monoclonal antibody mAb <p24 <M-6D9 / 4

Fig. 4 Plateaubestimmung des monoklonalen Antikörpers MAK<p24<M-2E7/3 Fig. 4 plateau determination of the monoclonal antibody MAK <p24 <M-2E7 / 3

Fig. 5 p24-Epitopkartierung; Reaktion der <p24<-MAKs mit verschiedenen Peptidmischungen gemäß Beispiel 4.2.3. Figure 5 p24 epitope mapping; Reaction of the <p24 <-MAKs with different peptide mixtures according to Example 4.2.3.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. The following examples further illustrate the invention.

Examples example 1 Execution of the combined test

Die Versuchsdurchführung erfolgt analog zu der in der Packungsbeilage des Enzymun- Test® Anti-HIV 1+2+SubtypO (Best.Nr. 1557319, Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) beschriebenen Vorgehensweise. Bis auf d Rezeptoren R1 bis R6 werden die Reagenzien und Puffer des Enzymun-Test® Anti-HIV 1+2+SubtypO der Boehringer Mannheim GmbH eingesetzt. Der Test wird bei 25°C auf dem Gerät ES700 (Hersteller: Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) in einem Probenvolumen von 100 µl in streptavidinbeschichteten Teströhrchen nach dem Prinzip des 2-Schritt-Sandwich-ELISA durchgeführt. Im einzelnen werden folgende Reagenzien verwendet:
The test is carried out analogously to the procedure described in the package insert for the Enzymun-Test® Anti-HIV 1 + 2 + SubtypO (Order No. 1557319, Boehringer Mannheim GmbH, Germany). Except for the receptors R1 to R6, the reagents and buffers of the Enzymun-Test® Anti-HIV 1 + 2 + SubtypO from Boehringer Mannheim GmbH are used. The test is carried out at 25 ° C on the ES700 (manufacturer: Boehringer Mannheim GmbH, Germany) in a sample volume of 100 µl in streptavidin-coated test tubes according to the principle of the 2-step sandwich ELISA. The following reagents are used:

Incubation buffer: Tris 25 mM pH 7.5; Beef Serum Ingredients
- Conjugate buffer: Tris 25 mM pH 7.5; Beef Serum Ingredients
- Conjugate: Peroxidase (POD) labeled anti-digoxigenin antibodies from sheep
- Substrate: ABTS® substrate solution (2,2'-azino-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate] 1.9 mmol / l in 100 mmol / l phosphate / citrate buffer, pH 4.4, sodium perborate 3.2 mmol / l

Als Rezeptoren R1 bis R6 werden eingesetzt (Bi ist Abkürzung für Biotin, Dig ist Abkürzung für Digoxigenin):
The receptors R1 to R6 are used (Bi is an abbreviation for biotin, Dig is an abbreviation for digoxigenin):

R1: MAK <p24 <M-6A9 / 5-IgG-Bi, MAK <p24 <M-4B 1/1-IgG-Bi
R2: MAK <p24 <M-6D9 / 4-IgG-Dig, MAK <p24 <M-2E7 / 3-IgG-Dig
- R3: gp36-, gp41-peptide-Bi and polyhaptene-Bi according to those in the Enzymun® test Anti-HIV1 + 2 + SubO, order no. 15573 19, Boehringer Mannheim Germany used peptides
- R4: gp36-, gp41-peptide dig and polyhaptene dig corresponding to those in the Enzymun® Anti-HIV1 + 2 + SubO test, order no. 1557319, Boehringer Mannheim Germany used peptides
- R5: RT-Bi made from RT, order no. 1465333, Boehringer Mannheim Germany
- R6: RT-Dig made from RT, order no. 1465333, Boehringer Mannheim Germany.

Die hierzu notwendigen Derivatisierungen mit aktivierten Biotin- und Digoxigenin- Derivaten wurden nach dem Fachmann aus Lehrbüchern bekannten Verfahren durchgeführt. Für die Derivatisierung der RT oder der Antikörper eignen sich bevorzugt D- Biotin-ε-aminohexanoyl-N-hydroxy-succimmid und Digoxigenin-3 -carboxymethylether-ε aminohexanoyl-N-hydroxy-succinimid.The necessary derivatizations with activated biotin and digoxigenin Derivatives were prepared by methods known to those skilled in the art from textbooks carried out. D- are preferably suitable for the derivatization of the RT or the antibodies. Biotin-ε-aminohexanoyl-N-hydroxy-succimmide and digoxigenin-3-carboxymethyl ether-ε aminohexanoyl-N-hydroxy-succinimide.

Die Rezeptoren R1 bis R6 (Antikörper, Polyhaptene und RT jeweils 50-300 ng/ml, Peptide 5-50 ng/ml) werden zusammen mit dem Inkubationspuffer in die streptavidinbeschichteten Röhrchen gegeben und 120 min inkubiert. Nach mehreren Waschvorgängen und einer 60- minütigen Inkubation mit dem Konjugat wird die Substratlösung zugegeben und die Extinktionswerte der entstandenen Farblösungen nach 60 min bei 422 nm photometrisch bestimmt.The receptors R1 to R6 (antibodies, polyhaptens and RT each 50-300 ng / ml, peptides 5-50 ng / ml) are coated together with the incubation buffer in the streptavidin Tubes and incubated for 120 min. After several washes and a 60- minute incubation with the conjugate, the substrate solution is added and the Absorbance values of the resulting color solutions after 60 min at 422 nm photometrically certainly.

Example 2 Comparison of different combination tests

Um die Erfindung mit dem Stand der Technik zu vergleichen, wurden kommerzielle HIV- Seroconversionspanel der Firma Boston Biomedica Inc., Bridgewater, USA (BBI) vermessen und mit den von BBI gelieferten Daten verglichen (Tabelle 1).
In order to compare the invention with the prior art, commercial HIV seroconversion panels from Boston Biomedica Inc., Bridgewater, USA (BBI) were measured and compared with the data supplied by BBI (Table 1).

BBI Panel N: Best.Nr. PKB914
BBI Panel W: Best.Nr. PKB923
BBI Panel AG: Best.Nr. PKB932
HIV-Ag Test: Abbott Monoclonal HIV Ag, Prod.Nr. 2A81 (Daten von BBI)
Anti-HIV Test 1: Abboff HIV 1/2, Prod.Nr. 3A77 (Daten von BBI)
Anti-HIV Test 2: Gen. Sys. HIV 1/2, Prod.Nr. 0230 (Daten von BBI)
Kombitest 1: Anti-p24-Antikörper, gp4l und gp36 (Beschreibung siehe unten)
Kombitest 2: Anti-p24-Antikörper und RT (Beschreibung siehe unten)
Kombitest 3: Anti-p24-Antikörper, gp41, gp36 und RT (Beschreibung siehe unten).BBI Panel N: Order no. PKB914
BBI Panel W: Order no. PKB923
BBI Panel AG: Order no. PKB932
HIV-Ag test: Abbott Monoclonal HIV Ag, Prod.No. 2A81 (data from BBI)
Anti-HIV Test 1: Abboff HIV 1/2, Prod.No. 3A77 (data from BBI)
Anti-HIV Test 2: Gen. Sys. HIV 1/2, Prod.No. 0230 (data from BBI)
Combo test 1: anti-p24 antibody, gp4l and gp36 (see description below)
Combi test 2: anti-p24 antibody and RT (description see below)
Combo test 3: anti-p24 antibody, gp41, gp36 and RT (description see below).

Die drei Kombiteste wurden unter identischen Bedingungen mit den gleichen Reagenzien mit Ausnahme der unterschiedlichen Antigene durchgeführt. Die Testdurchführung erfolgte analog zu Beispiel 1. Als Basis dienten (wie in Beispiel 1) die Reagenzien und die 25°C Applikation des käuflichen Produktes Enzymun-Test® Anti-HIV 1+2+SubtypO (Best.Nr. 1557319, Boehringer Mannheim, Deutschland). Für die Kombitests 1 bis 3 wurden folgende Antikörper bzw. Antigene verwendet:
The three combination tests were carried out under identical conditions with the same reagents with the exception of the different antigens. The test was carried out analogously to Example 1. The reagents and the 25 ° C. application of the commercially available product Enzymun-Test® Anti-HIV 1 + 2 + SubtypO (Order No. 1557319, Boehringer Mannheim, served as the basis (as in Example 1) Germany). The following antibodies or antigens were used for combination tests 1 to 3:

- Combined test 1:
MAK <p24 <M-6A9 / 5-IgG-Bi, MAK <p24 <M-4B 1/1-IgG-Bi and biotinylated synthetic peptides and polyhaptens (gp41 and gp36) from the Enzymun-Test® Anti-HIV 1+ 2 + subtype O, MAK <p24 <M-6D9 / 4-IgG-Dig, MAK <p24 <M-2E7 / 3-IgG-Dig and digoxigenylated synthetic peptides and polyhaptens (gp41 and gp36) from the Enzymun-Test® Anti HIV 1 + 2 + subtype O
- Combined test 2:
MAK <p24 <M-6A9 / 5-IgG-Bi, MAK <p24 <M-4B1 / 1-IgG-Bi and biotinylated recombinant HIV reverse transcriptase
MAK <p24 <M-6D9 / 4-IgG-Dig, MAK <p24 <M-2E7 / 3-IgG-Dig and digoxigenylated recombinant HIV reverse transcriptase
- Combi test 3 (according to the invention):
R1: MAK <p24 <M-6A9 / 5-IgG-Bi, MAK <p24 <M-4B1 / 1-IgG-Bi,
R3: biotinylated synthetic peptides and polyhaptens (gp41 and gp36) from the Enzymun-Test® Anti-HIV 1 + 2 + SubtypO
R5: biotinylated recombinant HIV reverse transcriptase
R2: MAK <p24 <M-6D9 / 4-IgG-Dig, MAK <p24 <M-2E7 / 3-IgG-Dig,
R4: digoxigeninylated synthetic peptides and polyhaptens (gp41 and gp36) from the Enzymun-Test® Anti-HIV 1 + 2 + SubtypO
R6: digoxigenylated recombinant HIV reverse transcriptase.

Für alle Tests ist das Verhältnis von Signal zu Cut-off-Wert angegeben (Cut-off Index, coi). Die Daten sind folgendermaßen zu interpretieren: Werte kleiner 0,9 sind negativ, Werte zwischen 0,9 und 1,0 sind im Graubereich und Werte größer gleich 1,0 sind positiv. In der Spalte "Tag" ist die Anzahl der Tage eingetragen, die seit der ersten aufgeführten Blutabnahme vergangen sind. Die eingesetzten Panel enthalten unterschiedliche Analyten (Antigene und Antikörper), die in der Serokonversionsphase nach den unter "Tag" angegebenen Zeiten auftreten. The ratio of signal to cut-off value is given for all tests (cut-off index, coi). The data should be interpreted as follows: values less than 0.9 are negative, Values between 0.9 and 1.0 are in the gray area and values greater than or equal to 1.0 are positive. In the "Day" column, the number of days entered since the first Blood sampling has passed. The panels used contain different analytes (Antigens and antibodies) that are in the seroconversion phase after the "Tag" specified times occur.

Vergleich verschiedener HIV-NachweistestsComparison of different HIV detection tests

Es zeigt sich, daß der erfindungsgemäße Kombitest (Kombitest 3) im Unterschied zu den Vergleichstests alle Phasen der Infektion lückenlos detektiert. It can be seen that the combi test according to the invention (combi test 3) differs from that Comparative tests detected all phases of the infection without gaps.

Example 3 Detection of HIV1 virus isolates of various subtypes

Durch die Verwendung der vier erfindungsgemäßen Antikörper ist eine breite HIV1- Subtyperkennung gewährleistet. Die Testführung, Reagenzzusammensetzung und Auswertung ist identisch zu dem erfindungsgemäßen Kombitest 3 aus Beispiel 2. Als Proben wurden alle unten aufgeführten HIV1-Virusisolate (Gruppe M und SubtypO) 1 : 100 in Humanserum verdünnt, da die unverdünnten Isolate alle das gleich große Maximalsignal ergaben und somit keine Unterschiede zu sehen waren.By using the four antibodies according to the invention, a broad HIV1- Subtype recognition guaranteed. The test procedure, reagent composition and Evaluation is identical to combi test 3 according to the invention from example 2. As Samples were all HIV1 virus isolates (group M and subtype O) listed below Diluted 1: 100 in human serum, since the undiluted isolates are all the same size Gave maximum signal and therefore no differences could be seen.

Tabelle 2Table 2

Es zeigt sich, daß der erfindungsgemäße Kombitest die Antigene und Antikörper aller HIV1-Subtypen sicher detektiert.It turns out that the combination test according to the invention the antigens and antibodies of all HIV1 subtypes safely detected.

Example 4 Epitope mapping of the monoclonal antibodies against p24 4.1. Peptide synthesis

Die entsprechenden Teilsequenzen der Aminosäuresequenz des HIV-p24-Virusproteins werden mittels Fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)-Festphasenpeptidsynthese an einem Batch-Peptidsynthesizer, z. B. von Applied Biosystems A431 oder A433, hergestellt. Dazu werden jeweils 4.0 Äquivalente von folgenden Fmoc-Aminosäurederivaten verwendet: The corresponding partial sequences of the amino acid sequence of the HIV p24 virus protein are synthesized on a by means of fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) solid phase peptide synthesis Batch peptide synthesizers, e.g. B. from Applied Biosystems A431 or A433. To 4.0 equivalents of the following Fmoc amino acid derivatives are used:

Tabelle 3Table 3

Die Aminosäuren oder Aminosäurederivate werden in N-Methylpyrolidon gelöst. Das Peptid wird an 400-500 mg 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-Aminomethyl)-Phenoxy- Harz (Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107) mit einer Beladung von 0.4-0.7 mmol/g aufgebaut (JACS 95 (1973), 1328). Die Kupplungsreaktionen werden bezüglich Fmoc- Aminosäurederivat mit 4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 4 Äquivaltenen N- Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid als Reaktionsmedium während 20 min durchgeführt. Nach jedem Syntheseschritt wird die Fmoc-Gruppe mit 20%igem Piperidin in Dimethylformamid in 20 min abgespalten. Enthalten die Peptide eine intramolekulare Disulfidbrücke, so wird die Fmoc-geschützte, Peptidsequenz vor der Kupplung des artifiziellen Spacers mit Jod in Hexafluorisopropanol/Dichlormethan (Rober et al., The Peptide Academic Press, New York, 1981, pp 145-47) an der Festphase oxidiert und anschließend die N-terminale Fmoc-Schutzgruppe abgespalten, und der Spacer sowie das N-terminale Biotin gekuppelt.The amino acids or amino acid derivatives are dissolved in N-methylpyrolidone. The Peptide is added to 400-500 mg of 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl) phenoxy Resin (Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107) with a loading of 0.4-0.7 mmol / g established (JACS 95 (1973), 1328). The coupling reactions are related to Fmoc Amino acid derivative with 4 equivalents of dicyclohexylcarbodiimide and 4 equivalents of N- Hydroxybenzotriazole in dimethylformamide as the reaction medium for 20 min carried out. After each synthesis step, the Fmoc group with 20% piperidine split off in dimethylformamide in 20 min. The peptides contain an intramolecular Disulfide bridge, so the Fmoc-protected peptide sequence before the coupling of the artificial spacers with iodine in hexafluoroisopropanol / dichloromethane (Rober et al., The Peptide Academic Press, New York, 1981, pp 145-47) on the solid phase and oxidized then the N-terminal Fmoc protective group is split off, and the spacer and the N-terminal biotin coupled.

Die Freisetzung des Peptides vom Syntheseharz und die Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppen - mit Ausnahme der Phenylacetylschutzgruppe am Lysin - erfolgt mit 20 ml Trifluoressigsäure, 0.5 ml Ethandithiol, 1 ml Thioanisol, 1.5 g Phenol und 1 ml Wasser in 40 min bei Raumtemperatur. Die Reaktionslösung wird anschließend mit 300 ml gckühltem Diisopropylether versetzt und zur vollständigen Fällung des Peptides 40 min bei 0°C gehalten. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Diisopropylether nachgewaschen, mit wenig 50%iger Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Das erhaltene Rohmaterial wird mittels präparativer HPLC an Delta-PAK RP C18-Material (Säule 50×300 mm, 100 Å, 15 µ) über einen entsprechenden Gradienten (Eluent A: Wasser, 0.1% Trifluoressigsäure, Eluent B: Acetonitril, 0.1% Trifluoressigsäure) in ca 120 min aufgereinigt. Die Identität des eluierten Materials wird mittels Ionenspray-Massenspektrometrie geprüft.The release of the peptide from the synthetic resin and the cleavage of the acid labile Protective groups - with the exception of the phenylacetyl protective group on the lysine - are applied with 20 ml Trifluoroacetic acid, 0.5 ml ethanedithiol, 1 ml thioanisole, 1.5 g phenol and 1 ml water in 40 min at room temperature. The reaction solution is then with 300 ml cooled diisopropyl ether and 40 min to complete precipitation of the peptide Kept at 0 ° C. The precipitate is filtered off, washed with diisopropyl ether, with a little 50% acetic acid dissolved and lyophilized. The raw material obtained is by means of preparative HPLC on Delta-PAK RP C18 material (column 50 × 300 mm, 100 Å, 15 µ) over a corresponding gradient (eluent A: water, 0.1% trifluoroacetic acid, eluent B: acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid) purified in about 120 min. The identity of the eluted material is checked by means of ion spray mass spectrometry.

Peptid-Sequenzen der p24-EpitopePeptide sequences of the p24 epitopes

4.2. Epitope mapping 4.2.1. General immunological test

Die Epitopcharakterisierung wurde analog dem Boehringer Mannheim Enzymun®-Test Anti-HIV 1+2 (BM 1 165 062) durchgeführt. Das Testprinzip ist ein 2-Schritt-Sandwich- ELISA mit Streptavidin-Technologie. Jedoch wurden statt der Humanseren die verschiedenen monoklonalen <p24<Antikörper eingesetzt und mit den jeweils biotinylierten Peptiden oder rekombinantem.p24 vermessen. Die Detekrion erfolgt über <Maus IgG<-POD (BM 1 431 323). Alle anderen Zusatzreagentien, wie Waschlösung, Streptavidintubes, ABTS usw. wurden beibehalten. Die Messungen wurden an den Enzymun®-Analysen-Automaten ES 22 oder ES 600 von Boehringer Mannheim durchgeführt.The epitope characterization was carried out analogously to the Boehringer Mannheim Enzymun® test anti-HIV 1 + 2 (BM 1 165 062). The test principle is a 2-step sandwich ELISA with streptavidin technology. However, the various monoclonal <p24 <antibodies were used instead of the human sera and measured with the respective biotinylated peptides or recombinant.p24. Detection is carried out using <mouse IgG <-POD (BM 1 431 323). All other additional reagents, such as wash solution, streptavidin tubes, ABTS, etc., were retained. The measurements were carried out on the Enzymun® automatic analyzers ES 22 or ES 600 from Boehringer Mannheim.

4.2.2. Patriot provision

Die Bestimmung der optimalen MAK-Einsatzkonzentration für die Epitopkartierung wurde im oben beschriebenen Testkonzept durchgeführt. Als Antigen wurde biotinyliertes rekombinantes p24 (Einsatzmenge 200 ng/ml) verwendet. The determination of the optimal MAK use concentration for epitope mapping was made carried out in the test concept described above. Biotinylated was used as the antigen recombinant p24 (amount used 200 ng / ml) used.

Tabelle 5Table 5

Die Plateaubestimmung ist in den Fig. 1 bis 4 graphisch dargestellt. The plateau determination is shown graphically in FIGS. 1 to 4.

4.2.3. Epitope mapping

Die Kartierung wurde mit 25 Aminosäuren langen, N-terminal biotinylierten Peptiden, die im 10er Raster über die HIV1 Consensus B-Sequenz von p24 synthetisiert wurden (Peptide SEQ ID NO: 1-30), durchgeführt. Zuerst wurde eine Grobkartierung mit 6 verschiedenen Peptidmischungen A-F (Einsatzmenge pro Peptid 60 ng/ml), die jeweils 5 verschiedene biotinylierte Peptide enthalten, im indirekten Testkonzept vermessen.
The mapping was carried out using 25 amino acid-long, N-terminally biotinylated peptides, which were synthesized in a 10-fold pattern using the HIV1 Consensus B sequence of p24 (peptides SEQ ID NO: 1-30). First, a rough mapping with 6 different peptide mixtures AF (amount used per peptide 60 ng / ml), each containing 5 different biotinylated peptides, was measured in the indirect test concept.

Reaktivität der Antikörper mit Peptidmischung A-FReactivity of the antibodies with peptide mixture A-F

Ergebnis der Grobkartierung: 3 MAKs reagieren spezifisch mit jeweils einer Peptidmischung (graphische Darstellung siehe Fig. 5).Result of the rough mapping: 3 MAKs react specifically with one peptide mixture each (graphical representation see FIG. 5).

4.2.4. Fine mapping

In der Feinkartierung wurden die Peptide (Einsatzmenge 100 ng/ml) aus den reaktiven Mischungen einzeln im indirekten Testkonzept eingesetzt:In the fine mapping, the peptides (amount used 100 ng / ml) from the reactive Mixtures used individually in the indirect test concept:

MAK<p24<M-4B1/1 mit Einzelantigenen aus Mischung DMAK <p24 <M-4B1 / 1 with single antigens from mixture D

MAK<p24<M-2E7/3 mit Einzelantigenen aus Mischung BMAK <p24 <M-2E7 / 3 with single antigens from mixture B

MAK<p24<M-6D914 mit Einzelantigenen aus Mischung AMAK <p24 <M-6D914 with single antigens from mixture A

reaktive Peptid-Sequenzenreactive peptide sequences

Sequenzvergleich der Epitope von p24 HIV I Consensus B und Subtyp OSequence comparison of the epitopes of p24 HIV I Consensus B and subtype O

Laut Sequenzvergleich sollten die MAKs 6D9 und 4B1 die Kreuzreaktion zu p24 (SubO) ermöglichen, da hier die größte Homologie in der Sequenz ist.According to the sequence comparison, MAKs 6D9 and 4B1 should cross-react to p24 (SubO) enable because this is the greatest homology in the sequence.

Zur weiteren Einschränkung des Epitops wurde nochmals eine Feinkartierung mit den Peptiden 3 (= SEQ ID NO 3), 3A (= SEQ ID NO 31), 3B (= SEQ ID NO 32), und MAK<p24<M-6D9/4; Peptide 9 (= SEQ ID NO 9), 9A (= SEQ ID NO 33), 9B (= SEQ ID NO 34) und MAK<p24<M-2E7/3; sowie Peptide 17 (= SEQ ID NO 17), 17A (= SEQ ID NO 35), 17B (= SEQ ID NO 36) und MAK<p24<M-4B1/1 durchgeführt.To further restrict the epitope, a fine mapping with the Peptides 3 (= SEQ ID NO 3), 3A (= SEQ ID NO 31), 3B (= SEQ ID NO 32), and MAK <p24 <M-6D9 / 4; Peptides 9 (= SEQ ID NO 9), 9A (= SEQ ID NO 33), 9B (= SEQ ID NO 34) and MAK <p24 <M-2E7 / 3; and peptides 17 (= SEQ ID NO 17), 17A (= SEQ ID NO 35), 17B (= SEQ ID NO 36) and MAK <p24 <M-4B1 / 1.

MAK<p24<M-4B1/1 mit Einzelantigenen 17, 17A und 17BMAK <p24 <M-4B1 / 1 with single antigens 17, 17A and 17B

MAK<P24<MT2E7/3 mit Einzelantigenen 9, 9A und 9BMAK <P24 <MT2E7 / 3 with single antigens 9, 9A and 9B

MAK<p24<M-6D914 mit Einzelantigenen 3, 3A, 3BMAK <p24 <M-6D914 with single antigens 3, 3A, 3B

Daraus folgt, daß das Epitop des Antikörpers MAK<p24<M-4B1/1 nicht weiter eingeschränkt werden kann. Das Epitop von MAK<p24<M-2E7/3 kann auf die Sequenz 9B (SEQ ID NO: 34) EEAAEWDRVHP
minimiert werden. Das Epitop von MAK<p24<M-6D9/4 kann auf die Sequenz
3A (SEQ ID NO: 31) QAISPRTLNAWVKVI
ohne größere Signalverluste verkürzt werden kann. It follows that the epitope of the antibody MAK <p24 <M-4B1 / 1 can not be further restricted. The epitope of MAK <p24 <M-2E7 / 3 can be sequence 9B (SEQ ID NO: 34) EEAAEWDRVHP
be minimized. The epitope of MAK <p24 <M-6D9 / 4 can be based on the sequence
3A (SEQ ID NO: 31) QAISPRTLNAWVKVI
can be shortened without major signal losses.

Example 5 HIV subtype recognition using the monoldonal anti-p24 antibodies

Der Test wurde entsprechend Beispiel 1 und 2 nach den Vorschriften des Enzymun-Test® Anti-HIV 1+2+SubtypO (Best.Nr. 1557319, Boehringer Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Zur Austestung der HIV-Subtypenerkennung wurden jedoch nur die Rezeptoren R1 und R2, d. h. die monoklonalen Antikörper gegen p24 verwendet. Es wurden jeweils 250 ng MAK/ml eingesetzt.The test was carried out according to Examples 1 and 2 according to the Enzymun-Test® Anti-HIV 1 + 2 + SubtypO (Order No. 1557319, Boehringer Mannheim, Germany) carried out. However, only those were tested to test HIV subtype recognition Receptors R1 and R2, i. H. used the monoclonal antibodies against p24. It 250 ng MAK / ml were used in each case.

Erkennung von p24 (HIV1 und HIV1-SubO) durch die MAKsRecognition of p24 (HIV1 and HIV1-SubO) by the MAKs

Es zeigt sich, daß der monoklonale Antikörper MAK <p24<M-4B1/1 und der monoklonale Antikörper MAK <p24<M-6A9/5 jeweils bevorzugt für den Einsatz als R1, d. h. auf der Festphasenseite geeignet sind. Der monoklonale Antikörper MAK <p24<M-2E7/3 und der monoklonale Antikörper MAK <p24<M-6D9/4 sind bevorzugt für den Einsatz als R2, d. h. auf der Nachweisseite geeignet. Für eine effektive gleichzeitige Erkennung des p24 von HIV1 und HIV1-SubO werden alle vier Antikörper bevorzugt gemeinsam eingesetzt. It can be seen that the monoclonal antibody MAK <p24 <M-4B1 / 1 and the monoclonal Antibodies MAK <p24 <M-6A9 / 5 each preferred for use as R1, d. H. on the Solid phase side are suitable. The monoclonal antibody MAK <p24 <M-2E7 / 3 and the monoclonal antibodies MAK <p24 <M-6D9 / 4 are preferred for use as R2, i.e. H. suitable on the detection side. For effective simultaneous detection of the p24 by HIV1 and HIV1-SubO all four antibodies are preferably used together.

SequenzprotokollSequence listing

Claims

1. Procedure for the diagnosis of HIV infection by means of an immunoassay by the specific detection of p24 antigen from HIV1, HIV1-SubO and / or p26- Antigen from HIV2, at least one antibody against the env region of HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 and at least one antibody against the pol- and / or gag range from HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2.

2. The method according to claim 1, characterized in that the detection of HIV Infection occurs using a heterogeneous immunoassay.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that for the detection at least one receptor R1, which is specifically bindable with the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 and is bound to a solid phase or can be bound
at least one receptor R2 which is specifically capable of binding to the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 and which carries a label, the epitopes recognized by R1 and R2 being different,
at least one receptor R3 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R4 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1 SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and which bears a label,
at least one receptor R5 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the pol or gag region and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R6, which is specifically bindable and carries a label with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined, which is directed against an antigen from the pol or gag range, is used, optionally separating the solid of the liquid phase and determination of the marking in one of the two phases.

4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that the receptors R1 and R2 are specifically bindable to the p24 antigen of HIV1, the receptors R3 and R4 with the one to be determined, against an antigen from the env range targeted HIV1 antibodies are specifically bindable and the receptors R5 and R6 with the one to be determined against an antigen from the gag or pol range targeted HIV1 antibodies are specifically bindable.

5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that the receptors R5 and R6 with the one to be determined, directed against an antigen from the polar region HIV1 antibodies are specifically bindable.

6. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that the R5 and R6 receptors with anti-HIV reverse transcriptase Antibodies are specifically bindable.

7. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that the Receptors R5 and R6 with antibodies directed against the gag-p17 antigen are specifically bindable.

8. The method according to any one of claims 1-7, characterized in that also Infection with HIV1 subtype O is detected.

9. The method according to any one of claims 1-8, characterized in that a Infection with all HIV1 subtypes of group M is detected.

10. The method according to any one of claims 1-9, characterized in that the receptors R1 and R2 are each mixtures of different receptors that are different Epitopes of the p24 antigen from HIV1, HIV1-SubO and / or different epitopes recognize the p26 antigen of HIV2.

11. A method for the detection of antibodies against HIV, characterized in that at least one receptor R3, which is specifically bindable to and to be determined with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody directed against an antigen from the env range a solid phase is bound or can be bound,
at least one receptor R4 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1 SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and which bears a label,
at least one receptor R5 which is specifically bindable with the HIV1, H1V1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the pol or gag region and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R6, which is specifically bindable and carries a label with the HIVl, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined, which is directed against an antigen from the pol or gag range, is used, optionally separating the solid of the liquid phase and determination of the marking in one of the two phases.

12. Monoclonal antibodies against HIV1 p24 antigen, which the p24 epitopes according to SEQ ID NO: bind specifically 1-36.

13. Monoclonal antibodies against HIV1 p24 antigen, which the p24 epitopes according to SEQ ID NO: 3, 9, 17, 31 or 34 specifically bind.

14. Monoclonal antibodies to HIV1 p24 antigen derived from the cell lines MAK <p24 <M-6A9 / 5 (Accession No. DSM ACC23 10), MAK <p24 <M-4B1 / 1 (Accession No. DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (Accession No. DSM ACC2300), or MAK <p24 <M-2E7 / 3 (deposit no. DSM ACC2301) will.

15. Monoclonal antibodies to HIV1 p24 antigen, which are equivalent to p24 bind like the monoclonal antibodies derived from the cell lines MAK <p24 <M-6A9 / 5 (Accession No. D SM ACC23 10), MAK <p24 <M-4B 1/1 (Accession No. DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (Accession No. DSM ACC2300), or MAK <p24 <M-2E7 / 3 (deposit no. DSM ACC2301).

16. Monoclonal antibodies against HIVl p24 antigen that bind to the same epitopes like the monoclonal antibodies derived from the cell lines MAK <p24 <M-6A9 / 5 (Accession No. DSM ACC2310), MAK <p24 <M-4B 1/1 (Accession No. DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (Accession No. DSM ACC2300), or MAK <p24 <M-2E7 / 3 (deposit no. DSM ACC2301).

17. Use of at least one monoclonal antibody according to one of the Claims 12 to 16 in a diagnostic test for the detection of an HIV infection.

18. Use of at least one monoclonal antibody according to one of the Claims 12 to 16 in a diagnostic test in a method according to Claims 1 to 10 for the detection of an HIV infection.

19. Reagent kit for the detection of an HIV infection, containing at least one receptor R1 which is specifically bindable with the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 and which is bound or can be bound to a solid phase ,
at least one receptor R2 which is specifically capable of binding to the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 and which carries a label, the epitopes recognized by R1 and R2 being different,
at least one receptor R3 which is specifically capable of binding with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R4 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and which bears a label,
at least one receptor R5 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the pol or gag region and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R6 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the pol or gag region and which carries a label, and, if appropriate, other customary auxiliaries.

20. Reagent kit according to claim 19, characterized in that R1 as receptors and R2 the antibodies derived from the cell lines MAK <p24 <M-6A9 / 5 (deposit no. DSM ACC2310), MAK <p24 <M-4B1 / 1 (deposit no. DSM ACC2299), MAK <p24 <M-6D9 / 4 (Accession No. DSM ACC2300), or MAK <p24 <M-2E7 / 3 (Filing No. DSM ACC2301), are produced, used.

21. Test strips containing at least one receptor R1 which is specifically bindable with the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R2 which is specifically capable of binding to the p24 antigen of HIV1, HIV1-SubO and / or the p26 antigen of HIV2 and which carries a label, the epitopes recognized by R1 and R2 being different,
at least one receptor R3 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R4 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the env range and which bears a label,
at least one receptor R5 which is specifically bindable with the HIV1, HIV1-SubO and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the pol or gag region and which is bound or can be bound to a solid phase,
at least one receptor R6 which is specifically capable of binding with the HIV1 and / or HIV2 antibody to be determined and which is directed against an antigen from the pol or gag region and which carries a label, and optionally further customary auxiliaries.